DE19831429A1 - Verfahren zur Identifizierung und chemisch-synthetischen Nachahmung von Bindungsstellen auf Proteinen - Google Patents
Verfahren zur Identifizierung und chemisch-synthetischen Nachahmung von Bindungsstellen auf ProteinenInfo
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Abstract
Die Erfindung betrifft ein Verfahren zur Herstellung und Identifizierung eines Polytop-Peptids, DOLLAR A (a) welches über eine Antigen- oder Ligandenbindungsstelle einen Komplex mit dem korrespondierenden Bindungsmolekül bildet, DOLLAR A (b) welches zwei Peptidfragmente umfaßt, DOLLAR A (i) die durch einen Linker miteinander verbunden sind, DOLLAR A (ii) die Fragmente einer Aminosäuresequenz Proteins sind, DOLLAR A (iii) wobei das erste Fragment mit der Teil-Aminosäuresequenz des Proteins nach systematischem Mischungsprinzip mit dem zweiten Fragment mit derselben oder - deutlich häufiger - mit einer weiteren Teil-Aminosäuresequenz des Proteins kombiniert wird DOLLAR A umfassend die folgenden Schritte: DOLLAR A - Herstellen eines Polytop-Peptids, DOLLAR A - wobei das erste Peptidfragment über einen Linker mit dem zweiten Peptidfragment kovalent verbunden wird, DOLLAR A - Zugeben des Bindungsmoleküls und Abwaschen des nicht im Komplex gebundenen Bindungsmoleküls, DOLLAR A - Identifizieren der Komplexe aus Polytop-Peptid und Bindungsmolekül.
Description
Die Erfindung betrifft ein Verfahren zur Identifizierung und chemisch-synthetischen
Nachahmung von Bindungsstellen auf Proteinen, insbesondere Antikörpern oder
Rezeptoren.
Um Bindungsstellen von Antigen und Antikörper oder Ligand und Rezeptor zu
studieren, wurden verschiedene Lösungen erarbeitet.
- (i) Bei der Röntgenstrukturanalyse wurden die Komplexe aus Antigen und Antikörper oder Ligand und Rezeptor dreidimensional analysiert. [JONES and THORNTON (1996) Proc. Natl. Acad. Sci. USA, Vol. 93, pp 13-20] Diese Methode ist nur dann anwendbar, wenn die Aminosäuresequenz der Antikörper oder Rezeptoren bekannt ist. Die Röntgenstrukturanalyse ist ein sehr kompliziertes Verfahren, bei dem Kristalle der Komplexe aus Antigen/Antikörper oder Ligand/Rezeptor vorliegen müssen.
- (ii) Eine andere Methode besteht darin, überlappende Peptide aus einer
Antikörpersequenz oder Rezeptorsequenz auf die Bindung mit dem Antigen oder
Liganden zu testen. Dieser Vorgang ist auch umgekehrt möglich, wobei die
Antigensequenz oder Ligandensequenz (wenn ein Protein oder Peptid vorliegt) mit
dem Antikörper oder dem Rezeptor getestet wird. Dabei werden die Peptide in
Festphase synthetisiert und auch dort analysiert [FRANK et al. (1992) Tetrahedron,
Vol. 48, pp 9217-9232] oder in löslicher Phase synthetisiert und ausgetestet.
[HOUGHTON (1985) Proc. Natl. Acad. Sci, USA, Vol. 82, pp 5131-5135]
Nachteilig ist, daß diese Peptide häufig niedrige Bindungskapazitäten besitzen, da diese Peptidsequenzen üblicher Weise zusammen mit mindestens einer weiteren, in der dreidimensionalen Proteinstruktur benachbart angeordneten Peptidsequenz die hohe Bindungskapazität aufweisen. - (iii) Es wurde auch beschrieben, zwei Peptidfragmente zu verwenden, welche aus
einem Antikörper stammen. Die Struktur der Bindungsstellen war durch die
Untersuchung von Mutanten des Antigens genau bestimmt worden. Die
Bindungsfähigkeit von Ligand und den Peptidfragmenten wurde getestet. [Bidart et al.
(1990) Science, Vol. 248, pp 736-739]
Dieses Verfahren ist allein auf Peptidsequenzen beschränkt, bei denen eine Beteiligung an der Bindung bereits durch andere Methoden bekannt ist. - (iv) Antikörper besitzen hypervariable Bereiche, welche an das Antigen binden. Hier liegen je drei Peptidfragmente für die schwere und leichte Kette (zusammen 6 Ketten) vor, die durch Linker (Abstands-Peptidfragment) miteinander verbunden sind. Die Antikörpersequenz entsteht nach dem Zufallsprinzip in den B-Zellen des Körpers. Die Selektion des richtigen, mit dem Antigen einen Komplex bildenden Antikörpers tritt im Laufe einer Immunantwort auf. Der Körper eines Vertebraten, insbesondere eines Säugetieres, stellt den Ort eines wesentlichen Schritts dieses Verfahrens dar. Die Sequenzen der Aminosäuren der Antikörper sind nur dann analysierbar, wenn monoklonale Antikörper vorliegen.
Es stellt sich die Aufgabe, ein Herstellungsverfahren und Identifizierungsverfahren für
mindestens zwei Peptidfragmente eines Antikörpers oder Rezeptors (= Protein)
anzubieten, wobei die Peptidfragmente mit einem bezüglich der Struktur bekannten
oder unbekanntem Antigen oder Liganden (= Bindungsmolekül) einen Komplex bilden
und wobei die Peptidfragmente aus der Sequenz eines Antikörpers oder Rezeptors
stammen.
Die Aufgabe wird gelöst durch ein Verfahren zur Herstellung und Identifizierung eines
Polytop-Peptids,
- (a) welches über eine Antigen- oder Ligandenbindungsstelle einen Komplex mit dem korrespondierenden Antigen oder Liganden (Bindungsmolekül) bildet,
- (b welches mindestens zwei Peptidfragmente umfaßt,
- (i) die durch einen Linker miteinander verbunden sind,
- (ii) die Fragmente einer Aminosäuresequenz eines Antikörpers oder eines Rezeptors sind,
- (iii) wobei das erste Fragment mit der Teil-Aminosäuresequenz des
Proteins nach systematischem Mischungsprinzip bei
gleichzeitiger Identifizierbarkeit mit dem zweiten Fragment mit
derselben oder - deutlich häufiger - mit einer weiteren Teil-
Aminosäuresequenz des Proteins kombiniert wird und
gegebenenfalls diese beiden Fragmente nach systematischem Mischungsprinzip mit einem oder mehreren weiteren Fragmenten mit denselben oder mit mindestens einer weiteren Teil- Aminosäuresequenz des Proteins kombiniert wird,
umfassend die folgenden Schritte:
- - Herstellen einen Polytop-Peptids,
- - wobei das erste Peptidfragment über einen Linker mit dem zweiten Peptidfragment kovalent verbunden wird und gegebenenfalls dieses zweite über einen weiteren Linker mit mindestens einem weiteren Peptidfragment kovalent verbunden wird,
- - Zugeben des Bindungsmoleküls und abwaschen des nicht im Komplex gebundenen Bindungsmoleküls,
- - identifizieren der Komplexe aus Polytop-Peptid und Bindungsmolekül.
