DE3872500T2

DE3872500T2 - Verwendung eines mit biotin verknuepften immobilisierten rezeptors in einer testvorrichtung, einem testsatz und einer methode zur bestimmung eines liganden.

Info

Publication number: DE3872500T2
Application number: DE8888311906T
Authority: DE
Inventors: Margaret Jeannette Smith-Lewis
Original assignee: Eastman Kodak Co
Current assignee: Ortho Clinical Diagnostics Inc
Priority date: 1987-12-18
Filing date: 1988-12-16
Publication date: 1993-02-11
Anticipated expiration: 2008-12-17
Also published as: JPH0731206B2; EP0321261A1; US4870007A; JPH01202663A; CA1303495C; EP0321261B1; DE3872500D1

Description

Die Erfindung betrifft eine Vorrichtung sowie ein Verfahren zu ihrer Verwendung, um einen Liganden in wässrigen Flüssigkeiten, wie beispielsweise biologischen Flüssigkeiten zu bestimmen. Die Erfindung betrifft weiterhin einen Testsatz, welcher die Vorrichtung enthält.
Es besteht in der medizinischen Praxis, in der Forschung und bei diagnostischen Verfahren beständig das Bedürfnis nach schnellen zuverlässigen qualitativen oder quantitativen Bestimmungen biologischer Substanzen, die in biologischen Flüssigkeiten mit kleinen Konzentrationen vorhanden sind. Beispielsweise muß die Anwesenheit von Arzneimitteln/Drogen, Narkotika, Hormonen, Steroiden, Polypeptiden, Prostaglandinen oder infektiösen Organismen im Blut, Urin, Speichel, Vaginalsekreten, Samenflüssigkeiten und anderen biologischen Flüssigkeiten in genauer und schneller Weise für eine angemessene Diagnose oder Behandlung bestimmt werden.
Um diese Bestimmungen zu ermöglichen, wurden verschiedenen Methoden zur Isolierung und Identifizierung biologischer Substanzen unter Verwendung spezifischer Bindungsreaktionen zwischen der zu bestimmenden Substanz (hier als "Ligand" bezeichnet) und Rezeptoren, die eine spezifische Reaktivität mit dieser Substanz aufweisen, ersonnen. Es wurden radioaktive oder Enzym-Marker zur Bestimmung des sich ergebenden reaktiven Komplexes verwendet.
Im Stand der Technik ist eine bestimmte Art des Tests, der entwickelt wurde, als immunometrischer oder "Sandwich-Assay" bekannt. Ein solcher Test beeinhaltet, daß der Ligand (wie beispielsweise ein Antigen) mit zwei oder mehr Rezeptormolekülen (wie beispielsweise Antikörpern), die mit der Verbindung in einer nicht-störenden Weise und an unterschiedlichen Epitopenstellen komplexieren, ein "Sandwich" ausbildet. Die Verwendung monoklonaler Antikörper mit hoher Affinität in Sandwich-Assays ist ebenso bekannt. Bei den meisten Sandwich-Assays werden ein oder mehrere Rezeptormoleküle in geeigneter Weise auf einem unlöslichen Träger wie beispielsweise kleinen Partikeln, Membranen, Plättchen oder ähnlichen Objekten immobilisiert, wie in der US-A-4 496 654 beschrieben, wo ein biotinylierter Antikörper auf einem mit Avidin beschichteten Träger immobilisiert ist.
Bei Avidin handelt es sich um im Eiweiß vorkommendes Protein. Biotin oder Hexahydro-2-oxo-1H-thieno[3,4]imidazol-4-pentansäure (auch als Vitamin H bekannt) ist ein relativ kleines wasserlösliches Molekül. Von diesen Substanzen ist bekannt, daß sie spezifisch miteinander reagieren, wobei ein sehr starker und stabiler Komplex ausgebildet wird, in dem jede der vier Untereinheiten des Avidins ein Biotinmolekül bindet. Diese starke Bindung wird auch dann aufrechterhalten, wenn entweder Biotin oder Avidin oder beide kovalent an andere Materialien gebunden werden.
Die EP-A-201 079 beschreibt Sandwich-Assays, in denen der Komplex zwischen dem Liganden und zwei Rezeptoren in Lösung gebildet wird. Einer der Rezeptoren (beispielsweise ein Antikörper) ist mit entweder Biotin oder Avidin konjugiert. Ein Träger mit daran gebundenem Biotin oder Avidin wird dazu verwendet, den sich ergebenden ternären Komplex zu insolubilisieren. Während der Assay nach der EP-A-201 079 vorgeblich gewisse Vorteile gegenüber Assays erzielt, die Antikörper mit direkter Bindung an den unlöslichen Träger einsetzen, wird der Assay durchgeführt, in dem die individuellen Mengen aller Reaktanden in einer Testkammer (beispielsweise einem Teströhrchen) vereinigt werden.
Es wäre von hohem Nutzen, Assays für eine Massenproduktion bereitzustellen, bei denen eine minimale Anzahl an individuell hinzugefügten flüssigen Reagenzien und Mischungsschritten erforderlich sind, um den Liganden zu bestimmmen. Es wäre wünschenswert, ein oder mehrere Reagenzien, die zur Durchführung des Assays verwendet werden, in einer Testvorrichtung zusammenzufassen.
Im Stand der Technik besteht aber über dem bloßen Einbau von Reagenzien in eine Testvorrichtung hinaus noch das Bedürfnis nach einer bequemen Reagenzienzufuhr. Diese Reagenzien müssen auch über lange Zeiträume stabil sein. Falls beispielsweise ein Assay-Kit (Testsatz) über lange Entfernungen transportiert und vor der Verwendung unbegrenzt gelagert werden soll, ist es erforderlich, daß gelagerte Reagenzien gegenüber den verschiedenen Umweltbedingungen während dieser Zeit stabil sind. Viele Proteine, die als Rezeptormoleküle zur Bestimmung von Liganden in Patientenproben verwendet werden könnten, sind nicht allgemein bei Raumtemperatur über längere Zeiträume stabil. Insbesondere ist die Verwendung von biotinylierten Antikörpern oder Antigenen problematisch, worauf im Stand der Technik nicht hingewiesen wird. Aus einem bis jetzt nicht bekannten Grunde haben biotinylierte Antikörper eine begrenzte Lagerungsstabilität.
Die zuvor beschriebenen Probleme werden mit einer Vorrichtung gelöst, die für die Bestimmung eines Liganden in einer wässrigen Flüssigkeit geeignet ist und ein in Wasser unlösliches Substrat umfaßt, wobei die Vorrichtung dadurch gekennzeichnet ist, daß sie an einer oder mehreren Stellen des Substrats einen biotinylierten Rezeptor für den Liganden mit einem oder mehreren getrockneten in Wasser löslichen Acrylamidhomo- oder -copolymeren mit mindestens 50 Gew.-% Acrylamid befestigt, jedoch nicht gebunden aufweist.
Darüberhinaus wird ein Testsatz für die Bestimmung eines Liganden in einer wässrigen Flüssigkeit bereitgestellt mit:
einer Vorrichtung, wie zuvor beschrieben,
und einem Nachweissystem für den Nachweis der Bildung eines Reaktionskomplexes zwischen dem Liganden und dem biotinyliertem Rezeptor, umfassend einen zweiten Rezeptor für den Liganden an einer zweiten Epitopenstelle, wobei der Rezeptor nachweisbar markiert ist, jedoch mit Avidin oder seinen Derivaten nicht zu reagieren vermag.
Ein Verfahren zur Bestimmung eines Liganden in einer wässrigen Flüssigkeit umfaßt die Stufen:
A. Kontaktieren einer Probe einer Flüssigkeit, die einen Liganden enthält, mit der zuvor beschriebenen Vorrichtung, Lösen des getrockneten biotinylierten Rezeptors für den Liganden unter Bildung eines Reaktionsproduktes aus dem Liganden und dem Rezeptor,
B. Umsetzung des gelösten biotinylierten Rezeptors mit Avidin auf einer unlöslichen Phase, entweder vor oder nach Bildung des Reaktionsproduktes und
C. Bestimmung der Anwesenheit oder Abwesenheit des gebildeten unlöslich gemachten Reaktionsprodukts als Anzeichen der Anwesenheit des Liganden in der Flüssigkeitsprobe.
Die Vorrichtung, der Testsatz (Kit) und das Verfahren gemäß der Erfindung stellen ein schnelles und genaues Mittel zum qualitativen oder quantitativen Nachweis der Anwesenheit oder Abwesenheit eines Liganden in einer Flüssigkeitsprobe bereit. Der Testsatz hat eine Reihe notwendiger und fakultativer Komponenten, aber die Anzahl der Lösungen und Mischungsschritte ist auf ein Minimum gebracht.
Wichtiger ist es aber, daß die Vorrichtung einen oder mehrere biotinylierte Rezeptoren enthält, welche über einen längeren Zeitraum stabil sind. Dieser Vorteil wird durch Immobilisierung des Rezeptors in der Vorrichtung in trockener Form mit einem oder mehreren getrockneten in Wasser löslichen Acrylamidhomo- oder -copolymeren erreicht. Derartige Bindemittelmaterialien verbessern wirksam die Haltbarkeit des Rezeptors während der Herstellung, dem Transport und der Lagerung und werden durch die wässrige flüssige Probe während des Assays leicht in Lösung gebracht, wobei der biotinylierte Rezeptor zur Reaktion mit dem interessierenden Liganden in der Flüssigkeitsprobe verfügbar wird. Wie sich im folgenden aus den Beispielen 2 und 3 ergibt, gewährleistet jedoch nicht jegliches wasserlösliche Bindemittel die gewünschte Lagerstabilität. Nur die Acrylamidpolymere, wie sie hier angegeben sind, ermöglichen die unerwartete Lagerstabilität, die mit der Erfindung erreicht wird.
Die vorliegende Erfindung stellt eine Vorrichtung sowie ein Verfahren zur Verwendung derselben in analytischen Methoden bereit, wobei ein nachweisbarer Komplex zwischen Ligand und Rezeptor erhalten wird. Das Verfahren kann eingesetzt werden, um eine Bestimmung so bereitzustellen, daß in einer Arztpraxis oder beim Verwender zuhause ein Assay durchgeführt werden kann, um unmittelbare Ergebnisse zu liefern. Der Test kann verwendet werden, um die Anwesenheit oder Abwesenheit einer ein- oder mehrwertigen oder mulideterminanten Verbindung von biologischer Bedeutung in einer wässrigen Flüssigkeit, wie beispielsweise einer biologischen Flüssigkeit, nachzuweisen. Vorzugsweise wird der Assay zum Nachweis einer multideterminanten Komponente wie hCG verwendet.
Insbesondere kann die vorliegende Erfindung dazu verwendet werden, einen Liganden in wässrigen Flüssigkeiten, zu denen es natürlich vorkommende oder synthetisch hergestellte spezifische Bindungsrezeptoren gibt, zu bestimmen (qualitative oder quantitative Messung). Diese Bestimmung kann durch eine bloße Feststellung der Anwesenheit oder Abwesenheit des Liganden erfolgen, oder durch eine quantitative Bestimmung der Ligandenmenge. Insbesondere kann die Erfindung dazu eingesetzt werden, biologische Flüssigkeiten von Tieren, Menschen oder Pflanzen, aber vorzugsweise von Menschen, zu testen. Solcherlei Flüssigkeiten umfassen, beschränken sich aber nicht auf, Vollblut, Seren, Plasma, Lymphe, Galle, Urin, Rückenmarksflüssigkeit, Samenflüssigkeit, Tränenflüssigkeit, vaginale Sekretionen, Sputum, Ausdünstungen und dergleichen sowie Stuhlproben. Ebenso ist es möglich, flüssige Präparate menschlicher oder tierischer Gewebe zu testen, wie beispielsweise Skelettmuskel, Herz, Niere, Lunge, Hirn, Knochenmark oder Haut.
Ein einwertiger Ligand hat eine einzige epitope Stelle zur Komplexierung. Ein mehrwertiger Ligand hat zwei oder mehr epitope Stellen zur Komplexierung mit einer Vielzahl des gleichen spezifischen Bindungsrezeptors. Ein multideterminanter Ligand hat zwei oder mehr epitope Stellen mit einer Vielzahl verschiedener Rezeptoren.
Ein interessierender Ligand kann einer immunologischen Spezies angehören, die (1) irgendeine Substanz ist, welche, wenn sie einem immunokompetenten Wirt präsentiert wird, zur Produktion eines spezifischen Antikörpers, der zur Bindung mit der Substanz fähig ist, führt, oder die (2) ein so gewonnener Antikörper ist, wobei der Ligand an einer Antigen-Antikörperreaktion teilnimmt.
Bei der vorliegenden Erfindung ist Biotin oder ein Biotinderivativ in geeigneter Weise an das Rezeptormolekül gebunden, welches spezifisch mit dem Liganden reagiert. Verbindungsverfahren sind im Stand der Technik gut bekannt. Ein spezifisches Verfahren wird in Beispiel 1 beschrieben.
Liganden, die beispielsweise mittels der Erfindung nachgewiesen werden können, umfassen primäre Amine, Aminosäuren, Peptide, Polypeptide, Proteine, Lipoproteine, Glycoproteine, Arzneimittel/Drogen, Haptene, Enzyme, Steroide, Lipide, Nukleinsäuren, Hormone, Vitamine, Polysaccharide, Glykolipide, Alkaloide, Organismen (Bakterien, Protozoen, Pilze, Viren einschließlich Retroviren, Rickettsien und dergleichen) und Bestandteile davon, Blutbestandteile, Gewebe- und Organantigene und andere Materialien, die dem Fachmann bekannt sind. Zuweilen handelt es sich bei dem Liganden um einen Antikörper, der gegen ein Arzneimittel/Droge, ein Hormon, ein Antibiotikum oder andere Verbindung mit antigenen Eigenschaften gerichtet ist. Wenn es sich bei dem Liganden um ein Antigen und bei dem Rezeptor um einen Antikörper handelt, können sowohl monoklonale als auch polyklonale Antikörper verwendet werden, und bei diesen kann es sich um komplette Moleküle oder verschiedene Fragmente davon handeln. Vorzugsweise werden biotinylierte monoklonale Antikörper bei der Erfindung verwendet.
Nach einer bevorzugten Ausgestaltung ist die Erfindung einsetzbar zum Nachweis von hCG als einem frühen Indikator von Schwangerschaft. Bei dieser Ausgestaltung werden ein oder mehrere verschiedene Antikörper gegen hCG in der Testvorrichtung, wie zuvor beschrieben, immobilisiert, so daß Reagenzien zur Ausbildung eines immunologischen Komplexes mit hCG an verschiedenen epitopen Stellen bereitgestellt werden. Wenigstens einer dieser Antikörper ist biotinyliert.
Wie bereits zuvor angegeben, enthält der erfindungsgemäße Testsatz die hier beschriebene Vorrichtung sowie ein Nachweissystem zum Nachweis der Bildung eines Reaktionskomplexes zwischen dem Liganden und seinem biotinylierten Rezeptor.
