JPH02501186A - 異種ウイルス性ペプチド粒子の免疫原 - Google Patents
異種ウイルス性ペプチド粒子の免疫原Info
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Abstract
(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるため要約のデータは記録されません。
Description
【発明の詳細な説明】
異種ウィルス性ペプチド粒子の免疫原
光所夏分互
この発明は、免疫原として有用である粒子に関する。さらに詳しくは、該粒子は
、免疫応答を引き起こす、1もしくは複数のウィルスまたは寄生体〔例えば、肝
炎(B、A、非−A、非−B) 、AIDS(HIV、 1(TLVIII)
、7ラリア、***、ポリオ)由来のエピトープを示すペプチドを単量体として
含む。
発−明!すL最
B型肝炎ウィルス(“HBV”)で感染された個体の血液から単離された天然に
生ずる20nmの粒子に類似のペプチド粒子が、免疫原として有用であることが
知られている。例えば、Murray、米国特許第4.710.463号は、免
疫原として有用である粒子を形成せしめるのに利用できるHBVのSペプチドを
生産するための組換え方法を開示している。Valenzuelθら、欧州特許
公開第0175261号は、免疫原として有用であるとクレームされている粒子
を形成するHBVからのSタンパク質に連結しである種のウィルスおよび寄生体
からのエピトープを含むペプチドを生産するための組換え方法を開示している。
これらの粒子のタイプは、所望のエピトープを含むペプチドの大部分が生成粒子
中に組み込まれるようにする比において、粒子を形成するであろうペプチドを発
現する細胞が種々のペプチドを発現する場合に、免疫原として最も効果的である
。Valenzuelaらは、粒子を作るのに使われている単量体の全てに完全
なSペプチドを組み込んだ。このValenzuelaの構成物における強力な
S開始領域の存在は、異種(HBV以外の)エピトープを含有しない単量体を産
生ずる転写開始シグナルとして働き、異種エピトープを有する単量体の減少され
たレベルを含む粒子を生じるであろう。
主所夏翌立
本明細中で使われる“エピトープ”という用語は、指示されたウィルスのゲノム
または特別に指示されたゲノムの領域によりコードされる少なくとも6個の連続
したアミノ酸配列を言及する(例えば、“HAVエピトープ”は、A型肝炎ウィ
ルスのゲノムによりコードされる少なくとも6個の連続したアミノ酸の配列を言
う)。本明細書中で使われる“異種エピトープ”という用語は、B型肝炎ウィル
ス以外のあらゆる起源のエピトープを言う。本明細書中で使われる“T−細胞エ
ピトープという用語は、T−細胞の表面上のレセプターと相互作用して免疫応答
を増強するかまたはその逆に影響を及ぼすエピトープを言う。
本発明によれば、複数の第一のペプチド単量体および複数の第二のペプチド単量
体を共に結合して含んで成る免疫原性の粒子が開示される。第一のスプチド単量
体の各々は、分泌の際に少な(とも直径Ion−の粒子を形成するであろうペプ
チドの実質的部分に相当するアミノ酸配列、および異種エピトープに相当するア
ミノ酸配列を含んで成る。第二のペプチド単量体の各々は、(1)分泌の際に少
なくとも直径10nmの粒子を形成するであろうペプチドの実質的部分に相当す
るアミノ酸配列を含んで成り、そして(2)異種エピトープに相当するアミノ酸
配列を含まない。第一のペプチド単量体と第二のペプチド単量体は同じではない
(即ち、異なるアミノ酸配列を含有する)。
複数の第一のペプチド単量体、複数の第二のペプチド単量体および複数の第三の
ペプチド単量体を共に結合して含んで成る免疫原性の粒子もまた開示される。第
一および第二のペプチド単量体が同じであり得ることを除いて、第一および第二
のペプチド単量体は前記のものと同様である。第三のペプチド単量体は、分泌の
際に直径少なくともIonsの粒子を形成するであろうペプチドの実質的部分に
相当するアミノ酸配列、およびT−細胞エピトープに相当するアミノ酸配列を含
んで成る。
複数の第一のペプチド単量体および複数の第二のべ・ブチド単量体を共に結合し
て含んで成る他の免疫原性の粒子も開示される。この第一のペプチド単量体の各
々は、分泌の際に直径少な(とも10nmの粒子を形成するであろうペプチドの
実質的部分に相当するアミノ酸配列、異種エピトープに相当するアミノ酸配列、
およびT−細胞エピトープに相当するアミノ酸配列を含んで成る。第二のペプチ
ド単量体の各々は、(1)分泌の際に直径少な(ともLoneの粒子を形成する
であろうペプチドの実質的部分に相当するアミノ酸配列を含んで成り、そして(
2)異種エピトープに相当するアミノ酸配列を含まない。
分泌の際に直径少なくとも1ona+の粒子を形成するであろうペプチドは、’
HBV Sペプチド、HBVコア抗原、ポリオ表面抗原、A型肝炎表面抗原、
A型肝炎コア抗゛原、HIV表面抗原およびHIVコア抗原を包含する。好まし
くは、少なくともIontnの粒子を形成するペプチドがHBV Sペプチドで
ある。直径少なくとも10nmである粒子を形成するであろうペプチドが)IB
V Sペプチドである、前記の免疫原性粒子もまた開示される。成るそのような
免疫原性粒子においては、HBVSペプチドの実質的な部分のみに相当するアミ
ノ酸配列が存在し;成る粒子においては、HBV Sペプチドの全部に相当する
アミノ酸配列が存在する。
本発明の免疫原性粒子中の異種エピトープは、ウィルスまたは寄生体のエピトー
プであることができる。ウィルス性エピトープは、A型肝炎エピトープ、非−A
型肝炎エピトープ、非−B型肝炎エピトープ、HIVエピトープ、ポリオエピト
ープおよび***ウィルスエピトープを包含する。マラリアエピトープが寄生体
エピトープの一例である。好ましい異種エピトープのヌクレオチド配列が第1表
に挙げられている。
他の既知の異種エピトープまたは後で発見される異種エピト寄生体起源であるか
にかかわ゛らず、本発明を実施するのに使好ましいT−細胞エピトープのヌクレ
オチド配列は第1表に示されている。
単量体コード領域を含んで成る組換えDNA分子もまた開示される。該単量体コ
ード領域は、第一のDNA配列および第二のD N A配列を含んで成る。第一
のDNA配列は、HBVSペプチドの全部ではなく実質的部分に相画するアミノ
酸配列の発現をコードする。第二のDNA配列は異種エピトープに相当するアミ
ノ酸配列の発現をコードする。第−D N A配列および第二D N A配列は
、(1)同じリーディングフレーム内にあり、(2)単一ペプチドのそれぞれ別
々の領域をコードし、そして(3)組換えDNA分子において発現調節配列に作
用可能に連結される。
第一のDNA配列および第二のDNA配列を含んで成る組換えD N A分子が
開示される。この第一のDNA配列は、HBV Sペプチドの実質的部分に相当
するアミノ酸配列の発現をコードする。第二のDNA配列は、T−細胞エピトー
プに相当するアミノ酸配列の発現をコードする。第一のD N A配列および第
二のDNA配列は、(1)同じリープイン、グフレーム内にあり、(2)単一ペ
プチドのそれぞれ別々の領域をコードし、そして(3)組換えDNA分子におい
ては発現調節配列に作用可能に連結される。
第一のDNA配列、第二のDNA配列および第三のDNAこの第一のDNA配列
は、RBV Sペプチドの実質的部分に相当するアミノ酸配列の発現をコードす
る。第二のD N A配列は、異種エピトープに相当するアミノ酸配列の発現を
コードする。第三のD N A配列は、T−細胞エピトープに相当するアミノ酸
配列の発現をコードする。第一のDNA配列、第二のDNA配列および第三のD
NA配列は、(1)同じリーディングフレー五内にあり、(2)単一ペプチドの
それぞれ別々の領域をコードし、そして(3)組換えDNA分子において発現調
節配列に作用可能に連結される。
前記の組換えD N A分子を用いて形質転換された宿主細胞が開示される。前
記の組換えD N A分子および、HBV Sペプチドのアミノ酸配列の実質的
部分または全部に相当するアミノ酸配列の発現をコードするD N A配列を含
んで成る第二の組換えD N A分子を用いて、同時形質転換された宿主細胞も
また開示される。
第一の分離した(discrete)領域および第二の分離した領域を含んで成
るペプチドが開示される。第一の領域は異種エピトープのアミノ酸配列に相当し
、そして第二の領域はHBV Sペプチドの全部ではなく実質的部分に相当する
。本質的に第一の領域および第二の領域から成る他のペプチドも開・示される。
第一の分離した領域および第二の分離した領域を含んで成るペプチドも開示され
る。この第一の領域はT−細胞エピトープのアミノ酸配列に相当し、そして第二
の領域はHBV Sペプチドの実質的部分に相当する。
第一の分離した領域、第二の分離した領域および第三の分離した領域を含んで成
る他のペプチドが開示される。この第一の領域は異種エピトープのアミノ酸配列
に相当し、第二の領域はT−細胞エピトープのアミノ酸配列に相当し、そして第
三の領域はHBV Sペプチドの実質的部分に相当する。
医薬調製物および抗体の生産に有用な調製物が開示される。
該調製物は、該調製物の投与の際に免疫応答を誘発せしめるのに十分な濃度にお
いて前記の免疫原性粒子を含んで成る。
調製物の投与の際に免疫応答を誘発せしめるのに十分な濃度の前記の免疫原性粒
子および適当なキャリヤーを含んで成る、抗体の生産に有用な調製物も開示され
る。
形質転換された細胞を生産するための方法が開示され、この方法は、コンピテン
トにされた宿主細胞をD N Aの取込みのために用意し、この宿主細胞を、前
記の組換えDNA分子を含んで成る第一のDNAm製吻に暴露し、適当な条件下
で該宿主細胞が第一のD N A 14製物からD N Aを取り込むのを許容
し、そして外来D N Aを取り込んだ宿主細胞について選択することを含んで
成る。第一のD N A 11製物は、)IBV Sペプチドのアミノ酸配列を
含むペプチドをコードするDNA分子をさらに含んで成ることができる。該方法
は、宿主細胞を第一のDNA調製物に暴露する前または後に、それらを第二のD
NA調製物に暴露しそして適当な条件下で宿主細胞が第二のD N A 11製