Der Vorteil des erfindungsgemäßen Verfahrens besteht darin, daß dieses Verfahren
lediglich voraussetzt, daß die Aminosäuresequenz des Antikörpers oder des
Rezeptors (Antikörper oder Rezeptor = Protein) bekannt ist. Deren Gesamtsequenz
wird in einzelne Peptidsequenzen unterteilt, die sich, sofern benachbarte Sequenzteile
betroffen sind, überlappen. So kann zum Beispiel die Gesamtaminosäuresequenz des
Proteins Lysozym in 41 überlappende Peptide von 10 Aminosäuren Länge, die um je 3
Aminosäuren auf der Primärstruktur verschoben sind, aufgeteilt werden. Der Polytop
scan enthält alle möglichen Kombinationen von je zwei dieser 41 Peptide. Die
zehnmeren Peptidfragmente sind mit einem Linker aus 2 β-Alaninresten verbunden,
so daß jedes Polytop-Peptid des Polytop-scans aus 22 Aminosäuren besteht. Der
Scan enthält dabei 41 × 41 = 1681 verschiedene Polytop-Peptide, die in einer 41 × 41
Matrix aufgebaut sind. Somit ist eine bestimmte Kombination zweier Peptidfragmente
einem spezifischen, definierten Reaktionsort zugeordnet, in dem ausschließlich diese
bestimmte Kombination vorliegt.
Es ist nicht notwendig vor dem Test bereits zu wissen, welche Aminosäuren des
Proteins an der Bindung des Antigens oder Liganden (Antigen oder Ligand =
Bindungsmolekül) beteiligt sind.
Die Kenntnis über die Struktur des Antigens oder des Liganden braucht vor dem Test
nicht vorzuliegen.
Wenn durch zum Beispiel biologische Tests sichergestellt ist, daß ein Antigen oder ein
Ligand in einer Lösung vorliegt, so kann diese bei dem Identifizierungsverfahren
eingesetzt werden. Dieses ist gerade dann wesentlich, wenn man ein Gemisch aus
Antigenen oder Liganden vorliegen hat, welches unter anderen Molekülen auch das
gewünschte Molekül umfaßt.
Mehrere Verfahren sind für die Identifizierung von Komplexen möglich: (i) Ein
Antikörper gegen einen Liganden wird in Kombination mit einem zweiten zum Beispiel
enzymmarkierten oder fluoreszenzmarkierten Antikörper verwendet.
(ii) Eine Enzymmarkierung oder eine Fluoreszenzmarkierung des ersten Antikörpers
wird zum Test eingesetzt. (iii) Radioaktiv-, enzym- oder fluoreszenz-markierte Antigene
oder Liganden werden verwendet.
Vorteilhaft ist es, das erfindungsgemäße Verfahren bei der Identifizierung von Polytop-
Peptiden einzusetzen, die als künstliches Antigen bei der Antikörperbestimmung bei
Patienten in einem ELISA eingesetzt werden. Das sonst dem Antikörper
entsprechende Antigen wird durch die Polytop-Peptide ersetzt. Somit lassen sich auch
Antikörpertiter bestimmen, die wegen zum Beispiel instabilen Antigens als Test nicht
zu etablieren sind. Auch können kostenaufwendig herzustellende Antigene leicht
ersetzt werden.
Die mit dem Antigen oder Liganden einen Komplex bildenden Polytop-Peptide können
als biochemisches Werkzeug in Forschung und Entwicklung eingesetzt werden. Mit
ihnen lassen sich in der Diagnostik Antigene nachweisen.
In der Therapie ist der Einsatz von Antikörpern bisweilen wünschenswert. Nachteilig ist
deren Größe. Dieser Nachteil kann durch die Polytop-Peptide, die entsprechend dem
erfindungsgemäßen Verfahren hergestellt worden sind, kompensiert werden. Die
Polytop-Peptide können eine bessere Pharmakokinetik als Antikörper aufweisen.
Auch ist das erfindungsgemäße Verfahren anzuwenden, um für Waschmittel Polytop-
Peptide herzustellen, die Farbstoffe und andere Schmutzpartikel an Stelle von großen
Antikörpern binden können. Dazu ist erst ein Antikörper gegen den Farbstoff oder das
Schmutzpartikel herzustellen, der anschließend mit dem erfindungsgemäßen
Verfahren zu einem Polytop-Peptid verkleinert wird.
In der Lebensmittelindustrie lassen sich Antikörper gegen bestimmte
Geschmacksrezeptoren zu Polytop-Peptide minimieren. Dann lassen sich diese gegen
die Geschmacksrezeptoren gerichteten Polytop-Peptide als Geschmackszusatzstoffe
den Nahrungsmitteln zusetzen.
In der Biotechnologie werden häufig Substanzen über mit Antikörpern behafteten
Säulen gereinigt. Das erfindungsgemäße Verfahren erlaubt es, diese Antikörper durch
die entsprechenden Polytop-Peptide zu ersetzen. Solche "minimalisierten" Antikörper
sind deutlich kostengünstiger herzustellen. Auch sind die Polytop-Peptide chemisch
leichter als die Antikörper zu handhaben.
Was auf Säulen Anwendung finden kann, läßt sich auch in der Umweltanalytik
verwenden. So können Antikörper, die an bestimmte Schadstoffe binden, zu Polytop-
Peptiden verkleinert werden, so daß die letzteren in einem einfachen Testsystem
einsetzbar sind. Jedoch ist dieses Verfahren nicht nur in der Analytik einzusetzen,
auch in der Reinigung oder in dem Recycling von Flüssigkeiten und Gasen läßt sich
der "minimierte" Antikörper oder Rezeptor verwenden.
Erstrebenswert kann es sein, Enzyme auf das katalytische Zentrum zu reduzieren.
Das erfindungsgemäße Verfahren erlaubt es, Polytop-Peptide identifizieren zu
können, die die Funktion von Enzymen imitieren können. Ein vergleichbares Vorgehen
erfolgte zum Beispiel bei katalytischen Antikörpern.
Auch ist es denkbar, diese Polytop-Peptide auf ihre Eigenschaft als Enzyminhibitoren
zu selektionieren. Hierzu ist es auch erfolgversprechend, Sequenzen von Proteinen,
die als Enzyminhibitoren wirken, für die Identifizierung von Polytop-Peptiden zu
verwenden.
Alle pharmakologisch interessanten Proteine können in bezug auf eine Bindungsstelle
zu einem Bindungspartner verkleinert werden. Die Protein-Protein-Interaktion kann
inhibiert (Antagonisten) oder stimuliert werden (Agonisten). Diese entsprechend dem
erfindungsgemäßem Verfahren verkleinerten Proteine können als Polytop-Peptide
entweder direkt therapeutisch Anwendung finden oder als Leitstruktur für die
Umwandlung der Peptide in Peptidmimetika oder kleine organische Moleküle dienen.
Beispiele für diese Proteine sind:
Zytokine oder Wachstumsfaktoren und ihre Rezeptoren,
Zelladhäsionsproteine und ihre Rezeptoren,
Proteine der Signaltransduktionswege und ihre Bindungspartner,
zytosolische Rezeptoren, Steroidrezeptoren,
Proteine der Blutgerinnung,
Neurotransmitter und ihre Rezeptoren,
Proteine in Stoffwechselwegen,
Proteine in Replikation, Transkription und Translation,
Proteine, die von Krankheitserregern (Bakterien, Viren, eukaryotischen Einzellen und Parasiten) in den Organismus eingebracht werden und untereinander oder mit Proteinen des Wirts interagieren.
Zytokine oder Wachstumsfaktoren und ihre Rezeptoren,
Zelladhäsionsproteine und ihre Rezeptoren,
Proteine der Signaltransduktionswege und ihre Bindungspartner,
zytosolische Rezeptoren, Steroidrezeptoren,
Proteine der Blutgerinnung,
Neurotransmitter und ihre Rezeptoren,
Proteine in Stoffwechselwegen,
Proteine in Replikation, Transkription und Translation,
Proteine, die von Krankheitserregern (Bakterien, Viren, eukaryotischen Einzellen und Parasiten) in den Organismus eingebracht werden und untereinander oder mit Proteinen des Wirts interagieren.
Ein Polytop-Peptid kann auch nur zwei Peptidfragmente umfassen, wobei dann die
Bezeichnung Duotop-Peptid für diese spezielle Form des Polytop-Peptids verwendet
wird.
