JPH02501186A

JPH02501186A - 異種ウイルス性ペプチド粒子の免疫原

Info

Publication number: JPH02501186A
Application number: JP63505505A
Authority: JP
Inventors: トーマ，ハンス　アー．
Original assignee: メディコ　ラブス　アクチェンゲゼルシャフト
Priority date: 1987-06-22
Filing date: 1988-06-22
Publication date: 1990-04-26
Also published as: JP2758184B2; US6110706A; IL86833A0; DE3856496D1; IL86832A0; DE3856496T2; WO1988010300A1; US6117653A; IL86832A; DE10299017I1; DE10299017I2; CA1341074C; EP0299242A3; ES2167304T3; EP0300213A1; EP0299242A2; US6100065A; JPH02501187A; US6022543A; US6072049A

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるため要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】異種ウィルス性ペプチド粒子の免疫原光所夏分互この発明は、免疫原として有用である粒子に関する。さらに詳しくは、該粒子は、免疫応答を引き起こす、１もしくは複数のウィルスまたは寄生体〔例えば、肝炎（Ｂ、Ａ、非−Ａ、非−Ｂ）　、ＡＩＤＳ（ＨＩＶ、　１（ＴＬＶＩＩＩ）　、７ラリア、***、ポリオ）由来のエピトープを示すペプチドを単量体として含む。

発−明！すＬ最Ｂ型肝炎ウィルス（“ＨＢＶ”）で感染された個体の血液から単離された天然に生ずる２０ｎｍの粒子に類似のペプチド粒子が、免疫原として有用であることが知られている。例えば、Ｍｕｒｒａｙ、米国特許第４．７１０．４６３号は、免疫原として有用である粒子を形成せしめるのに利用できるＨＢＶのＳペプチドを生産するための組換え方法を開示している。Ｖａｌｅｎｚｕｅｌθら、欧州特許公開第０１７５２６１号は、免疫原として有用であるとクレームされている粒子を形成するＨＢＶからのＳタンパク質に連結しである種のウィルスおよび寄生体からのエピトープを含むペプチドを生産するための組換え方法を開示している。

これらの粒子のタイプは、所望のエピトープを含むペプチドの大部分が生成粒子中に組み込まれるようにする比において、粒子を形成するであろうペプチドを発現する細胞が種々のペプチドを発現する場合に、免疫原として最も効果的である。Ｖａｌｅｎｚｕｅｌａらは、粒子を作るのに使われている単量体の全てに完全なＳペプチドを組み込んだ。このＶａｌｅｎｚｕｅｌａの構成物における強力なＳ開始領域の存在は、異種（ＨＢＶ以外の）エピトープを含有しない単量体を産生ずる転写開始シグナルとして働き、異種エピトープを有する単量体の減少されたレベルを含む粒子を生じるであろう。

主所夏翌立本明細中で使われる“エピトープ”という用語は、指示されたウィルスのゲノムまたは特別に指示されたゲノムの領域によりコードされる少なくとも６個の連続したアミノ酸配列を言及する（例えば、“ＨＡＶエピトープ”は、Ａ型肝炎ウィルスのゲノムによりコードされる少なくとも６個の連続したアミノ酸の配列を言う）。本明細書中で使われる“異種エピトープ”という用語は、Ｂ型肝炎ウィルス以外のあらゆる起源のエピトープを言う。本明細書中で使われる“Ｔ−細胞エピトープという用語は、Ｔ−細胞の表面上のレセプターと相互作用して免疫応答を増強するかまたはその逆に影響を及ぼすエピトープを言う。

本発明によれば、複数の第一のペプチド単量体および複数の第二のペプチド単量体を共に結合して含んで成る免疫原性の粒子が開示される。第一のスプチド単量体の各々は、分泌の際に少な（とも直径Ｉｏｎ−の粒子を形成するであろうペプチドの実質的部分に相当するアミノ酸配列、および異種エピトープに相当するアミノ酸配列を含んで成る。第二のペプチド単量体の各々は、（１）分泌の際に少なくとも直径１０ｎｍの粒子を形成するであろうペプチドの実質的部分に相当するアミノ酸配列を含んで成り、そして（２）異種エピトープに相当するアミノ酸配列を含まない。第一のペプチド単量体と第二のペプチド単量体は同じではない（即ち、異なるアミノ酸配列を含有する）。

複数の第一のペプチド単量体、複数の第二のペプチド単量体および複数の第三のペプチド単量体を共に結合して含んで成る免疫原性の粒子もまた開示される。第一および第二のペプチド単量体が同じであり得ることを除いて、第一および第二のペプチド単量体は前記のものと同様である。第三のペプチド単量体は、分泌の際に直径少なくともＩｏｎｓの粒子を形成するであろうペプチドの実質的部分に相当するアミノ酸配列、およびＴ−細胞エピトープに相当するアミノ酸配列を含んで成る。

複数の第一のペプチド単量体および複数の第二のべ・ブチド単量体を共に結合して含んで成る他の免疫原性の粒子も開示される。この第一のペプチド単量体の各々は、分泌の際に直径少な（とも１０ｎｍの粒子を形成するであろうペプチドの実質的部分に相当するアミノ酸配列、異種エピトープに相当するアミノ酸配列、およびＴ−細胞エピトープに相当するアミノ酸配列を含んで成る。第二のペプチド単量体の各々は、（１）分泌の際に直径少な（ともＬｏｎｅの粒子を形成するであろうペプチドの実質的部分に相当するアミノ酸配列を含んで成り、そして（２）異種エピトープに相当するアミノ酸配列を含まない。

分泌の際に直径少なくとも１ｏｎａ＋の粒子を形成するであろうペプチドは、’ 　ＨＢＶ　Ｓペプチド、ＨＢＶコア抗原、ポリオ表面抗原、Ａ型肝炎表面抗原、Ａ型肝炎コア抗゛原、ＨＩＶ表面抗原およびＨＩＶコア抗原を包含する。好ましくは、少なくともＩｏｎｔｎの粒子を形成するペプチドがＨＢＶ　Ｓペプチドである。直径少なくとも１０ｎｍである粒子を形成するであろうペプチドが）ＩＢＶ　Ｓペプチドである、前記の免疫原性粒子もまた開示される。成るそのような免疫原性粒子においては、ＨＢＶＳペプチドの実質的な部分のみに相当するアミノ酸配列が存在し；成る粒子においては、ＨＢＶ　Ｓペプチドの全部に相当するアミノ酸配列が存在する。

本発明の免疫原性粒子中の異種エピトープは、ウィルスまたは寄生体のエピトープであることができる。ウィルス性エピトープは、Ａ型肝炎エピトープ、非−Ａ型肝炎エピトープ、非−Ｂ型肝炎エピトープ、ＨＩＶエピトープ、ポリオエピトープおよび***ウィルスエピトープを包含する。マラリアエピトープが寄生体エピトープの一例である。好ましい異種エピトープのヌクレオチド配列が第１表に挙げられている。

