DE3781180T2

DE3781180T2 - Pruefung unter verwendung von bindungspaargliedern auf teilchen und auf einem filter oder einer membran.

Info

Publication number: DE3781180T2
Application number: DE8787302338T
Authority: DE
Inventors: Brian Bertolotti Lentrichia; Michael Francis Turanchik
Original assignee: IL Holding Spa
Current assignee: IL Holding Spa
Priority date: 1986-03-18
Filing date: 1987-03-18
Publication date: 1992-12-17
Anticipated expiration: 2007-03-19
Also published as: EP0239318A1; US4960692A; EP0239318B1; DE3781180D1

Description

Die vorliegende Erfindung betrifft Verfahren und Ausrüstungen für spezifische Bindungsassays, z. B. Immunoassays, mit Bindungspaargliedern auf suspendierbaren Teilchen.
Immunoassays mit suspendierbaren Teilchen (z. B. Polystyrollatex) sind bekannt, wobei die Anwesenheit von Analyt-Bindungspaargliedern die Bindung von Teilchen aneinander beeinflußt. In manuellen Assays werden die agglutinierten Teilchen durch die Schwerkraft beobachtet oder getrennt. In der US-A-4 202 665 wirken agglutinierte Teilchen spezifisch in einem Zentrifugenfeld. Alternativ binden sich Teilchen zweier spezifischer Gewichte in einer Menge aneinander, die durch die Analytkonzentration beeinflußt wird. Wenn zunächst Teilchen eines spezifischen Gewichtes durch Zentrifugenwirkung bewegt werden, bewegen sich jene zweiten Teilchen des anderen spezifischen Gewichtes, die daran gebunden sind, mit den ersten Teilchen. Siehe auch US-A-4 115 535 für Assays mit zwei Teilchen, von denen jedes ein Protein hat, das sich an denselben Analyt bindet.
Die US-A-4 459 361 beschreibt einen Teilchenimmunoassay, in welchem Teilchen als eine Funktion der Analytligandenkonzentration an andere Teilchen binden oder mit ihnen agglutinieren. Filtration (z. B. durch ein 0,4-Mikrometer-Porengrößenfilter) erlaubt es, daß einzelne Teilchen (z. B. mit einem Durchmeser von 0,3 um) durchgehen, während Doppelteilchen und höhere Teilchenaggregate durch das Filter abgefangen werden. Durch das Filter gehende Teilchen können durch Farbe, optische Dichte, Fluoreszenz oder andere Eigenschaften der Teilchen oder durch an die Teilchen gebundene Enzyme (Spalte 4, Zeile 42 bis Spalte 5, Zeile 4) sichtbar gemacht oder in der Sichtbarkeit verstärkt werden.
Die US-A-4 424 279 beschreibt eine Assaymethode und eine Kolbenapparatur, worin große Teilchen (mit einem Durchmesser von 20 bis 30 um), die ein Bindungspaarglied (z. B. Antikörper) tragen, in einer Kammer der Apparatur angeordnet werden. Ein Analyt-Bindungspaarglied (z. B. Antigen) und ein lösliches markiertes Bindungspaarglied (z. B. zweites Antikörper-Enzym) gelangen jeweils in die Kammer der Apparatur während einer Reaktionsperiode, und dann werden Flüssigkeiten aus der Kammer der Apparatur durch Vakuum abgezogen, wobei die Teilchen durch ein grobes Filter (z. B. mit einer Porengröße von 15 bis 17 um zurückgehalten werden. Danach werden in der Kammer der Apparatur verbleibende Teilchen hinsichtlich der Markierungen durch Zusatz von enzymatischen Reagentien und Spaltung der Bindung zwischen dem Enzym und dem zweiten Antikörper geprüft.
Verschiedene Literaturstellen einschließlich L. A. Blankstein et al, Am. Clin. Prod. Rev., Seiten 33 bis 41 (November 1985), US-A-4 200 690, US-A-4 246 339 und US-A-4 407 943 beschreiben Immunoassays, in welchen ein Antikörper oder Antigen in einer mikroporösen Membran mit einer sehr großen (0,65 bis 5,0 um) Porengröße immobilisiert wird, damit entweder kleine Moleküle oder kleine Moleküle und Bakterien durch die Membran wandern. So fängt in in der US-A-4 200 690 ein auf einer solchen Membran als Überzug aufgebrachter Antikörper Analytantigen aus der rohen Probe ein. Nach dem Waschen wird ein mit einem Enzym konjugierter (lösliches Konjugat) zweiter Antikörper eingeführt, um sich spezifisch an gebundenes Analytantigen zu binden. Nach dem Waschen wird die enzymatische Ablesung mit jener von einer ähnlichen Membran mit einem für den Analyten nicht spezifischen Antikörper darauf verglichen. Die US-A-4 407 943 von Cole ist ähnlich.
