JPS60500358A

JPS60500358A - マウスの細胞内で組み換えｄｎａによって生産されたヒト成長ホルモン

Info

Publication number: JPS60500358A
Application number: JP84500747A
Authority: JP
Inventors: ヘイマー，デイーン・エイチ; パブラキス，ジヨージ・エヌ
Original assignee: アメリカ合衆国
Priority date: 1982-12-23
Filing date: 1983-12-22
Publication date: 1985-03-22
Also published as: CA1224168A; WO1984002534A1

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるため要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】マウスの細胞内で組み換えＤＮＡによって産生されたヒト成長ホルモン１１蕊Ｉゴーデル他（Ｇｏｅｄｄｅｌ　ｅｔ　ａｔ、）の米国特許第４，３４２゜８３２号では、バクテリアにおいてヒト成長ホルモンをつくり出すために合成遺伝子を使用する。

サーバー他（Ｓａｒｖｅｒ　ｅｔ　ａｌ、）が表した、１９８１年６月発行「分子細胞生物学１」（“ＭＯ１ｅｃｔ＋Ｉａｒ　ａｎｄ　Ｃｅ１ｌｕｌａｒ　Ｂｉｏｌ。

ａｙ”）第６＠、第４８６−４９６ページ掲載の「ウシ乳頭腫ウィルスＤＮＡ　：新しい成熟核クローニングベクター」　（”Ｂｏｖｉｎｅ　Ｐａｐｉｌｌｏｍｄ　ｖｉｒｕｓ　ＤＮＡ：Ａ　ｎｏｖｅｌ　Ｅｕｋａｒｙｏｔｉｃ　Ｃｌｏｎｉｎｇ　Ｖｅｃｔｏｒ”）には、ＢＰＶクローニングベクターについて記載されており、ベクターはプレプロインシュリンに付着されている。　プリンスター他（ＢｒｉｎＳｔｅｒ　ｅｔ　ａｌ、）が表した１９８２年３月発行「ネイチ？　− Ｊ　（”Ｎａｔｕｒｅ”　）第２９６号、第３９−４２ページ掲載の「マウス卵に注入された金属チオネイン−サイミゾイン・キナーゼ融合プラズマの調整（” Ｒｅｇｕｌａｔｉｏｎ　ｏｆ　Ｈｅｔａｌｌｏｔｈｉｏｎｅｉｎ　Ｔｈｙｍｉｄｉｎｅ　Ｋｉｎａｓｅ　Ｆｕｓｉｏｎ　Ｐｌａｓｍａ　Ｉｎｊｅｃｔｅｄ　１ｎｔｏ　Ｈｏｕｓｅ　Ｅ（ＩＱｓ”）では、ヘルペス・ウィルス・サイミゾイン・キナーゼに融合された金属チオネイン−１遺伝子プロモータ達が、キナーゼ遺伝子の発現を行なうためニ使用される。マウス卵は同プラスミツトに顕微注入されている。

ヘイマー他（ｌａｍｅｒ　ｅｔ　ａｌ、）が表した、１９８２年ニューヨーク州のコールド・スプリング・ハーバ−研究所（ＣｏｌｄＳｐｒｉｎｇ　Ｈａｒｂｏｒ　Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ　）発行「成熟ｔｅ、ウイ）し；Ｌへ’）９−」（“ ｔｕｈａｒｙｏｔｔｃ　Ｖｉｒａｌ　ｖｅｃｔｏｒｓ″第７−１２ページ（アブストラクト）に掲載の「動物ウイルネベクターにおけるマウス金属チオネイン− ■遺伝子の導入”　（”　Ｉｎｄｕｃｔｉｏｎ　ｏｆ１４ｏｕｓｅ　Ｈｅｔａｌｌｏｔｈｉｏｎｅｉｎ−Ｉ　Ｇｅｎｅ　ｉｎ　Ａｎｉｍａｌ　Ｖｉｒｕｓ　ＶｅｃｔｏｒＳ　″）。

ｔ＜７５’Ｆストバーｖ　−（Ｐａｖｌａｋｉｓ　ａｎ、ｄ　ｌａｍｅｒ）が表した、ＱＣ，Ｎａｔｌ、ＡＣａｄ　、　ＳＣｉ、”　）　（７）論評に掲載サレｌ＝　ｒウシ乳１１ｍウィルスにおける金属チオネイン−成長ホルモン雑種遺伝子ノｇｍ整」　（“Ｒｅｇｕｌａｔｉｏｎ　ｏｆ　ａ　Ｈｅｔａｌｌｏｔｈｉｏｎｅｉｎ−Ｇｒｏｗｔｈ　Ｈｏｒｓｏｎｅ　Ｈｙｂｒｉｄ　Ｇｅｎｅ　ｉｎ　Ｂｏｖｉｎｅ　Ｐａｐｉｌｌｏｍａ　Ｖｉｒｕｓ”　）　。

メイヨ他（Ｈａｙｏ　ｅｔ　ａｌ、）による、１９８２年５月発行［セコ９８２年発行「細胞生化学ジャーナル」　（“Ｊｏｕｒｎａｌ　ｏｆＣｅｌｌｕｌａｒ　Ｂｉｏｃｈｅｓｌｓｔｒｙ”）補遺第６号３４６ページ記載のｒｉｌｃＬＡシンボジア抄録Ｊ　（ＵＣＬＡ　Ｓｙｍｐｏｓｉａ　Ａｂｓｔｒａｃｔｓ”）１１立１１ｅ　）　＊　ｎｔ　’ｆ　＞、　成長ホルモン（以下ｈＧＨとも言短小発育症が生ずる。この短小発育症が重い症状のときは、ヒトの死体から分離されたヒト成長ホルモンで治療される。

この場合、採取される分量はわずかで、分離精製が複雑かつ高価である。ｈＧＨのアミノ酸鎖がよく知られているが、合成化学法が実用的でない。

組み換え合成遺伝子を使用してバクテリアにｈＧＨを産生する方法が、ゴーデル他（Ｇｏｅｄｄｅｌ　ｅｔ　ａｌ、）の米国特許第４３４２．８３２号に記載されている。この方法の欠点は、分離と精製が困難であることと、得られたＩＩＩ物に、正常成長ホルモンには見られない、人体に対して免疫原となり得るアミノ・ターミナル・フオルミルーメチニオン残留物が含まれていることである。

金属メチオニン。　金属メチオニンはシスチンに富む小重金属結合たん白質である。また、金属メチオニンは今まで検査されたすべての成熟核種ならびに各種の器官および細胞類型に存在する。この金属メチオニンは細胞を重金属に被毒されないように保護するとともに、亜鉛および銅による動的平衡作用も行なう。

最近、りＯン化された金属チオネイン−１遺伝子は、顕微注入、共変換あるいは組み換えサル・ビールス４０　（ＳＶ４０）との転移によって細胞内に導入された場合、カドミウムに誓うてその誘導性が保たれることが分った。この発明では、まず、金属チオネイン（ＭＴ）−ヒト成長ホルモン（ｈＧＨ）の雑種遺伝子を形成し、次に、この雑種遺伝子をウシ乳頭腫は、デキサメタソンではなく、カド゛ミウムによって調整される。また一方で、同細胞内における染色体遺伝子は両者によって誘導される。ｈＧＨポリペプチド合成物は変換された細胞内でカドミウムにより誘導可能であり、高水準のたん白質が集められる。