他の既知の異種エピトープまたは後で発見される異種エピト寄生体起源であるかにかかわ゛らず、本発明を実施するのに使好ましいＴ−細胞エピトープのヌクレオチド配列は第１表に示されている。

単量体コード領域を含んで成る組換えＤＮＡ分子もまた開示される。該単量体コード領域は、第一のＤＮＡ配列および第二のＤ　Ｎ　Ａ配列を含んで成る。第一のＤＮＡ配列は、ＨＢＶＳペプチドの全部ではなく実質的部分に相画するアミノ酸配列の発現をコードする。第二のＤＮＡ配列は異種エピトープに相当するアミノ酸配列の発現をコードする。第−Ｄ　Ｎ　Ａ配列および第二Ｄ　Ｎ　Ａ配列は、（１）同じリーディングフレーム内にあり、（２）単一ペプチドのそれぞれ別々の領域をコードし、そして（３）組換えＤＮＡ分子において発現調節配列に作用可能に連結される。

第一のＤＮＡ配列および第二のＤＮＡ配列を含んで成る組換えＤ　Ｎ　Ａ分子が開示される。この第一のＤＮＡ配列は、ＨＢＶ　Ｓペプチドの実質的部分に相当するアミノ酸配列の発現をコードする。第二のＤＮＡ配列は、Ｔ−細胞エピトープに相当するアミノ酸配列の発現をコードする。第一のＤ　Ｎ　Ａ配列および第二のＤＮＡ配列は、（１）同じリープイン、グフレーム内にあり、（２）単一ペプチドのそれぞれ別々の領域をコードし、そして（３）組換えＤＮＡ分子においては発現調節配列に作用可能に連結される。

第一のＤＮＡ配列、第二のＤＮＡ配列および第三のＤＮＡこの第一のＤＮＡ配列は、ＲＢＶ　Ｓペプチドの実質的部分に相当するアミノ酸配列の発現をコードする。第二のＤ　Ｎ　Ａ配列は、異種エピトープに相当するアミノ酸配列の発現をコードする。第三のＤ　Ｎ　Ａ配列は、Ｔ−細胞エピトープに相当するアミノ酸配列の発現をコードする。第一のＤＮＡ配列、第二のＤＮＡ配列および第三のＤＮＡ配列は、（１）同じリーディングフレー五内にあり、（２）単一ペプチドのそれぞれ別々の領域をコードし、そして（３）組換えＤＮＡ分子において発現調節配列に作用可能に連結される。

前記の組換えＤ　Ｎ　Ａ分子を用いて形質転換された宿主細胞が開示される。前記の組換えＤ　Ｎ　Ａ分子および、ＨＢＶ　Ｓペプチドのアミノ酸配列の実質的部分または全部に相当するアミノ酸配列の発現をコードするＤ　Ｎ　Ａ配列を含んで成る第二の組換えＤ　Ｎ　Ａ分子を用いて、同時形質転換された宿主細胞もまた開示される。

第一の分離した（ｄｉｓｃｒｅｔｅ）領域および第二の分離した領域を含んで成るペプチドが開示される。第一の領域は異種エピトープのアミノ酸配列に相当し、そして第二の領域はＨＢＶ　Ｓペプチドの全部ではなく実質的部分に相当する。本質的に第一の領域および第二の領域から成る他のペプチドも開・示される。

第一の分離した領域および第二の分離した領域を含んで成るペプチドも開示される。この第一の領域はＴ−細胞エピトープのアミノ酸配列に相当し、そして第二の領域はＨＢＶ　Ｓペプチドの実質的部分に相当する。

第一の分離した領域、第二の分離した領域および第三の分離した領域を含んで成る他のペプチドが開示される。この第一の領域は異種エピトープのアミノ酸配列に相当し、第二の領域はＴ−細胞エピトープのアミノ酸配列に相当し、そして第三の領域はＨＢＶ　Ｓペプチドの実質的部分に相当する。

医薬調製物および抗体の生産に有用な調製物が開示される。

該調製物は、該調製物の投与の際に免疫応答を誘発せしめるのに十分な濃度において前記の免疫原性粒子を含んで成る。

調製物の投与の際に免疫応答を誘発せしめるのに十分な濃度の前記の免疫原性粒子および適当なキャリヤーを含んで成る、抗体の生産に有用な調製物も開示される。

形質転換された細胞を生産するための方法が開示され、この方法は、コンピテントにされた宿主細胞をＤ　Ｎ　Ａの取込みのために用意し、この宿主細胞を、前記の組換えＤＮＡ分子を含んで成る第一のＤＮＡｍ製吻に暴露し、適当な条件下で該宿主細胞が第一のＤ　Ｎ　Ａ　１４製物からＤ　Ｎ　Ａを取り込むのを許容し、そして外来Ｄ　Ｎ　Ａを取り込んだ宿主細胞について選択することを含んで成る。第一のＤ　Ｎ　Ａ　１１製物は、）ＩＢＶ　Ｓペプチドのアミノ酸配列を含むペプチドをコードするＤＮＡ分子をさらに含んで成ることができる。該方法は、宿主細胞を第一のＤＮＡ調製物に暴露する前または後に、それらを第二のＤＮＡ調製物に暴露しそして適当な条件下で宿主細胞が第二のＤ　Ｎ　Ａ　１１製物を取り込むのを許容することをさらに含んで成ることができる。第二のＤＮＡ調製物は、ＨＢＶ　Ｓペプチドのアミノ酸配列を含むペプチドをコードするＤ　Ｎ　Ａ配列を含んで成る。

ペプチドを生産する方法もまた開示され、この方法は、前記の組換えＤ　Ｎ　Ａ分子を調製し、該組換えＤ　Ｎ　Ａ分子を用いて宿主細胞を形質転換せしめ、該宿主細胞によるタンパク質の発現および分泌を許容する条件下で宿主細胞を培養し、そして該組換えＤ　Ｎ　Ａ分子内でのＤＮＡ配列の発現の結果として生産されたペプチドを回収する、ことを含んで成る。このような方法により生産されるペプチドは、該組換えＤ　Ｎ　Ａ分子のコード領域によりコードされる完全なアミノ酸よりも少な（含むことができる。これは、組換えＤＮＡ分子のコード領域の一部分のみの転写および／または翻訳に起因するか、あるいは翻訳後にペプチド内で起こった削除による。

免疫原性粒子を生産する方法が開示され、この方法は、前記の組換えＤＮＡ分子を調製し、この組換えＤＮＡ分子を用いて宿主細胞を形質転換せしめ、該宿主細胞によるタンパク質の発現および分泌を許容する条件下で宿主細胞を培養し、そして適当な条件下で該宿主細胞内での外来ＤＮＡ配列の発現の結果として生産されたペプチド単量体の会合を許容することを含んで成る。宿主細胞は、ＨＢＶ　Ｓペプチドのアミノ酸配列を含むペプチドをコードしているＤＮＡ分子を使、ってさらに形質転換され得る。