Bevorzugt ist ein erfindungsgemäßes Verfahren, bei dem der Linker sich oligomerisch
aus Bausteinen synthetisieren läßt, die durch folgende beispielhafte Bindungen
miteinander verknüpft sind: (i) Amid-, (ii) Ester-,
(iii) Ether-, (iv) Harnstoff-, (v) -C-C- und (vi) Sulfonamidbindungen. Solche Bausteine
können zum Beispiel die folgenden oligomerisierbaren Monomere sein: (i)
Aminosäuren (L- und D-Formen; genetisch kodierte und synthetische Aminosäuren) (ii)
Peptoide, (iii) PNAs, (iv) Ribose Phosphat Elemente, (v) Ethylenglykol und (vi)
Acrylsäure. Bevorzugt ist ein Linker von einer Länge von 0 bis 16 Bausteinen, mehr
bevorzugt von 1 bis 10, noch mehr bevorzugt von 2 bis 7, am meisten bevorzugt von 2
bis 4 Bausteinen.
Mehr bevorzugt ist ein Linker, der aus Aminosäuren besteht. Bevorzugt ist ein Linker
von einer Länger von 0 bis 16 Aminosäuren, mehr bevorzugt von 1 bis 10, noch mehr
bevorzugt von 2 bis 7, am meisten bevorzugt von 2 bis 4 Aminosäuren. Auch wenn der
Linker nicht aus Aminosäuren besteht, soll der Ausdruck Duotop-Peptid oder Polytop-
Peptid verwendet werden, der somit auch Linker mitumfaßt, die keine Aminosäuren
oder mindestens einen Polymerbaustein besitzen, der keine Aminosäure ist.
Vorteilhaft kann sein, wenn die Duotop-Peptide mindestens einen weiteren Baustein
außerhalb des N-terminalen und/oder C-terminalen Endes in Form von mindestens
einem weiteren Rahmenbaustein aufweisen, wobei die um die Rahmenbausteine
erweiterten Polytop-Peptide im wesentlichen die Funktion aufweisen, die das Polytop-
Peptid ohne Rahmenbaustein besitzt. Der Ausdruck Rahmenbaustein ist analog wie
der Ausdruck Polymerbaustein (siehe zuvor) definiert, lediglich seine Lage im Polytop
ist anders. Bevorzugte Rahmenbausteine sind Rahmenaminosäuren.
Die Sequenz des Polytop-Peptides kann am N-terminalen und/oder Cterminalen Ende
an Stelle einer Schutzgruppe mit weiteren Rahmen-Baustein-Sequenzen verbunden
sein. Diese weiteren Rahmen-Baustein-Sequenzen sind für die Bindung des Polytop-
Peptides nicht wesentlich, sie können jedoch Träger von anderen Funktionen sein, so
zum Beispiel enzymatische Funktionen umfassen. Ebenfalls ist es möglich, Polytop-
Peptide hintereinander zu koppeln, wobei Rahmen-Baustein-Sequenzen zwischen den
Einzelsequenzen angeordnet sind.
Um im Einzelfall zu entscheiden, ob ein Polytop-Peptid mit wenigstens einer Rahmen-
Baustein-Sequenz zum Gegenstand der Erfindung zählt, ist ein Vergleich zwischen
- a) diesem Polytop-Peptid mit Rahmen-Baustein-Sequenz und
- b) demselben Polytop-Peptide ohne Rahmen-Baustein-Sequenz
anzustellen. Dabei sollten beide Moleküle im wesentlichen dieselben Funktionen bei
der Bindung gegenüber dem entsprechenden Protein aufweisen.
Vorteilhaft ist, wenn die Polytop-Peptide je nach Ende Amino-Schutzgruppen oder
Carboxyl-Schutzgruppen oder deren Varianten aufweisen.
Die Schutzgruppe oder deren Varianten für den N-Terminus kann bestehen aus:
Alkyl-, Aryl-, Alkylaryl-, Aralkyl-, Alkylcarbonyl- oder Arylcarbonylgruppen mit 1 bis 10 Kohlenstoffatomen, bevorzugt sind Naphthoyl-, Naphthylacetyl-, Naphthylpropionyl-, Benzoylgruppe oder einer Acylgruppe mit 1 bis 7 Kohlenstoffatomen.
Alkyl-, Aryl-, Alkylaryl-, Aralkyl-, Alkylcarbonyl- oder Arylcarbonylgruppen mit 1 bis 10 Kohlenstoffatomen, bevorzugt sind Naphthoyl-, Naphthylacetyl-, Naphthylpropionyl-, Benzoylgruppe oder einer Acylgruppe mit 1 bis 7 Kohlenstoffatomen.
Die Schutzgruppe oder deren Varianten für den C-Terminus können bestehen aus:
Einer Alkoxy- oder Aryloxygruppe mit 1 bis 10 Kohlenstoffatomen oder aus einer Aminogruppe.
Einer Alkoxy- oder Aryloxygruppe mit 1 bis 10 Kohlenstoffatomen oder aus einer Aminogruppe.
Weitere Schutzgruppen können sich aus Bausteinen zusammensetzen, wobei die
Bausteine Amine, Naturstoffe, wie Zucker, Nukleinsäuren, Phosphat-(Desoxi)-Ribosen,
PNAs, Steroide und Lipide umfassen.
Weitere Schutzgruppen oder deren Varianten sind in Houben-Weyl (1974) Georg
Thieme Verlag, 4. Auflage beschrieben. Die Beschreibung der Schutzgruppen in der
zitierten Literaturangabe ist Teil der Offenbarung.
Um im Einzelfall zu entscheiden, ob ein Polytop-Peptid mit wenigstens einer
Schutzgruppe zum Gegenstand der Erfindung zählt, ist ein Vergleich zwischen
- a) diesem Polytop-Peptide mit Schutzgruppe und
- b) demselben Polytop-Peptid ohne Schutzgruppe
anzustellen. Dabei sollten beide Moleküle im wesentlichen dieselben Funktionen bei
der Bindung gegenüber dem entsprechenden Protein aufweisen.
Bevorzugt ist ein erfindungsgemäßes Verfahren, bei dem die Aminosäuren natürliche
oder künstliche Aminosäuren sind.
Die Aminosäuren stammen
- a) aus der Gruppe der natürlichen Aminosäuren in L- oder D-Form oder
- b) aus der Gruppe der Derivate der Aminosäuren.
Innerhalb einer Peptidsequenz sind auch Mischformen möglich. Derivate von
Aminosäuren zeichnen sich meistens dadurch aus, daß die Seitenketten substituiert
sind. Sie können auch β-Aminosäuren, γ-Aminosäuren und ω-Aminosäure umfassen.
Neben den zwanzig L-Aminosäuren existiert eine große Zahl an Aminosäurederivaten,
die zum Beispiel in dem Katalog der Firma BACHEM, Bubendorf, Basellandschaft,
Schweiz, beschrieben sind. Die künstlichen Aminosäuren sind in Houben-Weyl (1974)
Georg Thieme Verlag, 4. Auflage beschrieben. Derartige Peptide, die veränderte
Aminosäuren enthalten, legen häufig eine anders geartete Pharmakokinetik an den
Tag. Sie verhalten sich im Organismus anders als die Peptide, die ausschließlich aus
natürlichen Aminosäuren bestehen. Sie sind gegenüber Proteasen stabiler, sie
durchdringen teilweise die Zellmembranen schlechter, wodurch das als Medikament
genutzte synthetische Peptid für die Einwirkung im extrazellulären Bereich geeigneter
als eine Sequenz aus L-Aminosäuren ist.
Es ist auch ein besserer Membrantransfer denkbar und in vielen Fällen (cytosolische
Rezeptoren) gewünscht.
Normaler Weise sind Peptide N-C-verknüpft. Jedoch können auch die
Teilaminosäuresequenzen des Polytop-Peptids über die C-Termini oder über die N-
Termini verknüpft sein.