Die US-A-4 486 530 beschreibt Immunoassays mit monoklonalen Antikörpern, besonders von Sandwich-Geometrie. Es wird jedoch in Spalte 15, Zeilen 33 bis 51 auf einen Assay Bezug genommen, der mit Chromophor markiertes Antigen und an Latex gebundenen monoklonalen Antikörper verwendet, so daß Analytantigen Agglomerierung hemmt und so gestarttet, daß der Chromophor in Lösung bleibt, wo seine Fluoreszenz nicht ausgelöscht wird. Andere Hemmungsassays, wo ein Bindungspaarglied an Teilchen gebunden sein kann, sind in der US-A-4 308 026 beschrieben.
Die WO-A-85/5451 beschreibt einen Assay für die Bestimmung eines Zielliganden in einer Fließmittelprobe, bei dem die Fließmittelprobe durch ein poröses Teil gezogen wird, an welches ein Rezeptor für den Zielliganden gebunden ist oder welches Zellmaterial, mit welchem der Zielligand verbunden ist, durch einen Körper von Adsorbensmaterial abtrennen kann, wobei ein markierter zweiter Rezeptor zu der Fließmittelprobe zugesetzt wird oder anschließend durch das poröse Teil gezogen wird, und an Liganden, der an ersten Rezeptor gebunden ist, gebundener markierter zweiter Rezeptor wird festgestellt. Die EP-A-70 527 beschreibt einen Sandwich-Assay, in welchem eine Probe zunächst mit einem Bindungspaarglied, das an eine Festphase gebunden ist, und als zweites mit einem markierten Bindungspaarglied, das durch Bindung feiner Teilchen markiert ist, umgesetzt wird.
Gemäß der vorliegenden Erfindung bekommt man ein Verfahren zur Bestimmung eines Analyt- Bindungspaargliedes in einer biologischen Probe mit den Stufen, in denen man
a) suspendierte Teilchen, die zu den Analyt-Bindungspaargliedern komplementäre erste Reagens-Bindungspaarglieder tragen, mit der biologischen Probe unter Bedingungen in Berührung bringt, bei denen die Analyt-Bindungspaarglieder, wenn vorhanden, sich an die ersten Reagens-Bindungspaarglieder binden,
b) das Reaktionsgemisch aus der Behandlungsstufe (a) durch ein Filter führt, durch desen Poren die Teilchen, wenn sie nicht an das Filter gebunden werden, gehen, wobei das Filter zu den ersten Reagens-Bindungspaargliedern komplementäre und mit den Analyt- Bindungspaargliedern für Bindungsstellen an den ersten Reagens-Bindungspaargliedern kompetitive zweite Reagens-Bindungspaarglieder trägt, und
c) die durch das Filter gehenden Teilchen als eine Anzeige der Anwesenheit und Menge von Analyt-Bindungspaargliedern in der biologischen Probe bestimmt.
Die Teilchen, die durch das Filter gehen, können beispielsweise durch Widerstandsimpulstechniken, durch Lichtabsorption oder Lichtstreuung oder durch enzymatische Ablesung festgestellt werden.
Die Erfindung liefert auch eine Ausrüstung zur Bestimmung (qualitativ oder quantitativ) eines Analyt-Bindungspaargliedes in einer biologischen Probe mit
a) einer Suspension von Teilchen, die zu Analyt-Bindungspaargliedern komplementäre erste Reagens-Bindungspaarglieder tragen,
b) einem Filter mit genügend großer Porengröße, um Teilchen, wenn sie nicht an das Filter gebunden sind, durch das Filter hindurchzulassen, und
c) an dem Filter immobilisierte zweite Reagens-Bindungspaarglieder, die zu den ersten Reagens-Bindungspaargliedern komplementär sind und mit den Analyt-Bindungspaargliedern für Bindungsstellen an den ersten Reagens-Bindungspaargliedern kompetitiv sind.