シ　頭　イルスベクター　ウシ乳頭腫ウィルスＤＮＡをベクターとして利用することによって、各種の遺伝子を組織培養しだ哺乳類の細胞に導入している（サーバー他、１９８１年）。

この発明においては、ウシ乳頭腫ウィルス（以下ＢＰＶとモ言つ）をベクターとして利用して、マウスの金属チオネイン（以下ＭＴとも言う）遺伝子を培養したマウス細胞内に移し換えている。この組み換えＢＰＶ−ＭＴは細胞にカドミウム（以下ｃｄとも言う）に対する抵抗性を与える大量の金属チオネイン合成物を支配するのでマーカーとしての役割を果た１゜サラに、ｃｄ抵抗剤は、他の非選択性遺伝子を哺乳類の細胞に共変換するに際して優性選択として利用される。ヒト成長ホルモンのミニ遺伝子がＢＰＶ−ＭＴベクター内に挿入されて選択されたのち、Ｃｄ抵抗剤クローンは媒体中に大量のヒト成長ホルモンを産生分泌する。この単純な優性選択によりＢＰＶ７Ａ択性遺伝子を各種の細胞類型に導入することガＶ膨″ｒ−あろ− この発明では、ウシ乳頭腫ウィルスの変換域のうち６９％を含むこのベクターと、プラスミドｐＭＬ２．．（サーバー他）Ｓａｒｖｅｒ　ｅｔ　ａｌ、）　、　１’９８２年輪評；ラスキーおよびボウチャン（Ｒｕｓｋｙ　、ａｎｄ　’Ｂｏｔｃｈａｎ）　、　１９８１年）においてクローン化されたウシ乳ａＩｌｌウィルス分子の全量を含むベクターを利用して、ヒト成長ホルモンを培養したマウスの細胞内に導入する。この発明は大量のｈＧＨを産生分泌する細胞ラインを単離する。このため、（１）使用するマウス金属チオネイン−■プロモータの強度とＭ導性が増すとともに、山マウス細胞内に導入された組み換えＤＮＡ分子の安定度と増殖数が増すことになる。

ヒト成長ホルモンを細胞内に導入するための方法として初期の段階では（主としてサーバー他、１９８１年に記載がある）、ヒト成長ホルモン遺伝子を発現できる細胞が、変更された表現型を基準として選択された。この細胞が増殖されてｈＧＨを発現分泌する能力が組織培養媒体をラジオイムノアッセイによってテストされた。

この発明にする方法と得られた生成物の新規な面は、（１）変換された細胞内の組織培養媒体において大量のｈＧＨが集められることである。すなわち、たん白質の量は従来行なわれた実験（サーバー他、１９８１年）と比べて少なくとも１００倍に遅する。理由としては２つあげられる。（ａ）この発明で用いられるマウスＭＴ−１プロモータは、ＢＰＶベクター中にあっては、特にカドミウム等の重金属によって誘導されると、強力なプロモータとなることが分った。（ｂ）使用されたＭＴ−ｈＧＨＩ掻遺伝子は、ベクターを安定させる鎖を含むことが分った。従来用いられたベクターはこの鎖を含んんでおらず不安定であった。この方法による雑種遺伝子の圧出量は、このプロモータに関する従来の研究（プリンスター他、１９８２年；メイヨ他、１９８２年）から予測されえた以上に大きいものである。（２）　ＩＩＪ胞り０−ンの種類によっては培養液で増殖させたので、大量の細胞を増殖させることが容易に匂った。培養液に導入されることによって、ｈＧＨを産止するクローンの能力は最初低下した。したがって、液体培地および単層培地の両方で成長し、ｈＧＨを直レベルで産生ずることのできるドータ細胞ラインが選択された。これが、組み換えＢＰＶで変換された細胞を培養液で成長させて、良好な圧出を維持することができた最初の例である。（３）この発明による方法で産生されたｈＧＨは、補乳類のホスト細胞によって処理されて分泌されている。したがって、アミノ端に異質のアミノ酸が含まれるようなことはない。これは、アミン・ターミナル・フォルミルメチオニンを含むバクテリアのホスト細胞（米国特許第４．３４２．８３２Ｎ＞によって産生されたｈＧＨと比べて対照的である。

使用された第２の方法では、マウス金属チオネイン遺伝子全体がＢＰＶベクターに対して結さつされた。ＢＰＶ上の金属メチオニン遺伝子は、細胞に有害濃度のカドミウムに対すしたがって、組み換えＤＮＡ分子を維持し圧出する細胞の単離は簡単になっている。すなわち、組み換え遺伝子を細胞内に導入したのち、有害濃度のｃｄｃＩ２が組織培Ｉｍ体中に入れられた。組み換えＤＮ−Ａ分子を含まない細胞はＣｄによって殺されて、一方でＢＰＶ上に新しく導入された金属メチオニンを圧出する細胞は正常に成長する。

このＢＰＶ−ＭＴベクターは、他の非選択性遺伝子をマウスの細胞内に導入するのに利用される。例えば、介在鎖を含まないヒト成長ホルモンの“ミニ遺伝子” が前述のベクターに挿入された。得られた組み換え分子はマウス細胞内に導入されて、　Ｃｄに対して抵抗性を有する細胞ラインが単離されて増殖された。これらの細胞ラインで検査されたもののうち数ラインは、挿入された遺伝子によってコード化された高レベルのｈＧＨを産生分泌することが分った。この方法の新規なところは、ＭＴ遺伝子が組み換えＢＰＶに対するマーカーとして使われた最初である点である。このベクターは、他の非選択性遺伝子を培養細胞内に導入するために使用できる。この種の非選択性遺伝子の例としては、インシュリン、カルシトニン等のホルモン用遺伝子およびハバチチスＢ・表面アンチゲン等の、ワクチンとして使用できるウィルス遺伝子生成物用の遺伝子があげられる。

１１亘旦」第１−Ａ図マウスの金属チオネイン遺伝子、ヒト成長ホルモンのミニ遺伝子およ°びＩｖｌＴ−ｈＧＨ９１に種遺伝子の構造を示す。なお、各遺伝子の下方には、予想されるメツセンジャーＲＮＡ分子が示されている。

第１−８図組み換えウィルスＢＰＶＭＧ６およびＢＰＶＭＧ７の構造を示す。これらのウィノ１スはこの明細書に示すような方法で形成され、マウスの０１２７細胞に導入される。

第１−０図異なる方向に非損傷マウス（ｌｉｌｌＴ−１遺伝子を含む組み換えプラスミドＢＰＶを示す。これらの分子は、ＭＴ−１ブＯモータのコントロールの下で他の構造鎖を形成したり、変換細胞にカドミウム耐性を付与するために使用することができる。

