DE69126664T2

DE69126664T2 - Bestimmung von analyten in biologischen flüssigkeiten in gegenwart von störenden substanzen

Info

Publication number: DE69126664T2
Application number: DE69126664T
Authority: DE
Inventors: Ronald J. West Bridgewater Ma 02379 Byrnes; James F. Chelmsford Ma 01824 Ollington; Donald E. Nashua Nh 03060 Pogorzelski
Original assignee: Genzyme Corp
Current assignee: Genzyme Corp
Priority date: 1990-04-27
Filing date: 1991-04-25
Publication date: 1997-10-30
Anticipated expiration: 2011-04-26
Also published as: US5403745A; EP0527212A1; CA2081559A1; WO1991017441A1; AU659797B2; JPH05506930A; AU7762491A; JP3040162B2; CA2081559C; EP0527212B1; DE69126664D1; US6010866A

Description

Die Erfindung betrifft die Bestimmung von Analyten in Gegenwart von Substanzen, die den Nachweis dieser Analyten stören. Die Erfindung betrifft ferner die Verwendung von Vorrichtungen zur Durchführung einer solchen Bestimmung. Die Erfindung eignet sich zum Nachweis - in einer flüssigen biologischen Probe - von Analyten bestimmter Lipoproteinklassen, bestimmter Isoenzyme der Kreatinkinase, der Lactatdehydrogenase, der Amylase und der alkalischen oder sauren Phosphatase wie auch bestimmter Immunglobuline und anderer Analyten.

A. Allgemeines

Die moderne medizinische Praxis verlangt gewöhnlich routinemäßig klinische Tests von Seren und Urin auf biologische Analytenwiecholesterin, Enzyme (bspw. Kreatinkinase, Latactdehydrogenase, saure Phosphatase, alkalische Phosphatase, Amylase usw.), Immunglobuline sowie andere Substanzen.
Neben den Routinetests erfolgen insbesondere auch spezielle diagnostische Tests, welche in der Regel zeitaufwendiger sind. So wird zum Beispiel der Nachweis bestimmer Isoenzyme der sauren Phosphatase klinisch verwandt als indikator für Prostatakrebs und verschiedene Leukämien. Die in einer Blut- oder Serumprobe nachgewiesenen Spiegel bestimmter Isoenzyme der alkalischen Phosphatase sind Indikatoren für die metabolische Aktivität von Knochen und der Leber. Der Spiegel der Bauchspeicheldrüsen-spezifischen Amylase ist ein Indikator für eine Pankreatitis. Die Serumspiegel der MB-Isoenzyme der Kreatinkinase (CKMB) sowie die Spiegel der Isoenzyme der Lactatdehydrogenase sind Indikatoren für einen Myocardinfarkt (Noel, S. et al. "Enyzmes" in Clinical Chemistry (Kaplan, L. und Pesce, A., Hsrg. The C.V. Mosby Company, St. Louis, MI) S.454-483, 1989). Ähnlich dient der Nachweis Cholesterin spezifischer Lipoproteinklassen zur Bestimmung des Risikos einer koronaren Herzerkrankung (Russel et al., "Lipids" in Clinical Chemistry, S. 968-1004, 1989). Diese spezielleren Tests richten sich oft gegen eine bestimmte Klasse von Analyten, die bereits Gegenstand eines Routinetests waren.
Die Effizienz der Analyse eines Analyten in einer flüssigen biologischen Probe kann durch Substanzen verringert werden, die die Analyse stören (Kaplan, L. und Pesce, A., "Interferences in Chemical Analysis" in Clinical Chemistry, S.808-819, 1989). Stoffe wie Hämoglobin oder Bilirubin mit einer starken sichtbaren Absorption können z.B. die spektrophotometrische Analyse des Analyten stören (Kaplan and Pesce, id.).
Bei klinischen Untersuchungen - sowohl bei Routinetests als auch bei spezielleren Untersuchungen - ist es erforderlich, dass die sorgfältig entwickelten Qualitätssicherungs- und - Kontrollverfahren streng eingehalten werden, was die Genauigkeit sicherstellt und Schwankungen der Testergebnisse kleinstmöglich hält. Bedenken zur Stabilität und Genauigkeit der Testergebnisse haben sogar dazu geführt, dass man den klinischen Labors weitere Vorschriften auferlegt hat seitens der Health Care Financing Administration des U.S. Department of Health and Human Services - 53 Federal Register 29590-29632 (Freitag, 5. August, 1988) (vorgeschlagene Änderungen zu 42 CFR Teil 74 ff.); 55 Federal Register 9538-9610 (Mittwoch, 14. März 1990) (überarbeitete Fassung der Laborbestimmungen, endgültige Vorschrift mit Antrag auf Anmerkungen). Durch diese neuen Vorschriften werden den klinischen Untersuchungslabors zusätzliche Lasten auferlegt. Deshalb benötigt man in den Labors Testverfahren, mit denen sich leicht überprüfen läßt, ob sie den Qualitätskontrollnormen entsprechen. Die spezielleren Tests (im Gegensatz zu den Routinetests) können leicht überprüft werden, aber die von Natur aus anspruchsvolle Beschaffenheit dieser Tests erfordert, dass der Laborant einen Satz Testprotokolle beherrscht, die sich vollständig von denen der Routinetests unterscheiden. Dies läuft darauf hinaus, dass die Qualitätskontrolle solcher spezieller Tests gewöhnlich umfangreichere Laborschritte und eine Schulungen des Laborpersonals erfordert.
Eine weitere Erschwerung ist die Auswertung der Testergebnisse, selbst wenn man annimmt, dass zwischen den einzelnen Testläufen eine gute Qualitätskontrolle vorliegt. wegen der wichtigen diagnostischen Informationen, die beispielsweise aus den Cholesterinergebnissen gewonnen werden, und weil man die werteschwankungen innerhalb eines Labors beseitigen will, wurden auf Grund von Bevölkerungsstudien einheitliche Cholesteringrenzwerte eingeführt. Zudem wurde ein nationales Referenzsystem für Cholesterin entwickelt, so dass nun die Cholesterinmessungen standardisiert sind und man Werte auf das Referenzsystem zurückführen kann. Nachdem es kein anerkanntes nationales Referenzsystem für Triglyceride, Lipoproteine und Apolipoproteine gibt, muss noch viel getan werden, damit innerhalb der Labors die Testwertschwankungen bei den Lipiden nicht mehr auftreten. Zur Zeit dürfen diese Tests und andere speziellere Test für Cholesterin nicht direkt auf das nationale Cholesterin-Referenzsytem bezogen werden.
Vor diesem Hintergrund wird im übrigen Teil dieses Abschnitts zum Stand der Technik die Cholesterinbestimmung als Beispiel des Stands der Technik zur Bestimmung eines Analyten in einer biologischen Flüssigkeit beschrieben. Der Stand der Technik beschreibt kein Nachweissystem für Cholesterin bestimmter Lipoproteinklassen, das gleichzeitig (i) epidermiologisch leicht auszuwerten ist; (ii) leicht, schnell und kostengünstig durchgeführt werden kann, und (iii) universell in allen Routinetestsystemen der klinischen Chemie anwendbar ist. Es gibt bislang kein Analyseverfahren für bestimmte Klassen von Analyten, die in den oben beschriebenen Routinetests eingesetzt werden können und diese zwei Kriterien erfüllen.

B. Cholesterin

Biochemischer Hintergrund

Triglyceride und Cholesterin werden im Blut von Lipoproteinteilchen transportiert. Anomalien dieser Lipoproteine, die entweder vererbt, umweltbedingt oder eine Kombination aus beidem sind, führen zu vielfältigen Erkrankungen, einschließlich der Prädisposition für ein vorzeitiges Koronarleiden (CHD) und Atherosklerose (N.I.H. Publikationsnummer 88-2925, 1988; und Schäfer und Levy, The New England Journal of Medicine 312: 1300-1310, 1985). In den letzten 30 Jahren wurden die zugrundeliegenden zellulären und genetischen Mechanismen vieler Erkrankungen intensiv und auf elegante Weise untersucht (Brown und Goldstein, Science 232: 34-47, 1986, und Lusis, J. Lipid Research 29: 397-428, 1988).
Es gibt viele Übersichtsartikel, die die Chemie, die Biosynthese&sub1; die Funktion, den Metabolismus, die Zellbiologie und die Molekulargenetik der Lipoproteinteilchen beschreiben; siehe Segrest, Jere P., und Albers, John J., Hrsg., 128 Methods in Enzymology (1986) und Albers, John J., und Segrest, Jere P., Hrsg., 129 Methods in Enzymology (1986).
Die Lipoproteinteilchen werden hinsichtlich ihrer Dichte, ihrer Zusammensetzung und ihrer elektrophoretische Mobilität in folgende vier Hauptklassen eingeteilt: "Chylomicrons", "Very low density lipoproteins (VLDL)", "Low density lipoproteins (LDL)" und "High density lipoproteins (HDL)". LDL- und HDL-Teilchen können aufgrund ihrer Dichte weiter unterteilt werden. Die Lipoproteinteilchen setzen sich zusammen aus: Triglyceriden, Cholesterin, Fettsäureestern von Cholesterin, Phospholipid und Protein. Die unterschiedlichen Verhältnisse von Protein zu Lipid in den verschiedenen Lipoproteinklassen führen zu physikalischen Unterschieden, die man sich bei der Fraktionierung der Teilchen durch eine Dichtegradienten-Zentrifugation zunutze macht.
Die als Apolipoproteine bekannten Proteinbestandteile sind für zahlreiche Zellfunktionen verantwortlich. Es wurde gezeigt, dass hohe LDL-Cholesterinspiegel und niedrige HDL- Cholesterinspiegel Risikofaktoren für CHD sind. Es werden deshalb verstärkt klinische Routineuntersuchungen des Cholesteringehalts der Hauptlipoproteinklassen durchgeführt. Es gibt eine große Sammlung statistischer Daten mit den normalen Bereichen dieser Klassen, erhältlich und standardisiert von den "Centers for Disease Control" (McNamara and Schäfer, Clinical Chimica Acta 166: 1-8, 1987).