物を取り込むのを許容することをさらに含んで成ることができる。第二のDNA
調製物は、HBV Sペプチドのアミノ酸配列を含むペプチドをコードするD
N A配列を含んで成る。
ペプチドを生産する方法もまた開示され、この方法は、前記の組換えD N A
分子を調製し、該組換えD N A分子を用いて宿主細胞を形質転換せしめ、該
宿主細胞によるタンパク質の発現および分泌を許容する条件下で宿主細胞を培養
し、そして該組換えD N A分子内でのDNA配列の発現の結果として生産さ
れたペプチドを回収する、ことを含んで成る。このような方法により生産される
ペプチドは、該組換えD N A分子のコード領域によりコードされる完全なア
ミノ酸よりも少な(含むことができる。これは、組換えDNA分子のコード領域
の一部分のみの転写および/または翻訳に起因するか、あるいは翻訳後にペプチ
ド内で起こった削除による。
免疫原性粒子を生産する方法が開示され、この方法は、前記の組換えDNA分子
を調製し、この組換えDNA分子を用いて宿主細胞を形質転換せしめ、該宿主細
胞によるタンパク質の発現および分泌を許容する条件下で宿主細胞を培養し、そ
して適当な条件下で該宿主細胞内での外来DNA配列の発現の結果として生産さ
れたペプチド単量体の会合を許容することを含んで成る。宿主細胞は、HBV
Sペプチドのアミノ酸配列を含むペプチドをコードしているDNA分子を使、っ
てさらに形質転換され得る。
医薬調製物および抗体の生産に有用な調製物の製造方法が開示され、この方法は
、前記組換えD N A分子を調製し;該組換えD N A分子を用いて宿主細
胞をトランスフェクトし;該宿主細胞によるタンパク質の発現および分泌を許容
する条件下で該宿主細胞を培養し;゛適当な条件下で該宿主細胞内でのDNA配
列の発現の結果として生産されたペプチドの会合を許容し、免疫原性粒子を形成
せしめ;そして該免疫原性粒子が個体への調製物の投与の際に抗体を誘発せしめ
るのに十分な濃度で存在するように、該免疫原性粒子を適当なキャリヤーと配合
する;ことを含んで成る。宿主細胞は、HBV Sペプチドのアミノ酸配列を含
むペプチドをコードしているDNA分子を用いてさらにトランスフェクトされ得
る。
士しい 能−のi′B
本発明の組換え構成物は、ヌクレオチド配列が決定されるかまたは単離され得る
ようなあらゆるウィルス性エピトープを使って調製され得る。本発明を実施する
のに好ましいエピトープは、HBV、、A型肝炎ウィルス(“HAV″)、AI
DSウィルス(”HI V’)、マラリア、ポリオウィルスおよびロ蹄疫ウィル
ス由来のものである。好ましいエピトープ(T−細胞およびB−細胞のエピトー
プともに)およびそれらの配列は第1A表に要約される。
A ゛
男」」(表コm
1it口m
IA し01[L
第1表中に示されたエピトープは、下記に特定的に記載されるような本発明の構
成物の設計においてまたは他の組合せにおいて使用され得る。第1表中に示され
たエピトープまたは他の望ましいエピトープを本発明の構成物に挿入するために
、アダプターまたはリンカ−配列(例えば、下記に記載されるもの以外の制限断
片または合成オリゴヌクレオチド)を利用することができる。
劃−」−
異種エピトープがHAV起源のものであるペプチドの発現に利用されるベクター
プラスミドpHBI
H2にプロモーターをpspH2(Exogenから入手可能)からEcoRI
/ B gl U断片(−kb)として単離した。そのプロモーターをHBV
ゲノムから(7)2.3kb(7)BglII/BglI[断片、並びに選択マ
ーカーおよび複製開始点を含むpBR322からの断片と連結させた。
プラスミドpHA1
エンドヌクレアーゼEcoRIおよびBamHIでの制限消化の後の粘着末端を
有するpBR322断片を、合成アダプター配列:EcoRI BglI[
5’ −AATTCAAGATCTGCCATGCAGTGGAAGCTTAA
GGATCCTCTAGA−3’GTTCTAGACGGTACGTCACCT
TCGAATTCCTAGGAGATCTCTAGおよびHAVゲノムからの旧
nd m −BamHI断片(310bp)と連結させた。該アダプターは、H
AVの旧nd m −BamHI断片が開始シグナルの正確な読み枠内にあるこ
とを保証し、そのため開始シグナルおよびそれのフランキング配列はHBV表面
抗原(“HBV−3−Ag、HBsまたはHBsAg”)(サブタイプayw)
由来である。
この新規プラスミドをBglIIおよびXbalで消化しく322bp)、そし
てHAV−遺伝子コード領域を含有するその322bpの断片をアガロースゲル
電気泳動後に単離した。
プラスミドpHBA2
このベクターは、EcoRI部位とBg1m部位の間のpBR322部分にクロ
ーニングされるH2にプロモーター配列、および例えばHBV Sペプチドをコ
ードする遺伝子配列(2,3kbのBgl■断片、HBV−ゲノムから単離、サ
ブタイプayw)を含む。該HBV断片の5′−末端配列の一部をBglIIお
よびXbalでの限定消化により除去しく550bp) 、そしてHAV遺伝子
の上流に開始シグナルを有するHAVのVPIペプチドの部分をコードしている
、プラスミドpHA1から単離されたD N A断片(322bp)で置き換え
た。この置換は、除去された断片と同じリーディングフレーム内にセントされた
。
プラスミドpHBA3. pHBA4. pHBA5. pHBA6. pHB
A7プラスミドpHBA3. pHBA4. pHBA5. pHBA6および
pHBA7は、pHBA2が前記322bpのHAV断片の代わりに第1表から
それぞれオリゴヌクレオチドNα105.107.109.111および113
の置換を有するように作製された。
プラスミドpHBA2s1. pHBA3s1. pHBA4s1. pHBA
5s1. pHBA6s1゜pHBA7s1
プラスミドpHBA2. pHBA3. p)IBA4. pHBA5. p)
IBA6およびpHBA7をEcoRIでそれぞれ線状にした。これらのEca
l? I断片の各々を、ネオマイシン選択遺伝子の上流にMT−プロモーターを
含有するプラスミドpMT−neo −K(ATCCから入手可能)から単離さ
れた第二のEcoRI断片と共に連結させた。
プラスミドpHBA2AおよびpFIBA3Aプラスミドp)IBA2およびp
HBA3をEcoRIで線状にした。これらの断片の各々を、aht’r選択(
増幅)遺伝子を含有するプラスミドpdhfr3.2 (ATCCから入手可能
)から単離された第二のEcoRI断片と共に連結させた。
プラスミドpHBA2S2およびpHBA3S2プラスミドpHBA2およびp
HBA3をEcoRIで線状にした。これらの断片の各々を、egpt選択遺伝
子の上流にMT−プロモーターを含有するプラスミドpMTegpt (Pha
rmaciaから入手可能)から単離された第二のEcoRI断片と連結させた
。
翌1.−
T−細胞エピトープを含むペプチドの発現に利用されるベクター
1)T−細胞エピトープがHBV−プレー82起源であるもの
プラスミドpUT2B
プラスミドpMT −neoKをEcoRIおよびBglIIで消化した。
2つの分子が予想され、MT−プロモーターを担持しているもの(1,9kb)
を、pBR部分およびネオマイシン選択遺伝子を担持している目的の断片からア
ガロースゲル電気泳動により除去した。この断片を、U2−プロモーター配列を
担持している別の断片(330bp)と−緒に連結させた。U2−プロモーター
はプラスミドpUc 8 42 (Exogenから入手可能)からEcoRI
−Apa I断片として単離された。新規プラスミドをpU2− neoと命
名した。
第二段階において、このプラスミドpU2− neoをBglIrおよびBam
HIで消化して該プラスミドからネオマイシン遺伝子を除去し、そしてpBR3
22部分およびpU2−プロモー、ターを含有する目的の断片を2.3kbのB
gl II−HBV断片(前記)と連結した。pUBと称するこのプラスミドを
BglIIおよびXbaIで消化して550bp (前記)を除去した。その除
去部分は、本来のプレーSIの開始シグナルおよびフランキング配列を含みそし
て対応する粘着末端を有する、HBVプレーS、のT−細胞エピトープをコート
する合成オリゴDNA配列により置き換えた。この新規プラスミドをptlT2
B1と命名した(オリゴヌクレオチドNα175第■表から)。
2)T−細胞エピトープがマラリア起源、HBV−プレー82起源またはHBV
−コア起源であるものプラスミドpUTIB、 pUT3B、 pUT4B。
プラスミドβUTIB、 pU73BおよびpLIT4Bは、ptlT2B1に
ついて前述したのと同様にして調製された。ただし置換するオリゴD N A配
列は、該D N A配列が別のT−細胞エピトープをコードしていることで異な
っている(マラリアについては:オリゴno、179 ; HB V−プレー3
2については:オリゴno。
177;HBV−コアについては:オリゴr+o、185 ;全て第1表HBV
起源のポリペプチドを形成する粒子の発現に利用されるベクター
プラスミドpHBP1
プラスミドpHB1をBglIIおよびXhoIで消化した。2つの分子が予想
されるが、430bpのもの(プレーS配列を含む)を除去しそしてアガロース
ゲル電気泳動により目的の・断片から分離した。大きい方の目的の断片を合成ア
ダプター配列=5’ GATCTTTAAC3’
AAATTGAGCT
Bgl TI Xho 1
と連結して閉じた環状のプラスミドD N Aを得た。
プラスミドpMBP 1
プラスミドpHBP1をEcoRIおよびBglI[で消化した。2っの分子が
生じ、H2に一プロモーター(2kb)を含むものを除去し、そしてプラスミド
pMT −neoから単離されたMT−プロモーターを含有するEcoR1−B
gl IIl断片より置き換えた。
プラスミドpMMp2
プラスミドpMT −neoをBamHIおよびBglIIで消化すると2つの
分子が生じた。ネオマイシン選択遺伝子を含むものを除去し、そしてMT−プロ
モーターおよびpBR部分を含む目的の断片(4,5kb)をアガロース電気泳
動後に単離し、そしてHBV−3−^g(サブタイプadw)をコードする断片
と連結した。HBV−3−Ag断片(1,8kb)は、エンドヌクレアーゼBg
lnおよびBam)I Iでの消化によりHBVゲノムから単離された。
プラスミドpHBP2