図中斜線部はＢＰＶ鎖を示し、実線部および枠部はＭＴ−１鎖を示し、破線部はｐＢ　Ｒ３２２鎖を示す。なお、記号Ｅ、Ｂ。

Ｈ，ＢＱ、に、ＳおよびＡは、それぞれ制限酵素ＥＣ０ＲＩ。

ＢａｍＨＩ、Ｈｉ　ｎｄｌｌｒ、Ｂａ　Ｉ　Ｉｆ、ＫｐｎＩ、５ａｃＩおよびＡＶａ■を示している。

第２図ＭＴ−ｈＧＨ雑種遺伝子の構造およびそのＢＰＶベクターへの導入について示す。すべてのマウスＭＴ−１遺伝子を含む４ＫｂＥｃｏＲＩブラグメントおよびｈＧＨミニ道伝子を含む２．ＩＫ　ｂ　Ｅ　ｃ　ｏ　ＲＩブラグメントがｐＢＲ３２２ｓＶ４０ベクター内に導入される。ｈＧＨミニ遺伝子は除去されたｈＧ）− １ｎ伝子の４つの介在列のうち３つを有し、サルの腎細胞伝子のキャップサイトからｐＢ　Ｒ！）２２の１３ａｍＨＩサイトに向って延びる。この２）（ｂ３ａｍＨＩブラグメントはｐＳｖＧ　Ｈ３Ｇ　２　（Ｌ）から単離され、ＭＴ−１遺伝子の第１エキソン内のＢＱＩＩＩサイトへ導入される。Ｍ−Ｔ−１３ｉＩ伝子として同一の転写方位（ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｉｏｎａｌ　ｏｒｉｅｎｔａｔｉｏｎ）のｈＧＨプた。このプラスミドをＨｉｎｄｌで切断すると、２ｋｂのＭＴ −Ｉ　５’　フランキング列（ｆｌａｎｋｉｎｇｓｅｑｕｅｎｃｅｓ）およびｈＧＨミニ遺伝子のキャップサイトに融合されたＭＴ遺伝子の第１エキソンの一部を含むプラグメントを生じる。このプラグメントは）ｌｉｎｄｌ［でリニアライズしたプラスミドｐＢＰＶ６９ＴＤ内に導入される。このベクターはｌ）　Ｂ　Ｒ３２２にクローニングされたウシ乳頭腫ウィルス−１の変換９ａｍＨＩ−Ｈ，１ｎｄＩ［［ブラグメントを６９％含む。なお、次の操作を容易に行なうために、少量のｐＢ　Ｒ３２２のＨｉ　ｎｄｌｌ−ＢａｍＨｌブラグメントはこのベクター内で培地される。大ＩＩＩ内でクローニングした後、方向の異なる４つ組み換えプラスミドが単離された。そのうち、ｐＢＰＶＭＧ６とｐＢＰＶＭＧ７においては、ＢａｍＨｌによって完全に切断することによって、Ｄ　Ｂ　Ｒ３２２列が創出された。これによって、２つの分子ＢＰＶＭＧ６とＢＰＶＭＧ７を生じる。そして、この場合雑種遺伝子は二つの可能な方向でＢＰＶベクターに組み込まれている。

第３図ＳＶ４０−ＭＴ−Ｉプラスミドを示す。マウスＭＴ−Ｉ遺伝子を含む４０００ｂ　ｐ　Ｅ　ｃ　ｏ　ＲＩブラグメントは完全なＳＶ４０ゲノムを含む″海性隙性 ”ｐＢ　Ｒ３２２ベクター内に導入される０図中点描枠部はＭＴ−１構成列を示し、斜線枠部はＭＴ−１介在（Ｉｎｔｅｒｖｅｎｉｎｏ）鎖を示し、無地枠部はＭＴ−１フランキング列を示し、太線はＳＶ４０列を示し、細線はｐＢＲ３２２鎖を示す。なお、記号Ｑｒ　ｉ、Ｅ、Ｌ、ＰおよびＢは、それぞれ５Ｖ４０ＤＮＡ複製のオリジ＞　（ｏｒｉｏｉｎ）　、ＳＶ４０の初期転写（ｅａｒｌｙ　ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｉｏｎ）の方向、ＳＶ４０の末期転写、（１ａｔｅ　ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｉｏｎ）、ＰｓｔＩおよびＢａｍＨｌを示す。

第４図組み換えウシ乳頭腫金属チオネイン−ヒト成長ホルモンを示す。この組み換え分子はｈＧＨのミニ遺伝子をマウス細胞内に導入するために使用される。これらの組み換え分子は、ベクタ”ｌＢＰＶＭＴ５から誘導される完全なＭＴ３ｍ伝子と共にＢＰＶ（斜線部）の変換ＤＮＡプラグメントを６９％含む、介在列をもたないｈＧＨのミニ遺伝子は、ＤＮＡ複製の起ＩＩ（Ｏｒｉ）を含む５Ｖ４０ＤＮＡブラグメントと共にこのベクター内に組み込まれた。このような組み換え分子は、マウス細胞内およびサルのｃｏｓ−１細胞内のいずれにおいても培養できる。

なお、図中Ｂ、Ｅ、Ｈ，にはそれぞれ［３ａｍＨＩ、ＥｃｏＲＩ、Ｈｉ　ｎｄｌおよびＫｐｎＩを示す。

第５図ウシ乳頭−ウィルスと金属チオネインとの輯み換え分子を示す。この組み換え分子は他の非選択性遺伝子をマウス細胞内へ導入するためのベクターとして使用される。これらはＢａｍＨＩサイトで切断された全ＢＰＶ分子（斜線部）、マウスの金属チオネインエ遺伝子、およびｐＢ　Ｒ３２２複製オリジンおよびベニシリナーゼ遺伝子（波線）を含むｐＭＬ２ＤＮＡフラクションを含む。これらの分子は、大腸菌（アンピシリン耐性のあるもの）内でも増殖可能であるし、動物の細胞（カドミウム等の重金属に対する耐性のあるもの）内で増殖可能である。ベクターｐＢＭＴＨ１およびｐＢＭＴＨｌｌは、いずれもＢＰＶＤＮＡのＨｉｎｄｌｌｌサイトに導入されたＭＴ遺伝子の１つもしくは２つのコピーを含む。したがって、それらは不連続ＢＰＶＤＮＡ分子を含むことになる。ベクター１）ＢＭＴＫ６１は制限酵素ＢａｍＨＬ　Ｓａ　Ｉ　ＩおよびＳａｃＩに対して適した制限サイトをもつので、他の遺伝子を導入できる。

第６図ＢＰＶＭＧ変換細胞ラインによるｈＧＨの生成状態を示す。

細胞の培養には２４穴組織培養プレートを使用した。また、この細胞は塩化カドミウム（ＣｄＣ１２）またはデキサメタソンによって１６時ｍ＋＊導され、培地内のｈＧＨはラジオイムノアッセイによって定量された。図中（−）、（Ｃ）および（Ｄ）はそれぞれ非誘導細胞、１ｕＭのＣｄＣｌ２によって誘導された細胞、および５０ｎＭのデキサメタソンによって誘導された細胞を示す。分析の結果、コントロールライン（Ｃ１２７、ＩＤ１３、ＮＳ８　）の値は１　ｎｏ／　ｍｌより大きがった。