Cholesterinbestimmung

Im klinischen Labor werden folgende Routineuntersuchungen zur Bestimmung der Lipid- und Cholesterinprofile in Plasmaoder Serumproben durchgeführt: (i) Bestimmung von Triglyceriden, wobei Enzymlipase(n) und Enzyme verwendet werden, die an ein Farbindikatorsystem gekoppelt sind, (ii) enzymatische Bestimmung des Gesamtcholesteringehalts, wobei Cholesterinesterase, Cholesterinoxidase und anderen Enzyme und Reagenzien verwendet werden, die die Cholesterinoxidation in eine nachweisbare Farbeveränderung umwandeln, und (iii) enzymatische Bestimmung des HDL-Cholesterins wie oben in (ii) beschrieben aus dem Überstand einer Probe nach der selektiven Ausfällung der VLDL- und LDL-Fraktionen durch ein Gemisch aus Polyanionen, z.B. sulfatierten Polysacchariden oder Wolframatphosphat und divalenten Kationen (Burstein et. al., J. Lipid Research 11: 583, 1970; und Mulder et. al., Clinical Chimica Acta 143: 29-35, 1987). Die VLDL- und LDL-Cholesterinwerte (VLDL.C, LDL.C) werden indirekt mit Hilfe der Friedewald- Gleichung bestimmt (Friedewald et. al., Clinical Chemistry 18: 499-502, 1972):
Gesamtcholesterin = HDL.C + VLDL.C. + LDL.C
LDL.C = Gesamt.C - (VLDL.C + HDL.C)
LDL.C = Gesamt.C - (Triglyceride/5 + HDL.C)
Die Gleichung setzt voraus, dass (i) keine Cyklomicrone - beispielsweise in der Blutprobe eines nüchternen Patienten - vorkommen und (ii) ein konstantes Verhältnis von Cholesterin zu Triglyceriden vorliegt. Es ist bekannt, dass dies unter hypertriglyceridemischen Bedingungen nicht zutrifft (Cohn et. al., Clinical Chemistry 34: 2456-2459, 1988; und Rao et. al., Clinical Chemistry 34: 2532-2534, 1988).
Die oben beschriebenen Analyseverfahren haben deshalb mehrere Nachteile: (i) VLDL.C und LDL.C werden nicht direkt gemessen, sondern durch eine Formel ermittelt; (ii) es ist bekannt, dass die Friedewald-Formel unter klinisch relevanten Bedingungen ungenau ist, z.B. bei erhöhtem Triglyceridspiegel 0400 mg/100 ml) (Cohn et. al., Clinical Chemistry 34: 2456- 2459, 1988; und Rao et. al., Clinical Chemistry 34: 2532-2534, 1988); (iii) die HDLC-Bestimmung beruht auf der selektiven Ausfällung von VLDL- und LDL-Teilchen durch ein Polyanion oder Wolframatophosphat und divalente Kationen und einer anschließenden Bestimmung des Gesamtcholesterins in den getrennten Überständen. Allgemein fehlt für die Cholesterinbestimmung bestimmter Lipoproteinklassen ein genormtes Referenzsystem.
Mulder et. al. (Clinical Chimica Acta 143: 29-35, 1987) beschreiben die direkte Messung von Cholesterin in gelösten LDL-Niederschlägen, jedoch werden sie nicht in Routineuntersuchungen durchgeführt.
In jüngster Zeit verwendet man bei Versuchen zur Trennung und Quantifizierung der Lipoproteinklassen Antikörper. Diese sind entweder polydonal oder monoklonal und gegen Apolipoproteine gerichtet, die für bestimmte, klinisch relevante Lipoproteinteilchen spezifisch sind (Tikkanen et. al., J. Lipid Research 24: 1494-1498, 1983; und Ordovas et. al. J. Lipid Research 28: 1216-1224, 1987).
In den Forschungslabors werden vielfältige immunologische Analyseverfahren zur Quantifizierung von Lipoproteinen eingesetzt, umfassend radiale Immundiffusion, Radioimmuntests und Elektroimmuntests, wobei diese Verfahren zu aufwendig sind für den Einsatz in einem klinischen Diagnosetestaufbau, wobei eine große Anzahl Proben rasch behandelt werden müssen. Dieses Problem wird angegangen durch die Verwendung eines Enzym-gekoppelten Immunoabsorbtionstests (ELISA: enzyme-linked immunoabsorbant assay), und in diesem Bereich wird heftig geforscht (Ordovas et. al., J. Lipid Research 28: 1216-1224 1987).
Einige dieser immunologischen Verfahren, einschließlich der ELISA, leiden unter dem Problem, dass sie ein Epitop quantifizieren, das in bestimmten Lipoproteinklassen auftritt, nicht aber die Cholesterinspiegel messen. Dies bedeutet, dass bei einem immunologischen Verfahren eine sehr große Anzahl Proben analysiert werden muss, damit eine Korrelation zu den Cholesterinwerten (die enzymatisch gemessen wurden) hergestellt werden kann und die epidermologisch auswertbar sind. Die auf einem ELISA beruhenden Tests haben somit eine lange Vorlaufzeit bis sie von der klinisch-diagnostischen Industrie angenommen werden.
Verfahren, bei denen immobilisierte Antikörper verwendet werden zur Messung des Gehalts einer Substanz in einer biologischen Flüssigkeit sind bekannt. Longenecker (US. Patent 4302536, 1981) beschreibt die Bestimmung von antigenenmater ialien in biologischen Flüssigkeiten und in Zellen durch einen kolorimetrischen Immuntest mit einem Addukt aus einem Antikörper und einem Chrom-Protein. Das Patent EP-327918 von Onishi und Ito (1989) beschreibt einen Immuntest, wobei die homogene kompetitive Reaktion zwischen einem ausgewählten markierten Stoff und einem spezifischen Bindemittel eingesetzt wird. Das U.S. Patent 4657853 von Freytag und Ishikawa (1987) beschreibt einen hochempfindlichen Immuntest, wobei ein polymeres Enzym-Antikörper-Konjugat verwendet wird. Das japanische Patent 59226864 von Nippon (1985) beschreibt einen Immuntest, bei dem der Gehalt von "Transforming growth factor (TGF)" in einer flüssigen Probe mit einem immobilisierten TGF-Antikörper und einem Enzym-markierten-TGF-Antikörper nachgewiesen wird. Das U.S. Patent 4353982 von Gomez und Wicks (1982) beschreibt einen Immuntest zum Nachweis von Kreatinkinase in Blutserum mit Jod¹²&sup5;-markierten Antikörpern, wobei Immunokomplexgemische ausgefällt werden.
Die selektive Immunopräzipitation bestimmter Lipoproteinklassen wurde von verschiedenen Gruppen untersucht. Die Quantifizierung des Cholesterins erfolgt dann aus der in der Lösung verbleibenden Lipoproteinklasse. Heuck et. al. beschreiben den Gebrauch von Apob-Antikörpern zum Ausfällen von LDL und VLDL und die anschließende Messung des Cholesterinspiegels der im Überstand zurückbleibenden HDLs. Es wurden zum Ausfällen der HDLs und VLDLs auch ApoAI- und Apoc-Antikörper verwendet und der Cholesterinspiegel der LDLs dann im Überstand bestimmt (Heuck et. al. EP-A-0129696 und Clinical Chemistry 31: 252-258, 1985). Mit dem Verfahren von Hueck et. al. sind zahlreiche Probleme verbunden. Entsprechend der Druckschrift werden beispielsweise je nach Lipidspiegel der Probe verschiedene Behandlungen benötigt. Bei einem klinischen Aufbau ist es jedoch unpraktisch, für jede Probe mit einem möglicherweise hohen Cholesterinspiegel feststellen zu müssen, ob eine Vorbehandlung notwendig ist. Zudem können die Enzyme, die zur Vorbehandlung verwendet werden, den enzymatischen Cholesterintest negativ beeinflussen. Weiterhin umfasst das Verfahren von Hueck et. al. einen zusätzlichen Schritt, in dem für die Berechnung des Verdünnungsfaktors Lithiumchlorid zugegeben wird, wenn die nicht-umgesetzten Stoffe durch eine Säulenchromatographie erhalten werden. Dies macht den Versuch teurer und den Test ineffizient.
Das Patent EP-A-0361468 von Adachi et. al. beschreibt ein Kit sowie ein Verfahren, wobei denaturierte Lipoproteine in einem einzigen Versuchsschritt nachgewiesen werden. Bei diesem Verfahren müssen in einem Röhrchen, in das die Blutprobe gegeben wird, die Apolipoproteine A1 und B-100 mit einem Affinitäts-Gel gebunden werden. Dann wird ein Cholesterin-färbendes Mittel zugegeben und die Färbung des gesamten immunologisch nicht-umgesetzten Materials gemessen. Nach Adachi et. al. erfolgt keine physikalische Trennung des nicht-umgesetzten Blutmatenals.
