DE69016617T2

DE69016617T2 - Gepufferte Waschzusammensetzung, Zusammensetzung zur Unlöslichmachung, Testsätze und Verfahren zu ihrer Verwendung.

Info

Publication number: DE69016617T2
Application number: DE69016617T
Authority: DE
Inventors: Karen Lange Findling; Gregory Joseph Mcclune
Original assignee: Eastman Kodak Co
Current assignee: Eastman Kodak Co
Priority date: 1989-12-07
Filing date: 1990-11-30
Publication date: 1995-10-12
Anticipated expiration: 2010-12-01
Also published as: US5366864A; DE69016617D1; EP0431682A2; JPH03251764A; ATE118097T1; CA2028175A1; KR910012719A; IE904418A1; EP0431682A3; FI906044A; US5176999A; FI906044A0; EP0431682B1

Description

Die Erfindung betrifft eine Zusammensetzung, die in spezifisch bindenden Tests gleichzeitig als eine Waschlösung und eine farbstoffbildende Zusammensetzung verwendbar ist. Darüber hinaus wird eine immobilisierende Zusammensetzung bereitgestellt. Die Erfindung betrifft auch einen diagnostischen Testkit, der jede Zusammensetzung enthält und sie betrifft Verfahren zur Bestimmung spezifisch bindender Liganden.
In der medizinischen Praxis, in der Forschung und bei diagnostischen Verfahren besteht ein fortwährendes Bedürfnis nach einer raschen und exakten Bestimmung von biologischen Substanzen, die in biologischen Flüssigkeiten in niedrigen Konzentrationen vorliegen. Beispielsweise muß das Vorliegen von Hormonen, Arzneistoffen Narkotika, Steroiden, Polypeptiden, Prostaglandinen, Proteinen, Antikörpern oder infektiösen Organismen in Blut, Speichel, Urin oder anderen biologischen Flüssigkeiten für eine geeignete Diagnose oder Behandlung auf eine exakte und rasche Weise festgestellt werden.
Um solche Bestimmungen zu ermöglichen. sind verschiedene Verfahren zum Isolieren und Identifizieren biologischer Substanzen entwickelt worden, bei denen spezifisch bindende Reaktionen zwischen der zu bestimmenden Substanz (hier als ein "Ligand" bezeichnet) und Rezeptor-Molekülen, die mit dem Liganden spezifisch reagieren, eingesetzt werden. Zum Nachweis des erhaltenen Komplexes zwischen Ligand und Rezeptor sind Radioisotope, Fluorogene Chromogene, nachweisbare Perlen bzw. Beads und Enzyme verwendet worden. Ein allgemein bekanntes Beispiel für spezifisch bindende Reaktionen ist ein immunologischer Test, in dem eine antigene Substanz und ein dazu spezifischer Antikörper unter Bildung eines immunologischen Komplexes reagieren.
In den letzten Jahren hat die Verwendung von Enzym-Markern aufgrund verschiedener Nachteile, die mit radioaktiven und fluoreszierenden Merkern verbunden sind, vermehrt Beachtung gefunden. Tests, in denen Enzym-Merker verwendet werden, umfassen die aus dem Stand der Technik als kompetitive Enzym-Immunoassays (EIA) bekannten Tests und sowohl die sogenannten direkten als auch die indirekten sogenannten "enzyme-linked immunosorbent assays" (ELISA). Ein anderer brauchbarer Testtyp ist als ein immunometrischer oder "Sandwich"-Test bekannt, wie er beispielsweise in der US-A-4,486,530 beschrieben ist. In sämtlichen dieser Tests ist entweder ein Rezeptor für den Liganden oder eine bekannte Menge an Ligandanalog mit einem Enzym markiert, so daß Ligand-Rezeptor-Komplexe von unmarkiertem Material unterschieden werden können. Üblicherweise werden die Komplexe von unkomplexiertem Material abgetrennt, wobei geeignete Immobilisierungstechniken mit oder ohne Waschen oder Filtrieren verwendet werden.
Peroxidase ist ein Enzym, das vorteilhaft als ein Marker in analytischen Verfahren verwendet worden ist. Peroxidase wirkt auf Wasserstoffperoxid als ein Substrat und kann verschiedene Chromogene oder farbstoffbildende Materialien oxidieren, wobei eine nachweisbare Spezies mit einer Geschwindigkeit gebildet wird, die proportional zur Menge der vorliegenden Peroxidase ist. Aus dem Stand der Technik sind verschiedene farbstoffbildende Materialien bekannt, einschließlich Benzidin und seine Derivate und verschiedene Leuko-Farbstoffe.
In der EP-A-0 308 236 wird eine verbesserte farbstoffbildende Zusammensetzung beschrieben, die mit bestimmten Polymeren stabilisiert ist. Die Zusammensetzung enthält farbstoffbildende Leuko-Farbstoffe, die in Methanol gelöst sind und die in Gegenwart von Peroxidase und Wasserstoffperoxid zu nachweisbaren Farbstoffen umgewandelt werden können. Obwohl der beschriebene Test in der Technik in beachtlichem Umfang verwendet wird, und zwar speziell für Schwangerschaftstests, sind für wirksame Ergebnisse separate Wasch- und farbstoffbildende Lösungen und Schritte erforderlich. Es wäre wünschenswert, diese Schritte und Lösungen zu eliminieren, um den Test zuverlässiger und für den Anwender einfacher zu gestalten.
Der zuvor beschriebene brauchbare Test wird darüber hinaus verbessert, indem eine gepufferte, wäßrige Waschzusammensetzung verwendet wird, die umfaßt:
a. eine Zusammensetzung, die in der Lage ist, als Antwort auf ein Enzym, das der Merker auf einem spezifisch bindenden Reagens ist, einen Farbstoff zu bilden, und
b. einen Puffer, wobei die Zusammensetzung dadurch gekennzeichnet ist, daß sie darüber hinaus ein wasserlösliches, organisches Solvens umfaßt, das ein Molekulargewicht zwischen 40 und 100 aufweist und einer Menge von 2,5 bis 25 Volumen-% vorliegt.
Die Erfindung stellt auch einen diagnostischen Testkit bereit, der einen enzym-markierten Rezeptor für einen spezifisch bindenden Liganden umfaßt, wobei der Kit dadurch gekennzeichnet ist, daß er darüber hinaus die zuvor beschriebene gepufferte wäßrige Waschzusammensetzung umfaßt.
Darüber hinaus umfaßt ein Verfahren zur Bestimmung eines spezifisch bindenden Liganden die Schritte:
A. In-Kontakt-bringen einer Probe, von der angenommen wird, daß sie einen vorbestimmten, spezifisch bindenden Liganden enthält, mit einem enzymmarkierten Rezeptor für den Liganden, um einen nachweisbaren Komplex aus Ligand und Rezeptor zu bilden,
B. Waschen des nachweisbaren Komplexes mit einer gepufferten wäßrigen Waschzusammensetzung wie zuvor beschrieben und
C. Nachweisen des erhaltenen Farbstoffs als eine Indikation für das Vorliegen des spezifisch bindenden Liganden in der Probe.