医薬調製物および抗体の生産に有用な調製物の製造方法が開示され、この方法は、前記組換えＤ　Ｎ　Ａ分子を調製し；該組換えＤ　Ｎ　Ａ分子を用いて宿主細胞をトランスフェクトし；該宿主細胞によるタンパク質の発現および分泌を許容する条件下で該宿主細胞を培養し；゛適当な条件下で該宿主細胞内でのＤＮＡ配列の発現の結果として生産されたペプチドの会合を許容し、免疫原性粒子を形成せしめ；そして該免疫原性粒子が個体への調製物の投与の際に抗体を誘発せしめるのに十分な濃度で存在するように、該免疫原性粒子を適当なキャリヤーと配合する；ことを含んで成る。宿主細胞は、ＨＢＶ　Ｓペプチドのアミノ酸配列を含むペプチドをコードしているＤＮＡ分子を用いてさらにトランスフェクトされ得る。

士しい　能−のｉ′Ｂ本発明の組換え構成物は、ヌクレオチド配列が決定されるかまたは単離され得るようなあらゆるウィルス性エピトープを使って調製され得る。本発明を実施するのに好ましいエピトープは、ＨＢＶ、、Ａ型肝炎ウィルス（“ＨＡＶ″）、ＡＩＤＳウィルス（”ＨＩ　Ｖ’）、マラリア、ポリオウィルスおよびロ蹄疫ウィルス由来のものである。好ましいエピトープ（Ｔ−細胞およびＢ−細胞のエピトープともに）およびそれらの配列は第１Ａ表に要約される。

Ａ　゛男」」（表コｍ１ｉｔ口ｍＩＡ　し０１［Ｌ第１表中に示されたエピトープは、下記に特定的に記載されるような本発明の構成物の設計においてまたは他の組合せにおいて使用され得る。第１表中に示されたエピトープまたは他の望ましいエピトープを本発明の構成物に挿入するために、アダプターまたはリンカ−配列（例えば、下記に記載されるもの以外の制限断片または合成オリゴヌクレオチド）を利用することができる。

劃−」− 異種エピトープがＨＡＶ起源のものであるペプチドの発現に利用されるベクタープラスミドｐＨＢＩＨ２にプロモーターをｐｓｐＨ２（Ｅｘｏｇｅｎから入手可能）からＥｃｏＲＩ　／　Ｂ　ｇｌ　Ｕ断片（−ｋｂ）として単離した。そのプロモーターをＨＢＶゲノムから（７）２．３ｋｂ（７）ＢｇｌＩＩ／ＢｇｌＩ［断片、並びに選択マーカーおよび複製開始点を含むｐＢＲ３２２からの断片と連結させた。

プラスミドｐＨＡ１エンドヌクレアーゼＥｃｏＲＩおよびＢａｍＨＩでの制限消化の後の粘着末端を有するｐＢＲ３２２断片を、合成アダプター配列：ＥｃｏＲＩ　ＢｇｌＩ［５’　−ＡＡＴＴＣＡＡＧＡＴＣＴＧＣＣＡＴＧＣＡＧＴＧＧＡＡＧＣＴＴＡＡＧＧＡＴＣＣＴＣＴＡＧＡ−３’ＧＴＴＣＴＡＧＡＣＧＧＴＡＣＧＴＣＡＣＣＴＴＣＧＡＡＴＴＣＣＴＡＧＧＡＧＡＴＣＴＣＴＡＧおよびＨＡＶゲノムからの旧ｎｄ　ｍ　−ＢａｍＨＩ断片（３１０ｂｐ）と連結させた。該アダプターは、ＨＡＶの旧ｎｄ　ｍ　−ＢａｍＨＩ断片が開始シグナルの正確な読み枠内にあることを保証し、そのため開始シグナルおよびそれのフランキング配列はＨＢＶ表面抗原（“ＨＢＶ−３−Ａｇ、ＨＢｓまたはＨＢｓＡｇ”）（サブタイプａｙｗ）由来である。

この新規プラスミドをＢｇｌＩＩおよびＸｂａｌで消化しく３２２ｂｐ）、そしてＨＡＶ−遺伝子コード領域を含有するその３２２ｂｐの断片をアガロースゲル電気泳動後に単離した。

プラスミドｐＨＢＡ２このベクターは、ＥｃｏＲＩ部位とＢｇ１ｍ部位の間のｐＢＲ３２２部分にクローニングされるＨ２にプロモーター配列、および例えばＨＢＶ　Ｓペプチドをコードする遺伝子配列（２，３ｋｂのＢｇｌ■断片、ＨＢＶ−ゲノムから単離、サブタイプａｙｗ）を含む。該ＨＢＶ断片の５′−末端配列の一部をＢｇｌＩＩおよびＸｂａｌでの限定消化により除去しく５５０ｂｐ）　、そしてＨＡＶ遺伝子の上流に開始シグナルを有するＨＡＶのＶＰＩペプチドの部分をコードしている、プラスミドｐＨＡ１から単離されたＤ　Ｎ　Ａ断片（３２２ｂｐ）で置き換えた。この置換は、除去された断片と同じリーディングフレーム内にセントされた。

プラスミドｐＨＢＡ３．　ｐＨＢＡ４．　ｐＨＢＡ５．　ｐＨＢＡ６．　ｐＨＢＡ７プラスミドｐＨＢＡ３．　ｐＨＢＡ４．　ｐＨＢＡ５．　ｐＨＢＡ６およびｐＨＢＡ７は、ｐＨＢＡ２が前記３２２ｂｐのＨＡＶ断片の代わりに第１表からそれぞれオリゴヌクレオチドＮα１０５．１０７．１０９．１１１および１１３の置換を有するように作製された。

プラスミドｐＨＢＡ２ｓ１．　ｐＨＢＡ３ｓ１．　ｐＨＢＡ４ｓ１．　ｐＨＢＡ５ｓ１．　ｐＨＢＡ６ｓ１゜ｐＨＢＡ７ｓ１プラスミドｐＨＢＡ２．　ｐＨＢＡ３．　ｐ）ＩＢＡ４．　ｐＨＢＡ５．　ｐ）ＩＢＡ６およびｐＨＢＡ７をＥｃｏＲＩでそれぞれ線状にした。これらのＥｃａｌ？　Ｉ断片の各々を、ネオマイシン選択遺伝子の上流にＭＴ−プロモーターを含有するプラスミドｐＭＴ−ｎｅｏ　−Ｋ（ＡＴＣＣから入手可能）から単離された第二のＥｃｏＲＩ断片と共に連結させた。

プラスミドｐＨＢＡ２ＡおよびｐＦＩＢＡ３Ａプラスミドｐ）ＩＢＡ２およびｐＨＢＡ３をＥｃｏＲＩで線状にした。これらの断片の各々を、ａｈｔ’ｒ選択（増幅）遺伝子を含有するプラスミドｐｄｈｆｒ３．２　（ＡＴＣＣから入手可能）から単離された第二のＥｃｏＲＩ断片と共に連結させた。