プラスミドpH−neo (ATCCから入手可能)をBglIIおよびBal
1l Iで消化した。2つの分子が予想され、ネオマイシン選択遺伝子を含むも
のを除去し、そしてH2−プロモーターおよびpBR部分を含む目的の断片を単
離した。前記断片を、HBV−3−Agをコードしティる1、8kb(7)HB
Vゲ/ム(adWサブタイプ)から単離された断片(前述)と連結させた。
プラスミドpHBc1
プラスミドpH−neo @ B gl IIおよびBamHIで消化した。2
つの分子が予想され、ネオマイシン選択遺伝子を含む方を除去し、そしてH2−
プロモーターおよびpBR部分を含む目的の断片を単離した。前記断片を、)I
BM−コアペプチドをコードしているHBVゲノム(サブタイプadw)から単
離されたBawl(l断片(1,776kb)と連結させた。
プラスミドpoap1s1
プラスミドpHBP1をEcoRIで線状化し、そしてネオマイシン選択遺伝子
の上流にMT−プロモーターを含むプラスミドpMT−neo −Kから単離さ
れた第二のEcoRl断片と連結せしめた。
プラスミドpMBP1s1. pHBP2s1. pMBP2s1. pHBc
1s1プラスミドpMBP1. pi(BF2. pMBP2およびpHBcl
を、プラスミドp)IBPIsIについて記載されたようなネオマイシン選択遺
伝子をコードする遺伝子配列を付加することにより補足した。
プラスミド9118PIS2
プラスミドpHBP1をEcoRIで線状にし、そしてegpt選択遺伝子の上
流にMT−プロモーターを含有するプラスミドpMT−egpt−K (Pha
raaciaから入手可能)から単離された第二のEcoRl断片と連結せしめ
た。
プラスミドpMBP1s2. pHBP2s2. pMBP2s2プラスミドp
MBP1. pHBP2およびpMBP2を、前述したようなegpt選択遺伝
子をコードしている遺伝子配列を追加することにより補足した。
プラスミドpHBPIA
プラスミドpHBP1をEcoRIで線状化し、そして選択/増幅遺伝子dh、
frを含むプラスミドpdhfr3.2から単離された第二のEcoRl断片と
連結せしめた。
プラスミドpMBPIA、 pHBP2A、 pMBP2AプラスミドpMBP
1. pHBP2およびpMBP2を、プラスミドpHBPIAについて前述し
たような選択/増幅遺伝子dhfrをコードしている遺伝子配列を追加すること
により補足した。
■−土
宿主細胞中への所望のプラスミドの遺伝子伝達(トランスフェクション)による
抗原産生受容細胞の生産(1)まず、受容細胞(C127,L、 CIO(AT
CC) )をプラスミドpHBP2S2 (粒子を形成するポリペプチドの遺伝
子配列を含む)でトランスフェクトした。高レベルで前記粒子を発現する細胞ク
ローンを見つけた。
同定された該クローンの第二のトランスフェクション(同を用いて行った。同時
トランスフェクションされた細胞クローンをイムノアッセイにより分析し、同時
トランスフェクトしたプラスミドによりコードされる種々の単量体を分泌してい
る細胞を検出した。
(2)前記受容細胞を3種の所望のプラスミド(pHBP2s1 。
pHBA2およびpUT2B)の混合物で直接トランスフェクトした。
トランスフェクション後、増殖した細胞クローンをイムノアッセイにより直接分
析し、前記の同時トランスフェクトしたプラスミドによりコードされる種々の単
量体を分泌している細胞クローンを検出した。
(3)次のプラスミドの組合せをトランスフェクションに用いた時、受容細胞の
トラ7スフエクシヨン後に同一の単量体の収得物が得られるだろう:
a)最初にpHBP2s1 、次にpHBA2S2およびpUT2Bb ) p
HBP2A、 pHBA2およびpUT2B(7)混合物上記のトランスフェク
ション形式において、pHBA2の代わりにプラスミドpHBA3. pHBA
4またはpHBA5が置換され得る。
(4)次のプラスミドの組合せを用いた受容細胞の2回のトランスフェクション
後にも同様な単量体の収得物が得られるだろうニ
ー11回目トランスフェクション: pHBP2s2+pUT2B−2回目(D
)ランス7エクシs ン: pHBA3s1+puTIBトランスフェクショ
ンは次のように行った。受容細胞を1日目にペトリ皿(IOCI+の皿あたり1
−2X10−細胞数)中の標準的な増殖培地(DMIl’M+5%ウシ胎児血清
、グルコースおよびグルタミン)に接種した。
翌日培地を取り除き(DNA沈澱物を該細胞に添加する4時間前)、そして細胞
をIXPBSで2回洗った0次いでFe2を含まない8dのDMEM (最終濃
度101のHepesで補充)を添加した。4時間後、D N A沈澱物を該細
胞に加えた。
再び4時間後に培地を除去しそして3dのグリセロ−・ルー混合物(50dの2
XHBS緩衝液、30dのグリセロール、120altの蒸留水)を添加した。
37℃にて3分間インキエベーシッン後すぐに該グリセロール−混合物を除去し
、そして細胞をIXPBSで洗浄した。10%FC5を含む8dの聞EMで細胞
を一晩培養した。翌日、トリプシン−EDTA−溶液(0,025%トリプシン
+1 mM I’DTA)で処理することにより細胞に、細胞をIXPBSで洗
浄し、10%FCSを含むDMEM中に懸濁せしめ、そして24ウエルのプレー
ト中に分配した。
(細胞を1皿から1枚の24ウェル−プレートへ)。細胞が十分に増殖した時に
選択培地を添加した〔例えば、0.5−1■/d−4度のネオマイシン、および
キサンチン:250■/d:ヒポキサンチン:15■/−(またはアデニン:2
5■/d);チミジン=10■/d、アミノプテリン:2■/−、ミコフェノー
ル酸:25■/−〕。
該培地を毎週交換した。2週間後に最初の増殖している細胞コロニーが見えた。
増殖した細胞コロニーをELISAによりタンパク質の分泌についてスクリーニ
ングした。
トランスフェクション用のD N A沈澱物は次のように調製した。10鱈のプ
ラスミドD N Aおよび20鱈のキャリヤーD N A (サケ***D N
A、仔ウシ胸腺DNA)にTE−緩衝液(10mM Tris−HCl、 1m
M EDTA、 pH7,05)を最終体積440Iまで添加し、そして60m
の2M CaCf□と一緒に混合した。
次いで等量の2 XHBS (Hepes 50mM、 NaC1280+++
M、 NazHPOnl、5+++M、 pH7,05)を添加し、そしてよく
混合した。 ・その沈澱溶液を37℃で30分間インキュベートし、そしてトラ
ンスフェクトされる細胞に直接加えた。
第1表は、本発明に従って調製され、HAV異種エピトープ、HBV−ブL/S
、T−細胞エピトープおよびHBsAg エピトープを含む粒子のELISA分
析を要約している。
男」L表
請求の範囲に従ったCsC1勾配後の所望のエピトープの測定:抗体を用いたE
LISAによる測定
10−12 1.646 0.871 0.725[5
HBsAgの定量
a、ラジオイムノアッセイによる
AUSRIA ll−25″サンドインチ”ラジオイムノアッセイ(ABBOT
Tより入手可能)において、B型肝炎表面抗原に対するテンジクネズミ(gui
nea pig)の抗体(抗−HBs)でコートされたビーズを血清、血しょう
または精製タンパク質および適当な対照と共にインキュベートした。HBsAg
が存在するものはいずれも固相の抗体に結合した。非結合の物質の吸引およびビ
ーズの洗浄後、ヒトの1′■−抗−HBsをビーズ上の抗体−抗原複合体と反応
させた。次にそのビーズを洗浄して非結合の125I−抗−HBsを除去した。
)−抗−HBs HBsAg
)−抗−HBs−HBsAg ”’ I−抗−)IBs)−抗−HBs−HBs
Ag −”’ I−抗−HBsビーズ上に残っている放射能をガンマシンチレー
ションカウンターでカウントした。
b、ELISAによる
Enzygnost )IBsAgミクロ“サンドイッチ”アッセイ(Behr
ingから入手可能)において、ウェルを抗−HBs抗体でコートした。血清、
血しょうまたは精製タンパク質および適当な対照をそのウェルに添加しそしてイ
ンキュベートした。洗浄後、ペルオキシダーゼ−接合抗−HBs抗体を残存して
いる抗原決定基と反応させた。洗浄により非結合の酵素−接合抗体を除去し、そ
して固相上の酵素活性を測定した。過酸化水素および色原体の酵素触媒反応を希
硫酸の添加により停止させた。
色の強度は試料のHBsAg1度に比例し、そして未知試料の色の強度と、−緒
の負および正の対照血清との光度の比較により測定した。
HBV−プレーS−エピトープの定量
a、抗−HBsAg抗体でコートされたEL4SAプレートを用いて
Enzygnost )lBsAg−ミクロ“サンドイッチ”アッセイにおいて
、ウェルを抗−)(Bsでコートした。血清、血しようまたは精製タンパク質お
よび適当な対照を該ウェルに添加しそしてインキュベートした。洗浄後、抗−H
AV (ウサ・ギ、ヒト)または抗−HBV−プレーSを添加してそして再びイ
ンキュベートした。次の洗浄後、ペルオキシダーゼ−接合抗体(ヤギの抗−ウサ
ギ、ヤギの抗−ヒトまたはヤギの抗−マウス)を、結合した抗−HAVおよび/
または抗−HBV−プレーS抗体の検出、従って異種エピトープ()(AV)お
よび/またはT−細胞エピトー7′(HBV−プレーS)の存在の検出のための
計測器として用いた。非結合の酵素−接合抗体を洗浄により除去し、そして前述
のように酵素活性を測定した。
b、抗−プレーSs )lBsAgでコートされたELIS^プレートを用いて
この“サンドイッチ”アッセイでは、ウェルを抗−プレーS、−HBs抗体でコ
ートした。精製タンパク質または細胞上清および適当な対照を酸ウェルに添加し
、そしてインキュベートシた。非結合のタンパク質を洗浄(2回)により除去し
、そして抗−HAV抗体(ウサギ中で発達させたもの)を該ウェルに添加した。
インキュベーション後、結合した抗体を、酵素が接合した抗−ウサギ抗体で検出
した。次いで前述のよ本発明のベクターの宿主細胞ゲノム内での構成を特徴づけ
るために、本発明の粒子を産生ずる細胞系から染色体D N Aを単離し、そし
て適当な制限酵素で消化し、3tp−ラベル化DNAプローブを用いてサザンの
方法(J、Mo1.Biol、、 Vol、98゜pp、503−517.19
75)により分析した。この方法は引用により本明細書中に組み込まれる。制限
酵素BglI[での染色体DNA (20x)の消化の後で、生じた断片を0.