Die vorliegende Erfindung stellt eine verbesserte Zusammensetzung bereit, die in Gegenwart eines enzymmarkierten spezifisch bindenden Reagenzes einen Farbstoff bildet und die auch als eine Waschlösung in einem spezifisch bindenden Test brauchbar ist. Diese Zusammensetzung kann vorteilhaft in Tests verwendet werden, in denen ein beliebiges Enzym als der Marker verwendet wird, insbesondere jedoch, wenn Peroxidase als der Marker verwendet wird. Da die Zusammensetzung sowohl als eine Waschlösung als auch als eine farbstoffbildende Lösung verwendbar ist, werden separate Lösungen und Schritte elimiert. Auf diese Weise wird der Test vereinfacht, die Testzeit wird reduziert und die Fehlerwahrscheinlichkeit wird herabgesetzt. Die erfindungsgemäße Zusammensetzung kann ohne weiteres in einem diagnostischen Testkit zusammengestellt werden, der weniger Komponenten als bekannte Kits aufweist.
Die Vorteile dieser Erfindung liegen in einer speziell formulierten Waschzusammensetzung, die eine farbstoffbildende Zusammensetzung, die auf einen Enzymmarker antwortet. einen Puffer und ein wasserlösliches organisches Solvens mit einem Molekulargewicht von 40 bis 100 enthält und die in der Zusammensetzung zu 2,5 bis 25 Vol.-% vorliegt.
Wenn Peroxidase als der bevorzugte Enzymmarker verwendet wird, ist es notwendig, daß ein Reduktionsmittel enthalten ist, das die peroxidative Bildung von Farbstoff inhibiert, während überschüssige Peroxidase während des Waschschritts entfernt wird. In einigen Ausführungsformen, in denen ein biotinylierter Rezeptor verwendet wird, enthält eine unlöslich machende Zusammensetzung vorteilhafterweise ein teilchenförmiges Substrat, an das Avidin gebunden ist, und ein Peroxidase reduzierendes Agens.
Die erfindungsgemäße Waschzusammensetzung ist zur Bildung eines Farbstoffs in Gegenwart eines Enzyms verwendbar, das als ein Marker auf einem spezifisch bindenden Reagens, wie einem Antigen, Antikörper, Hapten oder Arzneistoffen, verwendet wird. Repräsentative Enzyme umfassen Peroxidase, Glucoseoxidase, alkalische Phosphatase, Glucosidase, Urease, ß-Glucosidase, ß-Galactosidase und andere, die dem Fachmann bekannt sind. Techniken zum Binden solcher Enzyme an spezifisch bindende Reagenzien sind ebenfalls gut bekannt. Diese Zusammensetzung ist besonders brauchbar bei Konjugaten von Peroxidase und dem spezifisch bindenden Reagens, beispielsweise einem mit Peroxidase markierten Antikörper. Vorzugsweise wird die erfindungsgemäße Waschzusammensetzung in Tests verwendet, bei denen spezifisch bindende Reaktionen beteiligt sind, wie immunologische Tests, wie im folgenden ausführlicher beschrieben wird.
Die erfindungsgemäße Waschzusammensetzung umfaßt eine farbstoffbildende Zusammensetzung, die wiederum ein oder mehr Reagenzien enthält, die bei Wechselwirkung des Enzyms mit den geeigneten Substraten einen Farbstoff bilden. In einigen Fällen ist die farbstoffbildende Zusammensetzung ein einzelner Reaktant, der sowohl einen Farbstoff bildet als auch das für das Enzym benötigte Substrat ist. In anderen Ausführungsformen werden zwei oder mehr Reagenzien für die enzymatische Aktivität und die Farbstoffbildung benötigt.
Je nach dem verwendeten Enzym variiert die farbstoffbildende Zusammensetzung in ihren Komponenten. Ein Durchschnittsanwender weiß, welche Reagenzien für ein gegebenes Enzym benötigt werden, und die brauchbaren Mengen. Wenn beispielsweise Glucoseoxidase der Marker ist, kann die farbstoffbildende Zusammensetzung ein Anilin und eine oxidierbare Verbindung enthalten, um einen Farbstoff zu bilden. Bei alkalischer Phosphatase enthält ein geeignetes Reagens ein Phosphatsubstrat, das direkt oder indirekt einen Farbstoff bildet.
In der bevorzugten Ausführungsform, in der das Enzym Peroxidase ist, können beliebige geeignete mit Peroxidase reaktive Substrate und Farbstoffbildner verwendet werden, einschließlich Tetrabenzidin und seine Derivate, die dem Fachmann bekannt sind. Vorzugsweise enthält die Zusammensetzung einen oder mehrere Leuko-Farbstoffe, die in der Lage sind, in Gegenwart von Wasserstoffperoxid und einer peroxidativen Substanz (d. h. Peroxidase oder eine Substanz, die wie Peroxidase wirkt) einen Farbstoff zu bilden. Der erhaltene Farbstoff wird üblicherweise im sichtbaren Bereich das elektromagnetischen Spektrums (im allgemeinen von 400 bis 700 nm) nachgewiesen. Vorzugsweise wird der Farbstoff bei 500 bis 650 nm nachgewiesen.
Hier brauchbare Imidazol-Leukofarbstoffe sind entweder Diarylimidazol- oder Triarylimidazol-Leukofarbstoffe. Aus dem Stand der Technik sind viele brauchbare Verbindungen bekannt, einschließlich der in der US-A-4,089,747 und den darin angeführten Literaturstellen, der in der EP-A-0 122 641 und der in der japanischen Patentveröffentlichung 581983)-045,557 beschriebenen.
Die Triarylimidazole, die die folgende allgemeine Formel aufweisen, sind besonders brauchbar:
in der R¹, R² und R³ jeweils eine solche organische Gruppe sind, daß mindestens eine von ihnen eine ortho- oder para-Hydroxy-substituierte Arylgruppe mit bis zu 18 Kohlenstoffatomen ist, die beiden anderen Gruppen Arylgruppen sind, die so ausgewählt sind, daß das durch zyklische Voltametrie gegen eine Standard-Kalomel-Elektrode unter Verwendung einer Elektrode auf Kohlenstoff- Basis gemessene Imidazol-Oxidationspotential zwischen -70 und +110 mV liegt. Die Messungen des Oxidationspotentials können gemäß herkömmlicher elektrochemischer Techniken durchgeführt werden (siehe beispielsweise Sawyer et al., Experimental Electrochemistry for Chemists, John Wiley & Sons, New York, 1974).
Der hier verwendete Begriff "Aryl" soll aromatische Kohlenwasserstoff-Gruppen, wie Phenyl, Naphthyl oder Anthryl, Tolyl, Xylyl und andere substituierte aromatische Gruppen umfassen. Die Anzahl der Kohlenstoffatome bezieht sich auf die Gesamtzahl der Kernkohlenstoffatome sowie der in den Substituenten. Mindestens eine der Gruppen R¹ , R² und R³ weist einen Elektronendonor-Substituenten in ortho - oder para-Stellung auf, wie eine Alkoxygruppe (-OR), in der R eine Alkylgruppe mit 1 bis 8 Kohlenstoffatomen ist beispielsweise Methyl, Ethyl, Isopropyl, t-Butyl, Hexyl, Chlormethyl oder Methoxymethyl), oder eine Dialkylaminogruppe, in der die Alkylgruppe die soeben angegebene Bedeutung aufweist. Die Gruppen R¹, R² und R³ können einen oder mehrere Substituenten aufweisen, die mit dem Imidazolkern elektronenkompatibel sind, um bei Oxidation einen geeigneten Farbstoff zu bilden. Weitere Details bevorzugter Triarylimidazol-Verbindungen und Verfahren zu ihrer Herstellung sind in der US-A-4,089,747 zu finden.