第７図ＢＰＶ組み換え分子および生成したｂＧＨを含む１２のクローンからの緻細胞ＤＮＡのゲルトランスファー雑種形成を示す。緻細１１ＤＮＡはＡ　（ＢａｍＨＩ）　、Ｂ　（ＳａｃＩ）もしくはＣ（ＫｐｎＩ）で切断され、１％の寒天ゲル内で電気泳動され、ニトロセルローズフィルタに吸収された。そして、雑種形成操作によって切断変換ＢＰＶプローブが形成された。

レーンＢは同一の酵素で切断されたｐＢＰＶＭＧ６ＤＮＡである。

第８図変換細胞からの低分子量Ｈｉｒｔ上ｆｆ１ＤＮＡのゲルトランスファー雑種形成を示す。ライン１はワイルド型（ｗｉ　Ｉｄ−ｔｙｐｅ）Ｂ　Ｐ　Ｖを含むｌ［）１３細胞のコントロールラインである。ライン２はＢＰＶＭＧ−６および生成したｈＧＨを含む細胞のクローン（０８ＭＧ６−９）である。ＤＮＡは未切断（ −）または５ａｃＩもしくはＫｐｈＩで切断されている。スーパーコイル分子（ｌ）、切断された円形分子（ＩＩ）および単位長線形分子（Ｉ）の近似位置が示されている。ここで、注意すべきはＢＰＶＤＮＡはＢＰｖＭＧ６ＤＮＡより小さいことである。ゲル上のＸで示される高いバンドはフリーマルチマー（ｆｒｅｅ　ｍｕｌｔｉｍｅｒ）もしくは鎖状分子である。

第９図マウスの０１２７細胞に対するＣｄＣｌ２の毒性を示す、１１胞は２４穴組織培養プレートで培養され、各種濃度のＣｄＣｌ２で処理された。Ｃｄ１１度が１５ｕＭ以上では生存する細胞はなかった。

第１０図マウス細胞Ｃ１２７にＢＰＶ−ＭＴ−ｂＧＨ組み換え分子の導入がそれらにＣｄ耐性を与えることを示す。マウスのＣ１２７細胞はＢＰＶ−ＭＴ−ｈＧＨをｌ入ＬＰ：後、２０ｕＭ（７）ＣｄＣＩ２で処理された。Ａ、ＢおよびＣはそれぞれ未処理のＣ１２７１１胞、ＣｄＣｌ２　（２ｏ　ｕ　Ｍ　）で処理したＣ１２１細胞およびＢＰＶ−ＭＴ−ｈＧＨを導入した後ＣｄＣｌ□（２０ｕ　Ｍ　）で処理したＣ１２７細胞を示す。

第１１図個々のクローンのＣｄ耐性を示す。２０ｕＭのＣｄＣｌ２内で生存している個々の部分（ｆｏｃｉ）を採取して培養した。そして、２４穴組織培養プレートに等数の細胞を採取し、２０゜４０．８０およヒ１１００ｕノＣｄＣｌ２テ処理した。８０ｕＭのＣｄＣｌ２内でも生存細胞が見られた。クローン０２〜Ｇ５はＢＰＶ−ＭＴ−ＧＨ１１１１分子を含み、りｏ−ンＭ３、Ｍ２ＳはＢＰＶ−ＭＴ組み換え分子を含む。そして、クローンＧ４、Ｇ５は多量のｈＧＨを生成する。

第１２図ＭＴタンパクおよびｈＧＨの誘導について示す。誘導もしくは非誘導細胞は、７時間の銹ｍ時ｌ［Ｉ軽過後、３５３−　ＣＶ　Ｓで１時ｌｉｌＷＡｇＩされた。

細胞質および媒介タンパクは２０％アクリルアミドグルにおける電気泳動およびオートラジオグラフィーで分析した。第１２−Ａ図はコントロールラインＩＤ１３（ＢＰｖ−■ウィルス使用）　、！：クロー’ン７−４　（ＢＰＶＭ０７使用）とから得られた媒介タンパクの比較を示す。真正な脳下垂体ｈＧＨと共に移動するバンドはクローン７−４にのみ見られる。第１２−Ｂ図は、それぞれＩＬｊＭのｃｄｃＩ２（Ｃ）　、５０ｕＭのデキサメタソン（Ｄ）で、または誘導剤なしで７時間処理した細胞からの総媒介タンパクを示す。第１２−Ｃ図は、Ｂで分析されたものと同一の細胞からの緻細胞質タン゛バクを示す。デキサメタソンで処理すると総タンパクの合成が抑制されるが、金属チオネインの生成が誘起される。

ｔｍ亘亙且ＩＭＴ−金属チオネインＥ−制限酵素ＥＣ０ＲＩＢ−制限酵素３ａｍＨＩＨ−制限酵素Ｈｉｎｄｌｌ［５ｏ−ｓＱ　ｌ　［Ｋ−制限酵素ＫｐｎＩＳ−８ａｃ”（ −ＡＶａｍｈＧＨ−ヒト成長ホルモンＢＰＶ−ウシ乳頭腫ウィルスＢＰＶ６９−ＢａｍＨｔサイトおよびＨｉｎｄｌ［［サイトで切り裂かれたりブゲ°ツムＢＰＶミニ遺伝子−ｈＧＨ遺伝子よりサイズが小さく制限サイトが数個所ない遺伝子非選択遺伝子−例として、インシュリン、カルシトニン等のホルモンを含む遺伝子もしくはバパチチスＢ°・表面アンチグン等のウィルス遺伝子生成物を含む遺伝子１１監立五旦１大腸菌菌種ＨＢ１０１（ボイヤおよびロイランドーデュソワ（Ｂｏｙｅｒ　ａｎｄ　Ｒｏｙｌａｎｄ−Ｄｕｓｓｏｉｘ）、「分子生化学ジャーナル」（Ｊ、Ｈｏ１．Ｂｉｏｌ、　）　、４１　、４５９．１９６９）　、プラスミドＥ）ＢＰＶＭＧ７１１人、ＡＴＣＣ受理番受理番号第３９鍔４２ＴＣＣ受理番号第３９２３９号大１１１１１１ＨＢ１０１　、７５スミドｐＢＰＶＭＴＫ６導入、ＡＴＣＣ受理番号第３９２４０＠大腸菌菌種ＨＢ１０１、プラスミドｐＢＰＶＭＴＨ１１１人、ＡＴＣＣ受理番号第３９２４１号細胞ラインＣＢＭＧ６−９、ＡＴＣＣ受理番号第ＣＲＬ８１８９号細胞ラインＣＢＭＧ７−４Ｌ２、ＡＴＣＣ受理番号第ＣＲ１８１８７＠細胞ラインＣＢＭ５Ｇ５、ＡＴＣＣ受理番号第ＣＲＬ８１８８号よびＩ）ＢＰＶＭＧ７の構成は三段階からなっている（第３図参照）。まず、ｈＧＨ“ミニ遺伝子”が構成される。このためエクソン２　（ｅｘｏｎ２　）のＰｖｕＩ［サイトとエクソン５（ｅｘｏｎ５）のＢＱＩＩ［サイトの間のゲノム鎖がｈＧＨ　ｃＤＮＡクローンの対応するプラグメントに置き換えられる（１９７９年マーシャル他（Ｍａｒｔｉａｌ　ｅｔ　ａｌ．）。このようにして得られつかの制限サイトが失われているのでさらに操作が可能となっている。このような “ミニ遺伝子”は不変遺伝子に関して説明したように、Ｓ■４０ベクトル中でサルの細胞で発現テストされた（１９８１年バブラキス（Ｐａｖｌａｋｉｓ　ｅｔ ’ａ１．　）　）が、多量のｈＧＨの合成をもたらすことが見い出された。