Im allgemeinen umfaßt die erfindungsgemäße Vorrichtung ein wasserunlösliches Substrat, das chemisch und immunologisch inert (das bedeutet nicht reaktiv) gegenüber dem Ligandenrezeptor oder anderen Reagenzien des Tests ist. Das Substrat kann ein flacher Testobjektträger, Papier, ein Becher, eine Petrischale, ein Teströhrchen, Plättchen, eine Membran oder ein anderes in geeigneter Weise geformtes Material sein, das eine oder mehrere Reagenzien beherbergt und das in irgendeiner Weise mit der Testflüssigkeit kontaktiert werden kann. Entweder wird die Flüssigkeit zu der Vorrichtung wie einem Teströhrchen oder einer Mikrotiterplatte, gegeben oder die Vorrichtung kann der Testflüssigkeit zugeführt werden oder in anderer Weise über eine bestimmte Zeit, die ausreichend ist, um den Test zu ermöglichen, damit in Kontakt gebracht werden. Die Vorrichtung kann entsorgbar oder wiederverwendbar sein.
Nach einer Ausgestaltung kann die Vorrichtung dazu verwendet werden, um einen Liganden mit einem Rezeptor umzusetzen, aber der sich ergebende Komplex wird dann einer zweiten Vorrichtung zugeführt, in der die Menge des Liganden in geeigneter Weise bestimmt wird. Alternativ kann die Vorrichtung eine Vorrichtung sein, in der der Assay durchgeführt wird, so wie eine Mikrotiterplatte, die eine Vielzahl vorgeformter Testbehälter aufweist. Verschiedene Testvorrichtungen sind im Stand der Technik bekannt, so aus US-A-3 825 410, US-A-3 888 629, US-A-3 970 429 und US-A-4 446 232. Eine verwendbare Vorrichtung wird in der EP-A-280 558 angegeben.
Die erfindungsgemäße Vorrichtung kann eine Vorrichtung sein, wobei die Reagenzien zur späteren Verwendung in einem Assay in einer anderen Vorrichtung oder einem anderen Behälter gemischt werden.
Vorzugsweise wird die Vorrichtung als Testvorrichtung sowohl für die Vermischung der Reagenzien als auch den Test selber entweder an demselben oder an einem anderen Ort der Vorrichtung ausgestaltet.
Spezifischer umfaßt die erfindungsgemäße Testvorrichtung ein wasserunlösliches Substrat mit einer oder mehreren Testzonen darin, wobei jede eine Probe einer biologischen Flüssigkeit und die geeigneten Reagenzien aufnehmen kann.
Das Substrat kann aus jeglichem geeignetem wasserunlöslichem Material, wie Glas, polymeren Materialien, faserförmigen Materialien, Cellulose-Materialien und anderen aus dem Stand der Technik bekannte Materialien, an die der biotinylierte Antikörper unter Verwendung des zuvor beschriebenen polymeren Bindemittelmaterials immobilisiert werden kann, erhalten werden.
Nach einer bevorzugten Ausführungsform hat die Testvorrichtung 3 Testzonen oder Behälter, die dazu bestimmt sind, ein Testergebnis und positive und negative Kontrollergebnisse zu besorgen. Diese Vorrichtung ist insbesondere in einer Arztpraxis oder bei einem Verbraucher zuhause als Teil eines diagnostischen Testsatzes, zum Beispiel eines Schwangerschaftstestsatzes, geeignet. Die Vorrichtung umfaßt beispielsweise wenigstens einen Flüssigkeit sammelnden Behälter (oder wie zuvor beschrieben einen Testbehälter), Mittel in dieser Abteilung, die eine Lüftungsöffnung definieren, so daß Flüssigkeit in dieser Abteilung in direktem Kontakt mit der Atmosphäre steht, und Verschlußmittel zum Verschließen der Lüftungsöffnung. Vorzugsweise hat die Testvorrichtung drei separate Testbehälter, einen für die Testprobe, ein zweites für eine negative Kontrolle und ein drittes für eine positive Kontrolle. Andere Abwandlungen einsetzbarer Testvorrichtungen sind dem Fachmann durchweg geläufig.
Die erfindungsgemäße Vorrichtung kann unter Verwendung geeigneter chemischer und biologischer Reagenzien an beliebige Assays angepaßt werden. Wesentlich ist jedoch, daß sie wenigstens einen biotinylierten Rezeptor für den Liganden immobilisiert darin enthält. Gewünschtenfalls können eine oder mehrere Testzonen der Vorrichtung den gleichen oder verschiedene Rezeptoren immobilisiert darin enthalten. Zuweilen ist es auch möglich, daß eine einzelne Testzone mehr als einen Rezeptor immobilisiert darin enthält, solange diese Rezeptoren derart sind, daß sie einander nicht beeinträchtigen, oder solchermaßen immobilisiert sind, daß sie einander nicht beeinträchtigen.
Der biotinylierte Rezeptor wird auf einem Substrat mit dem unten beschriebenen Polymer solchermaßen immobilisiert, daß er in gewisser Weise an ein Substrat befestigt ist. Im allgemeinen werden der Rezeptor und das Polymer miteinander vermischt und an dem Substrat befestigt. Alternativ kann der Rezeptor alleine an dem Substrat befestigt werden, wobei das Polymer darüber geschichtet wird. Polymer und Rezeptor können gewünschtenfalls in mehreren alternierenden Schichten vorgesehen sein. Bei all diesen Ausführungsformen können gegebenenfalls Befeuchtungsmittel, oberflächenaktive Substanzen oder Trocknungsmittel mit dem biotinylierten Rezeptor, dem Polymer oder beiden eingeschlossen sein. Im allgemeinen werden der biotinylierte Rezeptor und das polymere Bindemittelmaterial in einer wässrigen Lösung vereinigt und in der Vorrichtung immobilisiert und im Anschluß daran unter geeigneten Bedingungen getrocknet.
Einsetzbare wasserlösliche polymere Bindemittelmaterialien umfassen polymere Materialien, die leicht in wässrigen Medien gelöst werden können und die gegenüber einer Komplexbildung zwischen Ligand und Rezeptor ebenso wie gegenüber irgendeiner anderen chemischen oder spezifischen Bindungsreaktion, die während eines Assays ablaufen mag, inert sind. Ganz besonders brauchbare polymere Bindemittelmaterialien sind Acrylamidhomo- und -copolymere. Verwendbare Copolymere werden aus zwei oder mehr ethylenisch ungesättigten polymerisierbaren Monomeren hergestellt, wobei wenigstens 50 Gew.-% des vereinigten Monomergewichts Acrylamid ist. Verwendbare polymere Bindemittelmaterialien umfassen, sind aber nicht beschränkt auf, Polyacrylamid, Poly(acrylamid-co-1-vinyl-2-pyrrolidon) (90 : 10 Gewichtsverhältnis), Poly(acrylamid-co-1-vinyl-2-pyrrolidon) (50 : 50 Gewichtsverhältnis), Poly(acrylamid-co-1-vinylimidazol) (90 : 10 Gew.-%), Poly(acrylamid-co-2-methyl-1-vinylimidazol) (90 : 10 Gewichtsverhältnis), Poly(acrylamid-co-N-methyl olacrylamid (80 : 20 Gewichtsverhältnis), Poly(acrylamid-co-acrylsäure) (90 : 10 Gewichtsverhältnis), Poly(acrylamid-co-2-vinylpyridin) (89 : 11 Gewichtsverhältnis), Poly(acrylamid-co-2- methyl-5-vinylpyridin) (90 : 10) und Poly(acrylamid-co-1-vinyl-2-pyrrolidon-co-acrylsäure) (75 : 15 : 10 Gewichtsverhältnis). Polyacrylamid ist ein bevorzugtes Material. Es kann gewünschtenfalls mehr als ein Bindemittelmaterial eingesetzt werden. Unterschiedliche Bindemittelmaterialien können für unterschiedliche Rezeptoren oder in unterschiedlichen Zonen der Vorrichtung verwendet werden.