7%アガロースゲル電気泳動により単離した。その後、該DNAを366nmの
UV光線に10分間さらしそして0.5 M NaOHおよびIM NaC1の
溶液中で45分間インキュベートすることにより変性させた。0.5M Tri
s、 1.5M NaC1,pH7,5中での60分間のインキュベーションに
よりそのゲルを中和した。そのゲルを繊維のドライペーパータオルでニトロセル
ロースフィルターの頂部を覆うことにより該ゲルを通して3M NaCf 、
0.3 Mクエン酸ナトリウム(20X 5SC)中に20時間浸すことにより
該DNAをニトロセルロースフィルターにトランスファーせしめた。
該ニトロセルロースフィルターを80℃の真空オーブン中ニ2時間保持した。p
HBVのBglII断片(2,3kb)からニックトランスレーションにより放
射性DNAプローブを調製した。
該D N Aプローブとのハイブリダイゼーションのために、該ニトロセルロー
スフィルターを101dのプレハイブリダイゼーション混合物=50%ホルムア
ミド、5 X5SC、50mMリン酸ナトリウム(pH7,0) 、5 XDe
nhardt溶液、250JtIl/−の変性サケ***DNAを含むプラスチッ
クだフグ中に密封した。該フィルターをこの混合物中45°Cで4時間インキュ
ベートし、その後プレハイブリダイゼーション混合物をハイブリダイゼーション
混合物:50%ホルムアミド、5 X5SC。
20+++Mリン酸ナトリウム(pH7,0)、I XDenhardt溶液、
100I!g/In2の変性サケ***D N A、5 X 1105cp/ d
の32p=プローブで置き換えた。該ハイブリダイゼーション混合物中45℃に
て188時間インキュベートた後、該フィルターを0、 I X5SC、0,1
%SDS中50″Cにて5分間ずつ3回洗浄した。そのフィルターを60℃で1
0分間乾燥し、そして2つの増強スクリーンの間の2つのX線フィルム(XAR
−5,KODAK)に暴露し、そして−80°Cに維持した。1つめのX線フィ
ルムは3日間の暴露後に現像し、2つめのフィルムは7日間の暴露後に現像した
。
がニーも
ワクチン精製手順
a、ポリエチレングリコール(PEG)を用いた分別沈澱単量体を産生ずる培養
物の上滑を集め、そして2.400dの部分に分けた。各部分に144 g o
)PEG 6000(Serva)を添加し、そして室温で20分間撹拌して溶
解せしめ、さらに4℃で6時間撹拌した。500a+ffiの容器中G530−
ターで10°Cにて30分間の9.000rpa+ (15,000x g )
での遠心により、沈澱物を分離した。上滑を集め、144gのPEG 6000
を添加し、そして前述のようにして溶解させた。この溶液を4°Cで3時間撹拌
した。遠心を60分間行ったこと以外は前述と同様にして、この溶液から沈澱物
を収集した。そのペレットを20dのPBS中に再懸濁させ、そしてゲルクロマ
トグラフィーにかけた。
b、ゲルクロマトグラフィー
PEG沈澱後に得られた物質をPBS中に再懸濁し、そしてA −5m (Bi
oRad)のゲルクロマトグラフィーにかけた。カラムの大きさは25 X 1
000mmおよび480m1のベッド体積であった。典型的な分画作業では、1
0〜151d中1 、000 gのPEG沈澱単量体を負荷し、そして6滴/分
(18d/h)の速さでPBSで溶出させた。3 mflのフラクションを集め
、そしてCsCE勾配にかけた。
c、CsCff1勾配中での沈降
A−5m上でのカラムクロマトグラフィーで約30個のフラクションをカバーし
、精製前の単量体を含むピークを約100II11に集めた。この溶液をC3C
I!、で1.30g/ccの密度に調整し、次に5W27/280−ター(Be
ckman)に合うニトロセルロース試験管に移した。1.35g/ccのCs
Cl溶液4dを下層におきそして1.25g/ccの密度の溶液4n!lおよび
1.20g/ccの溶液4dを上層におくことにより勾配をセットした。その勾
配は10°Cで50時間28.00Orpmにて実施した。その後、勾配物を分
画し、そして1.20g/cc密度の層に浮いている精製単量体を集めた。バッ
ク中で水に対して3サイクル透析することにより該溶液を脱塩した。
■−エ
分析手順
a)ポリアクリルアミドゲル電気泳動(PAGE)PAGEによる分析のために
、精製単量体のアリコートを100tl/Idlに調整した。各試料から10バ
を取り出し、そして10%SO5中の5M DTT 10#および試料緩衝液1
0J11と混合した。該粒子を破壊しそして単量体分子を生じさせるために、負
荷の直前にこの混合物を10分間沸騰させた。Laemmliに従った緩衝系中
(これは引用により組みこまれる)1・2%ポリアクリルアミド−N 、 N
/−メチルビスアクリルアミドゲル(LKB−Midget−系)において、4
0mAおよび100vでタンパク質を泳動させた。
b)ウェスタンプロット分析
ゲル電気泳動後、未染色のSOS −PAGEゲルを室温で15〜20分間トラ
ンスファー緩衝液(25+++M Tris−HCj!、 pH8,15%メタ
ノール中192o+?1グリシン)の中に浸した。トランスファー膜(Mili
pore、 Immobilon PVDF)をそのゲルのサイズの断片に切っ
た。次いで酸膜を100%メタノールで予め湿らせ、そしてすぐにすすぎ用の蒸
留水中に浸し、続いて該ゲルを10〜15分間平衡化させ、プロッティングカセ
ットを組み立て、そしてトランスフナ−緩衝液を加え、タンパク質−トランスフ
ァーを25Vおよび200〜700mAで2時間行った。湿った膜を3〜4つの
同等な切片に切り、これを水中ですすぎ、次いでタンパク質“ブロッキング溶液
(TBS中5%BSA 20mFITris−HCj!、 pH7,4中0.9
%NaCi!、)中種やかに混合しながら37℃で1時間浸しておいた。その膜
を3回洗浄後、前述トを再び洗浄しそして基質と共にインキュベートして着色し
た反応生成物を発生せしめた。色の発生は室温で10〜20分か無菌塩溶液中に
懸濁された所望の濃度の抗原粒子に・、1:10.000体積のチメロゾール、
1710体積の濾過滅菌済0.24A 1. K(SO4) z ・12HzO
を添加した。無菌のlNNaOHでpnを5.0に調整し、そしてその懸濁液を
室温で3時間撹拌した。アルミで沈澱した抗原を2,000gでの10分間の遠
心により回収し、1 : 10.000のチメロゾールを含む無菌の標準の塩溶
液中に再懸濁し、そして無菌条件下でアリコートに分けた。
側ユ」−
例4(1)または4(2)に記載された異種重合体ワクチンによる免疫処置後の
動物における免疫応答a、抗−HBs応答の検出
オスのBal’b/eマウスを、所望の濃度の抗原を含む0.5mlの!A濁液
で腹腔内に免疫処置した。28日後、マウスを出血させそしてプラズマ血清を6
,000gでの30分間の遠心により分離した。該血清の抗体含量を、抗−HB
s “サンドインチ”アッセイを使って測定した。ウェルをHBsAg (サブ
タイプadwおよびayw)でコートした。血清プラズマおよび適当な対照を酸
ウェルに添加しそしてインキュベートした。
洗浄後、マウス抗体の第二の決定基に結合するペルオキシダーゼ接合HBsAg
を添加した。結合しなかった酵素接合抗原を洗浄により除き、そして固相上の酵
素活性を測定した。過酸化水素および色原体(chromogen)の酵素触媒
反応を希硫酸の添加により停止させた。色の強度は試料の抗−HBs抗体濃度に
比例し、そしてこれを−緒の負および正の対照血清の色の強度と未知の試料の色
の強度との光度比較により測定した。
b、抗−)(AV−エピトープ応答の検出ペプチドの“サンドイッチ”アッセイ
において、所望の異種エピトープ(HA V )を表わすペプチドでウェルをコ
ートし、次いでウシ血清アルブミンを含む緩衝液で飽和させた。
動物の血清プラズマおよび適当な対照をインキュベートし、酵素が結合した抗−
マウスrgG抗体との第二のインキュベーションにより、結合を検出した。非結
合の抗体を洗浄により除き、そして前述のようにして酵素活性を測定した。
C0抗−HBV−ブl/ S + T−細胞エピトープ応答の検出
ペプチドの“サンドインチ“アッセイにおいて、所望のT−細胞エビトニブ(プ
レーS、)を表わすペプチドでウェルをコートし、次いでウシ血清アルブミンを
含む緩衝液で飽和させた。動物の血清プラズマおよび適当な対照をインキュベー
トし、そして酵素が接合した抗−マウスIgG抗体との第二のインキュベーショ
ンにより、結合を検出した。非結合の該抗体を洗浄により除き、そし7て前述の
ようにL7て酵素活性を測定した。
第■表は免疫処置されたマウスの免疫応答を要約している。
策l査
動物における免疫応答−測定された抗体価免疫マウス 抗−HBsAg 抗−H
BV−プレーS1 抗−)IAνのNα (単位/d) (単位/d) (単位
/d)20 1.512 1.022 875劃」」4
例4(4)に記載の異種重合体ワクチンでの免疫処置後の動物における免疫応答
a、抗−HBs応答、抗−HAV−エピトープ応答および抗−HBV−プレーS
、T−細胞エピトープ応答の検出は前述のようにして行われた。
b、抗−マラリアニー細胞−エビトープ応答の検出ペプチドの“サンドインチ”
7゛ツセイにおいて、ウェルを、所望のT−細胞エピトープ(マラリア)を表わ
すペプチドでコートし、そしてウシ血清アルブミンを含む緩衝液で飽和させた。
動物の血清プラズマおよび適当な対照をインキュベートし、そして酵素が接合さ
れた抗−マウス−IgG抗体との第二のインキュベーションにより、結合を検出
した。非結合の該抗体を洗浄により除き、そして酵素活性を前述のようにして測
定した。
第■表は、免疫処置されたマウスの免疫応答を要約している。
l曳
動物における免疫応答−測定された抗体価20 2.317 1.536 1.
274 1.046■上主
宿主細胞への所望のプラスミドの遺伝子移入(トランスフェクション)による抗
体産生受容細胞の生産(異種HAVエピトープのみ)
前記の構成された異種重合体ワクチンを得るために、受容細胞をプラスミドpH
BA2s1およびpHBP2でトランスフェクト(同時トランスフェクション)
した。新しく発生した細胞クローンをイムノアッセイにより分析し、所望の単量
体を分泌している細胞を検出した。
次のプラスミドの組合わせを受容細胞のトランスフェクションに用いると、同じ
単量体の収得物が得られるであろうニーpHBP2s1 +pHBA2
−p)IBP2A +p)lBA2
−pHBP2 +pl(BA2S1
−pHBP2 +p)IBA2S2
− pMBP2 + p)lBA2s1プラスミドpHBA3. pHBA4.