゛ミニ遺伝子”は組み換えプラスミドｐＳ　Ｖ　Ｇ　Ｈ　３　Ｃ　２　（Ｌ）（第２図参照）を備えた大ｌ１ｌ）（８１０１で増殖された。このようなミニ遺伝子は純化の後、ＢａｍＨＩによりプラスミドから切除され、Ｂａｍｔ−＋ｔは遺伝子の下側のプラス−ミドＤＮＡ内にエクソン１　（ｅｘｏｎｌ　）の末端５′ で割り込む。次段階として、このようなブラグメントはｐＪＹＭＭＴ（Ｅ）中のマウスＭＴ−　Ｉ遺伝子の非翻訳域５′のＢＣＩＩＩＩサイトにサブクローン化される（１９８２年へイマ−（　Ｈａｉｅｒ）およびウオ１，−υ１１」７目＋ｈ＾い　ｌ゛館９Ｍ会詔）−７のよろか段階によって、１．９ｋ　ｂ　ｐのＭＴ −　Ｉ　５’　フランキング（　ｆｌａｎｋｉｎｇ）鎖、６　８　ｂｐのＭＴ− 　１　５’の非翻゛訳鎖７０ｂｐのｈＧＨ遺伝子第１エクソン（ｅｘｏｎ）　、２　５　０　ｂｐのｈＧＨイントロン（　１ｒｌｔｒＯｎ）、残りの７５０ｂｐのｈＧＨｌ造金具および４５０ｂｐのｈＧＨ３’　フランキング鎖からなる雑種遺伝子が生成される。

第三の段階として、このような雑種遺伝子は＠　ｉ　ｎｄｌｌの取り込みにより回収され、）−１ｉｎｄｌｌ［を部分的に取り込んだｐＢＰＶ６９ＴＤに挿入された。プラスミドｐＢＰＶ６９ＴＤはｐＢ　Ｒ　３２２でクローン化されたＢＰＶ−Ｉブラグメントを変形した６９％のＢａｍＨ　Ｉ−Ｈ　ｉ　ｎｄｌから成りている（１９８０年ロウイ他（Ｌｏｗｙ　ｅｔ　ａｌ．））　、第２図に示した２つの興なる配向はｐＢＰＶＭＧ６がｐＢＰＶＭＧ７と命名され、大腸菌Ｈ　８　１０１で増殖された。

ＢＰＶＭＧ６およびＢＰＶＭＧ７のＡＢＰＶＭＧ６およびＢＰＶＭＧ７は［３ｏｍＨＩを用いてｐＢ　Ｒ　３２２を割り込ませかつＤＮＡリガーゼにより再環化することにより、それぞれｐＢＶＭＧ６およびｐＢＶＭＧ７から構成された（第２図参照）。

ｐＢＰＶＭＴｌおよび　ＢＰＶＭＴ５のＡ組み換え体ｐＢＰＶＭＴ１およびｐＢＰＶＭＴ５を合成するため、プラスミドｐＪＹＭＭＴ（Ｅ）（第３図参照）がＨｉｎｄｌおよびマウスＭＴ−１遺伝子を含む３．３ｋｂプラグメントにより取り込まれ、５′のフランキング鎖がＨ　ｉ　ｎｄｌｌに部分的に取り込まれた１）ＢＰＶ６９ＴＤにクローン化された。

第Ｃ図に示した組み換え体は大腸１ｉ　Ｈ８１０１で増殖され、これから単離された。

■　の１ＢＰＶＭＴｌおよびＢＰＶＭＴ５はＨｉｎ、ｄｌｌ［を、用いてＰＢ　Ｒ３２２鎖を割り込ませることによりプラスミドｐｓｐｖＭＴ１およびｐＢＰＶＭＴ５゜（第１０図参照）から合成されたの４　４　１、）これらの組み換えウィルスを合成するには二つの方法が利ＪｌすｔＬｆ、　（１）　Ｈ，ｉ　ｎ　ｄ　ｍ直線化ＢＰＶＭＴ５分子が（ａ）介在鎖を有しないｈＧＨミニ遺伝子と（ｂ）ＳＶ４０複製原（ヌクレオチド５１７１〜３４６）を含む５ｖ４０ＤＮ八部分とからなる）ｌ　ｉ　ｎｄｌｌ［プラグメントに結紮された。（２）第２の方法は組み換えプラスミドＤＢＰＶＭ５Ｇ１およびｐＢＰＶＭ５Ｇ２の合成を含んでいる。プラスミドｐＢＰＶＭＳはＨｉｎｄｌｌの組み込みによって直線化され、上記と同様なｈＱＨ−８Ｖ４０プラグメントに結紮された。

大腸菌は結紮混合物によけ変形δれ、組み換えプラスミドｐＢＰＶＭ５Ｇ１およびｐＢＰＶＭ５Ｇ２は分離されてＨｉ　ｎｄｍの割り込みを受けた。結果として得られた分子ＢＰＶＭ５Ｇ１およびｐＢＶＭ５Ｇ２はＤＮＡリガーゼにより環化された。

ｐＢＭＴＫ６および　ＢＭＴＫ６１のＡ５全マウスＭＴ−１遺伝子１ｋｂのＫｐｎＩ−ＢａｍＨＩＢＰＶＤＮＡ部分とを含むＫｐｎＩブラグメントがＫｐｎＩ直線１）ＭＬ２−ＢＰＶ　１４；Ｌｌ）ＢＲ３２２ｖＡ１体ｐＭＬ　２　チク０− ＞化されたＢＰＶ１ゲノムを全体として含んでいる（１９８１年ラスキー（Ｌｕｓｋｙ　）およびボウチャン（ｂｏｔｃｈａｎ））　＠’　（＋　（７）ようにして得られたプラスミドｐＢＭＴＫ６は１ｋｂの直線状反ｔｌＢＰＶＤＮＡを側部に有するマウスＭＴ−１３ｍ仏子合金んでいる。またこれは５ａｌＩサイトから）ｌｉｎｄｌサイトに至るＰＭＬ２ＤＮＡ部分を含んでいる。プラスミドｐＢＭＴＫ６１はＰＢＭＴＫ６の銹導体であり、ＰＢＭＴＫ６は直線状反ＩＢＰＶＤＮＡが失われている。