Das Verhältnis Bindemittelmaterial zu Rezeptor kann in weiten Grenzen variieren in Abhängigkeit von dem durchzuführenden Assay und der Menge des Rezeptors, die für den gegebenen Liganden erforderlich ist. Im allgemeinen ist die Menge des immobilisierten Rezeptors wenigstens 0,01 ug, wobei 1 bis 10 ug bevorzugt werden, was aber von dem zu bestimmenden Liganden abhängt. Im allgemeinen ist das Verhältnis Bindemittelmaterial zu Rezeptor von 1 : 1 bis 100 : 1. Der biotinylierte Rezeptor und das Bindemittelmaterial werden im allgemeinen in einer geeigneten Weise vermischt und in der Vorrichtung untergebracht und vor der Verwendung in geeigneter Weise getrocknet. Der Trocknungsprozess dauert in der Regel weniger als 2 Stunden. Beispielsweise werden Bindemittelmaterialien und Rezeptor in einem Puffer in einem Glasteströhrchen vermischt und auf eine Seite eines Testbehälters aufgebracht und luftgetrocknet.
Wie oben definiert, ist der immobilisierte biotinylierte Rezeptor eine Verbindung, die mit dem Liganden spezifisch komplexiert. Meistens handelt es sich bei dem Rezeptor um einen Antikörper gegen einen Liganden mit antigenen Eigenschaften. Es kann sich aber auch um ein Antigen handeln, wenn der Ligand ein Antikörper ist, oder der Rezeptor kann ein Antikörper gegen einen Antikörper sein. Der immobilisierte Rezeptor ist biotinyliert, beispielsweise ein biotinyliertes Antigen oder Antikörper, die mittels bekannter Verfahren und Reagenzien hergestellt wurden (siehe beispielsweise EP-A-201 079 und US-A-4 276 206 und US-A-4 298 685).
Die erfindungsgemäße Vorrichtung kann weitere Reagenzien enthalten, die in geeigneter Weise eingebracht sind. Beispielsweise kann ein Puffer darin immobilisiert sein, beispielsweise durch Trocknung des Puffers in einem Bereich der Testvorrichtung. Diese Reagenzien können auch mit dem gleichen oder einem anderen Bindemittelmaterial als dem für den biotinylierten Rezeptor immobilisiert werden. Es ist wichtig, daß jegliche weiterhin einverleibten Materialien funktional von den anderen Reagenzien (wie beispielsweise dem biotinylierten Rezeptor) vor dem Assay isoliert ist. Dies kann dadurch erreicht werden, daß die zusätzlichen Materialien in einem Bereich immobilisiert werden, der von dem des immobilisierten Rezeptors verschieden ist, oder durch Verwendung von Schutzmaterialien, Beschichtungen und dergleichen (beispielsweise Einkapselung oder Schutzbeschichtungen). Dies kann aber auch dadurch erreicht werden, daß Reagenzien zusammen immobilisiert werden, die für eine Reaktion eine bestimmte Art eines Aktivierungsmittels benötigen.
Wie oben angegeben, umfaßt der erfindungsgemäße Testsatz auch ein Nachweissystem zum Nachweis der Bildung des Ligand/Rezeptorkomplexes. Hierbei kann es sich in einem einfachen Fall um einen zweiten Rezeptor für den Liganden handeln, der in geeigneter Weise für einen Nachweis markiert ist. Brauchbare Nachweiseinheiten umfassen, ohne daß diese darauf beschränkt sind, Radioisotope, chemilumineszierende Verbindungen, biolumineszierende Verbindungen, fluoreszierende Verbindungen, gefärbte Perlen, Farbstoffe, Farbstoffvorstufen und Enzyme. Eine Reihe verwendbarer Marker sind im Stand der Technik beschrieben, beispielsweise in EP-A-201 079. Diese Marker können mittels geeigneter Reagenzien, Apparate und Verfahren bestimmt werden.
Vorzugsweise ist der Marker ein Enzym (beispielsweise Peroxidase, alkalische Phosphatase, Malatdehydrogenase, Glucoseoxidase, Urease, Katalase oder Glucose-6-Phosphat-Dehydrogenase). In einem solchen Fall schließt der Testsatz gegebenenfalls ein Enzymsubstrat und falls erforderlich eine farbstoffbildende Zusammensetzung ein. Durch eine Reaktion des Enzyms mit dem Substrat kann dann eine nachweisbare Spezies, beispielsweise ein Farbstoff, erhalten werden. Alternativ können andere farbstoffbildende Materialien und Reaktionen erforderlich sein, um eine nachweisbare Spezies wie einen Farbstoff zu erhalten.
Wenn beispielsweise Peroxidase als Marker verwendet wird, kann der Testsatz ebenfalls Wasserstoffperoxid und geeignete farbstoffbildende Reagenzien wie Tetramethylbenzidin oder einen Leukofarbstoff, der einen Farbstoff in Gegenwart von Wasserstoffperoxidase und Peroxidase bildet, umfassen (beispielsweise einen Triarylimidazolleukofarbstoff wie aus US-A-4 089 747 bekannt oder den in US-A-4 670 385 beschriebenen Triarylmethanleukofarbstoff). Verwendbare Substrate und farbstoffbildende Reagenzien für weitere brauchbare Enzyme sind dem Fachmann geläufig.
Bei einer bevorzugten Ausgestaltung der Erfindung umfaßt der Testkit (Testsatz):
(a) ein insolubilisierendes Reagenz, umfassend eine unlösliche Phase, an die Avidin gebunden ist,
(b) eine Testvorrichtung, umfassend ein wasserunlösliches Substrat mit einer oder mehreren Testzonen, wobei in wenigstens einer der Testzonen ein biotinylierter Rezeptor für den Liganden angeordnet ist, der in trockener Form und immobilisiert zusammen mit einem oder mehreren getrockneten wasserlöslichen Acrylamidhomo- oder copolymeren, die wenigstens 50 Gew.-% Acrylamid aufweisen, vorliegt, derart, daß der biotinylierte Rezeptor befähigt ist, mit dem Liganden an einer ersten epitopen Stelle sowie mit dem Avidin zu reagieren, und
(c) einen zweiten Rezeptor für den Liganden, der markiert ist und der befähigt ist, mit dem Liganden an einer zweiten epitopen Stelle zu reagieren, der aber mit dem Avidin nicht reagieren kann.
Das insolubilisierende Reagenz dieses bevorzugten Kits weist eine unlöslich Phase, wie beispielsweise Glasperlen, Metallteilchen, Membranen, polymere Perlen, Glas- oder Cellulosefasern und andere aus dem Stand der Technik bekannte auf, an der Moleküle des Avidins oder eines Derivates davon, so wie Streptavidin, succinyliertes Avidin, monomeres Avidin und dergleichen, befestigt sind.
Avidin oder ein Derivat davon kann an der unlöslichen Phase in irgendeiner geeigneten Weise nach dem Stand der Technik befestigt werden, wie beispielsweise in US-A-4 298 685, US-A-4 496 654, US-A-4 582 810 und PCT-Veröffentlichung 84/03358 beschrieben. Das Avidin kann durch Adsorption befestigt werden, aber vorzugsweise wird es kovalent über eine Reaktion einer reaktiven Einheit des Avidinmoleküls (so wie reaktiven Amingruppen) mit passenden reaktiven Gruppen des Trägers (wie Carboxyl, Halogenmethyl, Vinylsulfonyl oder Chlorethylsulfonyl) gebunden.