Besonders brauchbare Triarylimidazol-Leukofarbstoffe sind ausgewählt aus der Gruppe bestehend aus:
2-(4-Hydroxy-3,5-dimethoxyphenyl)-4,5-bis(4-methoxyphenyl)imidazol,
2-(3,5-Dibrom-4-hydroxyphenyl)-4,5-diphenyl-imidazol,
2-(3-Brom-5-methoxy-4-hydroxyphenyl)-4,5-bis(4-methoxyphenyl)imidazol,
4,5-Bis(4-dimethylaminophenyl)-2-(4-hydroxyphenyl)- imidazol,
4,5-Bis(4-dimethylaminophenyl)-2-(4-hydroxy-3-methoxyphenyl)imidazol,
2-(4-Hydroxyphenyl)-4,5-bis(4-methoxyphenyl)-imidazol und 4,5-Bis(4-dimethylaminophenyl)-2-(4-hydroxy)-3,5- dimethoxyphenylimidazol.
Die Menge von Leukofarbstoff in der bevorzugten Waschzusammensetzung kann stark variieren. Im allgemeinen liegt sie in einer molaren Menge von 10&supmin;&sup6; bis 10&supmin;³ und vorzugsweise von 10&supmin;&sup5; bis 10&supmin;&sup4; vor.
Die erfindungsgemäße Waschzusammensetzung ist üblicherweise auf einen pH von 6 bis 9 gepuffert, je nach dem Test, in der sie verwendet werden soll. Es können ein oder mehrere Puffer verwendet werden und geeignete Puffer sind aus dem Stand der Technik bekannt, und umfassen, sind jedoch nicht darauf beschränkt, Phosphate, Borate, 3-(N-Morpholin)propansulfonsäure, Tris(hydroxymethyl)- aminomethan, N-Tris-(hydroxymethyl)methyl-2-aminoethansulfonsäure, N-(2-Hydroxyethyl)piperazin-N'-(2-ethansulfon) und andere, die dem Fachmann ohne weiteres ersichtlich sind. Die Puffermenge, um den gewünschten pH und die Pufferkapazität zu erhalten, kann ohne weiteres bestimmt werden. Im allgemeinen liegt sie mindestens 10 mmolar vor.
Darüber hinaus enthält die Waschzusammensetzung auch ein oder mehrere wasserlösliche organische Solventien mit einem Molekulargewicht von 40 bis 100. Solche Solventien sind polar und weisen in Wasser bei Raumtemperatur eine Löslichkeit von mindestens 10% (Volumen-%) auf. Einige Solventien sind mit Wasser mischbar, während andere eine beschränktere Wasserlöslichkeit aufweisen.
Brauchbare Solventien dürfen den Test in keiner Weise stören bzw. überlagern oder für das Waschen unkomplexierter Materialien oder für die Farbstoffbildung nachteilig sein. Es kann ein einfaches Experiment durchgeführt werden, um festzustellen, ob ein bestimmtes Solvens bei der Durchführung der Erfindung brauchbar ist. Besonders brauchbare Solventien sind die niederen Alkohole wie Ethanol, n-Propanol, Isopropanol, n-Butanol, sek.-Butanol, tert.-Butanol und andere dem Fachmann bekannte. Andere brauchbare Solventien umfassen Acetonitril, Ketone wie Aceton und Methylethylketon, und Ether wie Tetrahydrofuran und 1,4-Dioxan. Andere sind dem Fachmann ohne weiteres ersichtlich. Die bevorzugten Solventien sind die niederen Alkohole wobei sek.-Butanol am meisten bevorzugt ist.
Das mit Wasser mischbare Solvens liegt in der Zusammensetzung üblicherweise in einer Menge von 2,5 bis 25 und vorzugsweise von 5 bis 15 Vol-% vor.
In den bevorzugten Ausführungsformen, in denen die Waschzusammensetzung einen Leukofarbstoff umfaßt, umfaßt sie vorzugsweise auch ein oder mehrere in Wasser lösliche oder in Wasser dispergierbare Polymere, wie Vinylpyrrolidon- Polymere, Acrylamid-Polymere, Acryl- und Methacrylsäure- Polymere, Polyethylenglycole und Polyamine. Diese Polymere können entweder Homo- oder Copolymere sein. Typische Beispiele für brauchbare Polymere umfassen, sind jedoch nicht auf diese beschränkt: Poly(acrylsäure), Poly(methacrylsäure), Poly(acrylsäure-co-methylacrylat) (Gewichtsverhältnis 90 : 10), Poly(acrylamid), Poly(acrylamid-co-acrylsäure) (Gewichtsverhältnis 50 : 50), Polyamine wie die in der US-A-3,702,249 und in der US-A-4,689,359 beschriebenen. Besonders brauchbare Polymere sind Vinylpyrrolidon-Polymere, d. h. Homo- und Copolymere, die aus Vinylpyrrolidon hergestellt sind, wie Poly(vinylpyrrolidon), Poly(vinylpyrrolidon-co-acrylsäure) und Poly(vinylpyrrolidon-co-acrylamid).
Andere wahlweise Komponenten der Waschzusammensetzung umfassen Elektronen-Transfer-Agentien, wie 4'-Hydroxyacetanilid und andere Phenole, wie in der US-A-4,828,983 beschrieben ist. Elektronen-Transfer-Agentien sind Verbindungen, die den Transfer eines oder mehrerer Elektronen zwischen Reaktanten in Oxidations-Reduktions- Reaktionen erleichtern. Aus dem Stand der Technik sind viele brauchbare Elektronen-Transfer-Agentien bekannt, wie Phenazinmethosulfat, Phenazinethosulfat und Benzo- und Naphthochinone, wie in der US-A-4,746,607 beschrieben ist.
Die zuvor beschriebenen Komponenten der Waschzusammensetzung sind ohne weiteres aus einer Reihe von Queller im Handel erhältlich. Alternativ können sie unter Verwendung bekannter Ausgangsmaterialien und Verfahren hergestellt werden, wie in der US-A-4,089,747 und anderen zuvor aufgeführten Literaturstellen beschrieben ist.
Eine bevorzugte erfindungsgemäße Waschzusammensetzung ist auf einen pH von 6 bis 9 gepuffert und umfaßt Wasserstoffperoxid, ein phenolisches Elektronen-Transfer-Agens, Poly(vinylpyrrolidon), sek.-Butanol und Triarylimidazol- Leukofarbstoff, der aus der zuvor angegebenen Auflistung bevorzugter Leukofarbstoffe ausgewählt ist, wobei 2-(4-Hydroxy-3,5-dimethoxyphenyl)-4,5-bis(4-methoxyphenyl) imidazol am meisten bevorzugt ist.
Eine zweite Zusammensetzung wird verwendet, um ein biotinyliertes spezifisch bindendes Reagens oder den aus der Reaktion eines solchen Reaktanten mit einem spezifisch bindenden Partner gebildeten Komplex unlöslich zu machen. Diese Zusammensetzung kann beispielsweise verwendet werden, um den zwischen einem Antigen und seinem korrespondierenden biotinylierten Antikörper gebildeten Komplex unlöslich zu machen. Alternativ kann ein ternärer Komplex zweier Antikörper (wobei einer biotinyliert ist) und eines Antigens unlöslich gemacht werden. Darüber hinaus kann ein Komplex eines biotinylierten Antigens oder eines biotinylierten anti-Antikörpers mit einem Antikörper, der nachzuweisen ist, unlöslich gemacht werden.
Die unlöslichmachende Zusammensetzung umfaßt ein teilchenföriniges Substrat, an das Avidin auf eine geeignete chemische oder mechanische Weise gebunden ist. Es kann jedes beliebige brauchbare Substrat verwendet werden, solange es teilchenförmig ist, wasserunlöslich ist und den Test nicht nachteilig beeinflußt. Geeignete teilchenförmige Substrate weisen eine reguläre oder irreguläre Form auf und sind aus Polymeren, Glas, Keramiken oder anderen natürlich vorkommenden oder synthetisch hergestellten Materialen hergestellt. Polymere Partikel, die im allgemeinen einen Durchmesser von 0,1 bis 10 um aufweisen, sind bevorzugt. Das Substrat wird in einer wäßrigen Lösung in einer Menge von üblicherweise 0,1 bis 5 % Feststoffen suspendiert. In der Zusammensetzung können einer oder mehrere Puffer enthalten sein, falls gewünscht.