Bevorzugt ist ein Optimierungsverfahren bei dem ein Polytop-Peptid, welches nach
dem erfindungsgemäßen Verfahren hergestellt worden ist, in einem weiteren
Verfahren optimiert wird,
indem nach den Schritten des erfindungsgemäßen Verfahrens
- a) mindestens eine Aminosäure in der Sequenz des Polytop-Peptids durch eine natürliche oder nicht natürliche Aminosäuren substituiert wird,
- b) nach jeder Substituierung das modifizierte Polytop-Peptid auf die Bindungsfunktion gegenüber dem Bindungsmolekül ausgetestet und die am besten bindenden, modifizierten Polytop-Peptide selektioniert werden,
- c) die am besten bindenden, modifizierten Polytop-Peptide gegebenenfalls mindestens einen weiteren Zyklus gemäß der Punkt (a) und (b) des Optimierungsverfahrens durchlaufen.
Bevorzugt ist, wenn das Polytop-Peptid zyklisiert ist.
Das Resultat dieser Optimierung kann ein Polytop-Peptid sein, welches mit der
ursprünglich gefundenen Sequenz nur noch Teile gemeinsam hat. Die
Bindungskapazität kann erheblich gesteigert werden, wie aus dem Beispiel der
Erfindung hervorgeht.
Das Ausganspeptid und alle Peptide, die sich von diesem Ausgangspeptid in einer
Aminosäure unterscheiden, werden synthetisiert. Üblicher Weise werden diese
Bibliotheken in Gruppen unterteilt. Innerhalb einer Gruppe wird eine Position des
Ausgangspeptides gegen alle Aminosäuren ausgetauscht, die für die Optimierung
verwendet werden sollen. (L-, D- und nicht genetisch kodierte Aminosäuren). Eine
komplette Optimierungsbibliothek besteht aus so vielen Gruppen, wie
Aminosäurepositionen im Peptid vorhanden sind.
Es können auch zwei Positionen abhängig voneinander optimiert werden. Werden
zum Beispiel alle 20 L-Aminosäuren zur Optimierung verwendet, entstehen 20
Untergruppen mit je 20 verschiedenen Peptiden. Gemäß der kombinatorischen
Chemie werden die beiden zu substituierenden Positionen des Peptids systematisch
gegen die 20 L-Aminosäuren ausgetauscht, so daß 20 × 20 Ansätze gebildet werden.
Entsprechende Verfahren sind auch für 3 oder mehr voneinander abhängige zu
optimierende Positionen anwendbar.
Dieses Verfahren wird noch weiter durch die Beispiele verdeutlicht. Ein
routinemäßiges Bearbeiten von Sequenzen, die Polytop-Peptiden entsprechen, ist
durch diese Methode problemlos möglich. Die dabei auftretenden Ordnungsgrade
lassen sich auch ohne Computertechnik mit Hilfe des Trägermaterials Zellulose
bewältigen.
Die Erfindung umfaßt weiterhin einen Satz an Versuchsreagenzien zur Herstellung
und Identifizierung von einem Polytop-Peptid,
- (a) welches über eine Antigen- oder Ligandenbindungsstelle einen Komplex mit dem korrespondierenden Bindungsmolekül bildet,
- (b) welches mindestens zwei Peptidfragmente umfaßt,
- (i) die durch einen Linker miteinander verbunden sind,
- (ii) die Fragmente einer Aminosäuresequenz eines Bindungsmoleküls sind,
- (iii) wobei das erste Fragment mit der Teil-Aminosäuresequenz des
Proteins nach systematischem Mischungsprinzip bei
gleichzeitiger Identifizierbarkeit mit dem zweiten Fragment mit
derselben oder deutlich häufiger mit einer weiteren Teil-
Aminosäuresequenz des Proteins kombiniert ist und
gegebenenfalls diese beiden Fragmente nach systematischem Mischungsprinzip mit einem oder mehreren weiteren Fragmenten mit denselben oder mit mindestens einer weiteren Teil- Aminosäuresequenz des Proteins kombiniert ist,
umfassend die folgenden Teile:
- - einen Träger mit Reaktionsorten, in denen Polytop-Peptide synthetisiert und/oder gespeichert werden können,
- - verschiedene Polytop-Peptide an oder in den Reaktionsorten des Trägers,
- - Identifizierungsreagenzien für die Komplexe.
Verwendung von einem erfindungsgemäßen Satz an Versuchsreagenzien zur
Optimierung von Polytop-Peptiden, welche nach dem erfindungsgemäßen Verfahren
hergestellt und identifiziert worden sind, wobei auf einem Träger in Reaktionsorten die
modifizierten Polytop-Peptide mit substituierten Aminosäuren angeordnet sind.
Die im Text verwendeten Abkürzungen sind durch die Regeln bestimmt, die von der
IUPAC-IUB Kommission für biochemische Nomenklatur festgelegt worden sind
(Biochemistry 11: 1726 (1972) und Biochem. J. 219: 345 (1984)). Folgende übliche
Abkürzungen werden verwendet: Ala = A = Alanin; Arg = R = Arginin; Asn = N =
Asparagin; Cys = C = Cystein; Gln = Q = Glutamin; Glu = E = Glutaminsäure; Gly = G
= Glycin; His = H = Histidin; Ile = I = Isoleucin; Leu = L = Leucin; Lys = K = Lysin; Met
= M = Methionin; Phe = F = Phenylalanin; Pro = P = Prolin; Ser = S = Serin; Thr = T =
Threonin; Trp = W = Tryptophan; Tyr = Y = Tyrosin und Val = V = Valin.
Der Begriff Antikörper umfaßt alle Fragmente eines Antikörper, welcher noch
mindestens eine abgeschwächte Bindungsfunktion besitzt. Hierunter fallen zum
Beispiel Fab-Fragmente, die leichte Kette, die schwere Kette, die hypervariablen
Bereiche mit Rahmenaminosäuren (Framework) von Antikörpern.
Der Begriff Rezeptor umfaßt all die glykosilierten oder unglykosilierten Proteine und
Proteinkomplexe, die einen Liganden binden können. Die Rezeptoren können sich im
Zytoplasma, in Membranen inseriert oder in der extrazellulären Matrix befinden. Die
Rezeptoren können auch Koenzyme mitumfassen. Auch die T-Zellrezeptoren und
antigen-bindende Fragmente davon sind unter den Begriff Antikörper zu fassen.
Rezeptoren besitzen häufig Quatärstruktur. Der Rezeptor kann auch gegenüber einem
Antikörper ein Antigen sein.
Der Begriff Antigen umfaßt alle natürlichen und künstlichen Produkte, welche von
einem Antikörper oder einem Fragment davon erkannt werden kann.
Nach systematischem Mischungsprinzip bei gleichzeitiger Identifizierbarkeit:
Gemischt werden die Peptidfragmente, die Teil-Aminosäuresequenzen des Proteins sind. Dabei kann die gesamte Sequenz des Proteins in sich leilweise überlappende Teil-Aminosäuresequenzen, das heißt in die Peptidfragmente, aufgeteilt werden.
Gemischt werden die Peptidfragmente, die Teil-Aminosäuresequenzen des Proteins sind. Dabei kann die gesamte Sequenz des Proteins in sich leilweise überlappende Teil-Aminosäuresequenzen, das heißt in die Peptidfragmente, aufgeteilt werden.
- (i) Diese Peptidfragmente werden nun miteinander gemischt, so daß aufgrund der Reaktionsorte genau zu identifizieren ist, an welchem Reaktionsort welches Peptidfragment mit welchem weiteren Peptidfragment zur Reaktion gebracht wird. Somit gehört zu jedem Mischen gleichzeitig auch die Lokalisierung der Mischung und die Identifizierbarkeit der Mischungspartner.