Ein bevorzugtes insolubilisierendes Reagenz, das bei der Durchführung der Erfindung verwendbar ist, wird im Beispiel 1 unten angegeben. Diese bevorzugten Reagenzien werden durch kovalente Bindung des Avidins an die unlösliche Phase, beispielsweise polymere Perlen, über aktivierte 2-substituierte Ethylsulfonyl- oder Vinylsulfonylgruppen oder aktive Halogenatome erhalten.
Der bevorzugte oben beschriebene Testsatz beeinhaltet eine Testvorrichtung mit einer oder mehreren Testzonen und einem immobilisierten biotinylierten Rezeptor, der eine Reaktion mit dem insolubilisierenden Reagenz eingehen kann. Vorzugweise ist der Rezeptor biotinyliertes Antigen oder Antikörper. Besonders bevorzugt wird ein biotinylierter Antikörper.
Der oben erwähnte zweite Rezeptor in dem Testsatz reagiert mit dem Liganden an einer anderen epitopen Stelle, die verschieden ist von der epitopen Stelle der Reaktion zwischen dem Liganden und dem biotinylierten Rezeptor. Dieser zweite Rezeptor ist im allgemeinen mit einem geeigneten Marker markiert, beispielsweise wie oben beschrieben. Der zweite Rezeptor kann ebenso unter Verwendung eines geeigneten Bindemittelmaterials in der Testvorrichtung immobilisiert sein, wobei das Bindemittelmaterial das gleiche oder ein anderes sein kann, als das, das zur Immobilisierung des biotinylierten Rezeptors verwendet wurde.
Beispielsweise enthält ein Testsatz, der bei der Bestimmung von hCG verwendet werden kann, die folgenden Bestandteile:
(a) ein insolubilisierendes Reagenz mit einer unlöslichen Phase, an die Avidin gebunden ist,
(b) eine Testvorrichtung mit einem wasserunlöslichen polymeren Substrat, das eine Vielzahl an Testnäpfchen aufweist und wobei in wenigstens einem der Testbehälter ein biotinylierter Antikörper immobilisiert vorliegt, der eine Reaktion mit hCG an einer ersten epitopen Stelle eingehen kann, welcher Antikörper in trockener Form und vermischt mit einem oder mehreren getrockneten wasserlöslichen Acrylamidhomo- oder -copolymeren, die wenigstens 50 Gew.-% Acrylamid enthalten, vorliegt und
(c) ein zweiter Antikörper gegen hCG, der markiert ist und befähigt ist, an einer zweiten epitopen Stelle mit hCG zu reagieren.
Der erfindungsgemäße Testsatz kann weiterhin fakultative Reagenzien und Ausrüstungen wie Waschlösungen, Pufferlösungen, Reagenzlösungen, Flaschen, Pipetten, Vorrichtungen zum Vorfiltern von Proben und andere Materialien nach dem Stand der Technik zur Erleichterung der Verwendung des Testsatzes enthalten.
Im allgemeinen wird das erfindungsgemäße Verfahren derart ausgeführt, daß die Vorrichtung mit einer Flüssigkeitsprobe, von der vermutet wird, daß sie den Liganden enhält, kontaktiert wird, wobei ein Reaktionsprodukt zwischen gegebenenfalls anwesendem Liganden und biotinyliertem Rezeptor in der Testvorrichtung gebildet wird. Die flüssige Probe löst das Bindemittelmaterial, so daß der Rezeptor für eine Reaktion verfügbar wird. Vorzugsweise wird die flüssige Probe einer Testzone der Vorrichtung zugeführt oder in einen Testbehälter gebracht, jeweils in Abhängigkeit von der Konfiguration der Vorrichtung. Die Anwesenheit oder Abwesenheit des Reaktionsprodukts wird dann in geeigneter Weise bestimmt, beispielsweise durch Lichtstreuung, colorimetrische, fluorometrische, radiometrische oder andere Verfahrensweise.
Bei dem erfindungsgemäßen Verfahren kann es sich um einen kompetitiven Bindungs-Immunoassay unter Verwendung von sowohl markiertem als auch unmarkiertem Rezeptor handeln. Sowohl gebundenes (das ist komplexiertes) als auch ungebundenes (das ist nicht-komplexiertes) Material kann bestimmt werden. Gewünschtenfalls kann eine physikalische Trennung von gebundenem und nicht-gebundenem Material mittels irgendeines geeigneten Trennungsverfahrens durchgeführt werden.
Bei einer bevorzugten Ausgestaltung wird in dem Verfahren der aus dem Stand der Technik bekannte immunometrische Assay eingesetzt. Einzelheiten über diesen Assay sind aus US-A-4 486 530 bekannt. Dieser Assay kann zur Bestimmung mehrwertiger oder multideterminanter Liganden, wie oben beschrieben, d.h. Liganden mit zwei oder mehr epitopen Stellen zur immunologischen Reaktion mit zwei oder mehr Rezeptormolekülen eingesetzt werden. Bei dem Sandwich-Assay wird ein zweiter Rezeptor mit dem Liganden in Kontakt gebracht, entweder vor oder zugleich mit oder nach einer Kontaktierung des Liganden mit der Testvorrichtung (und somit Kontaktierung des Liganden mit dem ersten Rezeptor). Es ergibt sich hierbei die Bildung eines immunologischen Komplexes der beiden unterschiedlichen Rezeptoren mit dem Liganden. Wenigstens einer der Rezeptoren ist biotinyliert. Besonders bevorzugt ist der erste Rezeptor biotinyliert. Der sich ergebende Komplex wird insolubilisiert, wenn das Avidin auf einer unlöslichen Phase und das Biotin als Teil des ersten Rezeptors reagieren. Der sich ergebende insolubilisierte Komplex kann von nicht umgesetztem Material in der Testvorrichtung abgetrennt werden. Einer der Rezeptoren oder auch die unlösliche Phase kann in geeigneter Weise zur Bestimmung des insolubilisierten Komplexes markiert werden.
Ein bevorzugtes Verfahren zur Bestimmung von hCG in einer wässrigen Flüssigkeit umfaßt die Stufen:
A. Kontaktierung einer Probe der Flüssigkeit mit einer Testvorrichtung, die ein wasserunlösliches Substrat umfaßt mit einer oder mehreren Testzonen, wobei auf wenigstens einer der Testzonen ein biotinylierter Antikörper gegen hCG in trockener Form immobilisiert und vermischt mit einem oder mehreren getrockneten wasserlöslichen Acrylamidhomo- oder copolymeren, die wenigstens 50 Gew.-% Acrylamid aufweisen, vorliegt, derart, daß ein Reaktionsprodukt zwischen hCG und biotinyliertem Antikörper an einer ersten epitopen Stelle ausgebildet wird,
B. vorher, zugleich oder im Anschluß an die Kontaktierungsstufe (A) wird die flüssige Probe mit einem zweiten Antikörper gegen hCG kontaktiert, der markiert ist und welcher mit hCG an einer zweiten epitopen Stelle reagiert, wobei ein Komplex zwischen hCG und dem ersten und zweiten Antikörper ausgebildet wird,
C. Kontaktierung des ternären Komplexes mit einem insolubilisierenden Reagens, das eine unlösliche Phase umfaßt, an die Avidin gebunden ist, wobei ein insolubilisierter Komplex über eine Reaktion zwischen Avidin und Biotin gebildet wird,
D. Trennung des sich ergebenden markierten insolubilisierten Komplexes von nicht-umgesetztem Material und
E. Bestimmung der Anwesenheit oder Abwesenheit des markierten insolubilisierten Komplexes.
Dieses Verfahren kann in einer Arztpraxis oder zuhause zur frühen Schwangerschaftsbestimmung durch Untersuchung von Urinproben durchgeführt werden.
Die folgenden Beispiele sind beispielhaft und dienen nicht dazu, den Umfang der Erfindung zu beschränken.