pHBA5. pHBA6またはpHBA7が上記のpHBA2の代わりに置
き換えられ得る。
第■表は、前記のワクチンで免疫処置されたマウスの免疫応答を要約したもので
ある。
第に表
CsCi、勾配後の所望のエピトープの測定抗体を用いたELISAによる測定
10−13 1.549 0.782 0.000±上土
例13に記載の異種重合体ワクチンでの免疫処置後の動物における免疫応答
a、抗−HBs応答の検出
オスのBa1b/cマウスを、所望の濃度の抗原を含む0.5−の懸濁液で腹腔
内に免疫処置した。28日後、そのマウスを出血させ、そしてプラズマ血清を6
+ 000rpo+での30分間の遠心により分離した。血清の抗体含量を抗−
HBs“サンドイッチ”アッセイを使って測定した。ウェルをHBsAg (サ
ブタイプadwおよびayw)でコートした。血清プラズマおよび適当な対照を
該ウェルに添加し、そしてインキュベートした。洗浄後、マウス抗体の第二の決
定基と結合するペルオキシダーゼ接合HBsAgを加えた。非結合の酵素接合抗
原を洗浄により除去し、そして固相上の酵素活性を測定した。過酸化水素および
色原体の酵素触媒反応を希硫酸の添加により止め一緒の負および正の対照血清の
色の強度と未知試料の色の強度との光度比較により測定した。
b、抗−HAV−エピトープ応答の検出ペプチドの“サンドインチ”アッセイに
おいて、所望の異種エピトープ(HAV)を表わすペプチドでコートし、次いで
ウシ血清アルブミンを含む緩衝液で飽和させた。動物の血清プラズマおよび適当
な対照をインキュベートし、酵素を接合した抗−マウスIgG抗体との第二のイ
ンキュベーションにより結合を検出した。非結合の抗体を洗浄により除き、そし
て前述のようにして酵素活性を測定した。
第7表は、免疫処置されたマウスの免疫応答を要約したものである。
第V人
動物における免疫応答−抗体価の測定
至ロー1
異種エピトープがHIV起源でありそして/またはT−細胞エピトープがHBV
−プレーSI起源であるペプチドの発現に使われるベクターの説明
プラスミドpH’BII
H2K7”Oモーター、pBR322残基およびHBV−3−遺伝子を含むプラ
スミドpHB1をBglIIおよびXbalで消化した。
2つの分子が予想され、ゲル電気泳動後、1方の550bpの断片(プレーSお
よびSの5′端部分をコードしている)を除去し、そして目的の6.350kb
の断片(pBR,プロモーターおよびS遺伝子の部分を含む)を単離し、そして
連結のためドしている合成オリゴヌクレオチドD N A配列(NS 1885
−2022> (第1表のオリゴNα131)および該HIV断片の上流の開始
シグナルと正しいリーディングフレームにおいて連結させた。
プラスミドpHBI2. pHBI3. pHBI4. p)lBI5. p)
lBI6. pHBI7゜pHBIB、 pHBI9. pHB110前述した
のと同じやり方でプラスミドpHBI2−pHB110を調製した。それらは、
前記DNA配列が異なるHIVエピトープをコードしている(それぞれ第1表の
オリゴヌクレオチドNα133.135.137.139.141.143.1
45.147および149)という点だけ異なる。
プラスミドpHBIISI
プラスミドpHB11をEcoRlで線状化し、そしてネオマイシン耐性遺伝子
の上流にMT−プロモーターを含有するプラスミドpMT−neoK (前記)
から単離されたEcoRI断片と連結させた。
フラスミt’ pHBI351 pHB110s1プラスミド゛pHB1151
について記載されたものと同じ方法により、プラスミドpHBI2s1. pH
BI351. pHBI351. pHBI351゜p)lBI6s1. pH
BI351. pHBI351. pHBI351およびpHB110s1を調
製した。
プラスミドpHB1152
プラスミドpHB11をEcoRIで線状化し、そしてegpt選択遺伝子の上
流にMTプロモーターを含有するプラスミドpMTegpt(前記)から単離さ
れた第二〇EcoRI断片と連結せしめた。
プラスミドpHBIIA
プラスミドpHB11をEcoRIで線状にし、そして選択/増幅遺伝子を含む
プラスミドpdhfr3.2から単離されたEcoRI断片と連結せしめた。
プラスミドpHT2BII
BglIIおよびXbaIでの消化および5sobpの断片の除去後に誘導され
たプラスミドpH81(前記)を、対応する粘着末端を有するHBV−プレ31
−T細胞エピトープおよび旧Vgp160の1つのエピトープをコードしている
2oobpの合成オリゴヌクレオチド−D N A配列(第1表のオリゴヌクレ
オチド患201)並びにT細胞エピトープの上流の開始シグナルと、正しいリー
ディングフレームにおいて連結せしめた。2つの合成オリゴヌクレオチド(Nα
175およびNα131)を最初に連結してこの200bPのオリゴヌクレオチ
ドを得た。
劃」」−
宿主細胞への所望のプラスミドの遺伝子移入(トランスフェクション)による抗
原産生受容細胞の生産(異種HIVエピトープおよびT−細胞エビトープ)
(1)まず受容細胞をプラスミドpHBP2S2(粒子形成ポリペプチドの遺伝
子配列を含む)でトランスフェクトした。高レベルの単量体を発現する細胞クロ
ーンを見つけた。その同定されたクローンに向けてプラスミドpHB1151お
よびpUTIBを用いて第二のトランスフェクション(同時トランスフェクショ
ン)を行った。イムノアッセイにより新しい細胞クローンを分析し、前記の異種
重合体粒子を分泌している細胞を検出した。
(2)プラスミドpHBP2s1と共にプラスミドpH72B11の混合物で受
容細胞をトランスフェクト(同時トランスフェクション)した、トランスフェク
ション後、増殖した細胞クローンをイムノアッセイにより分析し、前記の異種重
合体粒子を分泌している細胞クローンを検出した。
(3)次のプラスミドの組合せを受容細胞のトランスフェクションに使った時に
同じ異種重合体抗原が得られるだろうニーpHBP2s1 +pHTlB11
−pHBP2s1 +pHT3B11
−pHBP2A +pH73B11
=pHBP2s2 +(pHB11s1+pU73B)−pHBP2S2 +
(pHB11s1+pU73B)プラスミドpHBI2 pHB110を、pH
B11について君己載されたのと同様にして使うことができる。
全てのその後の手順は前述したように行った。
11表
Cs’C1勾配後の所望のエピトープの測定抗体を用いたELISAによる測定
10−12 1.721 0.581 0.871開1ユ
例16に記載の異種重合体ワクチンでの免疫処置後の動物における免疫応答
a、抗−HBs応答の検出
オスのBa1b/cマウスを、所望の濃度の抗原を含む0.5m!の懸濁液で腹
腔内に免疫処置した。28日後、そのマウスを出血させ、そしてプラズマ血清を
6.00Orpmでの30分間の遠心により分離した。血清の抗体含量を抗−H
Bs “サンドインチ”アッセイを使って測定した。ウェルをHBsAg (・
サブタイプadwおよびayw)でコートした。血清プラズマおよび適当な対照
を該ウェルに添加し、そしてインキュベートした。洗浄後、マウス抗体の第二の
決定基と結合するペルオキシダーゼ接合)IBsAgを加えた。非結合の酵素接
合抗原を洗浄により除去し、そして固相上の酵素活性を測定した。過酸化水素お
よび色原体の酵素触媛反応を希硫酸の添加により止めた。色の強度は試料の抗−
HBs抗体濃度に比例し、これを−緒の負および正の対照血清の色の強度と未知
試料の色の強度との光度比較により測定した。
b、抗−HA V−エピトープ応答の検出ペプチドの“サンドインチ”アッセイ
において、所望の異種エピトープ(HAV)を表わすペプチドでコートし、次い
でウシ血清アルブミンを含む緩衝液で飽和させた。動物の血清プラズマおよび適
当な対照をインキュベートし、酵素を接合した抗−マウス■gG抗体との第二の
インキュベーションにより結合を検出した。非結合の抗体を洗浄により除き、そ
して前述のようにして酵素活性を測定した。
C0抗−HBV−プレーSI T−細胞エピトープ応答の検出
ペプチドの“サンドインチ”アッセイにおいて、所望のT−細胞エピトープ(プ
レーS、)を表わすペプチドでウェルをコートし、次いでウシ血清アルブミンを
含む緩衝液で飽和させた。動物の血清プラズマおよび適当な対照をインキュベー
トし、そして酵素が接合した抗−マウスIgG抗体との第二のインキュベーショ
ンにより、結合を検出した。非結合の該抗体を洗浄により除き、そして前述のよ
うにして酵素活性を測定した。
第it
動物における免疫応答−測定された抗体価〔例16(1))
20 1.220 1.172 0.775玉■鷹、
動物における免疫応答−測定された抗体価[例16(2)]
21 1.410 1.321 0.925貫上主
異種エピトープが他の起源であるペプチドの発現に使われるベクター
プラスミドpHBH3
H2−プロモーター、pBR322残基およびHBsAg遺伝子を含むプラスミ
ドpH81をBgllIおよびXbaIで消化した。2つの分子が生じ、ゲル電
気泳動後、1方の5sobpの断片を除きそして目的の断片(H2−プロモータ
ー、p、BR部分およびS−遺伝子の部分を含む)を単離し、連結のための対応
する粘着末端を有する、マラリアのT−細胞エピトープおよびそれの上流の開始
シグナルをコードしている合成オリゴヌクレオチド(第1表のオリゴヌクレオチ
ドNo、155 )と、正しいリーディングフレームにおいて連結せしめた。
プラスミドpHBH1およびpHRH2pHBH3について記載されたのと同じ
やり方で、この2つのプラスミドを調製した。プラスミドpHBH1は、マラリ
アB−細胞エピトープをコードしているオリゴヌクレオチド(第1表のオリゴヌ
クレオチドNαl55)を担持しており、そしてプラスミドpHB)12は口蹄
疫のエピトープをコードしているオリゴヌクレオチド(第1表のオリゴヌクレオ
チドNα161)を担持している。
プラスミドpHBH1s1. pHBH351,pHBH351これらのプラス
ミドは、前述したようにpHBHl、 pHBH2およびpHBH3にネ1マイ
シン耐性遺伝子を付加することにより補宿主細胞中への所望のプラスミドの遺伝
子移入(トランスフェクション)による抗原産生受容細胞の生産受容細胞をまず
プラスミドpUTIBおよびpHBP2S2でトランスフェクト (同時トラン
スフェクション)した。所望の単量体の安定した発現を有する細胞クローンを見
つけた。その同定されたクローンに対してプラスミドpUT2BおよびpHBH
351を用いて第二のトランスフェクション(同時トランスフェクション)を行
った。
その後の全ての手順は前述したものと同様に行われた。
里■表
CsC1,勾配後の所望のエピトープの測定抗体を用いたELISAによる測定
10−13 1.687 0.785 0.643 0.925翌しし史
例20に記載の異種重合体ワクチンでの免疫処置後の動物における免疫応答
a)上記に記載したのと同様にして抗−HBs応答および抗−)IBV−プレー
31応答の検出を行った。
b)抗−マラリア(ハイブリッドポリペプチド−B細胞エピトープ)応答の検出
ペプチドサンドイッチアッセイのウェルを、所望のB−細胞エピトープ(マラリ
ア)を表わすペプチドでコートし、次いでウシ血清アルブミンを含む緩衝液で飽
和させた。該動物の血清プラズマおよび適当な対照をインキュベートし、酵素が
接合した抗−マウス−1gG抗体との第二のインキュベーションにより、結合を
検出した。非結合の抗体を洗浄により除き、そして前述のように酵素活性を測定
した。
C)マラリアB−細胞エビトープについて前述したのと同様に抗−マラリア−ニ
ー細胞エピトープ応答の検出を行った。
ただし、アッセイのウェルをコートするのに、所望のT−細胞エピトープ(マラ
リア)を表わす特異的なペプチドを用いた。
玉X表
動物における免疫応答−測定された抗体価20 3.005 1.′r50 0
.877 2.107貫じLL
一般的方法
本発明を実施するのに有用な一般的方法は、(1) Methodsof En
z molo + 152巻、“分子クローニング技法へのガイド”、Berg
erおよびに’iame1m(Acadeg+ic Press 1987)お
よび(2)Maniatisら、“分子クローニング:研究マニュアル”、(C
oldSpring Harbor Laboratory 1982)の中に
見い出され、この両方とも引用により本明細書に組みこまれる。使用する特定の
技術を以下に記載する。
1)エンドヌクレアーゼによる消化および断片の単離使用する制限エンドヌクレ
アーゼ: Bgl IF 、 Ba+aHI 、 Hindm 、 EcoRI
、 XbaI 、 MstII 、 XhoI 、PflMIは、それら独自
の制限緩衝液(IOX)と共にGibco/BRLから商業的に入手可能であっ
た。
他に指摘しない限り、次のように制限消化を行いそして断片を単離した。
一最終体積8illまでエッペンドルフ試験管に蒸留水を加える;
一適当な10×消化緩衝液IJ!1を添加する;−制限酵素1#(5−10Uを
含む)を添加しそして注意深く混合するニ
ー該反応試験管を37°Cで1時間インキュベートする;−最終濃度10mMま
で0.5 M EDTA(pH8,0)を加えることにより消化を停止させ゛る
;
D N Aを直接ゲル上で分析する場合には、IJ!lのゲル−ローディング色
素m (Maniatis)を添加し、混合し、そして0.8%アガロースゲル
の溝の中に該試料を負荷する。
アガロースゲルは普通0.8%アガロース、1×泳動緩衝液(TBE、 Man
iatis)を含む。断片(約100−1000bp)をアガロースゲルから単
離する場合、該アガロースを1.2〜1.4%に増加させた。
2)コンピテントバクテリア細胞
濃厚な一晩の培養物から、1 mlのバクテリア細胞の懸濁液を100dの新し
い増殖培地(L−プロス)に添加した。その細胞を37°CでOD6゜。=0.