- (ii) Alternativ ist auch die Verwendung von kugelförmigem Trägermaterial, auf denen die Peptide synthetisiert werden, möglich. (K. S. LAM et al. (1991) Nature, Vol 354, 82). In unserem Beispiel 41 Ansätze werden gefahren, ein Ansatz pro Teil- Aminosäuresequenz. Nach den sukzessiven Syntheseschritten zur Herstellung der gesamten Teil-Aminosäuresequenz werden die Kugeln gemischt und erneut in 41 Reaktionsgefäße aufgeteilt. Bei der Selektionierung werden die positiven Kugeln ermittelt und die Sequenz der darauf befindlichen Peptide bestimmt. Die positiven Kugeln tragen die das Bindungsmolekül bindende Sequenzen. Nachteil dieser Methode ist die umständliche Handhabung nach der Synthese.
Es ist möglich die gesamte Sequenz eines Proteins in Teil-Aminosäuresequenzen
aufzuteilen oder auch nur besonders interessante Sequenzabschnitte. So kann zum
Beispiel ein interessanter Teil eine besonders konservative Passage in der Gesamt-
Aminosäuresequenz des Proteins sein, die von einer Genfamilie geteilt wird.
Identifizierbar ist eine Mischung, wenn jeder spezifischen Mischung, die in ihrer
Zusammensetzung bekannt ist, ein spezifischer Reaktionsort zuzuordnen ist.
Zu den Liganden zählen alle natürlichen und synthetisch hergestellten Substanzen,
die an einen Rezeptor binden können oder von einem T-Zell-Rezeptor oder Fragment
davon erkannt werden. Der Ligand kann auch ein gegen den Rezeptor gerichteter
Antikörper sein.
Mehrere Verfahren sind für die Identifizierung von Komplexen möglich: (i) Ein
Antikörper gegen einen Liganden wird in Kombination mit einem zweiten zum Beispiel
enzymmarkierten oder fluoreszenzmarkierten Antikörper verwendet.
(ii) Eine Enzymmarkierung oder eine Fluoreszenzmarkierung des ersten Antikörpers
wird zum Test eingesetzt. (iii) radioaktiv-, enzym- oder fluoreszenz-markierte
Antigene oder Liganden werden verwendet.
Die Festphasen-Synthese ist ausführlich beschreiben in Solid Phase Synthesis, E.
ATHERTON and R. C. SHEPPARD (1989) IRL Press, ISBN 1-85221-133-4 und Amino
Acid and Peptide Syntheses, J. JONES, Oxford Science Publication (1992) ISBN 0-19-
855668-3.
Die Flüssigphasen-Synthese oder Lösungstechnik ist in Methoden der Organischen
Chemie (HOUBEN/WEYL), Bd. 15/Nr. 1 und 2, E. WÜNSCH (Herausgeber), Thieme
Verlag Stuttgart, 1974 dargestellt.
Verschiedenste Trägermaterialen sind in der Standardliteratur beschreiben. Besonders
geeignet sind bei diesem Verfahren alle im wesentlichen planaren Träger, die ein
einfaches Auftragen der reagiblen Aminosäuren ermöglicht. Zellulose und Polypropylen
eignen sich besonders gut. Hierbei haben sich Materialien von WHATMAN, Typ:
Whatman Papier 540 oder 50 (gehärtete Zellulose) als sehr brauchbar herausgestellt. Bevorzugt sind Verfahren, bei denen das Trägermaterial aus Zellulose besteht. Es hat den Vorteil, daß ein für die Synthese brauchbarerer Träger vorliegt, auf dem leicht die Aminosäuren aufgetragen werden können. Die ebene Fläche und die hohe Saugfähigkeit erleichtern die Handhabung.
Whatman Papier 540 oder 50 (gehärtete Zellulose) als sehr brauchbar herausgestellt. Bevorzugt sind Verfahren, bei denen das Trägermaterial aus Zellulose besteht. Es hat den Vorteil, daß ein für die Synthese brauchbarerer Träger vorliegt, auf dem leicht die Aminosäuren aufgetragen werden können. Die ebene Fläche und die hohe Saugfähigkeit erleichtern die Handhabung.
Als Trägermaterial eignet sich auch Polystyren Kügelchen, an denen die Festphasen
synthese der Peptidbank (peptide library) ebenfalls durchgeführt werden kann. Die
Simultansynthese von Einzelkomponenten (zum Beispiel bei einem Hexapeptid mit der
Sequenz AA1.AA2.AA3.AA4.AA5.AA6 (AA = bestimmte Aminosäure) der
Peptidbank (peptide library) kann gut an einem multiplen Peptidsynthese-Automaten
(zum Beispiel der Firma Abimed AMS 422) durchgeführt werden. 48 Ansätze sind zum
Beispiel mit einem zuvor genannten Gerät simultan zu synthetisieren. Mit Hilfe dieser
Methode können größere Mengen an freien Peptiden gewonnen werden, die zum
Beispiel für Zelltests eingesetzt werden können.
Vorteilhaft sind Verfahren, bei denen die Polytop-Peptide über Alaninreste mit dem
Trägermaterial verbunden sind. Dabei sind die Peptide- auf oder in dem Trägermaterial
an β-Alaninreste gekoppelt, die mit dem Trägermaterial kovalent verbunden sind. β-
Alanin ist dabei über eine Esterbindung an das Zellulosematerial gekoppelt.
Als weitere Peptidkopplungs-Aminosäure eignet sich Glycin, andere Amino-Carbon
säuren (außer β-Alanin), Polyethylenglykol (RAPP et al. in Peptides 1988; Ed. G.
JUNG, E. BAYER, Walter deGRUYTER, Berlin 1989, Seiten 199-201) und sämtliche
Gruppen für die Peptidsynthese, die kommerziell erhältlich sind und von denen sich
nach der Synthese das Peptid wieder abspalten läßt (vgl. Katalog von NOVABIOCHEM
93).
Unter Reaktionsort (auch als Auftragungsort bezeichenbar) ist ein Reaktionsraum zu
verstehen, in dem identische Reaktionsbedingungen vorherrschen. Wichtig ist, daß der
Reaktionsort es ermöglicht, nachzuvollziehen, an welcher Stelle auf einem Träger oder
auch in einem Reaktionsgefäß welche Reaktionen stattgefunden haben.
Ein Reaktionsort kann somit ein Teil eines Zelluloseträgers oder auch ein separates
Reaktionsgefäß mit löslichen Substanzen sein. Auf dem Zelluloseträger werden pro
Reaktionsort dieselben Aminosäuren zur Reaktion gebracht.
Um den Versuch sinnvoll zu gestalten, ist die ein- oder zweidimensionale oder auch
gegebenenfalls dreidimensionale Festlegung von Stellen auf oder in dem
Trägermaterial erforderlich, um zu vermeiden, daß sich die Aminosäuren an den
entsprechenden Reaktionsorten unkontrolliert mit den Aminosäuren anderer
Reaktionsorte vermischen können.
Wenn die Reaktionsorte Reaktionsgefäße darstellen, kann die Reaktion als
Festphasen-Synthese oder als Flüssigphasen-Synthese (Lösungstechnik) ablaufen.
Die Fmoc-geschützen Aminosäuren sind von Novablochem (Schweiz) und Bachem
(Bubendorf; Schweiz) beziehbar. Ihre Herstellung ist Stand der Technik. Bei der
Synthese von Peptiden an Polystyrolharz werden die Aminosäuren in situ mit PyBOP
(Benzotriatol-1-yl-oxy-tripyrrolidinophasphoniumhexaffuorphosphat) und NMM (N-
Methyl-Morpholin) aktiviert.
Die Synthese von löslichen Peptidgemischen und Peptiden oder Peptidderivaten ist an
einem Multiplen Peptidsynthesizer (MPS) AMS 422 von ABIMED (Langenfeld)
ausführbar (H. GAUSEPOHL et al. (1992) Peptide Research 5/6: 315-320).
Für die Peptidsynthese werden als feste Träger gehärtete Zellulose (Whatman 540;
Katalog Nummer 1540917) der Firma Whatman (Maidstone, Großbritannien) und
Polystyrolharz Tenta Gel SRAM (Kapazität 0,25 meq/g) der Firma Rapp Polymere
(Tübingen, Deutschland) benutzt.