Materialien:

Antikörper-Biotinkonjugate wurden unter Verwendung von monoklonalen Anti-hCG-Antikörpern, erhalten von Immuno-Search, Inc. (Toms River, N. J.) und Biotin N-Hydroxysuccinimid, erhalten von Calbiochem-Behring Corp., unter Verwendung des von Hofmann et al. in J.A.C.S., 100, 3585 (1978), beschriebenen Verfahrens, hergestellt.
Menschliches Choriongonadotropin (hCG) wurde von Calbiochem. erhalten.
Antikörper-Peroxidase-Konjugate wurden unter Verwendung von monoklonalem Anti-hCG-Antikörper, erhalten von Cambridge Medical Diagnostics (Bellerica, Mass.), und Meerrettichperoxidase von Miles Laboratories nach dem bei Yoshitake et al.in Eur. J. Biochem., 101, 395 (1979) beschriebenen Verfahren hergestellt.
Eine Leukofarbstofflösung wurde mit 2-(4-Hydroxy-3,5-dimethoxyphenyl)-4,5-bis(4-methoxyphenyl)imidazol wie folgt hergestellt:
Fester Leukofarbstoff (um 0,1% Lösung zu erhalten) wurde in einer Lösung von 20% Polyvinylpyrrolidon in einem Natriumphosphatpuffer (5 mmolar) gelöst. Diese Lösung wurde dann einer Lösung aus Wasserstoffperoxid (10 mmolar), 4'-Hydroxyacetanilid- Elektronenübertragungsmittel (5 mmolar) und Diethylentriaminpentaessigsäure als Chelat-bildendem Mittel (10 umolar) in einem Natriumphosphatpuffer dazugegeben, um eine Endkonzentration von 1% Polyvinylpyrrolidon und 0,005% Leukofarbstoff zu erhalten.
Succinyliertes Casein wurde durch Umsetzung von Casein mit einem gleichen Gewichtsteil Bernsteinsäureanhydrid über 4 Stunden bei 25ºC und anschließender Reinigung des Produktes durch Dialyse erhalten.
Bei dem MOPS-Puffer handelt es sich um 3-(N-Morpholino)propansulfonsäure (pH 7,5).