Die vorliegende Erfindung läßt sich auf qualitative oder quantitative Feststellung verschiedener Typen von Bindungspaargliedern einschließlich Antigenen, Haptenen, Antikörpern, Bindungsproteinen, Rezeptoren und Nucleinsäuresequenzen anwenden. Zur Erleichterung der Wiedergabe werden zunächst Assays für Antigene oder Antikörper beschrieben. Kommentare über Assays für andere Analyten werden danach beschrieben. Der Ausdruck "komplementär" für zwei Bindungspaarglieder wird in dem Sinne verwendet, daß sie in der Lage sind, sich spezifisch aneinander zu binden, allgemein mit Hilfe ionischer Wechselwirkungen und/oder Wasserstoffbindungen. Der Ausdruck "kompetitiv" für die Analyt- und zweiten Bindungspaarglieder wird in dem Sinne verwendet, daß jedes komplementär zu den ersten Bindungspaargliedern ist und daß eine Bindung des Analyt-Bindungspaargliedes an das erste Bindungspaarglied die Stellen an dem ersten Bindungspaarglied, an die sich das zweite Bindungspaarglied binden kann oder sonst (z. B. sterisch) eine Bindung zwischen dem ersten und zweiten Bindungspaarglied hemmt, reduziert (oder beseitigt).
Zwei bei der vorliegenden Erfindung verwendete Reagentien sind eine Suspension von Teilchen, die ein erstes Bindungspaarglied tragen, und ein Filter oder eine Membran, die eiin zweites Bindungspaarglied tragen. Die Teilchen können verschiedene zellförmige, synthetische oder anorganische Typen sein, wie fixierte Erythrozyten, Bakterienzellen, Virusteilchen, Polystyrollatexteilchen, metallische Sole, angefärbte Cholesterinlecithinteilchen, Aktivkohle, feinteilige Farbstoffe und Bentonitteilchen. Bevorzugt sind die synthetischen Polymerlatexteilchen und besonders Polystyrollatexteilchen. Solche Teilchen können verschiedene Größen haben, wie beispielsweise einen Durchmesser von 0,05 bis 5,0 um, wobei Teilchen mit einem Durchmesser von 0,1 bis 1,5 um bevorzugt sind. Obwohl Teilchen mit einer relativ engen Teilchengrößenverteilung benutzt werden können (z. b. 90% der Teilchen mit einem Durchmesser innerhalb von 10 % Abweichung vom Mittelwert), können auch etwas breitere Verteilungen annehmbar sein.
Das erste Bindungspaarglied kann an die Teilchen nach einer Vielzahl bekannter Methoden adsorbiert oder gebunden werden, z. B. durch physikalische Adsorption, chemische Carbodiimidbindung oder Vernetzung mit einem mono- oder bifunktionellen Aldehyd. Die Teilchen können mit Materialien, wie Albumin, vorbeschichtet oder gleichzeitig beschichtet werden, um nichtspezifische Adsorption oder Agglomerierung von Teilchen zu hemmen. Die Teilchen können weiterhin eine Markierung enthalten oder darauf adsorbiert oder gebunden besitzen, wie fluoreszierende Moleküle, Enzyme, Farbstoffe oder Radioisotopen. In dem nachfolgend beschriebenen beispielartigen System ist das erste Bindungspaarglied ein für Digoxin spezifischer Antikörper.
Außer einer direkten Bindung der Markierung (z. B. des Enzyms) an das Teilchen kann man auch die Markierung an das Bindungspaarglied (z. B. den Antidigoxinantikörper) binden oder die Markierung (z. B. das Enzym) mit Avidin oder Biotin konjugiert haben, wobei das andere, Avidin oder Biotin, an das Bindungspaarglied (z. B. den Antidigoxinantikörper) oder an das Teilchen (kovalent oder durch Adsorption) gebunden ist, um so eine indirekte Bindung über eine Avidin- Biotin-Brücke zu bekommen.
Das Reagens, welches zweites Bindungspaarglied enthält, ist eine Membran oder ein Filter, auf dem das zweite Bindungspaarglied gebunden ist. Solche Membranen oder Filter wurden oftmals als solche für zwei Anwendungen beschrieben: 1. Affinitätsreinigung des komplementären Bindungspaargliedes oder 2. diagnostische Assays für das komplementäre Bindungspaarglied, in welchem die restlichen Reagentien gelöst sind. Besonders bevorzugt sind die mikroporösen Membranen der US-Patentschriften 4 066 512, 4 200 690, 4 246 339 und 4 407 943, in welchen eine Polymermembran [z. B. Nylon oder Poly-(vinylidenfluorid)] sowohl mit dem zweiten Bindungspaarglied als auch mit einem inerten Protein (z. B. Zein) beschichtet wird, um nichtspezifische Adsorption zu verzögern. Porengrößen der Membran sollten für die vorliegende Erfindung größer als der Durchmesser der Teilchen und vorzugsweise wenigstens etwa 400 % des mittleren Durchmessers der Teilchen sein. Wenn somit Membranen einer Porengröße von 5,0 um verwendet werden, könnten Teilchen mit einem mittleren Durchmesser kleiner als 5,0 um benutzt werden, doch sind Teilchen mit einem mittleren Durchmesser von etwa 1,25 um oder weniger bevorzugt. Wenn Membranen (Filter) von 3,0 um Porengröße verwendet werden, haben die Teilchen ähnlich bevorzugt einen mittleren Durchmesser von 0,75 um oder weniger.