In beiden Verfahren, Adachi et. al. und Hueck et. al., wird zur Analyse von Cholesterin eine einzige Kammer verwendet. Problematisch ist, dass die immunologisch nicht umgesetzten Materialien nicht für eine weitere Analyse aufbewahrt werden bzw. umgesetzt werden können und dass wegen Verunreinigungen mit Störsubstanzen, die beim Nachweis der nicht-umgesetzten Materialien im gleichen Gefäß zugegen sind, ungenaue Ergebnisse erhalten werden.
Kerscher et. al. beschreiben die Verwendung von HDL-Antikörpern zum Ausfällen von HDLs und VLDLs. Danach wird zentrifugiert, der Niederschlag abgetrennt und der Cholesteringehalt oder ein anderer Bestandteil der LDLs im Überstand bestimmt (Kerscher et. al., U.S. Patent 4 746 605, 1988; DB Patent P 32 15 310, 1983; Kerscher et. al., Clinical Biochemistry 18: 118-125, 1985). Für die Immunopräzipitation der Lipoproteine verwenden sie Antikörper, sowohl gegen Apoproteine als auch Gesamt-Lipoprotein, einschließlich immobilisierteantikörper. Es folgt die Bestimmung des Cholesteringehalts der in der Lösung zurückbleibenden Lipoproteinklasse (Ziegenhorn et. al., Kanadisches Patent 1 211 707, 1986). Diese Druckschrift beschreibt jedoch keine bestimmte Struktur oder Vorrichtung, auf der die Antikörper immobilisiert sind.
Ein Aspekt der Erfindung betrifft ein Verfahren zum Messen der Menge eines Analyten in einer Zielklasse biologischer Moleküle in einer biologischen Flüssigkeit in Gegenwart einer Störsubstanz aus einer anderen verwandten Klasse, umfassend:
(i) das Beschaffen einer wegwerfbaren Reaktionseinrichtung mit einer Reaktionskammer und einer Sammelkammer, wobei die Reaktionskammer stabilisierte Antikörper enthält, geeignet zum Binden jeglicher Störsubstanz in der biologischen Flüssigkeit;
(ii) das Zugeben einer Probe der biologischen Flüssigkeit in die Reaktionskammer der Einrichtung, damit sie mit den stabilisierten Antikörpern umgesetzt wird und eine selektive Immunoreaktion der Störsubstanzen mit den Antikörpern bewirkt wird;
(iii) das Veranlassen, das die nicht-umgesetzten Materialien, einschließlich des Analyten, aus der Reaktionskammer durch eine Filtereinrichtung in die Sammelkammer überführt werden, wobei die umgesetzte Störsubstanz in der Reaktionskammer verbleibt; und
(iv) das Durchführen eines klinischen Tests für den Analyten mit den nicht-umgesetzten Materialien, die den Analyten enthalten.
Das Filter kann in einer Öffnung der Reaktionskammer oder als externe, aber verbundene Anordnung angebracht sein.
Das Überführen der nicht-umgesetzten Materialien aus der Reaktionskammer in die Sammelkammer kann den Schritt umfassen: Anlegen von Druck an die Reaktionskammer.
Das Überführen der nicht-umgesetzten Materialien aus der Reaktionskammer in die Sammelkammer kann den Schritt umfassen: Anlegen einer Zentrifugalkraft an die Reaktionskammer.
Das erfindungsgemäße Verfahren kann zudem umfassen, das Vorabbestimmen der Konzentrationsmenge an stabilisierten Antikörpern, die erforderlich ist, damit die Störsubstanzen in den zu erwartenden biologischen Flüssigkeiten, die das Wirkvolumen der Reaktionskammer ausfüllen, mit ihnen immunologisch umgesetzt und so entfernt werden.
Vorzugsweise sind die stabilisierten Antikörper immobilisiert; die Antikörper können auf einem unlöslichen Trager immobilisiert sein oder auf einem löslichen Träger mit hohem Molekulargewicht.
Die Antikörper können durch Gefriertrocknen stabilisiert sein.
Es können folgende Kombinationen bei verschiedenen Anwendungen des erfindungsgemäßen Verfahrens verwendet werden:
der Analyt ist Cholesterin einer ausgewählten Lipoproteinklasse und die Störsubstanz ist Cholesterin einer anderen Lipoproteinklasse;
der Analyt ist ein ausgewähltes Immunglobulin und die Störsubstanz ist ein anderes Immunglobulin;
der Analyt ist ein ausgewähltes Isoenzym eines Enzyms und die Störsubstanz ist ein anderes Isoenzym des Enzyms;
der Analyt ist ein ausgewähltes Isoenzym, ausgewählt aus Milchsäuredehydrogenase, Kreatinkinase, Amylase, alkalische Phosphatase und saure Phosphatase; und
die Störsubstanz ist ausgewählt aus Bilirubin und Hämoglobin.
Ein weiterer Aspekt der Erfindung betrifft eine Einmal- Reaktionseinrichtung zum Nachweis eines Analyten in einer biologischen Flüssigkeit in Gegenwart einer Störsubstanz, die den Nachweis des Analyten stört, wobei die Vorrichtung umfasst:
(a) eine Reaktionskammer, in die die biologische Flüssigkeit gegeben werden kann;
(b) stabilisierte Antikörper gegen die Störsubstanz, wobei sich derartige Antikörper innerhalb der Reaktionskammer befinden;
(c) eine Sammelkammer, die mit der Reaktionskammer verbunden ist und das nicht-umgesetzte Material einschließlich den Analyten aufnimmt; und
(d) eine Filtervorrichtung durch die die nicht-umgesetzten Materialien einschließlich des Analyten auf dem Weg von der Reaktionskammer zur Sammelkammer hindurchgehen.
Die Filtervorrichtung kann eine Filteranordnung umfassen, die austauschbar an die Reaktionskammer angebracht ist.
Die Reaktionskammer kann zudem eine erste und eine zweite Öffnung umfassen, wobei die biologische Flüssigkeit durch die erste Öffnung zgegeben wird und die Filtervorrichtung mit der zweiten Öffnung verbunden ist; und
die Reaktionsvorrichtung kann eine Differenzialdruck- Vorrichtungen umfassen in Fließverbindung mit der ersten Öffnung zum Anbringen von positiven und negativen Druckdifferenzialen an die Reaktionskammer.
Die Konzentration der stabilisierten Antikörper wird am besten vorabbestimmt, so dass die Störsubstanzen in den zu erwartenden biologischen Flüssigkeiten, die das Wirkvolumen der Reaktionskammer ausfüllen, mit ihnen immunologisch umgesetzt und so entfernt werden.
Eine Ausführungsform der hier offenbarten Erfindung betrifft ein Verfahren zum Nachweis eines Analyten in einer biologischen Flüssigkeit in Gegenwart einer Substanz, die den Nachweis des Analyten stört. Bei dieser Ausführungsform werden Antikörpern verwendet zum selektiven Immunopräzipitieren mindestens eines Analyten oder einer Störsubstanz. Anschließend wird der Analyt in mindestens einer der immunologisch umgesetzten oder nicht-umgesetzten Materialien nachgewiesen. Eine weitere erfindungsgemäße Ausführungsform betrifft eine wegwerfbare Reaktionsvorrichtung zum Durchführen des Verfahrens.
Die Erfindung dient dem Nachweis einer großen Vielfalt biologischer Analyten, umfassend - aber nicht beschränkt auf - Cholesterin einer ausgewählten Lipoproteinklasse in Gegenwart von Cholesterin anderer Klassen, ausgewählte Isoenzyme von Kreatinkinase, Milchsäuredehydrogenase, Amylase, alkalische oder saure Phosphatase in Gegenwart von anderen Isoenzymen, und ausgewählte Immunglobuline in Gegenwart von anderen Immunglobulinen.
Es werden nun die vorstehenden Merkmale der Erfindung an Beispielen und mit Bezug auf die anliegenden Zeichnungen beschrieben. Es zeigt:
Figur 1 eine schematische Darstellung der Stufen-Dichtegradienten-Ultrazentrifugation zur Auftrennung der Lipoproteine, die als Antigene verwendet werden für die Gewinnung der Antiseren in Beispiel 1;
Figur 2 vergleichend die Cholesterinwerte im Überstand von 19 Humanplasma-Proben, wenn ermittelt mit dem Dextransulfat- bzw. dem Anti-NL-LDL-Serumprazipitationsverfahren nach Beispiel 1;
Figur 3 eine Kurve, welche die Übereinstimmungs-Genauigkeit zwischen den einzelnen Immunoprazipitationen nach Beispiel 1 von acht Humanplasma-Proben;