7の密度まで増殖させた。この密度は500Inlのアーレンマイヤーフラスコ
中で激しく振とうさせながら2時間以内に到達された。該培養物を氷上で10分
間冷やすことにより増殖を止めた。この培養物から、3dを指数のバクテリア細
胞を3. OOOrpmで5分間収得するために取り出した。この細胞を10m
M Tris、 pH8,0、中の50mM CaCjl!。
1、5 d中に再懸濁し、氷上でさらに15分間インキュベートした。3.00
0rpn+での5分間の遠心により該細胞を再度・収得し、そして10mM T
ris+ p)18.0中の50mM CaC1z 200jtl中に再懸濁し
、そして直接使用した。
3)コンピテントバクテリア細胞の形質転換形質転換せしめるためのDNAをI
ODIM Tris+ pH7−5+ 1mMEDTA 704中に懸濁し、そ
してこれをD N A取込み用の200Iのバクテリア細胞懸濁液に゛添加した
。その混合物を氷上で30分間インキュベートし、次いでIIdのL−ブロスを
加えた。その混合物を42℃で2分間および37°Cで40分間インキュベート
した。
インキュベーション後、50gアンピシリン/d寒天を含む寒天プレート上に、
プレートあたり50−300dの細胞F!濁液の量で細胞をまいた。該寒天プレ
ートを37°Cで一晩インキユベートした。このインキュベーション期間の後、
1つに単離されたバクテリアコロニーが形成された。
4)プラスミドD N Aの単離
1j2のプラスミド保有細胞をL−プロス中0.5のOD、。。
値まで増殖させ、200trg/mlのクロラムフェニコールで20時時間幅さ
せた。次いでこの培養物をJA−10ロ一ター中4℃にて20分間4.OOOr
pmで遠心した。ベレットを18dの冷25%ショWfR150mM Tris
(pH8,0)中に再懸濁し、250 dのア。
−レンマイヤーフラスコに移し、そして氷上に維持した。6mkの250mM
Tris、 pH8,0、中の5■/dリゾチームを添加し、そしてその混合物
を10−15分間放置しておいた。6dの250mMEDTA、 pH8,0、
を加え、穏やかに混合し、そして氷上で15分間インキュベートした。30dの
洗剤(0,01%Tr−iton X−100: 60mM EDTA、 pH
8,o ; 50mM Tris、 pH8,0)を添加し、そしてその混合物
を氷上で30分間インキュベートした。インキュベーション後、該混合物を5W
280一ター中4℃にて90分間25.00Orpmで遠心した。
上清液にプロナーゼを250x/dまで加え、そして37℃で30分間インキュ
ベートした。この溶液を、10mM Tris。
pH8,0,1+nM EDTAで平衡化された1/2体積のフェノールで1回
フェノール抽出した。水相を取り出した。次に酢酸ナトリウムを3001の最終
濃度まで加え、続いて3体積の冷1o。
%エタノールを撹拌しながら加えた。その混合物を一20°Cに一晩保存した。
該混合物を解凍しそして遠心した。ペレットを6dの10mMTris、 10
mM EDTA、 pH8,0中に再懸濁した。9.4gのC5Cj2および0
.65dの6■/−臭化エチジウムを加え、そして無菌の再蒸留水で体積を10
dに合わせた。その10m!アリコートをベックマンのヒートシール性勾配管に
入れ、そしてTi70.1ベックマンローター中50. OOOrpmで48時
間遠心した。
プラスミドのバンドをUVで目に見えるようにし、そしてシリンジおよび18ゲ
ージの針を用いて該試験管の側面に穴をあけることにより取り出した。等量のイ
ソブタノールでの十分な抽出によりプラスミド画分から臭化エチジウムを除去し
た。次に咳画分を(1)ワンロフトの22の10mM Tris。
pH7,4,1mM EDTA、 pH7,5,5mM NaC1に対して4°
Cにて2時間以上透析し;そして(2)上記のように平衡化された1/3体積の
フェノールで1回フェノール抽出した。次いで酢酸ナトリウムを最終濃度30抛
りまで添加し、続いて2体積の100%エタノールを添加した。沈澱は一20°
Cで一晩、または−70°Cで30分間で形成した。
5)ミニ−プラスミド調製
バクテリアの一晩培養物1 mlをエッペンドルフ管に入れ、そして20分間遠
心した。上)青を除去した。50mMグルコース、25mM Tris(p)1
8.0)、 10mM EDTA(p)18.0) 100.Jをペレットに添
加し、渦動により混合し、そして室温で5分間インキュベートした。0.2 N
+v a OH+ 1%SDS 200mを添加し、渦動により混合し、そし
て氷上で5分間インキュベートした。 150iの3M酢酸ナトリウム(pH4
,8)を添加し、渦動により混合し、そして氷上で5分間インキュベートした。
13. OOOrpmでの5分間の遠心の後、上清を新しいエッペンドルフ管に
デカンテーションした。3容の100%エタノールを補充し、よく混合し、そし
て−80°Cで30分間インキュベートし、次いで13. OOOrpmで10
分間遠心した。エタノールを除去し、そのペレットを70%エタノールで洗浄し
、凍結乾燥し、そして20Jllの蒸留水に溶かした。このプラスミドDNA溶
液5Iを制限酵素分析に直接使用した。
6)ニックトランスレーション
ニックトランスレーションは、Rigbyら、J、MOl、B101.1月、3
. pp、237−251.1977に従って行なった。これは引用により本明
細書中に組み込まれる。D N Aの32p−ラベル化用の反応混合物は、50
m?I Tris、 pH7,8+ 5m1l MgCfz 、10mMメルカ
プトエタノール、0.1 mM dATP、 0.1mM dGTP、 0.1
mM □dTTP。
50μCi ”P−dCTP、 10単位のD N AポリメラーゼI、1■/
mlのDNase Iの2X10−’倍希釈液3Iを存する全体積30I中に
0.5 wのHBV断片を含有し、そしてこれを15°Cで90分間インキュベ
ートすると、3 Xl0−’ 〜12X10−”全cpm、即ちI XIO’
〜5 X10’cpi/I!gDNAを与える。
7)サザンプロット分析
本発明のベクターの宿主細胞ゲノム内での構成を特徴づけるために、本発明の粒
子を生産する細胞系から染色体D N Aを単離し、そして適当な制限酵素で消
化し、そしてサザンの方法(J、Mo1.Biol、、 98巻、第503−5
17頁、1975) (これは引用により本明細書中に組み込まれる)により、
″2P−ラベル化D N Aブロー・ブを使って分析した。制限酵素BglII
による染色体D N A (20pg)の消化の後、生じた断片を0.7%アガ
ロースゲル電気泳動により分離した。その後、360nmのUV光への10分間
の暴露並びに0.5 M NaOHおよびIM NaC/!の溶液中での45分
間のインキュベーションによりD N Aを変性させた。0.5M Tris+
1.5M NaCj!、 p)17.5中での60分間のインキュベーション
により該ゲルを中和した。繊維のドライペーパータオルでニトロセルロースフィ
ルターの上を覆って該ゲルを通して3M NaCjl! 、0.3 Mクエン酸
ナトリウム(20×SSC>中に浸すことにより、DNAをニトロセルロースフ
ィルターに移した。該ニトロセルロースフィルターを80°Cの真空オーブン中
に2時間維持した。p)IBVのBglII断片からの放射性DNAプローブ(
2,8kb)をニックトランスレーションにより調製した。
8亥D N Aブローフ゛とのハイブリダイゼーションのために、3gニトロセ
ルロースフィルタ−
イゼーション混合物:50%ホルムアミド、5XSSC,501リン酸ナトリウ
ム(pH7。O ) 、5 XDenhardt溶液、250n/ mlの変性
されたサケ***DNAを含むプラスチックバッグ中に封入した。この混合物中で
該フィルターを45°Cにて4時間インキュベートし、その後プレハイブリダイ
ゼーション混合物をハイブリダイゼーション混合物=50%ホルムアミド、5
XSSC 、2 0dリン酸ナトリウム(pH7.0)、1×Denhardt
溶液、100g/mの変性されたサケ***DNA,5X10’cpm/InIl
の32p−プローブ゛により置き換えた。言亥ハイフ゛リダイゼーション混合物
中45°Cにて18時間インキュベートシタ後、=亥フィルターを50″C(7
)0. I XSSC 、0. 1%SDS中で3回、各5分間づつ洗浄した。
該フィルターを60″Cで10分間乾燥し、ぞして2つの映像強化スクリーンの
間の2つのX線フィルムに暴露し、− 8 0 ’Cに維持した.第一のX線フ
ィルムは3日間の露出後に現像し第二のX線フィルムは7日間の露出後に現像す
る。
8)トランスフェクション用の哺乳類細胞およびD N A沈澱物の調製
受容細胞(CI2? 、L−またはC)10−細胞(ATCCがら入手可能)〕
を、11日にペトリ皿(皿あたり1−2X10’細胞数、φ10cm)中の標準
的な増殖培地(DMEM+5%ウシ胎児血清、グルコースおよびグルタミン)中
に接種した。翌日培地を除去しく該細胞にDNA沈澱物を添加する4時間前)、
そして細胞をIXPBSで2回洗浄した。次いでFCSを含まない8 mlのD
MEM (Hepesで補充−最終濃度10mM)を添加した。4時間後、D
N A沈澱物(下記のようにして調製されたもの)を該細胞に添加した。再び4
時間後、培地を除去し、3dのグリセロール−混合物(50−の2xHBS緩衝
液、30dのグリセロール、120Idの蒸留水)を添加した。37°Cにて3
分間のインキュベーション後すぐにグリセロールー混合物を除去し、そして細胞
をIXPBsで洗った。10%FSCを含む8dのDMEM中で細胞を一晩培養
した。
翌日、トリプシン−EDT八溶液溶液、025%トリプシン+IIl1MEDT
A )で処理することにより細胞を皿から回収した。その後、浄し、10%FC