Avidin wird unter Verwendung bekannter Technologien, einschließlich Beschichten und Trocknen, Adsorption und chemischer Reaktion an das Substrat gebunden. Üblicherweise wird es durch Reaktion von Aminogruppen auf dem Avidin-Molekül mit aktivierten Carboxy-, aktivierten Halogenalkyl-, aktivierten Chlorethylsulfonyl- oder anderen reaktiven Gruppen auf den Partikeln kovalent gebunden. Ein bevorzugtes Verfahren ist in der EP-A-0 302 7l5 beschrieben.
Ein reduzierendes Agens ist in der unlöslichmachenden Zusammensetzung ebenfalls enthalten, sodaß jegliche nicht gebundene Peroxidase den Farbstoff oder Leukofarbstoff, der auf eine peroxidative Substanz reagiert, nicht vorzeitig oxidiert. Brauchbare Reduktionsmittel umfassen, sind jedoch nicht darauf beschränkt, Ascorbinsäure oder Salze davon (wie Ascorbat), Alkalibisulfite (wie Natriumbisulfit), wasserlösliche Hydrochinone (wie Hydrochinonsulfonsäure) und andere, die dem Fachmann ohne weiteres ersichtlich sind. Ascorbat ist bevorzugt. Das Reduktionsmittel liegt im allgemeinen in einer Menge von mindestens 5 umolar und vorzugsweise 10 umolar bis 200 mmolar vor.
Die unlöslichmachende Zusammensetzung umfaßt vorzugsweise ein oder mehrere wasserlösliche organische Solventien, die dieselben Eigenschaften aufweisen, wie die für die Waschzusammensetzung beschriebenen. Die speziellen Solventien, die in den beiden Zusammensetzungen verwendet werden, können gleich oder verschieden sein und in der gleichen oder in verschiedenen Nengen vorliegen. Vorzugsweise sind die in einem gegebenen Test verwendeten Solventien die gleichen.
Sowohl die Wasch- als auch die unlöslichmachenden Zusammensetzungen werden hergestellt, indem die einzelnen Komponenten miteinander auf geeignete Weise und in einem geeigneten Behälter gemischt werden. Jede kann sofort verwendet werden oder für die spätere Verwendung, beispielsweise in einem diagnostischen Testkit, aufbewahrt werden.
Ein diagnostischer Testkit kann die zuvor beschriebene Waschzusammensetzung enthalten, sowie eine oder mehrere andere Komponenten, Vorrichtungen, Instruktionen und dergleichen, die für einen spezifisch bindenden Test notwendig sind.
Insbesondere enthält der Testkit einen Rezeptor für den spezifisch bindenden Liganden. Andere brauchbare Komponenten des Kits enthalten zusätzliche Rezeptoren (wie einen zweiten Rezeptor, der biotinyliert ist), markiert oder unmarkiert, markierte Ligandenanaloge, die erfindungsgemäße immobilisierende Zusammensetzung, Materialien, die spezifisch an den Rezeptor oder Liganden binden, Einweg-Testvorrichtungen (im folgenden beschrieben), Reagenzbehälter, Pipetten, Vorfilter-Vorrichtungen und andere dem Fachmann bekannte Reagenzien.
Wegwerfbare bzw. Einweg-Testvorrichtungen umfassen üblicherweise ein wasserunlösliches Substrat, das eine oder mehrere Testzonen (beispielsweise Testnäpfchen) aufweist. Das Substrat ist aus einem wasserunlöslichen Material wie Glas, polymeren Materialien, Cellulose-Materialien und anderen dem Fachmann bekannten Materialien hergestellt. Die Vorrichtung kann ein Teströhrchen, eine Petrischale, Filterpapier oder ein Teststreifen sein, der Zonen für die Reaktion aufweist. Sie kann auch ein Mikrotestplatte sein, die eine Vielzahl von vorgeformten Testnäpfchen aufweist. Besonders brauchbare Testvorrichtungen sind in der US- A-4,870,007 beschrieben und beansprucht.
Die vorliegende Erfindung stellt ein Verfahren bereit, bei dem ein nachweisbarer Komplex zwischen einem Liganden (einer nachzuweisenden Substanz) und einem Rezeptor (einer Verbindung, die mit dem Liganden spezifisch reagiert) erhalten wird. Vorteilhafterweise ist das Verfahren einfach und kann daher in der Praxis eines Arztes oder beim Verbraucher zuhause durchgeführt werden und liefert sofortige Ergebnisse. Der Test kann zum Nachweis des Vorliegens oder des Nichtvorliegens eines einwertigen oder mehrwertigen oder multideterminanten Liganden in einer wäßrigen Flüssigkeit, beispielsweise einer biologischen Flüssigkeit, verwendet werden.
Ganz besonders kann die vorliegende Erfindung bei der Bestimmung (qualitative oder quantitative Bestimmung) eines Liganden in wäßrigen Flüssigkeiten bestimmt werden, für die natürlich vorkommende oder synthetisch hergestellte spezifisch bindende Rezeptoren vorliegen. Diese Bestimmung kann durch bloßes Bestimmen des Vorliegens oder des Nichtvorliegens des Liganden oder durch quantitative Bestimmung der Menge des Liganden durchgeführt werden. Insbesondere kann die Erfindung zum Testen biologischer Flüssigkeiten von Tieren, Menschen oder Pflanzen, vorzugsweise jedoch von Menschen, verwendet werden. Derartige Flüssigkeiten umfassen, sind jedoch nicht auf diese beschränkt, Vollblut, Plasma, Seren, Lymphe, Galle, Urin, spinale Flüssigkeit, Spermaflüssigkeit, Tränenflüssigkeit, Vaginalsekrete, Sputum, Schweiß und dergleichen sowie Stuhlproben. Es ist auch möglich, flüssige Präparationen von menschlichem oder tierischem Gewebe, wie Skelettmuskeln, Herz, Nieren, Lungen, Gehirn, Knochenmark, Haut und dergleichen zu testen.
Der interessierende Ligand kann eine immunologische Spezies sein, nämlich (1) jede Substanz, die, wenn sie einem immunkompetenten Wirt angeboten wird, zur Bildung eines spezifischen Antikörpers führt, der in der Lage ist, mit dieser Substanz zu binden, oder (2) der so erzeugte Antikörper, wobei der Ligand an der Antigen-Antikörper- Reaktion teilnimmt.
Repräsentative Liganden, die mit der vorliegenden Erfindung nachweisbar sind, umfassen primäre Amine, Aminosäuren, Peptide, Polypeptide, Proteine, Lipoproteine, Glykoproteine, Arzneistoffe, Haptene, Enzyme, Steroide, Lipide, Nucleinsäuren, Hormone, Vitamine, Polysaccharide, Glykolipide, Alkaloide, Organismen (Bakterien, Protozoen, Pilze, Viren einschließlich Retroviren; Rickettsia und dergleichen) und Komponenten davon, Blutkomponenten, Gewebe- und Organantigene und andere dem Fachmann bekannte Materialien. In einigen Fällen ist der Ligand ein Antikörper, der gegen einen Arzneistoff, ein Hormon, ein Antibiotikum oder eine andere Verbindung, die antigene Eigenschaften aufweist, gerichtet ist. Alternativ kann der Ligand ein antigenes Material sein. In noch einer anderen Ausführungsform ist die immunologische Spezies ein Antikörper, der gegen einen anderen Antikörper (d. h. ein Anti-Antikörper) gerichtet ist. Es können sowohl monoklonale als auch polyklonale Antikorper verwendet werden und sie können ganze Moleküle oder verschiedene Fragmente davon sein. Vorzugsweise werden in den Tests monoklonale Antikörper verwendet.