Figur 4 eine Kurve, die den zeitlichen Verlauf, bestimmt durch Abschätzen des Cholesteringehalts im Überstand, wenn ApoB-haltige Lipoproteinteilchen aus Humanplasma mit gefriergetrocknetem Anti-ND-LDL-Serum nach Beispiel 1 präzipitiert wird;
Figur 5 eine Kurve, ähnlich der von Figur 4, wobei das Prazipitiermittel nicht-gefriergetrocknetes Antiserum nach Beispiel 1 ist;
Figur 6 eine Kurve mit dem Cholesteringehalt des Überstands gegen die ApoB-Spiegel nach Beispiel 1;
Figur 7 einen Querschnitt der Reaktionsvorrichtung der erfindungsgemäßen Ausführungsform nach Beispiel 2.
Figur 8 verschiedene feste Trägermatrices zur erfindungsgemäßen Immobilisierung der Antikörper.
Figur 9 einen Querschnitt der inneren Reaktionskammer (74) der Reaktionsvorrichtung (70) aus Figur 7.
Figur 10 einen Querschnitt der äußeren Sammelkammer (72) aus Figur 7.
Figur 11 eine perspektivische Darstellung einer weiteren Ausführungsform der erfindungsgemäßen Vorrichtung nach Beispiel 3.
Figur 12 eine Detaildarstellung der Reaktionsvorrichtung aus Figur 11.
Figur 13 verschiedene feste Trägermatrices für die erfindungsgemäße Immobilisierung der Antikörper.
Figur 14 einen Querschnitt der Sammelreaktionspipette (114) aus Figur 12.
Figur 15 einen Querschnitt der Verbindungseinrichtung (116) aus Figur 12.
Figur 16 einen Querschnitt der Reaktionsvorrichtung aus Figur 11, angeordnet in einem Betriebssystem.
Figur 17 eine voll beladenes Probenaufbearbeitungssystem, wobei mehrere Reaktionsvorrichtungs-Einheiten aus Figur 11 in einem Betriebssystem enthalten sind.
Figur 18 einen Ausschnitt einer Ausführungsform der Reaktionsvorrichtung, ähnlich der aus Figur 11, jedoch mit bestimmten Verbesserungen.
Figur 19 einen Querschnitt der Reationspipette (202) aus Figur 18.
Figur 20 eine Großdarstellung der Filtereinheit (220) aus Figur 18 mit den dazugehörigen Teilen.
Eine erfindungsgemäße Ausführungsform betrifft ein Verfahren zum Nachweis eines Analyten in einer biologischen Flüssigkeit, in Gegenwart einer Substanz, die den Nachweis des Analyten stört, durch Verwenden eines immunologischen Trennverfahrens. Es werden in der Erfindung Antikörper verwendet, die selektiv mit dem Analyten oder mit der Substanz, die den Nachweis des Analyten stört, immunologisch umgesetzt werden. Anschließend wird der Analyt nachgewiesen, indem entweder das immunologisch umgesetzte oder das nicht-umgesetzten Material untersucht wird. Eine erfindungsgemäße Ausführungsform betrifft eine Reaktionsvorrichtung mit der die Immunotrennung schnell und kostengünstig durchgeführt werden kann. Die Antikörper, die in der Immunoreaktion verwendet werden, können gefriergetrocknet sein oder können als auf einem geeigneten Träger präzipitiert sein. Es sind eine Vielzahl geeigneter Träger und Trennverfahren für diesen Zweck erhältlich. Die Antikörper können somit an die Oberfläche eines unlöslichen Trägers gebunden sein, dessen Masse, Dichte, Oberfläche oder Ladung die Trennung der Immunoreagenzien von den nicht-umgesetzten Materialien begünstigt. Solche unlöslichen Träger sind z.B. mikroporige Perlen, Latexteilchen, magnetische Teilchen, "controlled pore"-Glas, Gel-Matrices aus quervernetztem Dextran, quervernetzte Polysaccharide oder quervernetzte Acrylamide, mikroporige Filter oder Filtermembranen. Andere geeignete unlösliche Träger umfassen ein gewendeltes Band oder die Innenwand der Reaktorvorrichtung selbst. Man kann die Antikörper auch an lösliche Polymere mit hohem Molekulargewicht binden, um einen leichter ausfällbaren Immunokomplex mit dem Analyten zu bilden. Geeignete Polymerträger sind z.B. Polysaccharide, Proteine oder Polynudeotide. Durch dieses Verfahren verbessert sich auch die Kinetik der Immunotrennung. Die immunopräzipitierenden Antikörper können polydonal oder monodonal oder eine Mischung aus den jeweiligen oder beiden sein vorausgesetzt, dass sie spezifisch genug sind, nicht kreuzreaktiv sind, die Fähigkeit haben quantifizierbar über einem breiten Bereich Substratkonzentration zu absorbieren und sich von dem immunologisch umgesetzten Komplex trennen lassen.
Durch die erfindungsgemäße Reinigung eines Analyten aus einer biologischen Flüssigkeit kann die Effizienz vorhandener, derzeit klinisch eingesetzter Routinetests verbessert werden. Die Erfindung stellt auch eine systematische Vorgehensweise bereit, die Routinetests spezifischer macht. Solche spezifischen Tests können die speziellen Testverfahren ersetzten. Die Erfindung trägt im Ergebnis dazu bei, dass eine Qualitätskontrolle erfolgt, die Kosten reduziert werden und Tests für spezifische Analyten einer Analytenklasse verfügbar sind.
Die Erfindung hat gegenüber dem Stand der Technik zum Nachweis von Cholesterin mehrere Vorteile. Die erfindungsgemäßen Ausführungsformen können zusammen mit der auf herkömmlichen enzymatischen Verfahren beruhenden Cholesterinbestimmung in einer immunologisch getrennten Lipoproteinklasse verwendet werden. Da die Erfindung den Gebrauch vorhandener klinischer Routinetests erlaubt - anzuwenden auf die immunologisch aufgetrennte Lipoproteinklasse - können die Testergebnisse, gemäß der bevorzugten erfindungsgemäßen Ausführungsform, direkt auf das national Referenzsystem bezogen werden; (andere immunologische Testsysteme, die von den erfindungsgemäßen Ausführungsformen bereitgestellt werden, umfassen die Quantifizierung von Apolipoprotein, wofür es noch keine statistisch signifikanten klinischen Daten gibt, z.B. den Normbereich der Bevölkerung). Die analytischen Daten, die durch Verwenden der Erfindung erhalten werden, können somit dirket auf die bereits vorhandenen Datenbanken bezogen werden. Hierdurch ließe sich die Vorlauf zeit bis zur industriellen Verwertung der Vorteile der Immunospezifität bei der Cholesterinnachweis wesentlich verkürzen. Die Erfindung ermöglicht zudem die Gestaltung analytischer Diätpläne mit einer internen Kontrolle der individuellen Cholesterinmessungen. Eine Plasmaoder Serumprobe kann z.B. zunächst auf Gesamtcholesterin untersucht werden ohne Trennen der Lipoproteinfraktionen.
Anschließend können Teile der ursprünglichen Probe mit verschiedenen spezifischen Antikörperpräparationen immunopräzipitiert werden. Dies kann entweder in Folge oder mit verschiedenen Teilen der ursprünglichen Probe erfolgen. In beiden Fällen ist es möglich die Testdiätpläne auszuwerten, indem die Cholesterinwerte aller Fraktionen addiert werden und die Summen mit den nicht-fraktionierten Werten verglichen werden. Die Verwendung von Antikörpern in der Erfindung ermöglicht eine hochspezifische Fraktionierung der Lipoproteinklassen.
In der Praxis können bei der Erfindung Mischungen aus polyund monoklonalen Antikörper verwendet werden. Die Antikörper müssen nicht hinsichtlich Eigenschaften optimiert werden, die bei anderen immunologischen Verfahren relevant sind wie z .B. ein gutes Bindevermögen an Plastikoberflächen beim ELISA. Zudem kann der erfindungsgemäße Test in einer Vorrichtung durchgeführt werden, die stabilisierte Antikörper enthält, was eine schnelle, preiswerte und wirksame Analyse ermöglich. Der Test ist universell in allen klinischen Routinetest systemen anwendbar.
Die unten beschriebenen Ausführungsformen werden allgemein im Zusammenhang mit dem Nachweis von Cholesterin in spezifischen Lipoproteinklassen durchgeführt. Die Erfindung ist jedoch, wie unten gezeigt, gleichermaßen zum Nachweis einer großen Vielfalt anderer Analyten anzuwenden.