Sを含むDMEM中に懸濁し、そして24コスター−ウェルのプレートに分配し
た(一枚の皿から細胞を一枚の24−ウェルのプレートへ)。細胞が十分に増殖
した時、選択培地を添加した〔例えば、0.5−1■/dの濃度のネオマイシン
、またはCl27、L−もしくはCOO−細胞(ATCCから入手可能)(eg
pt、)を含んで成る培地〕。培地は毎週交換した。最初の増殖している細胞コ
ロニーが2週間後に見られた。
10ttgのプラスミドDNAおよび20I!gのキャリヤーDNA(サケ***
DNA、仔牛胸腺DNA)にTE−緩衝液(10mM Tris−HCjl!、
1mM EDTA、 pH7,05)を最終体積440J1!まで添加し、そ
して60Ii1の2MCaCfzと一緒に混合した。次いで同量の2 XHBS
(Hepes 50mM、 NaCf 280mM、 NazHPO41,5
mM、 pH7,05)を添加し、そしてよ(混合した。この沈・澱溶液を37
℃にて30分間インキュベートし、そしてトランスフェクトすべき細胞に直接添
加した。
上記から、発明の精神および範囲から逸脱することなく、前記の組成物および方
法において種々の変更を行うことができることは当業者にとって明らかであろう
。従って、本発明は、その精神および本質的な゛特徴から逸脱することな(他の
特定の形式において具体的に記載され得る。それ故、本実施態様は全ての点で限
定としてでなく例示としてみなされるべきであり、本発明の範囲は上の記載より
もむしろ請求の範囲により指示され、そして請求の範囲の意味および同等の範囲
内で行うあらゆる変更を、その中に包含するつもりである。
国際調査報告
香り11−一門−me−^帥−電1・1・PCT/EP88100550tm、
aa。M41 A#maliMお、 PCτ/EP 811100550国際調
査報告
Claims (47)
- 1.複数の第一のペプチド単量体および複数の第二のペプチド単量体を含んで成 る免疫原性粒子であって、前記第一のペプチド単量体の各々は、分泌の際に直径 少なくとも10nmの粒子を形成するであろうペプチドの実質的部分に相当する アミノ酸配列、および異種エピトープに相当するアミノ酸配列を含んで成り; 前記第二のペプチド単量体の各々は、分泌の際に直径少なくとも10nmの粒子 を形成するであろうペプチドの実質的部分に相当するアミノ酸配列を含んで成り 、そして前記第二のペプチド単量体の各々は、異種エピトープに相当するアミノ 酸配列を含んでおらず; ここで前記第一のペプチド単量体と前記第二のペプチド単量体は同一ではなく互 いに結合することができるような、前記免疫原性粒子。
- 2.複数の第一のペプチド単量体、複数の第二のペプチド単量体および複数の第 三のペプチド単量体を含んで成る免疫原性粒子であって、 前記第一のペプチド単量体の各々は、分泌の際に直径少なくとも10nmの粒子 を形成するであろうペプチドの実質的部分に相当するアミノ酸配列、および異種 エピトーブに相当するアミノ酸配列を含んで成り; 前記第二のペプチド単量体の各々は、分泌の際に直径少なくとも10nmの粒子 を形成するであろうペプチドの実質的部分に相当するアミノ酸配列を含んで成り 、且つ前記第二のペプチド単量体の各々は、異種エピトーブに相当するアミノ酸 配列を含んでおらず;そして 前記第三のペプチド単量体の各々は、分泌の際に直径少なくとも10nmの粒子 を形成するであろうペプチドの実質的部分に相当するアミノ酸配列、およびT− 細胞エピトープに相当するアミノ酸配列を含んで成り; ここで前記第一のペプチド単量体、前記第二のペプチド単量体および前記第三の ペプチド単量体は互いに結合することができる、前記免疫原性粒子。
- 3.複数の第一のペプチド単量体および複数の第二のペプチド単量体を含んで成 る免疫原性の粒子であって、前記第一のペプチド単量体の各々は、分泌の際に直 径少なくとも10nmの粒子を形成するであろうペプチドの実質的部分に相当す るアミノ酸配列、異種エピトープに相当するアミノ酸配列、およびT−細胞エピ トープに相当するアミノ酸配列を含んで成り; 前記第二のペプチド単量体の各々は、分泌の際に直径少なくとも10nmの粒子 を形成するであろうペプチドの実質的部分に相当するアミノ酸配列を含んで成り 、そして前記第二のペプチド単量体の各々は、異種エピトープに相当するアミノ 酸配列を含んでおらず; ここで前記第一のペプチド単量体および前記第二のペプチド単量体は互いに結合 することができる、前記免疫原性粒子。
- 4.前記分泌の際に直径少なくとも10nmの粒子を形成するであろうペプチド が、HBVSペプチド、HBVコア抗原、ポリオ表面抗原、A型肝炎表面抗原、 .A型肝炎コア抗原、HIV表面抗原およびHIVコア抗原から成る群から選択 される、請求項1,2または3に記載の免疫原性粒子。
- 5.複数の第一のペプチド単量体および複数の第二のペプチド単量体を含んで成 る免疫原性の粒子であって、前記第一のペプチド単量体の各々は、HBVSペプ チドの実質的部分に相当するアミノ酸配列、および異種エピトーブに相当するア ミノ酸配列を含んで成り; 前記第二のペプチド単量体の各々は、HBVSペプチドの実質的部分に相当する アミノ酸配列を含んで成り、且つ前記第二のペプチド単量体の各々は異種エピト ープに相当するアミノ酸列を含んでおらず; ここで前記第一のペプチド単量体と前記第二のペプチド単量体は同ーではなく互 いに結合することができる、前記免疫原性粒子。
- 6.複数の第一のペプチド単量体、複数の第二のペプチド単量体および複数の第 三のペプチド単量体を含んで成る免疫原性粒子であって、 前記第一のペプチド単量体の各々は、HBVSペプチドの実質的部分に相当する アミノ酸配列、および異種エピトープに相当するアミノ酸配列を含んで成り; 前記第二のペプチド単量体の各々は、HBVSペプチドの実質的部分に相当する アミノ酸配列を含んで成り、且つ前記第二のペプチド単量体の各々は異種エピト ープに相当するアミノ酸配列を含んでおらず;そし,て 前記第三のペプチド単量体の各々は、HBVSペプチドの実質的部分に相当する アミノ酸配列、およびT−細胞エピトーブに相当するアミノ酸配列を含んで成り ;ここで前記第一のペプチド単量体、前記第二のペプチド単量体および前記第三 のペプチド単量体は互いに結合することができる、前記免疫原性粒子。
- 7.複数の第一のペプチド単量体および複数の第二のぺプチド単量体を含んで成 る免疫原性粒子であって、前記第一のペプチド単量体の各々は、HBVSペプチ ドの実質的部分に相当するアミノ酸配列、異種エピトーブに相当するアミノ酸配 列、およびT−細胞エピトープに相当するアミノ酸配列を含んで成り; 前記第二のペプチド単量体の各々は、HBVSペプチドの実質的部分に相当する アミノ酸配列を含んで成り;ここで前記第一のペプチド単量体と前記第二のペプ チド単量体は互いに結合することができる、前記免疫原性粒子。
- 8.前記第一のペプチド単量体の各々が、HBVSペプチドのエピトープに相当 するアミノ酸配列を含んで成る、請求項5,6または7に記載の免疫原性粒子。
- 9.前記第二のペプチド単量体が、HBVSペプチドの全部に相当するアミノ酸 配列を含んで成る、請求項5,6または7に記載の免疫原性粒子。
- 10.前記異種エピトープがウイルス性エピトープである、請求項5,6または 7に記載の免疫原性粒子。
- 11.前記ウイルス性エピトープが、A型肝炎エピトープ、非−A型肝炎エピト ープ、非−B型肝炎エピトープ、HIVエピトープ、ポリオエピトープおよび口 蹄疫ウイルスエピトープから成る群から選択される、請求項10に記載の免疫原 性粒子。
- 12.前記異種エピトープが、寄生体のエピトープである、請求項5,6または 7に記載の免疫原性粒子。
- 13.前記寄生体のエピトープが、マラリア寄生体のエビトープである、請求項 12に記載の免疫原性粒子。
- 14.前記異種エピトープが、第1表中に記載のヌクレオチド配列のいずれか1 つによりコードされるアミノ酸配列を有する、請求項5,6または7に記載の免 疫原性粒子。
- 15.前記T−細胞エピトープが、第1表中に記載のヌクレオチド配列のいずれ か1つによりコードされるアミノ酸配列を有する、請求項5,6または7に記載 の免疫原性粒子。
- 16.単量体コード領域を含んで成る組換えDNA分子であって、前記単量体コ ード領域は第一のDNA配列および第二のDNA配列を含んで成り、 前記第一のDNA配列は、HBVSペプチドの全部ではなく実質的部分に相当す るアミノ酸配列の発現をコードしており;前記第二のDNA配列は、異種エピト ープに相当するアミノ酸配列の発現をコードしており; 前記第一のDNA配列および第二のDNA配列は、(1)同じリーディングフレ ーム内にあり、(2)単一のペプチドのそれぞれ別々の領域をコーκしており、 そして(3)前記組換えDNA分子において前記単量体コード領域の外側に置か れた発現調節配列に作用可能に連結されている、前記組換えDNA分子。
- 17.前記単量体コード領域が、本質的に前記第一のDNA配列および前記第二 のDNA配列から成る、請求項16に記載の組換えDNA分子。
- 18.第一のDNA配列および第二のDNA配列を含んで成る組換えDNA分子 であって、 前記第一のDNA配列は、HBVSペプチドの実質的部分に相当するアミノ酸配 列の発現をコードしており;前記第二のDNA配列は、T−細胞エピトープに相 当するアミノ酸配列をコードしており; 前記第一のDNA配列および第二のDNA配列は、(1)同じリーディングフレ ーム内にあり、(2)単一ペプチドのそれぞれ別々の領域をコードしており、そ して(3)前記組換えDNA分子に発現調節配列に作用可能に連結されている、 前記組換えDNA分子。