In einem beispielhaften Assay für Digoxin (ein Hapten, das häufig als ein therapeutisches Mittel überwacht wird) können die Teilchen Antidigoxinantikörper tragen (aufgebaut durch die Impfung eines Tieres, z. B. von Kaninchen, mit einem Digoxinkonjugat, z. B. Digoxin-Albumin). Die Membran kann in einem solchen Fall ein Digoxin-Albuminkonjugat tragen. Nach Berührung der Teilchen mit einer Probe (z. B. aus einem Patientenserum) haben einige der Teilchen mit Analytdigoxin blockierte Antikörperstellen. Diese Reaktion kann sehr schnell ein Gleichgewicht erreichen und erfordert in den meisten Fällen 1 min oder weniger, um entweder ein Gleichgewicht oder einen ausreichenden Reaktionsgrad zu bekommen. Je mehr Analytdigoxin vorhanden ist, desto mehr Teilchen haben einige oder alle Antikörperstellen blockiert. Wenn das Reaktionsgemisch dann durch die Membran geschickt wird, gehen jene Teilchen mit wenigen oder keinen freien Antikörperstellen bevorzugt durch das Filter. Jene Teilchen, bei denen die meisten oder alle ihre Antikörperstellen frei sind, haften an den Digoxin-Albuminstellen an der Membran an und gehen nicht durch. Diese Reaktion ist auch sehr schnell und kann einfach in der Weise durchgeführt werden, daß man das Reaktionsgemisch durch das Filter unter der Wirkung von Druck oder Vakuum gehen läßt. Mit der geeigneten Antikörperbeladung auf Teilchen und mit geeignetem Teilchen/Serumgehalt, was jeweils leicht durch Routineexperimente zu bestimmen ist, kann ein Assaysystem entwickelt werden, das eine meßbare positive Wechselbeziehung zwischen dem Digoxingehalt im Serum (in dem interessierenden Bereich) und Teilchen in dem Eluat durch die Membran ergibt. Die vorliegenden Bespiele erläutern Dosis-Ansprechkurven in solchen Fällen, wobei die eluierten Teilchen durch enzymatische Ablesung (Beispiel 1), turbidimetrische Messung (Beispiel 2) oder Teilchenauszählung (welche unter Verwendung des gleichen Latexreagens und behandelten Filters, wie im Beispiel 2 beschrieben, durchgeführt wurde) gemessen werden.
Mehrere andere beispielhafte Systeme nach der vorliegenden Erfindung finden Anwendung bei der Benutzung der vorliegenden Erfindung zur Ermittlung von Antikörpern, Nucleinsäuresequenzen oder multiepitopischen Antigenen. So kann für die Feststellung von Antikörpern das komplementäre Antigen auf den Teilchen sein und ein mit dem Analytantikörper kompetitiver Antikörper auf der Membran (dem Filter) sein. Zur Feststellung einer Zielnucleinsäuresequenz kann eine komplementäre Nucleinsäuresequenz auf den Teilchen und eine kompetitive Nucleinsäuresequenz auf der Membran sein (siehe schwebende US-Patentanmeldung Serial No. 790 671 von Ellwood, Diamond und Collins, angemeldet am 23. Oktober 1985, äquivalent zur EP- A-0 219 842).
In ähnlicher Weise können Ausführungsformen der vorliegenden Erfindung verwendet werden, um Haptene (einschließlich Digoxin, Theophyllin, Thyroxin, Alkoholmißbrauchmittel und Gentamycin), Antigene (einschließlich HCG, LH, Transferrin, CRP und CEA), virale Mittel (wie Herpes vom allgemeinen oder speziellen Typ, Hepatitis vom allgemeinen oder speziellen Typ und HTLV-III), Tumorantigene, Exotoxine, andere durch Bakterien- oder Parasitenorganismen abgegebene Proteine, Antikörper (einschließlich jener gegen Streptolysin-O, DNase-B, HTLV-III oder Röteln oder jene, die mit infektiöser Mononucleose verbunden sind), virale DNA- oder RNA- Sequenzen, bakterielle oder parasitäre DNA-, mRNA- oder rRNA-Sequenzen, folatgebundenes Protein oder thyroxinbindendes Protein festzustellen.
Im allgemeinen ist zu sagen, daß die Bindungspaarglieder auf einigen Teilchen Bindungspaarglieder auf anderen Teilchen nichtspezifisch binden.