ＭＴＨよび　ＢＭＴＨｌｌの合成（５参照）ＭＴ−ＩＤＮＡを全体として含むＨｉ　ｎｄｌ［［ブラグメントはＨｉ　ｎｄｌｌ［一直線化ｐＭＬ２−ＢＰＶ１にＭ紮さｈ７：。このようにして得られた、１つもしくは２つのＭＴ遺伝子をそれぞれ含むプラスミドｐＢＭＴＨ１およびｐＢＭＴＩ−１１１は大ｍ菌ＨＢ　１０１から単離された状態で増殖された。

ＢＰＶＭＧ６およびＢＰＶＭＧ７を　むマ　ス　−　ンの倉羞上記のようにして合成された再環化ＢＰＶＭＧ６もしくはＵユは燐酸カルシウム共沈テクニック（１９７３年グラハム（Ｇｒａｈａｍ　）およＵｌｐ＞−デル・ニブ（Ｖａｎ　ｄｅｒ　Ｅｂ）を用いてマウスＣ１２７細胞（１９７８年ロウイ他（ｔｏｗｙ　ｅｔａｌ、））に導入された。二連間の後、個々の病巣は採取されて２４枚の組織培養プレートに入れられ、１０％の子牛胎児血清を含むダルベコ（Ｄｕｌｂｅｃｏ　）の最小必須媒体内で成長された。このような媒体は特定ｈＧＨラジオイムノアッセイ（ＲＩＡ）によりそのｈＧＨの存在をテストされた。テストされた２５のクローンは全てさまざまな量のｈＧＨの生成および分泌を示し、これらはＲＩＡにより簡単に検出された。クローン化細胞ラインはＢＰＶＭＧ６組み換え体を有するものにライてはＣＭＢＧ６−ｎ　（ｎ−１，２，３， −）と、ＢＰＶＭＧ７組み換え体を有するものについてはＣＭＢＧ７−ｎ（ｎ− １，２，３，・・・）と命名された。転換ラインにおける組み換え分子の状態を確認するため、それらの全ＤＮＡが抽出され、ＢＰＶプローブに対するゲル転換雑種形成により分析された。第７図は１２のクローンについての結果を示し、これらのクローンは３ａｍＨＩもしくは５ａＣＩを用いたものについては１回、ＫｐｎＩを用いたものについては２回切り離されている。１２のクローンのうち１０のクローンはＢａｍＨＩおよびＳａＣ工を用いたものでは非常に単純な単位長さのバンドを、ＫｐｎＩを用いたものでは過当な長さの２本のバンドを与えた。

これは、先の結果に合致して、組み換え分子が主として、すなわち、専らエピゾームとして保たれていることを示している。プラスミドＤＮＡ標準と比較すると、変換体は１０〜１００コピー／セルの組み換え分子を含んでいるものと見積られる。いくつかの切離体に見られるぼやけたバンドの存在はＤＮＡの僅かな転位もしくは１個以上のｉ＋ｕｉｉタイプ（ｃｅｌｌ　ｔｙｐｅ）の存在を表している。二つのクローン（６−２および６−３）は著しい転位を示す異なる制限パターンを与えた。これらのラインのうちの一つ（６−３）は不適当なものであり、５ケ月の培養の・後ｈＧＨの増殖が停止した。これとは対照的に予期したＤＮＡＩ造を有する１０のクローンは全て一年の経過後もひき続きｈＧＨの増殖を行なった。１０ケ月成長したいくつかのクローンを低分子ｉｌ！ハート（旧ｒｔ）上澄みＤＮＡ分析（１９６９年ハート（Ｈｉｒｔ））シたところ、ＤＮＡＩ造に何ら変化のないことが示され、スーパーコイルド・エピゾーマル分子（Ｓｕｌ）ｅｒｃＯｉｌｅｄ　ｅｌ）ｉｓＯｍａｔ　ｍｏｌｅｃｕｌｅｓ）の存在が１ｉ１認された。ｈＧＨ鎖の存在によってベクターが安定化され、従って組み換え分子がマウスの細胞内で安定的に増殖され、多量のｈＧＨが生産されることとｈＧＨ生産セルラインの成長のために、これから多量のｈＧＨ生産を可能とするスピナー培養を適用するにあたり、Ｇｘｉｏ６ａのセルがトリプシン処理され、１リツトルのスピナー培養媒体［１０％の子牛胎児血清で懸濁培養するための調整されたアールズ塩（Ｅａｒｌｅ’ｓ　５ａｌｔｓ）（ＧＩＢＣＯ）を含む最少必須媒体（イーグル（Ｅａａｌｅ）］に接種された。二連間の培養の後に検出された成長はほんの僅がであった。これらの細胞は次いで１０４セル／１の密度で新規なスピナー培養媒体内で別培養された。このような第２段階の後、これらの細胞は約４０時間の倍の時間スピナー培養による成長に供される。

懸濁培養を受けると、いくつかのＣＢＭＧ細胞クローンのｈＧＨ生産能力は消失する。セルはスピナー培養から採取されてプラスチック叡の組織培養ディツシュ（ファルコン（Ｆａｌｃｏｎ））に戻され、媒体のＲＩＡに°よりｈＧ）−１の発現を観察された。ＣＢＭＧ７−４１２で示したクローンはそのセル組織の変化にもかかわらず多量のｈＧｌ−（を生産することが見い出された。

ＢＰＶＭ５　Ｍ　Ｇ１　Ｍ５　Ｖ　− ＢＰＶＭＴＨ（７）Ａ上記のようにして合成された組み換え分子はａｍカルシウム共沈法（１９’７３年グラハムおよびファン・デル、ニブ）によりマウスＣ１２７細胞内に導入された。５０〜７０％の融合性Ｃ１２７細胞は６０Ｍの組織培養ディツシュについて１１の共沈液中で、０．１〜０．５ｕｇの組み換えＤＮＡを含む２０ｓｇの鮭の ***のＤＮＡにより処理することにより得られた。２４時間後、これらのセルはトリプシン処理され、３枚の６０ｓｍ組繊細胞ディツシュに分配された。５〜１０時間の後、媒体このような選択媒体は２〜３日毎に交換された。この条件下でマウス０１２７１１胞はカドミウムにより殺されるが（第９図および第１０図参照）、挿入マウスＭＴ−１遺伝子を表す変型細胞は抗性を持つこととなる（第１０図参照）。

Ｃｄ−抗性細胞の病巣は個々に、２４穴の組織培養プレートに移され、増殖された。ＭＳｏｌおよびＭ５Ｇ２で変換されたクローンに関しては、増殖病巣の媒体はＲＩＡによりｈＧＨの存在の分析がなされた。カドミラ・ム抗性を有しがっ挿入マウスＭＴ−１遺伝子を表すいくつかのクローンは隔絶され、０８Ｍ５Ｇｎ　（ｎ−１，２，３，・）と命名された。このようなりローンは高濃度のカド′Ｌ、ラム（８０ｕＨに至る。第１１図参照）に対する抗性を有しており、ラジオイム／アッセイによる測定では極めて多量のｈＧＨを有している。