Herstellung des Antigens

1. "Narrow-density"-Lipoproteinfrakionen

Zur Herstellung der als Antigene verwendeten Lipoproteinfraktionen wurde vereintes Humanplasma in CPD verwendet von der "New England Medical Center" Blutbank. Das Plasma mit einer Dichte von schätzungsweise 1.006 (g/ml) wurde durch eine Stufen-Ultrazentrifugation wie folgt fraktioniert:
8 x 38 ml Plasma und 1 ml KBr bei einer Dichte von 1,006 wurden in Beckman "Quickseal"-Röhrchen gegeben und in einem Ti60-Rotor 18 bis 22 Stunden bei 4ºC und 45k Upm zentrifugiert. Nach der Zentrifugation wurden die Gefäße auf Eis gestellt und die bei 1,006 schwebende Lipoproteinfraktion wurde vom oberen Teil des Gefäßes abgeschnitten, wobei dicht entlang der unteren Grenzschicht geschnitten wurde. Die Fraktionen unter 1,006 wurden vereint und durch ein Whatman-Filter (Grad #1) filtriert. Das Volumen des Filtrats wurde bestimmt und die Dichte eingestellt auf 1.03 festes KBr (getrocknet im Vakuumofen) nach der Formel 1:
Vi = Anfangsvolumen
Df = Enddichte
Di = Anfangsdichte
v = partielles spezifisches Volumen von KBr
Die zweite Ultrazentrifugation des Plasmas (jetzt bei einer Dichte von 1.03) wurde unter den gleichen Bedingungen wie oben durchgeführt und die Gefäße, die nach der Zentrifugation wieder auf Eis gehalten wurden, wurden zum Entfernen der oberen Fraktion abgeschnitten. Die Fraktionen mit einer Dichte unter 1,03 wurden vereint, wie zuvor filtriert und auf eine Dichte von 1,05 g/ml eingestellt, entsprechend der Formel 1. Die dritte Ultrazentrifugation wurde unter den gleichen Bedingungen wie oben durchgeführt und die gesammelten Gefäße wurden so lange auf Eis gehalten, bis die obere Lipoproteinschicht abgeschnitten wurde. Diese obere Schicht wurde knapp unter der unteren Grenzschicht abgeschnitten; die Schichten mit einer Dichte über 1,05 wurden vereint. Sie enthielten die LDL-Fraktion, die als "narrow density"-LDL (ND-LDL) bezeichnet wird.
Die Fraktionen mit einer Dichte unter 1,05 wurden vereint, wie zuvor beschrieben filtriert und die Dichte mit KBr auf 1,107 eingestellt (Formel 1). Das Material wurde der Ultrazentrifugation Nummer 4 unterworfen unter folgenden Bedingungen: 4ºC, 50k Upm, 42 bis 48 Stunden in einem Ti60- Rotor. Die gesammelten Gefäße wurden wie oben beschrieben gelagert und die obere Lipoproteinfraktion wurde nahe der unteren Grenzschicht abgeschnitten.
Die Fraktionen mit einer Dichte unter 1,107 wurden vereint, futriert und die Dichte auf 1,19 (Formel 1) eingestellt; diese Fraktion wurde der Ultrazentrifugation Nummer 5 unterworfen unter den gleichen Bedingungen wie in Lauf 4. Die gesammelten Gefäße wurden nahe der unteren Grenzschicht der oberen Schicht abgeschnitten und ergaben eine Fraktion mit einer Dichte über 1,19 mit "narrow density"-HDL (ND-HDL).
Die Fraktionierung der Lipoproteinteilchen durch Stufen- Ultrazentrifugation ist schematisch in Figur 1 zusammengefasst. Die geernteten "narrow density"-Fraktionen wurden gewaschen und durch wiederholte Ultrazentrifugation wieder fraktioniert. Die ND-LDL (Fraktion mit einer Dichte über 1,05) wurde nochmals für 18 bis 22 Stunden in einem Ti60-Rotor zentrifugiert bei einer Dichte von 1,05, bei 4ºC und mit 45k Upm; die obere Fraktion wurde gesammelt, wieder zentrifugiert, gesammelt und wieder zentrifugiert. Zuletzt wurde sie geerntet und gegen PBS dialysiert. Üblicherweise wurden 20 bis 25 ml der nochmals fraktionierten ND-LDL in 3,0 L PBS für 18 Stunden bei 4ºC dialysiert. Die PBS Formel ist wie folgt:
10 x Stammlösung =
Lösung A = 80 g NaCl
2.0 g KCl
1.97 g CaCl&sub2; 6H&sub2;O
1.0 g MgCl&sub2; 6H&sub2;O
0.01 g NaN&sub3; in 1.0 l deion. H&sub2;O
Lösung B = 11.5 g Na&sub2;HPO&sub4;
2.0 g KH&sub2;PO&sub4;
0,01 g NaN&sub3; in 1.0 l deion. H&sub2;O
End-PBS-Lösung:
100 ml Lösung A + 100 ml Lösung B;
mit deionisiertem H&sub2;O auf 900 ml auffüllen;
mit 1N NaOH den pH-Wert 7.4 einstellen;
auf ein Endvolumen von 1 l auffüllen.
Die ND-HDL Fraktion (1.19 oben) wurde nochmals für 48 Stunden bei einer Dichte von 1.107, 4ºC und 50k Upm in einem Ti60- Rotor einer Ultrazentrifuge zentrifugiert; die obere Fraktion wurde gesammelt und nochmal unter den gleichen Bedingungen zentrifugiert. Zuletzt wurde die obere Fraktion gegen PBS dialysiert; gewöhnlich 10 bis 15 ml in 3.0 L PBS für 18 Stunden bei 4ºC.
Die Reinheit der dialysierten "narrow density"-Fraktionen wurde überprüft, indem ein Teil der Probe elektrophoretisch aufgetrennt wurde über ein 4 bis 22.5%iges Polyacrylamid- Gradientengel unter denaturierenden Bedingungen, wobei das im wesentlichen durch Laemmli (1970) beschriebene System verwendet wurde. Der Proteingehalt der einzelnen Fraktionen wurde durch ein Standardverfahren bestimmt, entweder durch das nach Lowry oder durch Verwenden des Biorad Reagens. Die Herstellung der "narrow density"-Lipoproteinfraktionen wie oben beschrieben ist eine Verbesserung des Verfahrens von Schumaker, V.N. und Poppionef O.L. (1986), Methods in Enzymology, Vol 128, S. 155 bis 170.
Die Ausbeute der so islolierten "narrow density"-Lipoproteinfraktionen war wie folgt: aus 266 ml Plasma wurden 31 ml ND- LDL erhalten bei 1.2 mg/ml Protein und 12 ml ND-HDL bei 2.5 mg/ml Protein.

2. Reinigung der Apoproteine

ApoB wurde aus gereinigten ND-LDLs isoliert, indem diese über ein präparatives 15%iges Polyacrylamidgel elektrophoretisch aufgetrennt wurden und die aufgetrennte Apob-Bande anschließend aus dem Gel ausgeschnitten wurde. Nach erfolgter Elektrophorese wurde das Gel mit Natriumacetat gefärbt, wodurch die Proteinbanden sichtbar wurden, beschrieben in E. Harlow und D. Lane, Hsrg., Antibodies; Alaboratorvmanual (Coldspring Harbor Press, 1988). Der Apob-haltige Gelbereich wurde mit einem Skalpell oder einer Klinge ausgeschnitten. Das Polyacrylamidgel wurde homogenisiert, indem es wiederholt durch immer engere Kanülen gezwängt wurde, entsprechend dem Verfahren, beschrieben im wesentlichen in Antibodies, ibid. ApoB kann vor der Immunisierung in homogenisiertem Acrylamid bei 4ºC gelagert werden.
ApoAI und ApoAII wurden aus etwa 10 ml gereinigtem ND-HDL durch Chromatographie über eine Sephacryl-S-200-Säule gereinigt, im wesentlichen wie beschrieben in Brewer, et al., 1986, Methods in Enzymology 128: 223-246. Der Proteingehalt der getrennten ApoAI- und ApoAII-Fraktionen wurden mit dem Bioradtest bestimmt und die Fraktionen einer Elektrophorese unterworfen über ein präparatives 15%iges Polyacrylamidgel unter denaturierenden Bedingungen. Die Proteinbanden wurden sichtbar gemacht, ausgeschnitten und für die Immunisierung wie oben beschrieben vorbereitet.

B. Immunisierung

1. Es wurde 1 ml einer 1 mg (Protein)/ml-Lösung der "narrow density"-LDL-Fraktion mit dem gleichen Volumen kompletten Freund's Adjuvants gemischt und zur intramuskulären Injektion von Ziegen verwendet. In etwa 2- bis 4-Wochen- Abständen erhielten die Ziegen "booster"-Injektionen, zunächst mit 1 mg Protein (Äquivalent) in inkompletten Freund's Adjuvants und dannh mit 0,5 mg Protein (Äquivalent) in inkompletten Freund's Adjuvants.
Zum Halten des hohen Antikörpertiters wurden alle 2 bis 3 Wochen Apoprotein B in homogenisiertem Polyacrylamid injiziert, hergestellt wie oben beschrieben. Die Injektionen enthielten etwa 0,5 mg ApoB in inkompletten Freund's Adjuvants.
2. Es wurden 0,5 ml einer 5 mg (Protein)/ml-Lösung der "narrow density"-HDL-Fraktion mit dem gleichen Volumen kompletten Freund's Adjuvants gemischt und zur primären Immunisierung der Ziegen verwendet. Der erste "boost" enthielt 0,5 ml der 5 mg/ml-Lösung in dem gleichen Volumen inkompletten Adjuvants und der zweite "boost" enthielt 50% des oben genannten Immunogenspiegels.
Die Erfindung umfasst den Gebrauch von gereinigtem ApoAI und ApoAII zur Immunisierung einzelner Ziegen und das Gewinnen des entsprechenden Antiserums.
Die Erfindung umfasst in ähnlicher Weise den Gebrauch von gereinigtem ApoCI-III als Ergänzung des "narrow density"-HDL- Immunogens.
Zudem umfasst die Erfindung den Gebrauch von gereinigtem ApoB, sowohl alleine als auch zum Ergänzen der "narrow density"-HDL, bei der Immunisierung der Ziegen durch übliche immunologische Verfahren und das Gewinnen des entsprechenden Antiserums.

C. Antiserum: Charakterisierung und Reinigung

Aus den ersten Blutproben nach den "booster" -Injektionen wur den etwa 2 bis 10 ml Serum hergestellt. Die Antiseren wurden durch einen Westembiot charakterisiert (wie unten beschrieben) gegen isoliertes VLDL, LDL, HDL und Gesamthumanplasma. Bei diesem Verfahren enthielt das Anti-"narrow density"-LDL- Serum keine Stoffe, die eine Kreuzreaktivität zu anderen Apoproteinen des gereinigten HDL zeigten. Die ND-LDL-Antiseren zeigten nur eine Kreuzreaktivität zu Apob in VLDL, LDL und Gesamtplasma.
Die Anti-"narrow density"-HDL-Seren reagierten mit ApoAI in HDL und Gesamtplasma und mit ApoC und ApoE in HDL, VLDL und Gesamtplasma. Es wurde eine kleine Menge Material mit einer Kreuzreaktivität zu ApoB entdeckt, das durch eine Immunoaffinitätschromatographie über eine ND-HDL-Sepharosesäule entfernt werden kann. Die Säule wurde wie folgt hergestellt:

i) Liganden-(HDL)-Kopplung

Es wurden 3 g gefriergetrocknetes CNBR-aktiviertes Sepharose-TM-48-(Pharmacia)-Pulver ausgewogen und in 11,0 ml 1 mM HCl in einem 50 ml Zentrifugenröhrchen resuspendiert. Das Gel wurde 15 Minuten lang mit 1 mM HCl auf einem Sinterglasfilter gewaschen (wobei zum Verringern der Tropfgeschwindigkeit ein Vakuum eingesetzt wurde; und 200 ml/g Pulver verwendet wurden). Der Ligand (HDL) wurde in einem Kopplungspuffer dialysiert (0,1 M NaHCO&sub3;, 0,5M NaCl, pH 8,3; 10 bis 20 ml in 2,0 l Puffer, über Nacht bei 4ºC) und in einem Zentrifugenröhrchen über Nacht bei 4ºC auf einem Schüttler mit dem Gel gemischt (es wurden 5 ml Kopplungspuffer/g Pulver eingesetzt).