Beispiel 1

Von einem 0,465 m² (5 Quadratfuß) großen Abschnitt einer "Biodyne"-Immunoaffinitätsmembran (BIAO 50 C 5, Pall Corporation) mit einer Porengröße von 5,0 um wurden Kreise von 13 mm Durchmesser ausgeschnitten. Die carboxylataktivierten Filter wurden dann durch Untertauchen entweder in einer Lösung von 10 mg/ml BSA in PBS oder von 10 mg/ml BSA-Digoxinkonjugat in PBS während 2 h bei Raumtemperatur umgesetzt. Die Filter wurden dann durch Inkubation in PBS allein nach der gleichen Methode gewaschen. Nach Abtupfen des BSA und BSA-Digoxin ließ man die aktivierten Filter an Luft trocknen.
Unmodifizierte Polystyrollatexteilchen mit einem Durchmesser von 0,30 um (Japanes Synthetic Rubber Co., Nr. G 2203) wurden zunächst einer Adsorption mit Antidigoxin-Kaninchengesamtserum mit 180 ugt Protein je Milligramm Latex in 0,05 M Phosphatpuffer pH 7,8 durch Inkubation bei Raumtemperatur unter mildem Rühren während 2,5 h unterzogen. Nach Waschen mit Latex durch Zentrifugieren in dem gleichen Phosphatpuffer wurden die teilweise adsorbierten Teilchen dann in einer 64 mg/ml-Lösung von gereinigter Glucoseoxidase (EC 1.1.3.4.) in Phosphatpuffer pH 7,8 während 10 h bei 4 ºC inkubiert. Nach wiederholtem Waschen des Latex durch Zentrifugieren in PBS mit einem Gehalt von 10 mg/ml BSA (PBS/BSA) wurden die Teilchen schließlich bis zu einer Konzentration von 20 ug Latex je Milliliter (0,002 %) in demselben Puffer suspendiert.
Die antigensensibilisierten Filter wurden in Haltern vom Swinney-Typ, die mit 1 cm³-Spritzen ausgestattet waren, angeordnet. Das oben beschriebene Latexreagens (0,25 ml mit 0,002 %) wurde dann mit 0,25 ml PBS/BSA vereinigt, das verschiedene Analytkonzentrationen enthalten würde, und das gesamte Gemisch ging durch das Filter und in ein Röhrchen, das 0,30 ml eines Substratgemisches enthielt, welches 1,8 % Glucose, 8,7 Einheiten je Milliliter Meerrettich- Peroxidase und 1,2 mM 4-Aminoantipyrin enthielt. Das gesamte Gemisch wurde gerührt, bei 37 ºC während 5 min inkubiert, und die Absorption bei 510 nm wurde abgelesen.
Die digoxinsensibilisierten Filter hielten etwa 80 % der gesamenten festgestellten Enzymaktivität zurück, während die BSA-sensibilisierten Filter nur etwa 28 % zurückhielten (Tabelle I). Der Unterschied zeigt jene Anzahl von Latexteilchen, die über Digoxinimmunoreaktivität spezifisch an das Filter gebunden sind. Die zurückgehaltene Teichenzahl könnte auch durch Inkubation des Filters selbst mit dem Substratgemisch festgestellt werden.