In einer bevorzugten Ausführungsform ist das Verfahren zum Nachweis von hCG in Urin oder Blut als ein früher Schwangerschaftsindikator brauchbar. In dieser Ausführungsform sind ein oder mehrere verschiedene Antikörper für hCG in der Testvorrichtung immobilisiert, um als Reagenzien zur Bildung eines Komplexes mit hCG mit verschiedenen Epitopstellen zu dienen. Diese Ausführungsform ist ausführlicher in der US-A-4,870,007 beschrieben.
Im allgemeinen wird das erfindungsgemäße Verfahren ausgeführt, indem man einen enzymmarkierten Rezeptor für einen interessierenden Liganden mit einer Flüssigkeitsprobe in Kontakt bringt, von der angenommen wird, daß sie den Liganden enthält, und zwar auf solche Weise, daß von jedem vorliegenden Liganden und dem enzymmarkierten Rezeptor ein Reaktionsprodukt (d. h. ein Komplex) gebildet wird. Üblicherweise wird die Flüssigkeitsprobe auf eine Testzone einer Testvorrichtung aufgetragen oder in ein Testnäpfchen gegeben, je nach der Konfiguration der Vorrichtung. Das Vorliegen oder das Nichtvorliegen des Reaktionsproduktes wird dann nach Waschen des Komplexes mit der erfindungsgemäßen Waschzusammensetzung und Abtrennen von nichtumgesetzten Materialien von dem Reaktionskomplex auf geeignete Weise bestimmt. Der Farbstoff wird aus der Zusammensetzung in Gegenwart des Substrats und farbstoffbildender Reagenzien gebildet.
Das erfindungsgemäße Verfahren kann ein kompetitiv bindender immunologischer Test sein, bei dem sowohl enzymmarkierte als auch nichtmarkierte Rezeptoren verwendet werden. Es können sowohl gebundene (d. h. komplexierte) als auch ungebundene (d. h. nicht komplexierte) Materialien bestimmt werden. Die physikalische Trennung von gebundenen und nichtgebundenen Materialien kann, falls gewünscht, unter Verwendung beliebiger geeigneter Trennvorrichtungen und der erfindungsgemäßen Waschzusammensetzung durchgeführt werden.
In einer anderen Ausführungsform wird in einem kompetitiven immunologischen Test ein Rezeptor für den Liganden und eine festgelegte Menge an enzymmarkiertem Liganden verwendet. Der gebildete und unter Verwendung der erfindungsgemäßen Waschzusammensetzung nachgewiesene Komplex ist zur Menge des Liganden in der Probe umgekehrt proportional.
In einer weiteren Ausführungsform ist der Rezeptor unmarkiert und der Ligand-Rezeptor-Komplex wird unter Verwendung eines enzymmarkierten spezifisch bindenden Reagenzes, das spezifisch an den Rezeptor bindet, nachgewiesen. Wenn der Ligand beispielsweise ein antigenes Material ist und der Rezeptor ein unmarkierter Antikörper, kann das markierte spezifisch bindende Reagenz ein Anti- Antikörper sein.
In jeder dieser Ausführungsformen kann der nachweisbare Komplex mit einem spezifisch bindenden Reagenz umgesetzt werden, das entweder mit dem Liganden oder seinem Rezeptor einen Komplex bildet, und das entweder unlöslich ist oder in der Lage ist, den Komplex unlöslich zu machen. Beispielsweise kann das Reagenz Avidin sein, das an ein unlösliches Substrat (teilchenförmig oder nicht teilchenförmig) gebunden ist, wenn entweder der Ligand oder der Rezeptor biotinyliert sind.
In einer bevorzugten Ausführungsform ist das Verfahren ein Verfahren, das im Stand der Technik als ein immunometrisches Verfahren bezeichnet wird. Die Details derartiger Tests sind in der US-A-4,486,530 beschrieben. Ein solcher Test kann verwendet werden, um mehrwertige oder multideterminante Liganden, wie zuvor beschrieben, zu bestimmen, d. h. Liganden, die zwei oder mehr Epitop- Stellen für die immunologische Reaktion mit zwei oder mehr, gleichen oder verschiedenen, Rezeptormolekülen aufweisen. In dem Sandwich-Test wird ein zweiter Rezeptor mit dem Liganden in Kontakt gebracht, und zwar entweder vor, gleichzeitig mit oder nach dem Kontakt des Liganden mit einem ersten Rezeptor. Das Ergebnis ist die Bildung eines Komplexes der beiden Rezeptoren mit dem Liganden, wobei mindestens einer enzymmarkiert ist. Vorzugsweise ist ein zweiter Rezeptor biotinyliert. Der erhaltene Komplex wird unlöslich gemacht, wobei die unlöslichmachende erfindungsgemäße Zusammensetzung verwendet wird, da der biotinylierte Rezeptor und das Avidin auf dem teilchenförmigen Substrat reagieren, und der erhaltene unlöslichgemachte Komplex kann auf geeignete Weise von nichtumgesetztem Material abgetrennt werden. Der andere Rezeptor in dem unlöslichgemachten Komplex ist durch das Enzym nachweisbar.
In einer bevorzugten Ausführungsform umfaßt ein Verfahren zur Bestimmung von hCG in einer wäßrigen Probe (Urin oder Blut) die Schritte:
A. In-Kontakt-bringen einer Probe, von der angenominen wird, daß sie menschliches Choriongonadotropin enthält, mit einem ersten Antikörper (vorzugsweise einem biotinylierten Antikörper) für hCG, um einen immunologischen Komplex zu bilden,
B. gleichzeitig mit oder nach dem Schritt A In- Kontakt-bringen der Probe mit einem zweiten Antikörper für hCG, um einen Sandwich-Komplex zu bilden, wobei der erste und zweite Antikörper mit unterschiedlichen Epitopen reagieren und mindestens einer der Antikörper mit Peroxidase markiert ist und der andere Antikörper entweder unlöslichgemacht ist oder unlöslichgemacht werden kann,
C. Abtrennen nicht komplexgebundener Materialien aus dem Sandwich-Komplex durch eine Filtrationsmembran,
D. In-Kontakt-bringen des abgetrennten Sandwich- Komplexes mit der hier beschriebenen gepufferten wäßrigen Waschzusammensetzung in Gegenwart von Wasserstoffperoxid und
E. Nachweisen des erhaltenen Farbstoffs als eine Indikation des Vorliegens von hCG in der Probe.
Dieses Verfahren kann in der Praxis eines Arztes oder zuhause zur Früherkennung von Schwangerschaft durch das Testen von Urinproben durchgeführt werden.
Die folgenden Beispiele sind zur Durchführung dieser Erfindung typisch und sollen den Umfang der Erfindung nicht einschränken. Sämtliche Prozentangaben sind Gewichtsprozent, falls nicht anders angegeben.