江旦旦ユ１ｈＧＨは、分泌中に除去される疎水性のアミノ末端鎖を含むプレホルモンとして脳下重体で合成される。５Ｖ４０−ｈＧＨ組み換え体を混入させた舅の腎臓の培養セルはｈＧＨの加工および分泌の双方が可能である。（バブラキス他（ＰａＶｌａｋｉｓ　ｅｔ　ａｌ、）　、　１９８１年プロセス・ナショナル・アカデミツク・サイエンス・ニーニスニー誌（Ｐｒｏｃ、Ｎａｔｌ、＾ｃａｄ、ｓｃｉ、ＵＳＡ））。このことがＢ、ＰＶＭＧの変換についても真実であるがを検討するため、細胞には３５ｓ−システィンが加えられ、媒体中の分泌蛋白はゲル電気泳動により分析された。真正なｈＧＨ共移住する蛋白はＢＰＶＢＧ変換セルからの媒体中には観察されたが、コントロールＩＤ１３セルからの媒体中には観察されなかった（Ｍ１２図参照）。ざらに、セルをカドミウムもしくはデキサメタソンで８時間Ｍｓすると、このような蛋白の量はカドミウムにより２倍に増加したが、デキサメタソンでは何ら影響がなかった。変換ａｍはさまざまな量の高分子重量バンドがまた観察された。同様な細胞がらＳ＋＊された細胞内蛋白を平行分析したところ、金属チオネイン合成がカドミウムおよびデキサメタソンの双方によりＩ！導されることが示された。従って、変換細胞の内生的な金属チオネイン遺伝子は重金属およびグルココルチコイドの双方に対して０反応性を保持した。このようなゲルを走査すれば、変ＭｋＩＢＩ１２１がＭＴの２０〜６０倍のｈＧＨを生、産することが示される（ＭＴはシスティンの残留物を２０含むに対し、ｈＧＨはほんの４含むにすぎない）。

変換マウス細胞により分泌されたｈＧＨの量はラジオイムノアッセイによって計測された。基底レベルは０．２〜２．５υΩ／１の範囲にわたっており、これらのレベルはデキサメタソンによってではなく、カドミウムによる処理によって１．３〜２．５倍増加した。このようなｈＧＨ生産レベルは、セルが１０ケ月を経過しても一定に保たれ、もしくは実際的に増加した。細胞数と１０ケ月間培養されたＩｌ＆！の媒体ｈＧＨを測定すると、ｈＧＨ生産の基底レベルが４つの異なるクローンについて、２〜６×１０８分子／細胞／日の範囲にわたることが示される。

金　−カドミ　ムによる誘導以上ノセクションではカドミウムによりセルを８時間誘導すると、組織の蛋白の量が２倍に増加する結果が示された。

実験テはカドミウムを用いたがその他の重金属例えば亜鉛、銅および水銀等を用いてもよく、金属チオネイン遺伝子はこらのすべての金属で誘導可能であることが示されている。

浄書イ内容に変更なし）ＡＩ！ｌ＋セラインＦＩＧ、６ＦＩＧ、７＠；Ｓ：２ユ＝：誌：：１蚕８ａｃｌ　にｐｎｌ　− 手続補正書（方式）昭和９５年（２月２１日廖特許庁長官古賀　学殿１、事件の表示３、　補正をする者５、補正命令の日付ｎ’￥ｐＳへ町ｈ９８（養舌凪Ｓ名ヤ抗等＋１　’？＋’２ −”Ｉ　Ｅｌ）明　細　書マウスの細胞内で組み換えＤＮＡによって生産されたヒト成長ホルモン友丘且薯ゴーデル他（Ｇｏｅｄｄｅｌ　ｅｔ　ａｌ、）の米国特許第４．３４２゜８３２号では、バクテリアにおいてヒト成長ホルモンをつくり出すために合成遺伝子を使用する。

サーバー他（ｓａｒｖｅｒ　ｅｔ　ａｔ、）が表した、１９８１年６月発行「分子細胞生物学１」（“Ｍｏ１ｅｃｕｌａｒ　ａｎｄ　Ｃｅ１ｌｕｌａｒ　Ｂｉｏｌ。

ｇｙ”）第６号、第４８６−４９６ページ掲載の「ウシ乳頭腫ウィルスＤＮＡ　：新しい成熟核クローニングベクター」　（“Ｂｏｖｉｎｅ　Ｐａｐｉｌｌｏｍｄ　ｖｉｒｕｓ　ＤＮＡ；Ａ　ｎｏｖｅｌ　Ｅｕｋａｒｙｏｔｉｃ　Ｃｌｏｎｉｎｇ　Ｖｅｃｔｏｒ”）には、ＢＰＶクローニングベクターについて記載されており、ベクターはプレプロインシュリンに付着されている。　プリンスター他（Ｂｒｉｎｓｔｅｒ　ｅｔ　ａｌ、）が表した１９８２年３月発行［ネイチｔ−Ｊ（“Ｎａｔｕｒｅ”　）　第２９６号、第３９−４２ページ掲載の「マウス卵に注入された金属チオネイン−サイミゾイン・キナーゼ融合プラズマの調整（Ｒｅｇｕｌａｔｉｏｎ　ｏｆ　Ｈｅｔａｌｌｏｔｈｉｏｎｅｉｎ　Ｔｈｙｍｉｄｉｎｅ　Ｋｉｎａｓｅ　Ｆｕｓｉｏｎ　Ｐｌａｓｍａ　Ｉｎｊｅｃｔｅｄ　１ｎｔｏ　Ｈｏｕｓｅ　Ｅｇｇｓ”）では、ヘルペス・ウィルス・サイミゾイン・キナーゼに融合された金属チオネイン−■遺伝子プロモータ連が、キナーゼ遺伝子の発現を行なうために使用される。マウス卵は同プラスミツドに顕微注入されている。