Empfindlichkeit

Latexteilchen (0,40 um) wurden mit Antidigoxinserum und Glucoseoxidase, wie oben beschrieben, adsorbiert. Dann wurden 0,25 ml einer 0,0132 %igen (Gewicht/Gewicht) Suspension des Latex mit 0,25 ml PBS/BSA-Puffer mit einem Gehalt verschiedener Konzentrationen an Digoxin vermischt, bevor sie durch das digoxinsensibilisierte Filter und in 0,30 ml einer Substratlösung (Gesamtvolumen = 0,80 ml) geführt wurden. Nach Mischen und Inkubieren der Reaktion bei 37 ºC während 5 min wurde die optische Dichte bei 510 nm aufgezeichnet. Der Assay war empfindlich gegenüber wenigstens 5 ng/ml (Tabelle II). Nur 7 % der Gesamtaktivität wurden in der Membran infolge nichtspezifischer Wechselwirkung (unfiltrierte Kontrollprobe gegenüber BSA-Filter) zurückgehalten. Tabelle I Spezifische Rückhaltung von immunoreaktiven Latexteilchen durch digoxinsensibilisierte Mebranen % zurückgehaltener Latex Digoxinfilter BSA-Filter kein Filter Tabelle II Membranempfindlichkeit - Latexassay ng Digoxin/ml % zurückgehaltener Latex BSA-Filter unfiltrierte Kontrollprobe

Beispiel 2

Unmodifizierte Styrollatexteilchen mit einem Durchmesser von 1,09 µm (Japanese Synthetic Rubber Co., Nr. G 2101) wurden mit Antidigoxin-Gesamtkaninchenserum bei 200 um Protein je Milliliter Latex unter den gleichen Bedingungen, wie in Beispiel 1 beschrieben, adsorbiert. Nach dieser Sensibilisierung der Teilchen mit Antikörper wurden sie durch Zentrifugieren wiederholt in PBS/BSA gewaschen und schließlich bis zu einer Konzentration von 0,003 % (Gewicht/Gewicht) wieder suspendiert, wie durch optische Dichte bei 650 nm bestimmt wurde. Ein Abschnitt von "Biodyne"-Immunoaffinitätsmembran (Nr. BIO 50 C 5, Pall Corporation) mit einer mittleren Porengröße von 5,0 µm wurde zu Kreisen mit einem Durchmesser von 13 mm zerschnitten und mit einem BSA-Digoxinkonjugat aktiviert, das auch in Beispiel 1 beschrieben ist.
Um den Assay durchzuführen, wurden 1,5 ml der 0,003 %igen Latexsuspension mit 0,5 ml einer digoxinhaltigen Lösung in PBS vermischt, und das Gemisch wurde durch die Immunoaffinitätsmembran unter Verwendung einer 5 cm³-Spritze geführt. Die optische Dichte des Filtrats wurde dann bei 650 nm in einem Spektrophotometer gemessen.
Wie aus Tabelle III ersichtlich ist, wurde in Gegenwart von 10 ng/ml des Analyten ein über siebenfach größeres OD gegenüber dem OD beobachtet, das man in Abwesenheit von Digoxin findet. Außerdem stieg die Anzahl von Teilchen, die durch das Filter ging, mit steigenden Digoxinkonzentrationen weiter an. Eine bis zu 14fache Steigerung bei 100 ng/ml wurde gefunden, also bei einer Konzentration nahe der Sättigung für die teilchenimmobilisierten Bindungsstellen. Tabelle III Digoxinimmunoassay durch turbidimetrische Membranlatexmethode (manuell) ng Digoxin/ml