プラスミドｐＨＢＡ２Ｓ２およびｐＨＢＡ３Ｓ２プラスミドｐＨＢＡ２およびｐＨＢＡ３をＥｃｏＲＩで線状にした。これらの断片の各々を、ｅｇｐｔ選択遺伝子の上流にＭＴ−プロモーターを含有するプラスミドｐＭＴｅｇｐｔ　（Ｐｈａｒｍａｃｉａから入手可能）から単離された第二のＥｃｏＲＩ断片と連結させた。

翌１．− Ｔ−細胞エピトープを含むペプチドの発現に利用されるベクター１）Ｔ−細胞エピトープがＨＢＶ−プレー８２起源であるものプラスミドｐＵＴ２ＢプラスミドｐＭＴ　−ｎｅｏＫをＥｃｏＲＩおよびＢｇｌＩＩで消化した。

２つの分子が予想され、ＭＴ−プロモーターを担持しているもの（１，９ｋｂ）を、ｐＢＲ部分およびネオマイシン選択遺伝子を担持している目的の断片からアガロースゲル電気泳動により除去した。この断片を、Ｕ２−プロモーター配列を担持している別の断片（３３０ｂｐ）と−緒に連結させた。Ｕ２−プロモーターはプラスミドｐＵｃ　８　４２　（Ｅｘｏｇｅｎから入手可能）からＥｃｏＲＩ　−Ａｐａ　Ｉ断片として単離された。新規プラスミドをｐＵ２−　ｎｅｏと命名した。

第二段階において、このプラスミドｐＵ２−　ｎｅｏをＢｇｌＩｒおよびＢａｍＨＩで消化して該プラスミドからネオマイシン遺伝子を除去し、そしてｐＢＲ３２２部分およびｐＵ２−プロモー、ターを含有する目的の断片を２．３ｋｂのＢｇｌ　ＩＩ−ＨＢＶ断片（前記）と連結した。ｐＵＢと称するこのプラスミドをＢｇｌＩＩおよびＸｂａＩで消化して５５０ｂｐ　（前記）を除去した。その除去部分は、本来のプレーＳＩの開始シグナルおよびフランキング配列を含みそして対応する粘着末端を有する、ＨＢＶプレーＳ、のＴ−細胞エピトープをコートする合成オリゴＤＮＡ配列により置き換えた。この新規プラスミドをｐｔｌＴ２Ｂ１と命名した（オリゴヌクレオチドＮα１７５第■表から）。

２）Ｔ−細胞エピトープがマラリア起源、ＨＢＶ−プレー８２起源またはＨＢＶ −コア起源であるものプラスミドｐＵＴＩＢ、　ｐＵＴ３Ｂ、　ｐＵＴ４Ｂ。

プラスミドβＵＴＩＢ、　ｐＵ７３ＢおよびｐＬＩＴ４Ｂは、ｐｔｌＴ２Ｂ１について前述したのと同様にして調製された。ただし置換するオリゴＤ　Ｎ　Ａ配列は、該Ｄ　Ｎ　Ａ配列が別のＴ−細胞エピトープをコードしていることで異なっている（マラリアについては：オリゴｎｏ、１７９　；　ＨＢ　Ｖ−プレー３２については：オリゴｎｏ。

１７７；ＨＢＶ−コアについては：オリゴｒ＋ｏ、１８５　；全て第１表ＨＢＶ起源のポリペプチドを形成する粒子の発現に利用されるベクタープラスミドｐＨＢＰ１プラスミドｐＨＢ１をＢｇｌＩＩおよびＸｈｏＩで消化した。２つの分子が予想されるが、４３０ｂｐのもの（プレーＳ配列を含む）を除去しそしてアガロースゲル電気泳動により目的の・断片から分離した。大きい方の目的の断片を合成アダプター配列＝５’　ＧＡＴＣＴＴＴＡＡＣ３’ ＡＡＡＴＴＧＡＧＣＴＢｇｌ　ＴＩ　Ｘｈｏ　１と連結して閉じた環状のプラスミドＤ　Ｎ　Ａを得た。

プラスミドｐＭＢＰ　１プラスミドｐＨＢＰ１をＥｃｏＲＩおよびＢｇｌＩ［で消化した。２っの分子が生じ、Ｈ２に一プロモーター（２ｋｂ）を含むものを除去し、そしてプラスミドｐＭＴ　−ｎｅｏから単離されたＭＴ−プロモーターを含有するＥｃｏＲ１−Ｂｇｌ　ＩＩｌ断片より置き換えた。

プラスミドｐＭＭｐ２プラスミドｐＭＴ　−ｎｅｏをＢａｍＨＩおよびＢｇｌＩＩで消化すると２つの分子が生じた。ネオマイシン選択遺伝子を含むものを除去し、そしてＭＴ−プロモーターおよびｐＢＲ部分を含む目的の断片（４，５ｋｂ）をアガロース電気泳動後に単離し、そしてＨＢＶ−３−＾ｇ（サブタイプａｄｗ）をコードする断片と連結した。ＨＢＶ−３−Ａｇ断片（１，８ｋｂ）は、エンドヌクレアーゼＢｇｌｎおよびＢａｍ）Ｉ　Ｉでの消化によりＨＢＶゲノムから単離された。

プラスミドｐＨＢＰ２プラスミドｐＨ−ｎｅｏ　（ＡＴＣＣから入手可能）をＢｇｌＩＩおよびＢａｌ１ｌ　Ｉで消化した。２つの分子が予想され、ネオマイシン選択遺伝子を含むものを除去し、そしてＨ２−プロモーターおよびｐＢＲ部分を含む目的の断片を単離した。前記断片を、ＨＢＶ−３−Ａｇをコードしティる１、８ｋｂ（７）ＨＢＶゲ／ム（ａｄＷサブタイプ）から単離された断片（前述）と連結させた。

プラスミドｐＨＢｃ１プラスミドｐＨ−ｎｅｏ　＠　Ｂ　ｇｌ　ＩＩおよびＢａｍＨＩで消化した。２つの分子が予想され、ネオマイシン選択遺伝子を含む方を除去し、そしてＨ２− プロモーターおよびｐＢＲ部分を含む目的の断片を単離した。前記断片を、）ＩＢＭ−コアペプチドをコードしているＨＢＶゲノム（サブタイプａｄｗ）から単離されたＢａｗｌ（ｌ断片（１，７７６ｋｂ）と連結させた。

プラスミドｐｏａｐ１ｓ１プラスミドｐＨＢＰ１をＥｃｏＲＩで線状化し、そしてネオマイシン選択遺伝子の上流にＭＴ−プロモーターを含むプラスミドｐＭＴ−ｎｅｏ　−Ｋから単離された第二のＥｃｏＲｌ断片と連結せしめた。