ii) Glutaraldehyd Quervernetzung

Sepharose-HDL-Kügelchen wurden bei 2000 g für 15 Minuten zentrifugiert, wobei sich die Kügelchen absetzten. Die Kügelchen können auch gesammelt werden, indem sie auf ein Sinterglasfilter gegeben werden. Anschließend wurden die Kügelchen für eine Stunde mit 4 Volumen Lösung 2 inkubiert. Die Kügel chen wurden durch Futration oder Sedimentation gesammelt, der Überstand wurde verworfen und die Kügelchen wurden für 1 Stunde mit 4 Volumen NaHCO&sub3; und Glutaraldehyd inkubiert. Die nicht-umgesetzten Aldehydgruppen wurden durch Inkubieren mit gekoppelter Sepharose in 4 Volumen 1 M Tris-HCl blockiert (über Nacht bei 4ºC und einem pH-Wert von 7,8).
Die Sepharose wurde anschließend gesammelt und in 3 Zyklen bei verschiedenen pH-Werten gewaschen, wobei ein Zyklus wie folgt war: 0,1 M Acetatpuffer pH 4,0, 0,5 M NaCl und dann 0,1 M Tris pH 8,0, 0,5 .M NaCl. Die Sepharose wurde anschlie ßend suspendiert, mit Puffer A gekoppelt und über Nacht bei Raumtemperatur inkubiert. Anschließend wurde die Sepharose gesammelt, in Puffer A resuspendiert und bei 4ºC gelagert.
Lösungen: 1) NaHCO&sub3;, 0,25 M, pH 8,8
2) 0,015% Glutaraldehyd in Lösung 1.
3) 1 M Tris HCl, pH 7,8
4) Puffer A: 10 mM KPO&sub4; 150 mM NaCl 1 mM EDTA 0,1% NP4O
ND-HDL-IGG wurde über diese Säule affinitätsgereinigt, im wesentlichen durch das Verfahren beschrieben von McConathy, W. J. et al., (1985); Cuatrecasas, P. (1970) und Kowal, R., & Parsons, R. G. (1980).
Das Antiserum wurde weiter charakterisiert, indem die Immunoreaktivität untersucht wurde gegen Lipoproteinteuchen, die auf einem Agarosegel unter nicht-denaturierenden Bedingungen elektrophoretisch aufgetrennt worden waren mit Hilfe des "Corning Agarose Universal Electrophoresis Systems" (geschützte Make). Nach der Elektrophorese wurden 10 bis 20 ml des Antiserums (Kontroll- und Probeserum wurden getrennt getestet) in die senkrechte Gelvertiefungen gefüllt und für 18 Stunden bei der Umgebungstemperatur in einem geschlossenen feuchten Raum inkubiert. Zur Bestimmung der Spezifität der Antiserumprobe gegenüber des Kontrollantiserums wurde das Gel auf undurchsichtige Präzipitationslinien untersucht. Das Gel wurde ein- bis zweimal zur Equilibrierung in PBS getaucht, etwa 200 ml, bei Raumtemperatur und bei leichtem Schütteln. Das Gel wurde 16 bis 20 Stunden bei der Umgebungstemperatur luftgetrocknet und zum Sichtbarmachen der Proteine mit Coomassie Blau gefärbt.
Das Anti-ND-LDL-Serum zeigte nur eine Kreuzreaktivität mit dem beta-migratorischen Lipoproteinbereich. Es wurde keine Reaktivität mit dem alpha-migratorischen Bereich oder mit Albumin beobachtet.
Das Antiserum wurde entfettet und die IgG-Fraktionen wurden weiter gereinigt durch eine Kombination von Standardverfahren, einschließlich die Ammoniumsulfatpräzipitation, die Ultrazentrifugation und die Affinitätschromatographie über Protein A oder über das geeignete Immunoaffinitäts-Material (beispielsweise ND-HDL oder ND-LDL), wie oben beschrieben.
Die ND-LDL-Antiserumreinigung wurde wie folgt durch Westernblot überwacht. Die Lipoproteinteuchen wurden über eine SDS- PAGE, wie oben beschrieben, aufgetrennt und dann auf Nitrocellulose (5 & 5) elektrotransferriert unter folgenden Bedingungen: 16 bis 18 Stunden bei 40 Volt und dem Transferpuffer: 20 mM Tris pH 8,3, 150 mM Glycin, 20% Methanol. Das ND-LDL-Antiserum wurde mit dem Nitrozelluloseblatt umgesetzt und die Kreuzreaktivität durch einen Sekundär-Antikörper nachgewiesen, der an alkalische Phosphatase aus Kalbsdarm konjugiert war. Es folgte eine Inkubation mit einem Phosphatasesubstrat-Chromophorkomplex. Die Farbentwicklung wurde visuell beobachtet. Das Verfahren ist im wesentlichen beschrieben in Vogel et al., 1979 und Mason et al.,1978.
Zuletzt wurde das Anti-ND-LDL-Serum über Nacht in einem "Virtis Freezemobile 24 freeze drier" bei -55ºC bis -57ºC und 65 Millitorr gefriergetrocknet.

Beispiele

Beispiel 1

Es wurde die Immunopraziptation von Beta-Lipoproteinen in Humanplasma mit dem Anti-ND-LDL-Serum untersucht und mit dem Stand der Technik verglichen. 200 µl frisches Humanplasma wurden in konische 1,5 ml Polypropylenröhrchen gegeben, die ein Aquivalent von 50 µl Anti-ND-LDL-Serum enthielten, im wesentlichen hergestellt wie oben beschrieben. Der Inhalt wurde vorsichtig gemischt und bei Raumtemperatur 30 Minuten inkubiert. Dann wurde für 15 Minuten in einer Beckman Mikrofuge bei der Einstellung 12 zentrifugiert. Der Überstand wurde abgenommen und durch eine mit Baumwolle gestopfte Pipettenspitze filtriert.
Das Filtrat wurde mit einem "Abbott ACA 200 chemistry"-Analysegerät und den "Abbott A-Gent cholesterol"-Reagenzien auf Gesamtcholesterin untersucht. Die Cholesterinbestimmung sollte jedoch unabhängig vom Verfahren das gleiche Ergebnis ergeben. Fig. 2 zeigt einen Vergleich der Cholesterinwerte (mg/dl) im immunopräzpitierten Überstand (HDL) von 19 Humanplasmaproben zu den Werten, die erhalten werden, wenn Dextransulfat (50 kd Molekulargewicht) als Kontrolimittel für die Präzipitation von Beta-Lipoprotein verwendet wird, im wesentlichen eingesetzt wie beschrieben in Warnick et al., 1985. Fig. 3 zeigt die Übereinstimmungs-Genauigkeit zwischen den einzelnen Antikörper-Immunotrennungen des Verfahrens von 8 Humanplasmaproben, in zwei getrennten Ansätzen untersucht (im Duplikat) Zur Untersuchung des Zeitverlaufs der Immunotrennung einer Humanplasmaprobe wurde gereinigtes, gefriergetrocknetes Anti- ND-LDL-Serum aus einer anderen Serie verwendet. Fig. 4 zeigt die Ergebnisse des Zeitverlaufs, wobei das Äquivalent von 300 µl Antiserum für die Reaktion mit 200 µl Plasma verwendet wurden; der Wert des Kontrollüberstands von Dextransulfat betrug 58,5 mg/dl. Die Antiserumsene wurde vor dem Gefriertrocknen titriert zur Bestimmung der Wirksamkeit der Immunoprazipitation auf Humanplasma. Die Ergebnisse sind in Fig. gezeigt. Der Kontrollwert des Dextransulfats betrug für dieses Plasma 42 mg/dl.
Mit den Apoprotein-Immuntests wurde die Spezifität der Trennung von Lipoproteinteuchen zwischen dem Immunotrennungsund dem Dextransulfatverfahren verglichen. Fig. 6 zeigt die Immunopräzipitation von Lipoproteinteuchen mit dem Anti-ND- LDL-Serum, bestimmt über die Abnahme der Cholesterinwerte (wie obenbeschrieben) imüberstand (Filtrat) unddurcheinen Apoprotein-B-Immuntest nach dem Verfahren von Ordovas, et al., 1987. Bei einem Äquivalent von 350 µl Anti-ND-LDL-Serum betrug der Cholesterinwert im Überstand 32,9 mg/dl, der Kontroliwert für Dextransulfat war 30,0 mg/dl. Mit dem Immuntest wurden folgende Ergebnisse erhalten: mit 350 µl Antiserum war der Apob-Spiegel im Überstand nicht vom Hintergrundrauschen zu unterscheiden; der Dextransulfat-Überstand ergab 1,2 mg/dl ApoB.