Beispiel 3

Reagenszusammensetzung

Biodyne-Immunoaffinitätsfilter (Korngröße 5,0 um) wurden zunächst mit menschlichem Sottenhaut-Gonadotropin (HCG) nach dem folgenden Verfahren sensibilisiert: Filter mit einem Durchmesser von etwa 35,13 mm wurden einzeln in eine 2 ml-Lösung mit einem Gehalt von 4,5 mg/ml HCG gegeben, das durch Gelfiltration und DEAE-Ionenaustauschchromatographie (8409 IE/mg Feststoff) in PBS gereinigt worden war. Nach dem Tränken bei Raumtemperatur während 1 h wurden die Filter in 250 ml Lösung PBS mit einem Gehalt von 10 gm/ml Rinderserum Albumin (BSA) und 0,1 % Natriumazid überführt und weitere 20 min getränkt. Die Filter wurden schließlich durch Eintauchen in destilliertes Wasser gespült, auf Filterpapier abgetupft und bei Raumtemperatur getrocknet.
Latexteilchen mit einem Durchmesser von 0,49 um (JSR Nr. UO 403) wurden mit monoklonalem Anti-beta-HCG-Antikörper und Glucoseoxidase nach dem folgenden Verfahren sensibilisiert. Teilchen, die in 0,01 M Natriumphosphatpuffer pH 7,8 gewaschen worden waren, wurden in demselben Puffer bis zu einer Endkonzentration von etwa 10 % suspendiert, und 20 mg (0,20 ml) wurden in einen kleinen Kolben mit Glasschraubdeckel überführt. Sodann wurden 0,10 ml (0,56 mg) Protein eines gereinigten monoklonalen Anti-beta-HCG-Antikörpers (Maritime Chemical Corporation) zugegeben. Nach Inkubation bei 4 ºC über Nacht wurde die Latexprobe einmal durch Zentrifugieren in Phosphatpuffer gewaschen, in 0,10 ml desselben Puffers wieder suspendiert, und 10 mg feste gereinigte Glucoseoxidase (Boehringer Mannheim) wurden bis zu einem Gesamtvolumen von etwa 0,20 ml zugegeben. Das Reaktionsgemisch wurde 1 h bei Raumtemperatur inkubiert, zweimal mit 10 mg/ml BSA in PBS durch Zentrifugieren gewaschen und schließlich bis zu einer Konzentration von 0,88 % (8,8 mg Latex je Milliliter) in PBS/BSA mit einem Gehalt von 0,1 % Azid wieder suspendiert.

Assayverfahren

Ein frisches Substratgemisch, wie es in Beispiel 1 beschrieben ist, wurde hergestellt, und 0,5 ml wurden jeweils in fünf Reagenzgläser von 12 x 75 mm gegeben. Die oben beschriebenen HCG-sensibilisierten Filter wurden in Filterhalter vom Swinney-Typ gegeben, von denen jeder mit 1 cm³-Tuberkulinspritzen ohne Kolben ausgestattet war. Latex-Analytgemische wurden durch Vermischen von 0,01 ml 0,88 %igem Latex mit 0,69 ml Lösungen mit einem Gehalt der verschiedenen Konzentrationen von gereinigtem HCG in PBS/BSA-Puffer, die in Tabelle IV gezeigt sind, hergestellt (Endlatexkonzentration = 0,013 %). Nach dem Stehen bei Raumtemperatur während 2 bis 3 min wurden die Latexsuspensionen einzeln in verschiedene Spritzen überführt, die mit Filtern ausgestattet waren, und in die Reagenzgläser gepreßt, die das Substrat enthielten.
Die Absorption jeder Suspension bei einer Wellenlänge von 510 nm wurde nach einer 5minütigen Inkubation in einem Wasserbad von 37 ºC bestimmt, indem das Reagenzglas direkt in einem Spektrophotometer Spectronic 21 (Bausch und Lomb) gegeben wurde.
Eine Standardkurve für HCG nach der oben beschriebenen Methode ist in Tabelle IV gezeigt. Der größte Teil des erhaltenen OD-Gesamtunterschiedes wurde bei einer Konzentration von 5 IE/ml (84 %) mit einer allmählichen Steigerung des OD bis zu 40 IE/ml beobachtet. Tabelle IV Immunoassay für beta-HCG unter Verwendung der enzymergänzten Latex-Immunoaffinitätsfiltermethode