Materialien:

Es wurde ein biotinylierter Antikörper hergestellt, wobei monoklonale Anti-hCG-Antikörper verwendet wurden, die von Immuno-Search Inc. bezogen wurden und Biotin-N-hydroxysuccinimid, das von Calbiochem-Behring Corp. erworben wurde, wobei das von Hofmann et al., J. A. C. S. 100, S. 3585 (1978) beschriebene Verfahren nachgearbeitet wurde.
Der peroxidasemarkierte Antikörper wurde hergestellt, indem von Cambridge Medical Diagnostics erworbene monoklonale Anti-hCG-Antikörper und von Miles, Inc. erworbene Meerrettichperoxidase verwendet wurde, wobei das von Yositake et al. (Eur. J. Biochem., 101, S. 395, 1979) beschriebene Verfahren nachgearbeitet wurde.
Succinyliertes Casein wurde durch Umsetzen von Casein mit einem gleichen Gewicht Succinanhydrid 4 Stunden lang bei 25 ºC hergestellt, und dann wurde das Produkt durch Dialyse gereinigt.
Eine unlöslichmachende Zusammensetzung, die in dieser Erfindung brauchbar ist, wurde hergestellt, indem Teilchen von Poly[styrol-co-m- & p-(2-Chlorethylsulfonylmethyl)- styrol] (Molverhältnis 96 : 4) (0,6 % Feststoffe) in Phosphatpuffer (250 ul, 100 mmolar, pH 7,2) suspendiert wurden.
Avidin wurde durch die reaktiven 2-Chlorethylgruppen auf den Teilchen kovalent an die Teilchen gebunden. In der Zusammensetzung waren ebenfalls Ascorbat (25 mmolar) und sek.-Butanol (2,5 Vol.-%) enthalten.