Beispiel 1:

Assay von Urin auf hCG

Herstellung des insolubilisierenden Reagenzes:

Die drei unten angegebenen Lösungen wurden bei 80ºC zu einem 1365 ml Gefäß, das Sauerstoff-freies Wasser enthielt, mit den angegebenen Geschwindigkeiten hinzugefügt.

Lösung 1:

Styren (739 g), m & p-(2-Chlorethylsulfonylmethyl)styrol (82 g) und 1-Dodekanthiol (8,2 g) bei 2,5 g/min. über 380 Minuten.

Lösung 2:

Ammoniumpersulfat (19,7 g) und destilliertes Sauerstoff-freies Wasser (1152 g) bei 2,14 g/min. über 380 Minuten.

Lösung 3:

Natriumpyrosulfit (9,9 g) und destilliertes Wasser (1152 g) bei 2,27 g/min. über 380 Minuten.
Nach 380 Minuten wurde die Reaktion unterbrochen, was etwa 1218 g Latex mit einem 33,4%igen Feststoffgehalt liefert. Der Latex wurde über 3 Tage dialysiert, wobei ein Latex mit einem Feststoffgehalt von 27,3% und einem pH von 5 erhalten wurde. Dieses Latex wurde auf einen Feststoffgehalt von 13,5% verdünnt. Nach einer NMR-Analyse ergab sich ein molares Verhältnis zwischen Styrol und dem zweiten Monomer von 96 : 4. Die sich ergebenden Latexpartikel hatten einen durchschnittlichen Durchmesser von etwa 0,67 um gemessen durch Transmissionselektronenmikroskopie.
Eine Probe (0,75 ml) des zuvor beschriebenen Latex wurde mit 20 ml Boratpuffer (50 mmolar, pH 8,5) verdünnt, und anschließend wurde Avidin (5 mg) hinzugefügt. Die erhaltene Suspension wurde bei 37ºC über 18 Stunden durch Umschichtung durchgearbeitet und im Anschluß daran zentrifugiert. Der Überstand wurde verworfen und die Partikel wurden einmal mit Puffer in einer Zentrifugation gewaschen und in 10 ml Boratpuffer resuspendiert. Eine Biotinbindungsanalyse (das ist eine Titration mit Tritium-markiertem Biotin) zeigte, daß Avidin kovalent an die Partikel gebunden worden war (7x 10&supmin;&sup6; molar Bindungsstellen pro 0,3% Perlsuspension), wobei ein Reagens zur Verwendung in der vorliegenden Erfindung gebildet wurde.

Assay

Testvorrichtungen, wie zuvor beschrieben, wurden verwendet, um hCG auf die folgende Weise in Urinproben zu bestimmen. Jede Testvorrichtung umfaßte: einen negativen Kontrollbehälter, um einen Hintergrund aufzuzeigen und um als Referenztest zu dienen, einen positiven Kontrollbehälter, um anzuzeigen, ob die Reagenzien und verwendeten Verfahren richtig eingesetzt wurden, und einen Testbehälter für den Assay. Jeder Testbehälter enthielt eine Filtermembrane, die aus einer mikroporösen Nylon- filtermembran (erhalten von Pall Corp.) bestand und die mit succinyliertem Casein (1,07 g/m²) beschichtet war.
Die Testvorrichtung A wurde erfindungsgemäß hergestellt. Der negative Kontrolltestbehälter enthielt MOPS-Puffer (2 mg) und Polyacrylamidbindemittel (60 ug). Der Testbehälter für den Assay enthielt eine getrocknete Beschichtung mit biotinylierten Anti-hCG-Antikörpern (3 ug), immobilisiert in Polyacrylamidbindemittel (60 ug), und getrockneten MOPS-Puffer (2 mg) in einem anderen Bereich innerhalb des Testbehälters. Der positive Kontrollbehälter enthielt biotinylierte Anti-hCG-Antikörper (3 ug), immobilisiert in Polyacrylamidbindemittel (60 ug) und getrocknetes hCG (400 mI.E.) in einem von dem MOPS-Puffer (2 mg) getrennten Bereich des Testbehälters.
Testvorrichtung B wurde hergestellt und untersucht als eine Kontrollvorrichtung und enthielt die gleichen Materialien wie die Testvorrichtung A mit der Ausnahme, daß die Antikörper nicht in Polyacrylamidbindemittel immobilisiert waren.
Beide Testvorrichtungen wurden bei 25ºC und 50% relativer Feuchtigkeit über 3 Monate aufbewahrt.
Nach der Aufbewahrungszeit wurden die Testvorrichtungen verwendet, um Urinproben auf hCG zu testen. Diese Proben waren vorgefiltert worden, um Verunreinigungen zu entfernen und es war bekannt, daß sie etwa 50 mI.E./ml hCG enthielten. Die Proben wurden allen Näpfchen der Testvorrichtungen zugefügt. Im Anschluß daran wurde jedem Näpfchen Peroxidase-markierter monoklonaler Anti-hCG-Antikörper (40 ul einer 10&supmin;&sup9; molaren Lösung) hinzugefügt. Nach einer zweiminütigen Inkubationsperiode wurde eine Suspension des zuvor beschriebenen unlöslichen immunoreaktiven Reagenzes (40 ul einer 0,42%igen Dispersion) hinzugefügt, und man ließ die Flüssigkeit durch die Membran in jeden Behälter eindringen.
Jeder Behälter wurde mit einer Waschlösung (200 ul) aus Natriumphosphat (0,1 molar) beaufschlagt, gefolgt von der Zugabe der oben beschriebenen Leukofarbstofflösung (40 ul). Nach zwei Minuten wurde die auf jeder Membran gebildete Farbe über eine Reflektionsmessung unter Verwendung einer Standardausrüstung bestimmt. Die Ergebnisse wurden in Transmissionsdichte (DT) unter Verwendung der Williams-Clapper-Transformation umgerechnet.
Die Ergebnisse sind in der folgenden Tabelle I als Differenz (DT) zwischen der Testprobenbehälterdichte und der Negativkontrollbehälterdichte für jede Testvorrichtung angegeben. Die Standardabweichung wird in Klammern angeführt. Die Meßergebnisse zeigen, daß die Testvorrichtung A wegen der Anwesenheit von Polyacrylamid darin zur Immobilisierung des biotinylierten Antikörpers eine signifikante Verbesserung bei aufrechterhaltener Empfindlichkeit bei der hCG-Bestimmung aufweist. Tabelle I DT Test nach der Aufbewahrung Testvorrichtung (Erfindung) (Vergleich)