プラスミドｐＭＢＰ１ｓ１．　ｐＨＢＰ２ｓ１．　ｐＭＢＰ２ｓ１．　ｐＨＢｃ１ｓ１プラスミドｐＭＢＰ１．　ｐｉ（ＢＦ２．　ｐＭＢＰ２およびｐＨＢｃｌを、プラスミドｐ）ＩＢＰＩｓＩについて記載されたようなネオマイシン選択遺伝子をコードする遺伝子配列を付加することにより補足した。

プラスミド９１１８ＰＩＳ２プラスミドｐＨＢＰ１をＥｃｏＲＩで線状にし、そしてｅｇｐｔ選択遺伝子の上流にＭＴ−プロモーターを含有するプラスミドｐＭＴ−ｅｇｐｔ−Ｋ　（Ｐｈａｒａａｃｉａから入手可能）から単離された第二のＥｃｏＲｌ断片と連結せしめた。

プラスミドｐＭＢＰ１ｓ２．　ｐＨＢＰ２ｓ２．　ｐＭＢＰ２ｓ２プラスミドｐＭＢＰ１．　ｐＨＢＰ２およびｐＭＢＰ２を、前述したようなｅｇｐｔ選択遺伝子をコードしている遺伝子配列を追加することにより補足した。

プラスミドｐＨＢＰＩＡプラスミドｐＨＢＰ１をＥｃｏＲＩで線状化し、そして選択／増幅遺伝子ｄｈ、ｆｒを含むプラスミドｐｄｈｆｒ３．２から単離された第二のＥｃｏＲｌ断片と連結せしめた。

プラスミドｐＭＢＰＩＡ、　ｐＨＢＰ２Ａ、　ｐＭＢＰ２ＡプラスミドｐＭＢＰ１．　ｐＨＢＰ２およびｐＭＢＰ２を、プラスミドｐＨＢＰＩＡについて前述したような選択／増幅遺伝子ｄｈｆｒをコードしている遺伝子配列を追加することにより補足した。

■−土宿主細胞中への所望のプラスミドの遺伝子伝達（トランスフェクション）による抗原産生受容細胞の生産（１）まず、受容細胞（Ｃ１２７，Ｌ、　ＣＩＯ（ＡＴＣＣ）　）をプラスミドｐＨＢＰ２Ｓ２　（粒子を形成するポリペプチドの遺伝子配列を含む）でトランスフェクトした。高レベルで前記粒子を発現する細胞クローンを見つけた。

同定された該クローンの第二のトランスフェクション（同を用いて行った。同時トランスフェクションされた細胞クローンをイムノアッセイにより分析し、同時トランスフェクトしたプラスミドによりコードされる種々の単量体を分泌している細胞を検出した。

（２）前記受容細胞を３種の所望のプラスミド（ｐＨＢＰ２ｓ１　。

ｐＨＢＡ２およびｐＵＴ２Ｂ）の混合物で直接トランスフェクトした。

トランスフェクション後、増殖した細胞クローンをイムノアッセイにより直接分析し、前記の同時トランスフェクトしたプラスミドによりコードされる種々の単量体を分泌している細胞クローンを検出した。

（３）次のプラスミドの組合せをトランスフェクションに用いた時、受容細胞のトラ７スフエクシヨン後に同一の単量体の収得物が得られるだろう：ａ）最初にｐＨＢＰ２ｓ１　、次にｐＨＢＡ２Ｓ２およびｐＵＴ２Ｂｂ　）　ｐＨＢＰ２Ａ、　ｐＨＢＡ２およびｐＵＴ２Ｂ（７）混合物上記のトランスフェクション形式において、ｐＨＢＡ２の代わりにプラスミドｐＨＢＡ３．　ｐＨＢＡ４またはｐＨＢＡ５が置換され得る。

（４）次のプラスミドの組合せを用いた受容細胞の２回のトランスフェクション後にも同様な単量体の収得物が得られるだろうニー１１回目トランスフェクション：　ｐＨＢＰ２ｓ２＋ｐＵＴ２Ｂ−２回目（Ｄ　）ランス７エクシｓ　ン：　ｐＨＢＡ３ｓ１＋ｐｕＴＩＢトランスフェクションは次のように行った。受容細胞を１日目にペトリ皿（ＩＯＣＩ＋の皿あたり１ −２Ｘ１０−細胞数）中の標準的な増殖培地（ＤＭＩｌ’Ｍ＋５％ウシ胎児血清、グルコースおよびグルタミン）に接種した。

翌日培地を取り除き（ＤＮＡ沈澱物を該細胞に添加する４時間前）、そして細胞をＩＸＰＢＳで２回洗った０次いでＦｅ２を含まない８ｄのＤＭＥＭ　（最終濃度１０１のＨｅｐｅｓで補充）を添加した。４時間後、Ｄ　Ｎ　Ａ沈澱物を該細胞に加えた。

再び４時間後に培地を除去しそして３ｄのグリセロ−・ルー混合物（５０ｄの２ＸＨＢＳ緩衝液、３０ｄのグリセロール、１２０ａｌｔの蒸留水）を添加した。

３７℃にて３分間インキエベーシッン後すぐに該グリセロール−混合物を除去し、そして細胞をＩＸＰＢＳで洗浄した。１０％ＦＣ５を含む８ｄの聞ＥＭで細胞を一晩培養した。翌日、トリプシン−ＥＤＴＡ−溶液（０，０２５％トリプシン＋１　ｍＭ　Ｉ’ＤＴＡ）で処理することにより細胞に、細胞をＩＸＰＢＳで洗浄し、１０％ＦＣＳを含むＤＭＥＭ中に懸濁せしめ、そして２４ウエルのプレート中に分配した。

（細胞を１皿から１枚の２４ウェル−プレートへ）。細胞が十分に増殖した時に選択培地を添加した〔例えば、０．５−１■／ｄ−４度のネオマイシン、およびキサンチン：２５０■／ｄ：ヒポキサンチン：１５■／−（またはアデニン：２５■／ｄ）；チミジン＝１０■／ｄ、アミノプテリン：２■／−、ミコフェノール酸：２５■／−〕。

該培地を毎週交換した。２週間後に最初の増殖している細胞コロニーが見えた。

増殖した細胞コロニーをＥＬＩＳＡによりタンパク質の分泌についてスクリーニングした。

トランスフェクション用のＤ　Ｎ　Ａ沈澱物は次のように調製した。１０鱈のプラスミドＤ　Ｎ　Ａおよび２０鱈のキャリヤーＤ　Ｎ　Ａ　（サケ***Ｄ　Ｎ　Ａ、仔ウシ胸腺ＤＮＡ）にＴＥ−緩衝液（１０ｍＭ　Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ、　１ｍＭ　ＥＤＴＡ、　ｐＨ７，０５）を最終体積４４０Ｉまで添加し、そして６０ｍの２Ｍ　ＣａＣｆ□と一緒に混合した。

次いで等量の２　ＸＨＢＳ　（Ｈｅｐｅｓ　５０ｍＭ、　ＮａＣ１２８０＋＋＋Ｍ、　ＮａｚＨＰＯｎｌ、５＋＋＋Ｍ、　ｐＨ７，０５）を添加し、そしてよく混合した。　・その沈澱溶液を３７℃で３０分間インキュベートし、そしてトランスフェクトされる細胞に直接加えた。