- 19.第一のDNA配列、第二のDNA配列および第三のDNA配列を含んで成 る組換えDNA分子であって、前記第一のDNA配列は、HBVSペプチドの実 質的部分に相当するアミノ酸配列の発現をコードしており;前記第二のDNA配 列は、異種エビトープに相当するアミノ酸配列の発現をコードしており; 前記第三のDNA配列は、T−細胞エピトープに相当するアミノ酸配列をコード しており; 前記第一のDNA配列および第二のDNA配列は、(1)同じリーディングフレ ーム内にあり、(2)単一ペプチドのそれぞれ別々の領域をコードしており、そ して(3)前記組換えDNA分子において発現調節配列に作用可能に連結されて いる、前記組換えDNA分子。
- 20.請求項16,17.18または19に記載の組換えDNA分子を用いてト ランスフェクトされた宿主細胞。
- 21.第一の組換えDNA分子および第二の組換えDNA分子を用いて同時トラ ンスフエクトされた宿主細胞であって、前記第一の組換えDNA分子は請求項1 6,17,18または19に記載の組換えDNA分子であり、そして前記第二の 組換えDNA分子はHBVSペプチドのアミノ酸配列の実質的部分に相当するア ミノ酸配列の発現をコードするDNA配列を含んで成るような、前記宿主細胞。
- 22.前記第二の組換えDNA分子が、HBVSペプチドのアミノ酸配列の全部 に相当するアミノ酸配列の発現をコードするDNA配列を含んで成る、請求項2 1に記載の宿主細胞。
- 23.第一の分離した領域および第二の分離した領域を含んで成るペプチドであ って、 前記第一の領域が異種エピトープのアミノ酸配列に相当し;前記第二の領域がH BVSペプチドの全部ではなく実質的部分に相当する、ペプチド。
- 24.前記ペプチドが、本質的に前記第一の分離した領域および前記第二の分離 した領域から成る、請求項23に記載のペプチド。
- 25.第一の分離した領域および第二の分離した領域を含んで成るペプチドであ って、 前記第一の領域がT−細胞エピトープのアミノ酸配列に相当し; 前記第二の領域がHBVSペプチドの実質的部分に相当するような、ペプチド。
- 26.第一の分離した領域、第二の分離した領域および第三の分離した領域を含 んで成るペプチドであって、前記第一の領域が異種エピトープのアミノ酸配列に 相当し;前記第二の領域がT− 細胞エピトープのアミノ酸配列に相 当し;そして 前記第三の領域がHBVSペプチドの実質的部分に相当するような、ペプチド。
- 27.調製物の投与の際に免疫応答を誘発せしめるのに十分な濃度の請求項1, 2,3,5,6,7または11に記載の免疫原性粒子、および適当なキャリヤー を含んで成る、医薬調製物。
- 28.抗体の生産に有用な調製物であって、個体への調製物の投与の際に抗体の 生産を誘発せしめるのに十分な濃度の請求項1,2,3,5,6,7または11 に記載の免疫原性粒子、および適当なキャリヤーを含んで成る、医薬鋼製物。
- 29.抗体の生産に有用な調製物であって、個体への調製物の投与の際に抗体の 生産を誘発せしめるのに十分な濃度の請求項23,24,25または26に記載 のペプチド、および適当なキャリヤーを含んで成る、医薬調製物。
- 30.トランスフェクトされた宿主細胞を生産する方法であって、 コンピテントにされている宿主細胞をDNAの取込みのために用意し; 前記宿主細胞を、請求項16,17,18または19に記載の組換えDNA分子 を含んで成る第一のDNA調製物に暴露し;適当な条件下で、前記宿主細胞が前 記第一のDNA調製物からDNAを取り込むのを許容し;そして外来DNAを取 り込んだ宿主細胞について選択する;ことを含んで成る方法。
- 31.前記宿主細胞を前記第一のDNA調製物に暴露する前に、HBVSペプチ ドのアミノ酸配列を含むペプチドをコードするDNA配列を含んで成る第二のD NA調製物に暴露し、そして適当な条件下で前記宿主細胞が前記第二のDNA調 製物からDNAを取り込むのを許容することをさらに含んで成る、トランスフェ クトされた宿主細胞を生産するための請求項30に記載の方法。
- 32.前記宿主細胞を前記第一のDNA調製物に暴露した後に、HBVSペプチ ドのアミノ酸配列を含むペプチドをコードするDNA配列を含んで成る第二のD NA調製物に暴露し、そして適当な条件下で前記宿主細胞が前記第二のDNA調 製物からDNAを取り込むのを許容することをさらに含んで成る、トランスフェ クトされた宿主細胞を生産するための請求項30に記載の方法>
- 33.前記第一のDNA調製物が、HBVSペプチドのアミノ酸配列を含むペプ チドをコードしているDNA分子をさらに含んで成る、トランスフェクトされた 宿主細胞を生産するための請求項30に記載の方。
- 34.ペプチドの生産方法であって、 請求項16,17,18または19に記載の組換えDNA分子を調製し; 前記組換えDNA分子を用いて宿主細胞をトランスフェクトし; 前記宿主細胞によるタンパク質の発現および分泌を許容する条件下で前記宿主細 胞を培養し;そして前記組換えDNA分子内のDNA配列の発現の結果として生 産されたペプチドを回収する; ことを含んで成る方法。
- 35.前記組換えDNA分子内のDNA配列の発現の結果として生産されたペプ チドが、前記組換えDNA分子の完全なコード領域よりも少ない部分に相当する アミノ酸配列を含有する、請求項34に記載のペプチドの生産方法。
- 36.免疫原性粒子の生産方法であって、請求項16,17,18または19に 記載の組換えDNA分子を調製し; 前記組換えDNA分子を用いて宿主細胞をトランスフェクトし; 前記宿主細胞によるペプチドの発現および分泌を許容する条件下で前記宿主細胞 を培養し;そして適当な条件下で前記宿主細胞内での外来DNAの発現の結果と して生産されたペプチド単量体の会合を許容する;ことを含んで成る方法。
- 37.前記組換えDNA分子を用いて前記宿主細胞をトランスフェクトする前に 、HBVSペプチドのアミノ酸配列を含むペプチドをコードしているDNA分子 を用いて前記宿主細胞をトランスフェクトすることをさらに含んで成る、請求項 36に記載の免疫原性粒子の生産方法。
- 38.前記組換えDNA分子を用いて前記宿主細胞をトランスフェクトした後に 、HBVSペプチドのアミノ酸配列を含むペプチドをコードしているDNA分子 を用いて前記宿主細胞をトランスフェクトすることをさらに含んで成る、請求項 36に記載の免疫原性粒子の生産方法。
- 39.前記組換えDNA分子およびHBVSペプチドのアミノ酸配列を含むペプ チドをコードしているDNA分子を用いて、前記宿主細胞を同時にトランスフェ クトすることをさらに含んで成る、請求項36に記載の免疫原性粒子の生産方法 。
- 40.医薬調製物の製造方法であって、請求項16,17,18または19に記 載の組換えDNA分子を調製し; 前記組換えDNA分子を用いて宿主細胞をトランスフェクトし; 前記宿主細胞によるタンパク質の発現および分泌を許容する条件下で前記宿主細 胞を培養し; 適当な条件下で前記宿主細胞内でのDNA配列の発現の結果として生産されたペ プチドの会合を許容し、免疫原性粒子を形成せしめ;そして 前記免疫原性粒子が個体への前記調製物の投与の際に抗体の生産を誘発せしめる のに十分な濃度で存在するように、前記免疫原性粒子を適当なキャリヤーと配合 する;ことを含んで成る方法。
- 41.前記組換えDNA分子を用いて前記宿主細胞をトランスフェクトする前に 、HBVSペプチドのアミノ酸配列を含むペプチドをコードしているDNA分子 を用いて前記宿主細胞をトランスフェクトすることをさらに含んで成る、請求項 40に記載の医薬調製物の製造方法。
- 42.前記組換えDNA分子を用いて前記宿主細胞をトランスフェクトした後で 、HBVSペプチドのアミノ酸配列を含むペプチドをコードしているDNA分子 を用いて前記宿主細胞をトランスフェクトすることをさらに含んで成る、請求項 40に記載の医薬調製物の製造方法。
- 43.前記組換えDNA分子およびHBVSペプチドのアミノ酸配列を含むペプ チドをコードしているDNA分子を用いて前記宿主細胞を同時にトランスフェク トすることをさらに含んで成る、請求項40に記載の医薬調製物の製造方法。
- 44.抗体の生産に有用な調製物の製造方法であって、請求項16,17,18 または19に記載の組換えDNA分子を調製し; 前記組換えDNA分子を用いて宿主細胞をトランスフェクトし; 前記宿主細胞によるタンパク質の発現および分泌を許容する条件下で前記宿主細 胞を培養し; 適当な条件下で前記宿主細胞内でのDNA配列の発現の結果として生産されたペ プチドの会合を許容し、免疫原性粒子を形成せしめ;そして 前記免疫原性粒子が個体への前記調製物の投与の際に抗体の生産を誘発せしめる のに十分な濃度で存在するように、前記免疫原性粒子を適当なキャリヤーと配合 する;ことを含んで成る方法。
- 45.前記組換えDNA分子を用いて前記宿主細胞をトランスフェクトする前に 、HBVSペプチドのアミノ酸配列を含むペプチドをコードしているDNA分子 を用いて前記宿主細胞をトランスフェクトすることをさらに含んで成る、請求項 44に記載の抗体の生産に有用な調製物の製造方法。
- 46.前記組換えDNA分子を用いて前記宿主細胞をトランスフェクトした後で 、HBVSペプチドのアミノ酸配列を含むペプチドをコードしているDNA分子 を用いて前記宿主細胞をトランスフェクトすることをさらに含んで成る、請求項 44に記載の抗体の生産に有用な調製物の製造方法。
- 47.前記組換えDNA分子およびHBVSペプチドのアミノ酸配列を含むペプ チドをコードしているDNA分子を用いて前記宿主細胞を同時にトランスフェク トすることをさらに含んで成る、請求項44に記載の抗体の生産に有用な調製物 の製造方法。
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