Beispiel 1: Waschzusammensetzung

Die folgende Zusammensetzung wurde hergestellt und bei der Bestimmung von hCG als eine Waschlösung verwendet, wie in dem folgenden Beispiel 2 beschrieben ist. Es wurde eine Lösung von 2-4-(Hydroxy-3,5-dimethoxyphenyl)-4,5-bis(4-methoxyphenyl) imidazol-Leukofarbstoff (0,2 % Leukofarbstoff) und Polyvinylpyrrolidon (20 %) in Wasser hergestellt. Eine Probe dieser Lösung (5 ml) wurde zu 50 ml einer Lösung zugegeben, die Natriumdihydrogenphosphat (20 mmolar, pH 7,2), Diethylentriaminpentaessigsäure als Chelatbildner (20 umolar), Wasserstoffperoxid (16 mmolar), 4'-Hydroxyacetanilid als Elektronen-Transfer-Agens (8 mmolar), sek.-Butanol (15 ml) und Wasser (30 ml) umfaßte. Dies ergibt etwa 15 Vol.-% sek.-Butanol. Die Endkonzentration des Leukofarbstoffes betrug 0,01 % und die des Polyvinylpyrrolidons betrug 1 %.

Beispiel 2: Test für hCG unter Verwendung einer Waschzusammensetzung zur Bildung eines Farbstoffes

Die Waschzusammensetzung von Beispiel 1 wurde auf folgende Weise in einem Test für hCG verwendet.
In dem Test wurde eine Einweg-Testvorrichtung wie die in der US-A-4,870,007 beschriebene mit einer im Handel erhältlichen 5 um Nylonfiltermembran in jedem der drei Testnäpfchen verwendet. Jede Membran war mit succinyliertem Casein beschichtet. Eines der Testnäpfchen war mit dem biotinylierten Antikörper (3 ug) für hCG beschichtet, der in Polyacrylamid-Bindemittel (60 ug) immobilisiert war. 3-(N-Morpholin)propansulfonsäurepuffer (pH 7,5) wurde an einer separater Stelle in dieser Testnäpfchen getrocknet. Eine zweite Testnäpfchen, die getrockneten Puffer (2 mg) in Polyacrylamid-Bindemittel (60 ug) enthielt, wurde als negative Kontrolle verwendet. Die dritte Näpfchen enthielt getrocknetes hCG (400 mI.U.) an einer von einer getrockneten Beschichtung von biotinylierten Anti-hCG-Antikörper(3 ug) in Polyacrylamid-Bindemittel(60 pg) und Puffer(2 mg) getrennten Stelle als eine positive Kontrolle.
Eine Urinprobe (etwa 200 ul), die zum Entfernen von Verunreinigungen vorher gefiltert wurde, und etwa 50 mI.U./ml hCG enthielt, wurde zu jedem Näpfchen der Testvorrichtung zugegeben und anschließend wurden peroxidasemarkierte Antikörper (40 ul einer 10&supmin;&sup9; molaren Lösung) zugegeben. Nach einminütiger Inkubation wurde die zuvor beschriebene unlöslichmachende Zusammensetzung (40ul einer 0,6%igen Dispersion) zu jedem Näpfchen zugegeben und man ließ die Flüssigkeit durch die Membran einer jeden Näpfchen ablaufen.
Nicht komplex-gebundene Materialien wurden durch die Membranen weggewaschen, wobei die Waschzusammensetzung von Beispiel 1 (110 ul pro Näpfchen) verwendet wurde. Nach zweiminütiger Inkubation wurde der auf den Membranen gebildete Farbstoff visuell bestimmt und ergab einen positiven Test für hCG in der Probe.

Beispiel 3: Test für hCG unter Verwendung von Ascorbat als Reduktionsmittel und Acetonitril als dem wasserlöslichen Solvens

Dieses Beispiel veranschaulicht einen Test für hCG, wobei eine Waschzusammensetzung verwendet wurde, die Acetonitril als wasserlösliches Solvens und Ascorbat als Reduktionsmittel enthielt.
Die verwendete Einweg-Testvorrichtung war dieselbe wie die in Beispiel 2 beschriebene.
Es wurde eine Waschzusammensetzung aus den folgenden Komponenten hergestellt: Leukofarbstoff (0,01 % wie in Beispiel 1), Polyvinylpyrrolidon (1 %), Natriumdihydrogenphosphat (100 mmolar, pH 7,2), Diethylentriaminpentaessigsäure (10 umolar), 4'- Hydroxyacetanilid (4 mmolar), Wasserstoffperoxid (8 mmolar) und Acetonitril (15 Vol.-%).
Die unlöslichmachende Zusammensetzung enthielt: Avidin- Teilchen-Zusammensetzung (0,94 % Feststoffe) Natriumascorbat (25 mmolar), Glucose (18,5 mmolar), Katalase (147 Einheiten/ml) und Glucoseoxidase (0,26 Einheiten/ml). Die letzten drei Komponenten halten das Ascorbat in der reduzierten Form, solange verhindert wird, daß überschüssiger Sauerstoff in die Lösung eindringt.
Der Test wurde wie in Beispiel 2 beschrieben durchgeführt, mit der Ausnahme, daß 28 ul der unlöslichmachenden Zusammensetzung und 160 ul der Waschzusammensetzung zu den Näpfchenen der Testvorrichtung zugegeben wurden.
Der auf den Membranen der Testvorrichtung gebildete Farbstoff wurde visuell als für hCG positiver Test bestimmt.