Die Synthese von Peptiden an Zellulose wird von Frank und Döring beschreiben. (R.
FRANK (1992) Tetrahedron 48: 9217-9232 und R. FRANK and R. DÖRING (1988)
Tetrahedron 44: 6031-6040)
Die Zellulosemembran wird chemisch modifiziert, um geeignete Ankerfunktionen für
die nachfolgende Peptidsynthese anzubringen. Diese Ankerfunktionen dienen auch
als Spacer (Distanzhalter), um die freie Zugänglichkeit der immobilisierten Peptide zu
gewährleisten. In einem ersten Schritt wird die gesamte Membran 3 Stunden mit einer
0,2 M Fmoc-β-Alanin-Lösung (aktiviert mit 0,24 M DIC und 0,4 M NMI in DMF)
inkubiert, so daß sich über eine Veresterung mit den OH-Gruppen der Zellulose eine
gleichmäßige Verteilung von β-Alanin ergibt. Nach dreimaligem Waschen mit DMF
werden die Fmoc-Schutzgruppen des veresterten β-Alanins durch Inkubation mit 20%
Piperidin in DMF (20 Minuten) abgespalten. Die Membran wird fünfmal mit DMF und
zweimal mit Methanol gewaschen und getrocknet.
In einem zweiten Schritt wird eine 0,3 M Fmoc-β-Alanin-Lösung (aktiviert mit 0,3 M
TBTU, 1 : 1 in NMP) auf definierte Punkte der Membran mit Hilfe einer ausgezogenen
Glaskapillare aufgetropft (ca. 0,5 µl pro Auftragungsort), so daß dort ein zweites β-
Alanin gekoppelt wird (15 Minuten Inkubation). Die Punkte werden vorher unter
Verwendung einer Schablone mit einem Bleistift auf der Rückseite der Membran
markiert. Auch ist dieses Verfahren mit einem Peptidsyntheserobotor (Grundgerät von
AMS 422 von Abimed) automatisierbar. Alle restlichen Aminofunktionen der Membran
werden durch Acetylierung (zweimal 3 Minuten 2% Acetanhydrid in DMF, einmal 30
Minuten 2% Acetanhydrid plus 1% DIPA in DMF) blockiert. Nach fünfmaligem
Waschen mit DMS wird die Fmoc-Schutzgruppe mit 20% Piperidin in DMF (15
Minuten) gespalten. Die freien Aminogruppen werden nun durch Färben mit 0,01%
(w/v) BPB in DMF sichtbar gemacht und erscheinen als blaue distinkte
Auftragungsorte. Die Membran wird anschließend zweimal mit Methanol gewaschen
und dann getrocknet.
Ausführlich ist die Festphasen Peptidsynthese an Zellulose beschrieben in Achim
KRAMER und Jens SCHNEIDER-MERGENER (1998) Sytheses and Screening of
Peptide Libraries on Continous Cellulose Membrane Supports, Methods in Molecular
Biology, Vol 87, Combinatorial Peptide Library Protocols pp 25-39.
Eine weitere Peptidsynthese, bei der das Peptid oder Peptidderivat über eine Anker
gruppe fixiert ist und erst am Ende der Synthese abgespalten wird, erfolgt an
Polystyrolharz (Ansatzgröße zum Beispiel 50 µmol). Als Lösungsmittel wird DMF und
DCM verwendet. Es werden stets Doppelkopplungen durchgeführt. Der
Synthesezyklus des Automaten besteht aus der Abspaltung der Fmoc-Schutzgruppe
mit 20%-igem Piperidin (zweimal 15 Minuten) und einer anschließenden sechsmaligen
Waschprozedur mit DMF, bevor die Aminosäuren gekoppelt werden (zweimal 15
Minuten). Vor der nächsten Fmoc-Abspaltung wird wiederum sechsmal mit DMF
gewaschen.
Bei der Reaktion aktiviert der Automat 200 µmol Aminosäure in 400 µl DMF durch
Zugabe von 200 µmol PyBOP in 220 µl DMF und 400 µmol NMM in 100 µl DMF.
Der N-Terminus der Peptide oder Peptidderivate wird durch Zugabe von
DMF/Acetanhydrid/DIPA im Volumenverhältnis 7 : 2 : 1 acetyliert (30 Minuten rühren).
Zur Abspaltung des Peptids oder Peptidderivates vom Harz und zur Abspaltung der
Seitenschutzgruppen wird 2 bis 3 ml 90% TFA, 5% Triisobytylsiolan, 5% Wasser und
5% Phenol eingesetzt. Nach fünfstündiger Inkubation werden die Peptide oder
Peptidderivate mit ca. 35 ml eiskaltem Äther ausgefällt. Der Niederschlag wird
abzentrifugiert, das Pellet (Sediment) mit 15 bis 20 ml eiskaltem Äther resuspendiert
und gewaschen. Das Zentrifugieren und Waschen wird fünfmal wiederholt, bevor die
Peptide oder Peptidderivate in einem möglichst geringen Volumen 5%-iger Essigsäure
gelöst werden. Anschließend werden die Peptide oder Peptidderivate
gefriergetrocknet. Die Peptide oder Peptidderivate liegen nach der Abspaltung C-
terminal als Amid vor.
BPB | Bromphenolblau |
DCM | Dichlormethan |
DIC | Diisopropyldarbodiimid |
DIPA | Diisopropylethylamin |
DMF | Dimethylformamid |
Fmoc | o-Fluorenylmethoxycarbonyl |
PyBOP | Benzotriatol-1-yl-oxy-tripyrrolidinophosphoniumhexafluorphosphat |
NMI | N-Methylimidazol |
NMM | N-Methyl-Morpholin |
NMP | N-Methylpyrrolidon |
TBTU | 2-(1H-Benzotriazol-1-yl)-1,1,3,3-Tetramethyluroniumtetrafluoroborat |
TFA | Trifluoressigsäure |
Weiterhin sind die mit dem erfindungsgemäßen Verfahren aufgefundenen Peptide
oder Peptidderivate leicht herstellbar. Derartige Peptide oder Peptidderivate können
mittels einer Technik hergestellt werden, die den Fachleuten im Bereich der
Peptidsynthese bekannt ist. Eine Zusammenfassung vieler dieser Techniken können
bei J. M. STEWART and J. D. YOUNG, San Francisco, 1969; und J. MEIERRHOFER,
Hormonal Proteins and Peptides, Vol. 2 p 46, Academic Press (New York), 1973 für
die Festphasen-Methode und E. SCHRODER and K. LUBKE, The Peptides, Vol. 1,
Academic Press (New York) 1965 für die Flüssigphasen-Methode nachgelesen
werden. Die Schritte der Synthese sind in den EP-A 0 097 031 beschrieben. Die
allgemeinen Verfahrensschritte aus den europäischen Publikationen lassen sich
analog auf die Synthese der hier beschriebenen erfindungsgemäßen Peptide oder
Peptidderivate übertragen. Weitere Literatur zu der Festphasensynthese sind: Solid
Phase Synthesis, E. ATHERTON and R. C. SHEPPARD (1989) IRL Press, LSBN 1-
85221-133-4 and Amino Acid and Peptide Synthesis, J. JONES, Oxdford Science
Publication (1992)
ISBN 0-19-855668-3.
Gegeben war ein Antigen (Lysozym aus Hühnereiweiß, hier kurz Lysozym), das von
dem monoklonalen Antikörper D1.3 gebunden wird. Dieses Modellsystem dient als
Beweis für die Praktikabilität des in dieser Anmeldung beschriebenen Verfahrens.