Claims

1. Verfahren zur Bestimmung eines Analyt-Bindungspaargliedes in einer biologischen Probe mit den Stufen, in denen man

a) suspendierte Teilchen, die zu den Analyt-Bindungspaargliedern komplementäre erste Reagenz-Bindungspaarglieder tragen, mit der biologischen Probe unter Bedingungen in Berührung bringt, bei denen die Analyt-Bindungspaarglieder, wenn vorhanden, sich an die ersten Reagenz-Bindungspaarglieder binden,

b) das Reaktionsgemisch von der Behandlungsstufe (a) durch ein Filter führt, durch dessen Poren die Teilchen, wenn sie nicht an das Filter gebunden werden, gehen, wobei das Filter zu den ersten Reagenz-Bindungspaargliedern komplementäre und mit den Analyt-Bindungspaargliedern für Bindungsstellen an den ersten Reagenz- Bindungspaargliedern kompetitive zweite Reagenz-Bindungspaarglieder trägt, und

c) die durch das Filter gehenden Teilchen als eine Anzeige der Anwesenheit und Menge von Analyt-Bindungspaargliedern in der biologischen Probe bestimmt.

2. Verfahren nach Anspruch 1, bei dem die ersten Reagenz-Bindungspaarglieder Antikörper sind.

3. Verfahren nach Anspruch 1 oder 2, bei dem die zweiten Reagenz-Bindungspaarglieder und die Analyt-Bindungspaarglieder Haptene sind.

4. Verfahren nach Anspruch 1 oder 2, bei dem die zweiten Reagenz-Bindungspaarglieder und die Analyt-Bindungspaarglieder Antigene sind.

5. Verfahren nach einem der vorausgehenden Ansprüche, bei dem die Teilchen einen Durchmesser von 0,05 bis 5 um haben und bei dem das Filter eine Porengröße von wenigstens 200 % des Durchmessers der Teilchen hat.

6. Verfahren nach einem der vorausgehenden Ansprüche, bei dem man in der Stufe (c) das Eluiermittel, welches durch das Filter gegangen ist, durch eine Öffnung führt und die Impedanz durch die Öffnung mißt.

7. Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 5, bei dem man in der Stufe (c) das Absorptionsvermögen des Eluiermittels, welches durch das Filter gegangen ist, mißt.

8. Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 5, bei dem die Teilchen fluoreszierend sind und man in der Stufe (c) die Fluoreszenz des Eluiermittels, welches durch das Filter gegangen ist, mißt.

9. Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 5, bei dem die Teilchen ein Enzym tragen und man in der Stufe (c) das Eluiermittel, welches durch die Öffnung gegangen ist, mit Reagenzien für das Enzym vermischt.

10. Ausrüstung für die Bestimmung eines Analyt-Bindungspaargliedes in einer biologischen Probe mit

a) einer Suspension von Teilchen, die zu Analyt-Bindungspaargliedern komplementäre erste Reagenz-Bindungspaarglieder tragen,

b) einem Filter mit genügend großer Porengröße, um Teilchen, wenn sie nicht an das Filter gebunden sind, durch das Filter hindurchzulassen, und

c) an dem Filter immobilisierte zweite Reagenz-Bindungspaarglieder, die zu den ersten Reagenz-Bindungspaargliedern komplementär sind und mit den Analyt- Bindungspaargliedern für Bindungsstellen an den ersten Reagenz-Bindungspaargliedern kompetitiv sind.

11. Ausrüstung nach Anspruch 10, bei der die ersten Reagenz-Bindungspaarglieder Antikörper sind.

12. Ausrüstung nach Anspruch 10 oder 11, bei der die zweiten Reagenz-Bindungspaarglieder und die Analyt-Bindungspaarglieder Haptene sind.

13. Ausrüstung nach Anspruch 10 oder 11, bei der die zweiten Reagenz-Bindungspaarglieder und die Analyt-Bindungspaarglieder Antigene sind.