第１表は、本発明に従って調製され、ＨＡＶ異種エピトープ、ＨＢＶ−ブＬ／Ｓ、Ｔ−細胞エピトープおよびＨＢｓＡｇ　エピトープを含む粒子のＥＬＩＳＡ分析を要約している。

男」Ｌ表請求の範囲に従ったＣｓＣ１勾配後の所望のエピトープの測定：抗体を用いたＥＬＩＳＡによる測定１０−１２　１．６４６　０．８７１　０．７２５［５ＨＢｓＡｇの定量ａ、ラジオイムノアッセイによるＡＵＳＲＩＡ　ｌｌ−２５″サンドインチ”ラジオイムノアッセイ（ＡＢＢＯＴＴより入手可能）において、Ｂ型肝炎表面抗原に対するテンジクネズミ（ｇｕｉｎｅａ　ｐｉｇ）の抗体（抗−ＨＢｓ）でコートされたビーズを血清、血しょうまたは精製タンパク質および適当な対照と共にインキュベートした。ＨＢｓＡｇが存在するものはいずれも固相の抗体に結合した。非結合の物質の吸引およびビーズの洗浄後、ヒトの１′■−抗−ＨＢｓをビーズ上の抗体−抗原複合体と反応させた。次にそのビーズを洗浄して非結合の１２５Ｉ−抗−ＨＢｓを除去した。

）−抗−ＨＢｓ　ＨＢｓＡｇ）−抗−ＨＢｓ−ＨＢｓＡｇ　”’　Ｉ−抗−）ＩＢｓ）−抗−ＨＢｓ−ＨＢｓＡｇ　−”’　Ｉ−抗−ＨＢｓビーズ上に残っている放射能をガンマシンチレーションカウンターでカウントした。

ｂ、ＥＬＩＳＡによるＥｎｚｙｇｎｏｓｔ　）ＩＢｓＡｇミクロ“サンドイッチ”アッセイ（Ｂｅｈｒｉｎｇから入手可能）において、ウェルを抗−ＨＢｓ抗体でコートした。血清、血しょうまたは精製タンパク質および適当な対照をそのウェルに添加しそしてインキュベートした。洗浄後、ペルオキシダーゼ−接合抗−ＨＢｓ抗体を残存している抗原決定基と反応させた。洗浄により非結合の酵素−接合抗体を除去し、そして固相上の酵素活性を測定した。過酸化水素および色原体の酵素触媒反応を希硫酸の添加により停止させた。

色の強度は試料のＨＢｓＡｇ１度に比例し、そして未知試料の色の強度と、−緒の負および正の対照血清との光度の比較により測定した。

ＨＢＶ−プレーＳ−エピトープの定量ａ、抗−ＨＢｓＡｇ抗体でコートされたＥＬ４ＳＡプレートを用いてＥｎｚｙｇｎｏｓｔ　）ｌＢｓＡｇ−ミクロ“サンドイッチ”アッセイにおいて、ウェルを抗−）（Ｂｓでコートした。血清、血しようまたは精製タンパク質および適当な対照を該ウェルに添加しそしてインキュベートした。洗浄後、抗−ＨＡＶ　（ウサ・ギ、ヒト）または抗−ＨＢＶ−プレーＳを添加してそして再びインキュベートした。次の洗浄後、ペルオキシダーゼ−接合抗体（ヤギの抗−ウサギ、ヤギの抗−ヒトまたはヤギの抗−マウス）を、結合した抗−ＨＡＶおよび／または抗−ＨＢＶ−プレーＳ抗体の検出、従って異種エピトープ（）（ＡＶ）および／またはＴ−細胞エピトー７′（ＨＢＶ−プレーＳ）の存在の検出のための計測器として用いた。非結合の酵素−接合抗体を洗浄により除去し、そして前述のように酵素活性を測定した。

ｂ、抗−プレーＳｓ　）ｌＢｓＡｇでコートされたＥＬＩＳ＾プレートを用いてこの“サンドイッチ”アッセイでは、ウェルを抗−プレーＳ、−ＨＢｓ抗体でコートした。精製タンパク質または細胞上清および適当な対照を酸ウェルに添加し、そしてインキュベートシた。非結合のタンパク質を洗浄（２回）により除去し、そして抗−ＨＡＶ抗体（ウサギ中で発達させたもの）を該ウェルに添加した。

インキュベーション後、結合した抗体を、酵素が接合した抗−ウサギ抗体で検出した。次いで前述のよ本発明のベクターの宿主細胞ゲノム内での構成を特徴づけるために、本発明の粒子を産生ずる細胞系から染色体Ｄ　Ｎ　Ａを単離し、そして適当な制限酵素で消化し、３ｔｐ−ラベル化ＤＮＡプローブを用いてサザンの方法（Ｊ、Ｍｏ１．Ｂｉｏｌ、、　Ｖｏｌ、９８゜ｐｐ、５０３−５１７．１９７５）により分析した。この方法は引用により本明細書中に組み込まれる。制限酵素ＢｇｌＩ［での染色体ＤＮＡ　（２０ｘ）の消化の後で、生じた断片を０．７％アガロースゲル電気泳動により単離した。その後、該ＤＮＡを３６６ｎｍのＵＶ光線に１０分間さらしそして０．５　Ｍ　ＮａＯＨおよびＩＭ　ＮａＣ１の溶液中で４５分間インキュベートすることにより変性させた。０．５Ｍ　Ｔｒｉｓ、　１．５Ｍ　ＮａＣ１，ｐＨ７，５中での６０分間のインキュベーションによりそのゲルを中和した。そのゲルを繊維のドライペーパータオルでニトロセルロースフィルターの頂部を覆うことにより該ゲルを通して３Ｍ　ＮａＣｆ　、　０．３　Ｍクエン酸ナトリウム（２０Ｘ　５ＳＣ）中に２０時間浸すことにより該ＤＮＡをニトロセルロースフィルターにトランスファーせしめた。

該ニトロセルロースフィルターを８０℃の真空オーブン中ニ２時間保持した。ｐＨＢＶのＢｇｌＩＩ断片（２，３ｋｂ）からニックトランスレーションにより放射性ＤＮＡプローブを調製した。

該Ｄ　Ｎ　Ａプローブとのハイブリダイゼーションのために、該ニトロセルロースフィルターを１０１ｄのプレハイブリダイゼーション混合物＝５０％ホルムアミド、５　Ｘ５ＳＣ、５０ｍＭリン酸ナトリウム（ｐＨ７，０）　、５　ＸＤｅｎｈａｒｄｔ溶液、２５０ＪｔＩｌ／−の変性サケ***ＤＮＡを含むプラスチックだフグ中に密封した。該フィルターをこの混合物中４５°Ｃで４時間インキュベートし、その後プレハイブリダイゼーション混合物をハイブリダイゼーション混合物：５０％ホルムアミド、５　Ｘ５ＳＣ。