Beispiel 2

Wahlweise zum Trennverfahren aus Beispiel 1, bei dem die umgesetzte Probe zentrifugiert, der Überstand entfernt und die Probe anschließend futriert wurde, wurde eine spezielle erfindungsgemäße Reaktionsvorrichtung verwendet, die sowohl die Immunoreaktion als auch die Trennung ermöglicht. Fig. 7 zeigt schematisch eine Ausführungsform einer solchen Vorrichtung. Die Figuren 8, 9 und 10 zeigen die einzelnen Bestandteile dieser Ausführungsform Die Vorrichtung umfasst drei Teile: (i) eine äußere Sammelkammer 72 (getrennt in Fig. gezeigt), die das Filtrat nach Herstellung der Proben aufnimmt, (ii) eine innere Reaktionskammer 74 (getrennt in Fig. 9 gezeigt), die in der äußeren Sammelkammer 72 anbracht ist (z.B. mit einer Flansch 71, die Teil der Reaktionskammer ist und auf dem Gewindevorsprung 73 der Sammelkammer 72 ruht) und die ein geeignetes Filtermaterial 78 enthält, das im Boden eingebaut ist, und (iii) einen immobilisierten Antikörperbestandteil 76, der beispielsweise mit einem Antikörper beschichtet ist oder in Form von Kügelchen oder einem gewendelten Band ist wie in Fig. 8 gezeigt, enthalten in der Reaktionskammer 74. Es können auch andere geeignete Verfahren zur Immobilisierung der Antikörper verwendet werden, wie das Beschichten der Innenfläche der Reaktionskammer 74 mit den Antikörpern. Die Reaktionskammer 74 umfasst einen Deckel 75, der mit einem Scharnier an die Flansch 71 angebracht ist, so dass man die Reaktionskammer 74 wie unten beschrieben vor der Zentrifugation leicht verschließen kann.
Die Immunotrennung mit der Vorrichtung wurde durchgeführt, indem eine Serum-, Plasma- oder Blutprobe in die Reaktionskammer 74 pipettiert wurde (Fig. 7), der Deckel 75 der Reaktionskammer 74 geschlossen wurde und die Probe mit dem immobilisierten Antikörper gemischt und inkubiert wurde, wobei die Immunoreaktion erfolgte. Zum geeigneten Zeitpunkt wurde die Vorrichtung zentrifugiert, wobei die groben Rückstände und das feste Antikörperträgermaterial im Filter zurückge halten wurden und das nicht-umgesetzte Material als Filtrat in die Sammelkammer gelangte. Nach der Zentrifugation wurde die Reaktionskammer weggeworfen und die Sammelkammer verschlossen (mit einem Schraubverschluss, der in den Gewindeansatz 73 in Fig. 10 geschraubt wird) oder es wurde das Futrat oder ein Teil davon mit einem Routinetest auf nichtumgesetzte Analyten untersucht.

Beispiel 3

Eine weitere Ausführungsform der erfindungsgemäßen Reaktionsvorrichtung ist in den Figuren 11 bis 15 als Teil 110 gezeigt. Fig. 11 zeigt eine Ankopplungsanordnung 116 der Vorrichtung 110, wobei die Reaktionspipette 114 an die Vorrichtung angebracht ist. Die Ankopplungsvorrichtung umfasst im ein Filter 118 im Boden. Die Reaktionspipette 114 enthält eine vorbereitete Mengen an immobilisierten Antikörpern, z.B. auf Kügelchen oder gewendelten Bändern (Fig. 13) oder wie beschrieben in
Fig. 8. Die Reaktionspipette 114 kann aus einem Stück sein aus Plastik oder einem anderen geeigneten Material und umfasst wie in Fig. 12 gezeigt einen oberen elastischen Ballonbereich 121, einen Reaktionsbereich 122, eine Verschlusstellung 126 und eine Öffnung 123. Durch Zusammendrücken und Loslassen des Ballonbereichs 121 können positive und negative Druckdifferentiale auf den Reaktionsbereich 122 ausgeübt werden, so dass die Flüssigkeit wahlfrei über die Öffnung 123 aufgezogen oder aus dem Reaktionsbereich 122 ausgelassen werden kann. Während hier ein elastischer Ballon als Quelle der positiven und negativen Druckdifferentiale gezeigt wird, können auch andere Quellen verwendet werden. Die Reaktionspipette 114 wird eingesetzt, indem eine Serum-, Plasma- oder Blutprobe mit Hilfe des Ballonbereichs 121 aufgezogen wird (Fig. 12 und 14). Die Ankopplungsanordnung 116 (die eine modifizierte Pipettenspitze sein kann) wird zum Halten der Sammelreaktionspipette 114 bei der Immunoreaktion (Fig. 12 und 15) verwendet. Die Ankopplungsanordnung 116 enthält einen inneren Ring aus elastischem Material auf der Innenfläche 151, gezeigt in Fig. 15 als Band um die obere Lippe der Anordnung zur Befestigung der Verschlusstellung 126 der Reaktionspipette 114. Das elastische Material sollte jedoch einen größeren Bereich der Innenfläche bedecken oder sich über die ganze Länge der Innenfläche oder einem geeigneten Teil davon erstrecken. Am Boden der Ankopplungsanordnung 116 (Fig. 15) wurde nachträglich ein geeignetes Filtermaterial 118 angebracht, dass die Zellen und die groben Rückstände zurückhält.
Die Reaktionspipette 114 sollte für den Gebrauch so gestaltet sein, dass sie durch kontrolliertes Zusammendrücken des elastischen Ballonbereichs 121 (Fig. 14) ein Teil der flüssigen Probe aufzieht; die aufgezogene Probe wurde so mit den immobilisierten Antikörpern 112 in der Reaktionspipette 114 zusammengebracht; die Reaktionspipette 114 wurde dann in die Ankopplungsanordnung 116 gesetzt (Fig. 12 und 15), wobei der Verschlussbereich 126 gegen den inneren Ring 151 verschlossen wurde. Nach dem Mischen wurde die Vorrichtung 110 für eine geeignete Inkubationsdauer in die Betriebsvorrichtung 160 (Fig. 16) gebracht.
Nach der Inkubationsperiode wurde die Vorrichtung 110 aus der Betriebsvorrichtung 160 entfernt und der immunologisch nicht-umgesetzte Inhalt der Sammeireaktionspipette 114 wurde durch Zusammendrücken des elastischen Ballonbereichs 121 durch das Filter 118 aus der Pipette in einen abgetrennten Sammelbehälter überführt, der unter der Ankopplungsanordnung 116 angebracht werden kann.
Fig. 17 zeigt eine voll beladene Probenherstellungsvorrichtung, umfassend mehrere Einrichtungen 110, angeordnet in der Betriebseinrichtung 160, die in einem Kit zum Herstellen von Analyseproben verwendet werden können. Die Betriebseinrichtung 160, die Vorrichtung 110 und/oder Teile der Vorrichtung können farbig gekennzeichnet sein, damit die verschiedenen Probenbehandlungsvorrichtungen leichter wiederzuerkennen sind.
Wahlweise kann die Betriebseinrichtung 160 verändert werden, so dass sie eine individuelle Ankopplungskammer enthält, in die einzelne Reaktionsvorrichtungen während der Inkubation gebracht werden können und die Futrate der entleerten Vorrichtung innerhalb der Betriebsvorrichtung sammeln können. Nach dem Entleeren der Proben können die Vorrichtungen weggeworfen und die gesammelten Filtrate analysiert werden.
Fig. 18 zeigt eine Ausführungsform der Reaktionseinrichtung 200, ähnlich zu denen aus Fig. 11 bis 17, jedoch mit bestim mten Verbesserungen. Die Vorrichtung 200 umfasst eine Reaktionspipette 202, eine Filteranordnung 220 und ein Probengefäß 206. Die Reaktionspipette 202 (Fig. 19) enthält einenansaugballon 204, Antikörper, gebunden an die Trägermatrix 208, einen geformten Ring 210, der die immobilisierten Antikörper in der Reaktionspipette in Position hält und eine Öffnung 212 zum Einfüllen und Auslassen der biologischen Flüssigkeiten. Die Filteranordnung 220, vergrößert gezeigt in Fig. 20, umfasst einen Wischer 224, einen Filterhalter 226, ein Filter 228 und einen Filterträger 230. Diese Ausführungsform wird ähnlich betrieben wie die oben in Verbindung mit den Figuren 11 bis 17 beschriebene Ausführungsform. Das gesammelte Filtrat oder Immunoreagens kann anschließend in einem Routinetest untersucht werden.
Die Effizienz der Ausführungsformen der oben gezeigten Reaktionsvorrichtung kann dadurch gefördert werden, dass man das Wirkvolumen der Reaktionskammer berücksichtigt im Verhältnis zur Menge an stabilisierten Antikörpern in der Kammer. Insbesondere sollte das Verhältnis so sein, dass ausreichend Antikörper vorhanden sind, damit der ausgewählte Analyt vollständig umgesetzt und dann aus der jeweiligen biologischen Flüssigkeit entfernt werden kann, die das Volumen der Reaktionskammer einnimmt. Das Wirkvolumen der Reaktionskammer wird zum einen durch die begrenzte physikalische Größe der Reaktionskammer bestimmt. Daneben kann das Wirkvolumen der Reaktionskammer in den Ausführungsformen der Fig. 11 bis 20 beschränkt werden, indem das maximale Volumen begrenzt wird, das sich durch Zusammendrücken der Ballons 121 oder 204 überführen läßt. Das Überführen kann auch durch eine begrenzte Ballongröße eingeschränkt werden oder indem man physikalische Beschränkungen einführt hinsichtlich wie weit der Ballon zusammengedrückt werden kann, z.B. indem man ein großes festes Objekt in den Ballon einbringt.
Obwohl die vorstehende Diskussion sich hauptsächlich auf Vorrichtungen bezieht, die immobilisierte Antikörper enthalten, müssen die Antikörper nur zum Zeitpunkt der Immunotrennung ausreichend stabilisiert und in der Reaktionskammer enthalten sein. Gefriergetrocknete Antikörper können somit in einer wasserlöslichen oder permeablen Struktur in der Reaktionskammer enthalten sein. Wahlweise können die Antikörper in einer flüssigen Suspension in einem Behälter in Fließverbindung mit der Reaktionskammer sein, so dass sie bei Gebrauch der Vorrichtung mit der biologischen Flüssigkeit in Kontakt kommen. Der Behälter kann dann bei Gebrauch zerbrochen werden oder die Reaktionskammer kann so eingerichtet sein, dass sie die Suspension bis zum Gebrauch der Vorrichtung von der Umwelt abgeschlossen hält.
Obwohl die vorstehende Diskussion in erster Linie auf den Nachweis von Cholesterin in spezifischen Lipoproteinklassen ausgerichtet ist, ist die Erfindung vielseitig anwendbar zum Nachweis ausgewählter Analyten aus einer Klasse von Analyten wie ein ausgewähltes Isoenzym eines Enzyms in Gegenwart anderer Isoenzyme und ausgewählter Immunglobuline in Gegenwart von anderen Immunglobulinen. Die Erfindung kann beispielsweise angewendet werden auf ausgewählte Isoenzyme der Creatinkinase, der Milchsäuredehydrogenase, der Amylase und der alkalischen und sauren Phosphatasen. Die Erfindung kann auf eine ähnliche Weise durchgeführt werden wie oben beschrieben im Fall des Cholesterintests mit der Ausnahme, dass die Antikörper, die in den Reaktionsvorrichtungen von Fig. 7 bis 20 verwendet werden, Antikörper gegen einen der ausgewählten oder nichtausgewählten Analyten sein müssen. Dies hängt davon ab, wie der Versuch nach der Immunotrennung fortgesetzt wird. Die Antikörper können durch bekannte Verfahren hergestellt werden.
Es ist jedoch zu beachten, dass wenn der ausgewählte Analyt von den anderen Analyten in der betroffenen Analytenklasse getrennt ist und es einen Routinetest für diese Analytenklasse gibt, man den ausgewählten Analyten nach der erfindungsgemäßen Trennung durch den Routinetest für diese Analytenklasse nachweisen kann. Zum Nachweis der Bauchspeicheldrüsen-spezifischen Amylase kann man z.B. im Anschluss an die Erfindung einen Routinetest für Amylase einsetzen. Mit anderen Worten kann man die erfindungsgemäße Ausführungsform dazu verwenden, die Bauchspeicheldrüsen-spezifische Amylase von anderen Isoenzymen der Amylase zu trennen. Die Trennung wird hierbei beispiels weise erreicht, indem Antikörper gegen alle Isoenzyme der Amylase, außer der Bauchspeicheldrüse-spezifischen Amylase, verwendet werden. Danach kann man das Filtrat mit einem Routinetest untersuchen, um den Spiegel der Bauchspeicheldrüsenspezifischen Amylase in der Probe zu bestimmen. Es lassen sich durch ähnliche Verfahren alle ausgewählten Analyten aus einer Analytenklasse nachweisen für die ein Routinetest vorhanden ist.
Die Erfindung kann auch zum Entfernen von Substanzen verwendet werden wie Bilirubin und Hämoglobin, die den spektralfotometrischen oder einen anderen Nachweis des Analyten stören können. Mit Antikörpern gegen Bilirubin und Hämoglobin werden die Substanzen dabei immunologisch von der Probe getrennt (durch Verwenden der Erfindung) bevor sie einem Nachweis aus dem Stand der Technik unterworfen werden.
Die erfindungsgemäß verwendeten Antikörper sind nicht auf Antikörper bestimmter Moleküle beschränkt, da jede unerwünschte Substanz erfindungsgemäß immunologisch abgetrennt werden kann, sofern sich unerwünschte Kreuzreaktionen vermeiden lassen.