Das Modellsystem ist detailliert untersucht worden und eine Raumstruktur des
Komplexes ist verfügbar. (Bhat et al. (1994)) Proc. Natl. Acad. Sci. USA, Vol. 91, pp
1089-1093] Identifiziert werden sollte ein Peptid, das aus der Lysozymsequenz
abgeleitet ist und an den Antikörper D1.3 bindet. Dazu wurde ein Duotop-scan
gemäß der Erfindung mit Hilfe der Spotsynthese (trägergebundene Proteinsynthese
auf kleinstem Reaktionsort) auf Zellulose ausgeführt. Das Syntheseprinzip ist
beschrieben in Frank (1992) Tetrahedron, Vol 48, pp 9217-9323. Lysozym besitzt
129 Aminosäuren. Diese Sequenz wurde in 41 überlappende Peptide von 10
Aminosäuren Länge, die um je 3 Aminosäuren auf der Primärstruktur verschoben sind,
aufgeteilt. Der Doutop-scan enthält alle möglichen Kombinationen von je zwei dieser
41 Peptide. Die zehnmeren Peptidfragmente sind mit einem Linker aus 2
β-Alaninresten verbunden, so daß jedes Peptid des Duotop-scan aus 22 Aminosäuren
besteht. Der Scan enthält 41 × 41 = 1681 Peptide, die in einer
41 × 41 Matrix aufgebaut sind.
Der zellulosegebundene Duotop-scan wurde mit dem Antikörper D1.3 inkubiert (0,4
µg/ml, in TBS-Puffer mit pH 8,0 bei 4°C über Nacht) TBS = Tris buffered sahne. Der
peptidgebundene Antikörper wurde mit einem sekundären peroxidasemarkierten
Antikörper und einem Chemolumineszenz-Substrat nachgewiesen. Das stärkste Signal
ergab das Peptid:
Gly Thr Asp Val Gln Ala Trp Ile Arg Gly β-Ala β-Ala Asp Asn Tyr Arg Gly Tyr Ser Leu Gly Asn (siehe auch SEQ ID NO: 5)
Die beiden Peptidfragmente entsprechen genau den zwei in der Röntgenkristallstrukturanalyse des Komplexes beschriebenen Bindungsbereichen. Sie sind in der Primärstruktur des Lysozyms 90 AS voneinander getrennt, bilden aber in der dreidimensionalen Lysozymstruktur eine zusammenhängende Oberfläche. Die Dissoziationskonstante des Komplexes aus Peptid und Antikörper D1.3 wurde nach Kriguet [FRIGUET et al. (1985) J. Immunol. Meth., Vol. 77, pp 305-319) auf 27 µM bestimmt.
Gly Thr Asp Val Gln Ala Trp Ile Arg Gly β-Ala β-Ala Asp Asn Tyr Arg Gly Tyr Ser Leu Gly Asn (siehe auch SEQ ID NO: 5)
Die beiden Peptidfragmente entsprechen genau den zwei in der Röntgenkristallstrukturanalyse des Komplexes beschriebenen Bindungsbereichen. Sie sind in der Primärstruktur des Lysozyms 90 AS voneinander getrennt, bilden aber in der dreidimensionalen Lysozymstruktur eine zusammenhängende Oberfläche. Die Dissoziationskonstante des Komplexes aus Peptid und Antikörper D1.3 wurde nach Kriguet [FRIGUET et al. (1985) J. Immunol. Meth., Vol. 77, pp 305-319) auf 27 µM bestimmt.
Der Antikörper CB/RS/1 bindet das Zytokin Interieukin-10 (IL-10). Mit einem IL-10-
abgeleiteten Duotop-scan (siehe oben) wurde das CBIRS/1-bindende Peptid His Val
Asn Ser Leu Gly Glu Asn Leu Lys Thr Leu Arg Leu Arg
- Gly Gly Gly Gly Ser
- Ser Thr His Phe Pro Gly Asn Leu Pro Asn
(SEQ ID NO: 1)
identifiziert. Zum Nachweis wurde ein sekundärer peroxidasemarkierter Antikörper in Verbindung mit einem Chemolumineszenz-Substrat verwendet. Das Peptid besteht aus zwei IL-10-abgeleiteten Peptidfragmenten, die über einen Linker aus vier Glycin- und einem Serin-Rest verbunden sind. Mit einer Substitutionsanalyse, in der alt Aminosäuren nacheinander durch alle anderen L-Aminosäuren ausgetauscht wurden, ergaben sich für viele Substitutionen höhere Signalintensitäten im Vergleich zum Ausgangspeptid. Fünf dieser Substitutionen wurden für ein neues Peptid verwendet:
His Asp Asn Gln Leu Trp Glu Ala Leu Lys Gln Leu Arg Leu Arg Leu Arg
- Gly Gly Gly Gly Ser
- Ser Thr His Phe Pro Gly Asn Leu Pro Asn,
(SEQ ID NO: 2)
(die Substitutionen sind unterstrichen) Das zuvor genannte Peptid hat eine Dissoziationskonstante für den Peptid-CB/RS/1 Komplex von 6,8 µM. Dieses Peptid wurde wiederum mit Hilfe einer Substiutionsanalyse optimiert. Das daraus resultierende Peptid
His Asp Asn Gln Leu Leu Glu Thr Leu Lys Gln Abs Arg Leu Arg Asn Arg
- Arg Gly Asn Gly Ser
- Ser Thr His Phe Glu Gly Asn Leu Pro Asn,
(SEQ ID NO: 3)
hat eine Dissoziationskonstante von 200 nM. Von diesem Peptid wurden Zyklisierungen mit Hilfe von zwei Cystein-Resten, die zu einer Disulphidbrücke oxidiert wurden, getestet. Alle möglichen Verteilungen von zwei Cystein-Resten über das ganze Peptid (466 Varianten) wurden auf Zellulose synthetisiert, oxidiert und auf die Bindung zum Antikörper CB/RS/1 hin getestet. Die Dissoziationskonstante für den Komplex des besten dieser 466 Peptide
His Asp Asn Gln Leu Leu Glu Thr Cys Lys Gln Asp Arg Leu Arg Asn Arg
- Arg Gly Asn Gly Ser
- Ser Thr His Phe Glu Gly Asn Leu Pro Cys
(SEQ ID NO: 4)
mit CB/RS/1 beträgt 35 nM. Mit der gleichen halbmaximalen Konzentration inhibiert dieses Peptid auch die Wechselwirkung zwischen CB/RS/1 und IL-10.
- Gly Gly Gly Gly Ser
- Ser Thr His Phe Pro Gly Asn Leu Pro Asn
(SEQ ID NO: 1)
identifiziert. Zum Nachweis wurde ein sekundärer peroxidasemarkierter Antikörper in Verbindung mit einem Chemolumineszenz-Substrat verwendet. Das Peptid besteht aus zwei IL-10-abgeleiteten Peptidfragmenten, die über einen Linker aus vier Glycin- und einem Serin-Rest verbunden sind. Mit einer Substitutionsanalyse, in der alt Aminosäuren nacheinander durch alle anderen L-Aminosäuren ausgetauscht wurden, ergaben sich für viele Substitutionen höhere Signalintensitäten im Vergleich zum Ausgangspeptid. Fünf dieser Substitutionen wurden für ein neues Peptid verwendet:
His Asp Asn Gln Leu Trp Glu Ala Leu Lys Gln Leu Arg Leu Arg Leu Arg
- Gly Gly Gly Gly Ser
- Ser Thr His Phe Pro Gly Asn Leu Pro Asn,
(SEQ ID NO: 2)
(die Substitutionen sind unterstrichen) Das zuvor genannte Peptid hat eine Dissoziationskonstante für den Peptid-CB/RS/1 Komplex von 6,8 µM. Dieses Peptid wurde wiederum mit Hilfe einer Substiutionsanalyse optimiert. Das daraus resultierende Peptid
His Asp Asn Gln Leu Leu Glu Thr Leu Lys Gln Abs Arg Leu Arg Asn Arg
- Arg Gly Asn Gly Ser
- Ser Thr His Phe Glu Gly Asn Leu Pro Asn,
(SEQ ID NO: 3)
hat eine Dissoziationskonstante von 200 nM. Von diesem Peptid wurden Zyklisierungen mit Hilfe von zwei Cystein-Resten, die zu einer Disulphidbrücke oxidiert wurden, getestet. Alle möglichen Verteilungen von zwei Cystein-Resten über das ganze Peptid (466 Varianten) wurden auf Zellulose synthetisiert, oxidiert und auf die Bindung zum Antikörper CB/RS/1 hin getestet. Die Dissoziationskonstante für den Komplex des besten dieser 466 Peptide
His Asp Asn Gln Leu Leu Glu Thr Cys Lys Gln Asp Arg Leu Arg Asn Arg
- Arg Gly Asn Gly Ser
- Ser Thr His Phe Glu Gly Asn Leu Pro Cys
(SEQ ID NO: 4)
mit CB/RS/1 beträgt 35 nM. Mit der gleichen halbmaximalen Konzentration inhibiert dieses Peptid auch die Wechselwirkung zwischen CB/RS/1 und IL-10.