２０＋＋＋Ｍリン酸ナトリウム（ｐＨ７，０）、Ｉ　ＸＤｅｎｈａｒｄｔ溶液、１００Ｉ！ｇ／Ｉｎ２の変性サケ***Ｄ　Ｎ　Ａ、５　Ｘ　１１０５ｃｐ／　ｄの３２ｐ＝プローブで置き換えた。該ハイブリダイゼーション混合物中４５℃にて１８８時間インキュベートた後、該フィルターを０、　Ｉ　Ｘ５ＳＣ、０，１％ＳＤＳ中５０″Ｃにて５分間ずつ３回洗浄した。そのフィルターを６０℃で１０分間乾燥し、そして２つの増強スクリーンの間の２つのＸ線フィルム（ＸＡＲ −５，ＫＯＤＡＫ）に暴露し、そして−８０°Ｃに維持した。１つめのＸ線フィルムは３日間の暴露後に現像し、２つめのフィルムは７日間の暴露後に現像した。

がニーもワクチン精製手順ａ、ポリエチレングリコール（ＰＥＧ）を用いた分別沈澱単量体を産生ずる培養物の上滑を集め、そして２．４００ｄの部分に分けた。各部分に１４４　ｇ　ｏ）ＰＥＧ　６０００（Ｓｅｒｖａ）を添加し、そして室温で２０分間撹拌して溶解せしめ、さらに４℃で６時間撹拌した。５００ａ＋ｆｆｉの容器中Ｇ５３０− ターで１０°Ｃにて３０分間の９．０００ｒｐａ＋　（１５，０００ｘ　ｇ　）での遠心により、沈澱物を分離した。上滑を集め、１４４ｇのＰＥＧ　６０００を添加し、そして前述のようにして溶解させた。この溶液を４°Ｃで３時間撹拌した。遠心を６０分間行ったこと以外は前述と同様にして、この溶液から沈澱物を収集した。そのペレットを２０ｄのＰＢＳ中に再懸濁させ、そしてゲルクロマトグラフィーにかけた。

ｂ、ゲルクロマトグラフィーＰＥＧ沈澱後に得られた物質をＰＢＳ中に再懸濁し、そしてＡ　−５ｍ　（ＢｉｏＲａｄ）のゲルクロマトグラフィーにかけた。カラムの大きさは２５　Ｘ　１０００ｍｍおよび４８０ｍ１のベッド体積であった。典型的な分画作業では、１０〜１５１ｄ中１　、０００　ｇのＰＥＧ沈澱単量体を負荷し、そして６滴／分（１８ｄ／ｈ）の速さでＰＢＳで溶出させた。３　ｍｆｌのフラクションを集め、そしてＣｓＣＥ勾配にかけた。

ｃ、ＣｓＣｆｆ１勾配中での沈降Ａ−５ｍ上でのカラムクロマトグラフィーで約３０個のフラクションをカバーし、精製前の単量体を含むピークを約１００ＩＩ１１に集めた。この溶液をＣ３ＣＩ！、で１．３０ｇ／ｃｃの密度に調整し、次に５Ｗ２７／２８０−ター（Ｂｅｃｋｍａｎ）に合うニトロセルロース試験管に移した。１．３５ｇ／ｃｃのＣｓＣｌ溶液４ｄを下層におきそして１．２５ｇ／ｃｃの密度の溶液４ｎ！ｌおよび１．２０ｇ／ｃｃの溶液４ｄを上層におくことにより勾配をセットした。その勾配は１０°Ｃで５０時間２８．００Ｏｒｐｍにて実施した。その後、勾配物を分画し、そして１．２０ｇ／ｃｃ密度の層に浮いている精製単量体を集めた。バック中で水に対して３サイクル透析することにより該溶液を脱塩した。

■−エ分析手順ａ）ポリアクリルアミドゲル電気泳動（ＰＡＧＥ）ＰＡＧＥによる分析のために、精製単量体のアリコートを１００ｔｌ／Ｉｄｌに調整した。各試料から１０バを取り出し、そして１０％ＳＯ５中の５Ｍ　ＤＴＴ　１０＃および試料緩衝液１０Ｊ１１と混合した。該粒子を破壊しそして単量体分子を生じさせるために、負荷の直前にこの混合物を１０分間沸騰させた。Ｌａｅｍｍｌｉに従った緩衝系中（これは引用により組みこまれる）１・２％ポリアクリルアミド−Ｎ　、　Ｎ　／−メチルビスアクリルアミドゲル（ＬＫＢ−Ｍｉｄｇｅｔ−系）において、４０ｍＡおよび１００ｖでタンパク質を泳動させた。

ｂ）ウェスタンプロット分析ゲル電気泳動後、未染色のＳＯＳ　−ＰＡＧＥゲルを室温で１５〜２０分間トランスファー緩衝液（２５＋＋＋Ｍ　Ｔｒｉｓ−ＨＣｊ！、　ｐＨ８，１５％メタノール中１９２ｏ＋？１グリシン）の中に浸した。トランスファー膜（Ｍｉｌｉｐｏｒｅ、　Ｉｍｍｏｂｉｌｏｎ　ＰＶＤＦ）をそのゲルのサイズの断片に切った。次いで酸膜を１００％メタノールで予め湿らせ、そしてすぐにすすぎ用の蒸留水中に浸し、続いて該ゲルを１０〜１５分間平衡化させ、プロッティングカセットを組み立て、そしてトランスフナ−緩衝液を加え、タンパク質−トランスファーを２５Ｖおよび２００〜７００ｍＡで２時間行った。湿った膜を３〜４つの同等な切片に切り、これを水中ですすぎ、次いでタンパク質“ブロッキング溶液（ＴＢＳ中５％ＢＳＡ　２０ｍＦＩＴｒｉｓ−ＨＣｊ！、　ｐＨ７，４中０．９％ＮａＣｉ！、）中種やかに混合しながら３７℃で１時間浸しておいた。その膜を３回洗浄後、前述トを再び洗浄しそして基質と共にインキュベートして着色した反応生成物を発生せしめた。色の発生は室温で１０〜２０分か無菌塩溶液中に懸濁された所望の濃度の抗原粒子に・、１：１０．０００体積のチメロゾール、１７１０体積の濾過滅菌済０．２４Ａ　１．　Ｋ（ＳＯ４）　ｚ　・１２ＨｚＯを添加した。無菌のｌＮＮａＯＨでｐｎを５．０に調整し、そしてその懸濁液を室温で３時間撹拌した。アルミで沈澱した抗原を２，０００ｇでの１０分間の遠心により回収し、１　：　１０．０００のチメロゾールを含む無菌の標準の塩溶液中に再懸濁し、そして無菌条件下でアリコートに分けた。