Beispiel 4: Test für hCG unter Verwendung von Ascorbat als dem Reduktionsmittel und sek.-Butanol als dem wasserlöslichen Solvens

Der in Beispiel 3 beschriebene Test wurde wiederholt, mit der Ausnahme, daß die unlöslichmachende Zusammensetzung 200 mmolares Ascorbat anstelle von 25 mmolarem enthielt. Es wurde festgestellt, daß der auf den Membranen der Testvorrichtung gebildete Farbstoff ein positives Ergebnis für hCG zeigte.

Beispiel 5: Test für hCG unter Verwendung von Hydrochinonsulfonat als dem Reduktionsmit tel und sek.-Butanol als dem wasserlöslichen Solvens

Dieses Beispiel veranschaulicht einen Test für hCG unter Verwendung einer Waschzusammensetzung wie in Beispiel 3 beschrieben, mit der Ausnahme, daß das verwendete wasserlösliche organische So)vens sek.-Butanol (15 Vol .-%) war. Die unlöslichmachende Zusammensetzung, die wie zuvor beschrieben hergestellt wurde, enthielt eine Avidin- Teilchen-Zusammensetzung (0,94 % Feststoffe) und Hydrochinonsulfonat (10 umolar) als das Reduktionsmittel.
Der Test zeigte eine positive Indikation für hCG auf den Membranen der Testvorrichtung.

Claims

1. Gepufferte wäßrige Waschzusammensetzung, umfassend:

a) eine Zusammensetzung, die in der Lage ist, als Antwort auf ein Enzym, das der Marker auf einem spezifisch bindenden Reagens ist, einen Farbstoff zu bilden, und

b) einen Puffer, wobei die Zusammensetzung dadurch gekennzeichnet ist, daß sie darüber hinaus ein wasserlösliches, organisches Solvens umfaßt, das ein Molekulargewicht zwischen 40 und 100 aufweist und in einer Menge von 2,5 bis 25 Vol.-% vorliegt.

2. Waschzusammensetzung nach Anspruch 1, in der die farbstoffbildende Zusammensetzung einen Leukofarbstoff umfaßt, der in der Lage ist, in Gegenwart von Peroxidase und Wasserstoffperoxid einen Farbstoff zu bilden.

3. Waschzusammensetzung nach Anspruch 1 oder Anspruch 2, in der die farbstoffbildende Zusammensetzung darüber hinaus ein Elektronen-Transfer-Agens umfaßt.

4. Waschzusammensetzung nach einem der Ansprüche 1 bis 3, in der das wasserlösliche Solvens ein niedriger Alkohol, Acetonitril, ein Keton oder ein Ether ist.

5. Waschzusammensetzung nach einem der Ansprüche 1 bis 4, in der das wasserlösliche Solvens sek.-Butanol ist.

6. Diagnostischer Testkit, umfassend einen enzymmarkierten Rezeptor für einen spezifisch bindenden Liganden,

wobei der Kit dadurch gekennzeichnet ist, daß er darüber hinaus die gepufferte wäßrige Waschzusammensetzung nach einem der Ansprüche 1 bis 5 umfaßt.

7. Testkit nach Anspruch 6, wobei der markierte Rezeptor ein mit Peroxidase markierter Antikörper für menschliches Choriongonadotropin ist und der Kit darüber hinaus umfaßt:

einen zweiten Antikörper für menschliches Choriongonadotropin, der biotinyliert ist, und eine Zusammensetzung zum Unlöslichmachen des biotinylierten Antikörpers, die polymere Partikel mit an diese gebundenem Avidin umfaßt, und ein Reduktionsmittel.

8. Verfahren zur Bestimmung eines spezifisch bindenden Liganden, umfassend die Schritte:

A. In-Kontakt-bringen einer Probe, von der angenommen wird, daß sie einen vorbestimmten spezifisch bindenden Liganden enthält, mit einem enzymmarkierten Rezeptor für den Liganden, um einen nachweisbaren Komplex aus Ligand und Rezeptor zu bilden,

B. Waschen des nachweisbaren Komplexes mit einer gepufferten wäßrigen Waschzusammensetzung nach einem der Ansprüche 1 bis 5, und

C. Nachweisen des erhaltenen Farbstoffs als einer Indikation für das Vorliegen des spezifisch bindenden Liganden in der Probe.

9. Verfahren nach Anspruch 8, in dem der nachweisbare Komplex mit einem spezifisch bindenden Reagenz umgesetzt wird, das spezifisch mit entweder dem Liganden oder dem Rezeptor einen Komplex bildet, und wobei das bindende Material unlöslich ist oder in der Lage ist, den Komplex unlöslich zu machen.

10. Verfahren nach Anspruch 8, in dem der Farbstoff auf einer mikroporösen Membran nachgewiesen wird, durch die nicht komplexierte Materialien weggewaschen werden.

11. Verfahren zum Nachweis von menschlichem Choriongonadotropin, umfassend die Schritte:

A. In-Kontakt-bringen einer Probe, von der angenommen wird, daß sie menschliches Choriongonadotropin enthält mit einem auf hCG gerichteten ersten Antikörper, um einen immunologischen Komplex zu bilden,

B. In-Kontakt-bringen der Probe, gleichzeitig oder auf den Schritt A folgend, mit einem zweiten Antikörper für hCG, um einen Sandwich-Komplex zu bilden, wobei der erste und zweite Antikörper mit verschiedenen Epitopen reagieren, und mindestens einer der Antikörper mit Peroxidase markiert ist und der andere Antikörper entweder unlöslich gemacht ist oder unlöslich gemacht werden kann,

C. Abtrennen von nicht komplexierten Materialien von dem Sandwich-Komplex durch eine Filtrationsmembran,

D. In-Kontakt-bringen des abgetrennten Sandwich- Komplexes mit einer gepufferten wäßrigen Waschlösung, in Gegenwart von Wasserstoffperoxid, wobei die Waschzusammensetzung eine Waschzusammensetzung nach einem der Ansprüche 1 bis 5 ist, und

E. Nachweisen des erhaltenen Farbstoffs als eine Indikation für das Vorliegen von hCG in der Probe.

12. Verfahren nach Anspruch 11, in dem der andere Antikörper biotinyliert ist und durch In-Kontakt-bringen mit einer unlöslichmachenden Zusammensetzung unlöslich gemacht wird, die ein teilchenförmiges Substrat umfaßt, an das Avidin gebunden ist, und einem Reduktionsmittel.