Beispiele 2-3:

Vergleich unterschiedlicher Bindemittelmaterialien

Der in Beispiel 1 beschriebene Assay wurde mit mehreren Testvorrichtungen wiederholt, in denen die Antikörper unter Verwendung unterschiedlicher Bindemittelmaterialien immobilisiert waren. Nach der Einverleibung des biotinylierten Antikörpers mit dem Bindemittelmaterial wurden die Testvorrichtungen bei 25ºC und 50% relativer Feuchtigkeit über 5 Monate gelagert.
Die Meßergebnisse werden in Tabelle II als DT angegeben, berechnet sowohl vor dem Aufbewahrungstest ("frisch") und nach dem Aufbewahrungstest. Es wurden DT-Werte für den Test und die Negativbehälter bei jeder Vorrichtung gemessen. Es wurde eine Differenz in DT von wenigstens 0,008 Einheiten zwischen dem Testbehälter und dem negativen Testbehälter, sowohl frisch als auch nach der Aufbewahrung für erforderlich gehalten, um überhaupt Antigen positiv bestimmen zu können. Wenn die Differenz kleiner als 0,008 Einheiten ist, ist entweder der Hintergrund zu hoch oder die Testvorrichtung ermangelt an Empfindlichkeit.
Die Ergebnisse zeigen an, daß das in Beispiel 1 verwendete Bindemittelmaterial (60 ug Polyacrylamid), 2 (30 ug Polyacrylamid) und 3 (60 ug Polyacrylamid-co-1-Vinyl-2-Pyrrolidon) verwendbar ist, wobei Beispiel 1 bevorzugt wird. Der Assay mit dem Vergleich A unter Verwendung von 60 ug Poly-1-Vinyl-2-Pyrrolidon war sogar frisch nicht zu akzeptieren und bei dem Assay mit Vergleich B unter Verwendung von 60 ug Rinderserumalbumin (BSA) ergab sich ein zu hoher Hintergrund und eine verminderte Empfindlichkeit nach 5 monatiger Lagerung. Tabelle II Frisch Test nach der Aufbewahrung Testvorrichtung Beispiel Testbehälter negativer Kontrollbehälter Vergleich nicht getestet

Claims

1. Vorrichtung, die für die Bestimmung eines Liganden in einer wäßrigen Flüssigkeit geeignet ist, und ein in Wasser unlösliches Substrat aufweist, dadurch gekennzeichnet, daß an einer oder mehreren Stellen des Substrates ein biotinylierter Rezeptor für den Liganden mit einem oder mehreren getrockneten in Wasser löslichen Acrylamidhomo- oder -copolymeren mit mindestens 50 Gew.-% Acrylamid befestigt, jedoch nicht gebunden ist.

2. Vorrichtung nach Anspruch 1, in der der biotinylierte Rezeptor einen biotinylierten Antikörper für den Liganden aufweist.

3. Vorrichtung nach Anspruch 2, in der der Rezeptor ein biotinylierter Antikörper für menschliches Choriongonadotropin (hCG) ist.

4. Vorrichtung nach Anspruch 1, in der der biotinylierte Rezeptor ein biotinyliertes Antigen ist.

5. Vorrichtung nach einem der Ansprüche 1 bis 4, in der der biotinylierte Rezeptor an in Wasser löslichem Poly(acrylamid) befestigt ist.

6. Testsatz für die Bestimmung eines Liganden in einer wäßrigen Flüssigkeit mit:

einer Testvorrichtung nach einem der Ansprüche 1 bis 5, und

einem Bestimmungssystem für die Bestimmung der Bildung eines Reaktionskomplexes zwischen dem Liganden und dem biotinylierten Rezeptor mit einem zweiten Rezeptor für den Liganden an einer zweiten epitopischen Stelle, wobei der Rezeptor eine bestimmbare Markierung aufweist, jedoch mit Avidin oder seinen Derivaten nicht zu reagieren vermag.

7. Testsatz nach Anspruch 6, in dem der zweite Rezeptor eine Enzym-Markierung aufweist.

8. Testsatz nach Anspruch 7, in dem der zweite Rezeptor mit Peroxidase markiert ist.

9. Verfahren zur Bestimmung eines Liganden in einer wäßrigen Flüssigkeit mit den Stufen:

A. Kontaktieren einer Probe einer Flüssigkeit, die einen Liganden enthält, mit einer Vorrichtung nach einem der Ansprüche 1 bis 5, Lösen des getrockneten biotinylierten Rezeptors für den Liganden unter Bildung eines Reaktionsproduktes aus dem Liganden und dem Rezeptor,

B. Umsetzung des gelösten biotinylierten Rezeptors mit Avidin auf einer unlöslichen Phase, entweder vor oder nach Erzeugung des Reaktionsproduktes und

C. Ermittlung des Vorhandenseines oder der Abwesenheit von gebildetem unlöslichen Reaktionsprodukt als Anzeichen der Anwesenheit des Liganden in der Flüssigkeitsprobe.