国際調査報告

Claims

【特許請求の範囲】（１）金属チオネイン−ヒト成長ホルモン（１４Ｔ−ｈＧ旧の雑種遺伝子を形成する段階と、前記雑種遺伝子をウシ乳頭腫ウィルス（ＢＰＶ）ベクター内に組み込んで、組み換えプラスミドを形成する段階と、バクテリアのＤＮＡ鎖を取、り除いて、　ＨＴ−ｈＧＨ−ＢＰＶ組み換え分子を形成する段階と、前記組み換え分子を培養したマウスの細胞内に導入する段階と、前記組み換え分子を含む変換細胞を単離増殖させる段階と、前記変換細胞に対し有害とならない濃度のカドミウム−を添加する段階と、前記変１ＩｋＩ［胞から分泌されたヒト成長ホルモンを分ａｇ製する段階とから成ることを特徴とするヒト成長ホルモンの収率増大方法。（２）金属チオネイン−非選択性遺伝子の雑種遺伝子を形成する段階と、前記雑種遺伝子をウシ乳頭腫ウィルス（ＢＰＶ）ベクター内に組み込んで、組み換えプラスミドを形成する段階と、バクテリアのＤＮＡ鎖を取り除いて、ＨＴ−非選択性遺伝子−ｅｐｖ組み換え分子を形成する段階と、前記組み換え分子を培養したマウスの細胞内に導入する段階と、前記組み換え分子を含む変換細胞を単離増殖きせる段階と、前記変換細胞に対し有害とならない濃度のカドミウムを添加する段階と、生成した非選択性遺伝子を分離精製する段階とから成ることを特徴とする非選択性遺伝子の収率増大方法。、（３）前記組み換えプラスミドがＢＰＶＨＧ６であることを特徴と（４）前記組み換えプラスミドが、ＢＰＶＨＧ７であることを特徴とする請求の範囲第１項記載のヒト成長ホルモンの収率増大方法。（５）前記カドミウムに代えて、銅および水銀より成る群から選択される少なくとも１つの金属が使用されることを特徴とする請求の範囲第２項記載の非選択性遺伝子の収率増大方法。（６）マウスの金属チオネイン−１（ＨＴ−１）３１伝子を単離し、その遺伝子を適切な第１プラスミドＰＳＶＨＴ（１）に導入する段階と、ヒト成長ホルモンの構成鎖より成る第２遺伝子を単離して、その第２遺伝子を組み換えプラスミド、５ＶＧ８３Ｃ２（［）に導入し、そのプラスミドを大ｍ　ｌ　ＨＢ１０１内で増殖させる段階と、制限酵素ＢａｍＨＩを使用して前記第２遺伝子をプラスミドＰＳＶＧ８３Ｃ２（Ｌ）から切除し、その第２遺伝子を第１プラスミド内のマウスのＨＴ−１遺伝子のＢ（１１１１サイトにサブクローニングして、プラスミド、５ＶＨＴＧ１１８内で雑種遺伝子ＨＴ−ｈ’ＧＨを生成させる段階と、前記雑種遺伝子を採取するために・Ｈｉｎｄｌｌｌを使用してプラスミド、５ＶＨＴＧＨ８を切除する段階と、前記雑種遺伝子を適切なプラスミド−ウシ乳頭腫ウィルス（ｅｐｖ）ベクター、ＢＰシロ９ＴＯ内に導入する段階と、前記プラスミド− ＢＰＶベクターを大臨菌１１８１０１内で増殖させる段階と、プラスミド鎖をＢａｗ＋ＨＩを使用して切断し、ＢＰＶ−ＨＴ−ｈＧＨの組み換え分子をＤＮＡリガーゼによって再環化する段階と、組瘍快慟　由　じ　訣け　ス　ヒ　ト　−　区　本　１１２手　ゝノ　山　肚　向　し−毫高　１．を−憤普マ　向ス細胞内に前記ＢＰＶ−ＨＴ−ｈＧＨの組み換え分子を導入する段階とから成ることを特徴とするヒト成長ホルモン等の非選択性遺伝子の生成方法。（７）請求の範囲第１項の方法によって得られた変換マウス細胞ラインであって、ＣＢＨＧ　６−９およびＣＢＨＧ７−４Ｌ２より成る群から選択される変換マウス細胞ライン。（８）　ＨＴ遺伝子を適切なプラスミド−〇ＰＶベクター内に導入する段階と、そのベクター内にｈＧＨ遺伝子を導入して組み換え分子を形成する段階と、この組み換え分子をマウス細胞内に導入する段階と、この細胞を有害１１度のカドミウムで処理する段階と、１存細胞をｌ＄１離する段階と、これらの細胞中ｈＧＨを効率よく生成する細胞を増殖させる段階とから成ることを特徴とする効率のよいｈＧｌ（の産生方法。（９）　ＨＴ遺伝子を適切なプラスミド−ＢＰシベクター内に導入する段階と、そのベクター内に非選択性遺伝子を導入しτ細胞内に導入する段階と、この細胞を有害８１度のカドミウムで処理する段階と、生存細胞を単離する段階と、これらの細胞中非選択性遺伝子を効率よく生成する細胞を増殖させる段階とから成ることを特徴とする効率のよい非選択性遺伝子の産生方法。（１０）ウシ乳頭腫ウィルス−金属チオネインＩ　（ＢＰＶ−ＨＴ）組み換えプラスミドベクターを形成する段階と、前記ＢＰＶ−ＨＴベクターに非選択性遺伝子列を導入する段階と、ＲＰＶ−ＨＴ−非選択性遺伝子ベクターをマウス細胞内に導入する段階と、その細胞に有害濃度のカドミウムを添加する段階と、生存細胞を単離し、その細胞中非選択性遺伝子を効率よく生成する細胞を増殖させる段階とから成ることを特徴とする効率のよい非選択性遺伝子の産生方法。（１月非選択性遺伝子がヒト成長ホルモン（ｈＧＨ）であることを特徴とする請求の範囲第１０項記載の効率のよい非選択性遺伝子の産生方法。（１２）前記カドミウムに代えて、銅および水銀より成る群から選択される少なくとも１つの金属が使用されることを特徴とする請求の範囲第１０項記載の効率のよい非選択性遺伝子の産生方法。（１３）請求の範囲第１０項記載の効率のよい非選択性遺伝子の産生方法において使用されるプラスミドであって１．ＢＰＶＨＴｌ、ＰＢＰＶＨＴ５．　ＰＢＨＴＫ６　、ＢＨＴＫ６１．　、ＢＨＴＨｌ　、および、ＢＮ２ＴＨｌｌ、より成る群から選択されるプラスミド。（１４）ＣＢＨＧ６−９で表わされるほぼ純粋なマウス細胞ライン。（１５）ＣＢＨＧ７−４Ｌ２で表わされるほぼ純粋なマウス細胞ライン。（１６）ＣＢＨ５Ｇ５で表わされるほぼ純粋なマウス細胞ライン。（１７）組み換えプラスミド、ＢＰＶＨＧ６゜（１８）組み換え７−）　スミト、ＢＰＶＨＧ７゜（１９）組み換えｙ　５　スミＦ　、ＢＰＶＨＴ５゜（２０）組み換えプラスミド、ＢＰＶＨＴに６゜（２１）組み換エフ　７　スミトｐＢＰＶＨＴＨ１１。（２２）変換細胞を撹拌培養器内に連続的に投入することによって、その変換細胞を撹拌培養器内で成長させた後、ｈＧｌｌを高レベルで生成する細胞を単離増殖させることを特徴とする請求の範囲第１項記載のヒト成長ホルモンの収率増大方法。（２３）変換ｌ１ｌｖｉを撹拌培養器内に連続的に投入することによって、その変換細胞を撹拌培養器内で成長させた後、非選択性遺伝子を高レベルで生成する細胞を単離増殖させることを特徴とする請求の範囲第２項記載の非選択性遺伝子の収率増大方法。