Claims

1. Verfahren zum Messen der Menge eines Analyten in einer Zielklasse biologischer Moleküle in einer biologischen Flüssigkeit in Gegenwart einer Störsubstanz aus einer anderen verwandten Klasse, umfassend

(i) das Beschaffen einer wegwerfbaren Reaktionseinrichtung mit einer Reaktionskammer und einer Sammelkammer, wobei die Reaktionskammer stabilisierte Antikörper enthält, geeignet zum Binden jeglicher Störsubstanz in der biologischen Flüsssigkeit;

(ii) das Zugeben einer Probe der biologischen Flüssigkeit in die Reaktionskammer der Einrichtung, damit sie mit den stabilisierten Antikörpern umgesetzt wird und eine selektive Immunoreaktion der Störsubstanzen mit den Antikörpern bewirkt wird;

(iii) das Veranlassen, dass die nicht-umgesetzten Stoffe, einschließlich des Analyten, aus der Reaktionskammer durch eine Filtereinrichtung in die Sammelkammer überführt werden, wobei die umgesetzte Störsubstanz in der Reaktionskammer verbleibt; und

(iv) das Durchführen eines klinischen Tests für den Analyten mit den nicht-umgesetzten Materialien, die den Analyten enthalten.

2. Verfahren nach Anspruch 1, wobei das Filter in einer Öffnung der Reaktionskammer angeordnet ist.

3. Verfahren nach Anspruch 1, wobei das Filter als externe aber verbundene Anordnung angebracht ist.

4. Verfahren nach einem der vorstehenden Ansprüche, wobei das Überführen der nicht-umgesetzten Materialien aus der Reaktionskammer in die Sammelkammer den Schritt umfaßt: Anlegen von Druck an die Reaktionskammer.

5. Verfahren nach einem der vorstehenden Ansprüche, wobei das Überführen der nicht-umgesetzten Materialien aus der Reaktionskammer in die Sammelkammer den Schritt umfaßt: Anlegen einer Zentrifugalkraft an die Reaktionskammer.

6. Verfahren nach einem der vorstehenden Ansprüche, weiter umfassend das Vorabbestimmen der Konzentrationsmenge an stabilisierten Antikörpern, die erforderlich ist, damit die Störsubstanzen in den zu erwartenden biologischen Flüssigkeiten, die das Wirkvolumen der Reaktionskammer ausfüllen, mit ihnen immunologisch umgesetzt und so entfernt werden.

7. Verfahren nach einem der vorstehenden Ansprüche, wobei die stabilisierten Antikörper immobilisiert sind.

8. Verfahren nach Anspruch 7, wobei die Antikörper auf einem unlöslichen Trager immobilisiert sind.

9. Verfahren nach Anspruch 7, wobei die Antikörper auf einem löslichen Träger mit hohem Molekulargewicht immobilisiert sind.

10. Verfahren nach einem der vorstehenden Ansprüche, wobei die Antikörper durch Gefriertrocknen stabilisiert sind.

11. Verfahren nach einem der vorstehenden Ansprüche, wobei der Analyt ein Cholesterin einer ausgewählten Lipoproteinklasse ist und die Störsubstanz ein Cholesterin einer anderen Lipoproteinklasse ist.

12. Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 10, wobei der Analyt ein ausgewähltes Immunglobulin ist und die Störsubstanz ein anderes Immunglobulin ist.

13. Verfahren nach Anspruch 1 bis 10, wobei der Analyt ein ausgewähltes Isoenzym eines Enzyms ist und die Störsubstanz ein anderes Isoenzym des Enzyms ist.

14. Verfahren nach Anspruch 13, wobei der Analyt ein ausgewähltes Isoenzym ist, ausgewählt aus Milchsäuredehydrogenase, Creatinkinase, alkalische Phosphatase und saure Phosphatase.

15. Verfahren nach Anspruch 1 bis 10, wobei die Störsubstanz ausgewählt ist aus Bilirubin und Hämoglobin.

16. Wegwerfbare Reaktionseinrichtung zum Nachweis eines Analyten in einer biologischen Flüssigkeit in Gegenwart einer Substanz, die den Nachweis des Analyten stört, wobei die Vorrichtung umfaßt:

(a) eine Reaktionskammer, in die die biologische Flüssigkeit gegeben werden kann;

(b) stabilisierte Antikörper gegen die Störsubstanz, wobei sich derartige Antikörper innerhalb der Reaktionskammer befinden;

(c) eine Sammelkammer, die mit der Reaktionskammer verbunden ist und das nicht-umgesetzte Material, einschließlich den Analyten, aufnimmt; und

(d) eine Filtervorrichtung, durch die die nicht umgesetzten Materialien, einschließlich dem Analyten, auf dem Weg von der Reaktionskammer zur Sammelkammer hindurchgehen.

17. Vorrichtung nach Anspruch 16, wobei die Filtervorrichtung eine Filteranordnung umfaßt, die austauschbar an die Reaktionskammer angebracht ist.

18. Vorrichtung nach Anspruch 16 oder 17, wobei die Reaktionskammer weiterhin eine erste und eine zweite Öffnung umfasst, wobei die erste Öffnung der Zugabe der biologischen Flüssigkeit dient und die Filtervorrichtung mit der zweiten Öffnung verbunden ist; und

die Reaktions vorrichtung eine Differenzdruckvorrichtung umfaßt in Fließverbindung mit der ersten Öffnung, die positive und negative Druckdifferenziale an die Reaktionskammer anbringt.

19. Vorrichtung nach einem der Ansprüche 16 bis 18, wobei die Konzentration der stabilisierten Antikörper vorab bestimmt wurde, so dass die Störsubstanzen in den zu erwartenden biologischen Flüssigkeiten, die das Wirk volumen der Reaktionskammer ausfüllen, mit ihnen immunologisch umgesetzt und so entfernt werden.

20. Vorrichtung nach den Ansprüchen 16 bis 19, wobei die Antikörper gefriergetrocknet sind.