Claims (12)
1. Verfahren zur Herstellung und Identifizierung eines Polytop-Peptids,
- (a) welches über eine Antigen- oder Ligandenbindungsstelle einen Komplex mit dem korrespondierenden Antigen oder Liganden (Bindungsmolekül) bildet,
- (b) welches mindestens zwei Peptidfragmente umfaßt,
- (i) die durch einen Linker miteinander verbunden sind,
- (ii) die Fragmente einer Aminosäuresequenz eines Antikörpers oder eines Rezeptors (= Protein) sind,
- (iii) wobei das erste Fragment mit der Teil-Aminosäuresequenz des Proteins nach systematischem Mischungsprinzip bei gleichzeitiger Identifizierbarkeit mit dem zweiten Fragment mit derselben oder - deutlich häufiger - mit einer weiteren Teil- Aminosäuresequenz des Proteins kombiniert wird und gegebenenfalls diese beiden Fragmente nach systematischem Mischungsprinzip mit einem oder mehreren weiteren Fragmenten mit denselben oder mit mindestens einer weiteren Teil- Aminosäuresequenz des Proteins kombiniert wird,
- - Herstellen einen Polytop-Peptids,
wobei das erste Peptidfragment über einen Linker mit dem zweiten Peptidfragment kovalent verbunden wird und gegebenenfalls dieses erste oder zweite über einen weiteren Linker mit mindestens einem weiteren Peptidfragment kovalent verbunden wird, - - Zugeben des Bindungsmoleküls und abwaschen des nicht im Komplex gebundenen Bindungsmoleküls,
- - Identifizieren der Komplexe aus Polytop-Peptid und Bindungsmolekül.
2. Verfahren nach Anspruch 1, wobei der Linker sich oligomerisch synthetisieren
läßt
3. Verfahren nach Anspruch 2, wobei der Linker eine Amid-, Ester-, Ether-,
Harnstoff-, -C-C- und Sulfonamidbindungen umfaßt.
4. Verfahren nach Anspruch 3, wobei der Linker aus Bausteinen, bevorzugt
Aminosäuren, Peptoiden, PNAs, Ribose Phosphat Elementen, Ethylenglykolen
und Acrylsäuren besteht.
5. Verfahren nach Anspruch 4, wobei der Linker von einer Länger von 0 bis 16
Aminosäuren ist.
6. Verfahren nach einem der vorherigen Ansprüche, wobei die Polytop-Peptide
mindestens einen weiteren Baustein außerhalb des N-terminalen und I oder C-
terminalen Endes in Form mindestens eines weiteren Rahmenbausteins
aufweisen, wobei die um den Rahmenbaustein erweiterten Polytop-Peptide im
wesentlichen die Funktion aufweisen, die das Polytop-Peptid ohne
Rahmenbaustein besitzt.
7. Verfahren nach einem der vorherigen Ansprüche, wobei die Polytop-Peptide je
nach Ende Amino-Schutzgruppen oder Carboxyl-Schutzgruppen aufweisen,
wobei die um die Schutzgruppe erweiterten Polytop-Peptide im wesentlichen
die Funktion aufweisen, die das Polytop-Peptide ohne Schutzgruppe besitzt.
8. Verfahren nach einem der vorherigen Ansprüche, wobei die Aminosäuren
natürliche oder künstliche Aminosäuren sind.
9. Optimierungsverfahren bei dem ein Polytop-Peptid, welches nach einem
Verfahren nach einem der vorherigen Ansprüche hergestellt worden ist, in
einem weiteren Verfahren optimiert wird,
indem nach den Schritten des Verfahrens nach den vorherigen Ansprüchen
- (a) mindestens eine Aminosäure in der Sequenz des Polytop-Peptids durch eine natürliche oder nicht natürliche Aminosäuren substituiert wird,
- (b) nach jeder Substituierung das modifizierte Polytop-Peptid auf die Bindungsfunktion gegenüber dem Bindungsmolekül ausgetestet und die am besten bindenden, modifizierten Polytop-Peptide selektioniert werden,
- (c) die am besten bindenden, modifizierten Polytop-Peptide gegebenenfalls mindestens einen weiteren Zyklus gemäß der Punkte (a) und (b) des Optimierungsverfahrens durchlaufen.
10. Satz an Versuchsreagenzien zur Herstellung und Identifizierung von einem
Polytop-Peptid,
- (a) welches über eine Antigen- oder Ligandenbindungsstelle einen Komplex mit dem korrespondierenden Bindungsmolekül bildet,
- (b) welches mindestens zwei Peptidfragmente umfaßt,
- a) die durch einen Linker miteinander verbunden sind,
- b) die Fragmente einer Aminosäuresequenz eines Proteins sind,
- c) wobei das erste Fragment mit der Teil-Aminosäuresequenz des
Proteins nach systematischem Mischungsprinzip bei
gleichzeitiger ldentifizierbarkeit mit dem zweiten Fragment mit
derselben oder mit einer weiteren Teil-Aminosäuresequenz des
Proteins kombiniert ist und
gegebenenfalls diese beiden Fragmente nach systematischem Mischungsprinzip mit einem oder mehreren weiteren Fragmenten mit denselben oder mit mindestens einer weiteren Teil- Aminosäuresequenz des proteins kombiniert ist,
umfassend die folgenden Teile:
- 1. einen Träger mit Reaktionsorten, in denen Polytop-Peptide synthetisiert und/oder gespeichert werden können,
- 2. verschiedene Polytop-Peptide an oder in den Reaktionsorten des Trägers,
- 3. Identifizeriungsreagenzien für die Komplexe.
11. Verwendung von einem Satz an Versuchsreagenzien nach Anspruch 10 zur
Optimierung von Polytop-Peptide, welche nach dem Verfahren nach einem der
vorherigen Ansprüche 1 bis 9 hergestellt und identifiziert worden sind,
wobei auf einem Träger in Reaktionsorten die modifizierten Polytop-Peptide
mit substituierten Aminosäuren angeordnet sind.
Priority Applications (1)
Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
---|---|---|---|
DE1998131429 DE19831429A1 (de) | 1998-07-07 | 1998-07-07 | Verfahren zur Identifizierung und chemisch-synthetischen Nachahmung von Bindungsstellen auf Proteinen |
Applications Claiming Priority (1)
Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
---|---|---|---|
DE1998131429 DE19831429A1 (de) | 1998-07-07 | 1998-07-07 | Verfahren zur Identifizierung und chemisch-synthetischen Nachahmung von Bindungsstellen auf Proteinen |
Publications (1)
Publication Number | Publication Date |
---|---|
DE19831429A1 true DE19831429A1 (de) | 2000-04-27 |
Family
ID=7873938
Family Applications (1)
Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
---|---|---|---|
DE1998131429 Withdrawn DE19831429A1 (de) | 1998-07-07 | 1998-07-07 | Verfahren zur Identifizierung und chemisch-synthetischen Nachahmung von Bindungsstellen auf Proteinen |
Country Status (1)
Country | Link |
---|---|
DE (1) | DE19831429A1 (de) |
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