側ユ」− 例４（１）または４（２）に記載された異種重合体ワクチンによる免疫処置後の動物における免疫応答ａ、抗−ＨＢｓ応答の検出オスのＢａｌ’ｂ／ｅマウスを、所望の濃度の抗原を含む０．５ｍｌの！Ａ濁液で腹腔内に免疫処置した。２８日後、マウスを出血させそしてプラズマ血清を６，０００ｇでの３０分間の遠心により分離した。該血清の抗体含量を、抗−ＨＢｓ　“サンドインチ”アッセイを使って測定した。ウェルをＨＢｓＡｇ　（サブタイプａｄｗおよびａｙｗ）でコートした。血清プラズマおよび適当な対照を酸ウェルに添加しそしてインキュベートした。

洗浄後、マウス抗体の第二の決定基に結合するペルオキシダーゼ接合ＨＢｓＡｇを添加した。結合しなかった酵素接合抗原を洗浄により除き、そして固相上の酵素活性を測定した。過酸化水素および色原体（ｃｈｒｏｍｏｇｅｎ）の酵素触媒反応を希硫酸の添加により停止させた。色の強度は試料の抗−ＨＢｓ抗体濃度に比例し、そしてこれを−緒の負および正の対照血清の色の強度と未知の試料の色の強度との光度比較により測定した。

ｂ、抗−）（ＡＶ−エピトープ応答の検出ペプチドの“サンドイッチ”アッセイにおいて、所望の異種エピトープ（ＨＡ　Ｖ　）を表わすペプチドでウェルをコートし、次いでウシ血清アルブミンを含む緩衝液で飽和させた。

動物の血清プラズマおよび適当な対照をインキュベートし、酵素が結合した抗− マウスｒｇＧ抗体との第二のインキュベーションにより、結合を検出した。非結合の抗体を洗浄により除き、そして前述のようにして酵素活性を測定した。

Ｃ０抗−ＨＢＶ−ブｌ／　Ｓ　＋　Ｔ−細胞エピトープ応答の検出ペプチドの“サンドインチ“アッセイにおいて、所望のＴ−細胞エビトニブ（プレーＳ、）を表わすペプチドでウェルをコートし、次いでウシ血清アルブミンを含む緩衝液で飽和させた。動物の血清プラズマおよび適当な対照をインキュベートし、そして酵素が接合した抗−マウスＩｇＧ抗体との第二のインキュベーションにより、結合を検出した。非結合の該抗体を洗浄により除き、そし７て前述のようにＬ７て酵素活性を測定した。

第■表は免疫処置されたマウスの免疫応答を要約している。

策ｌ査動物における免疫応答−測定された抗体価免疫マウス　抗−ＨＢｓＡｇ　抗−ＨＢＶ−プレーＳ１　抗−）ＩＡνのＮα　（単位／ｄ）　（単位／ｄ）　（単位／ｄ）２０　１．５１２　１．０２２　８７５劃」」４例４（４）に記載の異種重合体ワクチンでの免疫処置後の動物における免疫応答ａ、抗−ＨＢｓ応答、抗−ＨＡＶ−エピトープ応答および抗−ＨＢＶ−プレーＳ、Ｔ−細胞エピトープ応答の検出は前述のようにして行われた。

ｂ、抗−マラリアニー細胞−エビトープ応答の検出ペプチドの“サンドインチ” ７゛ツセイにおいて、ウェルを、所望のＴ−細胞エピトープ（マラリア）を表わすペプチドでコートし、そしてウシ血清アルブミンを含む緩衝液で飽和させた。

動物の血清プラズマおよび適当な対照をインキュベートし、そして酵素が接合された抗−マウス−ＩｇＧ抗体との第二のインキュベーションにより、結合を検出した。非結合の該抗体を洗浄により除き、そして酵素活性を前述のようにして測定した。

第■表は、免疫処置されたマウスの免疫応答を要約している。

ｌ曳動物における免疫応答−測定された抗体価２０　２．３１７　１．５３６　１．２７４　１．０４６■上主宿主細胞への所望のプラスミドの遺伝子移入（トランスフェクション）による抗体産生受容細胞の生産（異種ＨＡＶエピトープのみ）前記の構成された異種重合体ワクチンを得るために、受容細胞をプラスミドｐＨＢＡ２ｓ１およびｐＨＢＰ２でトランスフェクト（同時トランスフェクション）した。新しく発生した細胞クローンをイムノアッセイにより分析し、所望の単量体を分泌している細胞を検出した。

次のプラスミドの組合わせを受容細胞のトランスフェクションに用いると、同じ単量体の収得物が得られるであろうニーｐＨＢＰ２ｓ１　＋ｐＨＢＡ２ −ｐ）ＩＢＰ２Ａ　＋ｐ）ｌＢＡ２ −ｐＨＢＰ２　＋ｐｌ（ＢＡ２Ｓ１ −ｐＨＢＰ２　＋ｐ）ＩＢＡ２Ｓ２ −　ｐＭＢＰ２　＋　ｐ）ｌＢＡ２ｓ１プラスミドｐＨＢＡ３．　ｐＨＢＡ４．　ｐＨＢＡ５．　ｐＨＢＡ６またはｐＨＢＡ７が上記のｐＨＢＡ２の代わりに置き換えられ得る。

第■表は、前記のワクチンで免疫処置されたマウスの免疫応答を要約したものである。

第に表ＣｓＣｉ、勾配後の所望のエピトープの測定抗体を用いたＥＬＩＳＡによる測定１０−１３　１．５４９　０．７８２　０．０００±上土例１３に記載の異種重合体ワクチンでの免疫処置後の動物における免疫応答ａ、抗−ＨＢｓ応答の検出オスのＢａ１ｂ／ｃマウスを、所望の濃度の抗原を含む０．５−の懸濁液で腹腔内に免疫処置した。２８日後、そのマウスを出血させ、そしてプラズマ血清を６＋　０００ｒｐｏ＋での３０分間の遠心により分離した。血清の抗体含量を抗− ＨＢｓ“サンドイッチ”アッセイを使って測定した。ウェルをＨＢｓＡｇ　（サブタイプａｄｗおよびａｙｗ）でコートした。血清プラズマおよび適当な対照を該ウェルに添加し、そしてインキュベートした。洗浄後、マウス抗体の第二の決定基と結合するペルオキシダーゼ接合ＨＢｓＡｇを加えた。非結合の酵素接合抗原を洗浄により除去し、そして固相上の酵素活性を測定した。過酸化水素および色原体の酵素触媒反応を希硫酸の添加により止め一緒の負および正の対照血清の色の強度と未知試料の色の強度との光度比較により測定した。

ｂ、抗−ＨＡＶ−エピトープ応答の検出ペプチドの“サンドインチ”アッセイにおいて、所望の異種エピトープ（ＨＡＶ）を表わすペプチドでコートし、次いでウシ血清アルブミンを含む緩衝液で飽和させた。動物の血清プラズマおよび適当な対照をインキュベートし、酵素を接合した抗−マウスＩｇＧ抗体との第二のインキュベーションにより結合を検出した。非結合の抗体を洗浄により除き、そして前述のようにして酵素活性を測定した。

第７表は、免疫処置されたマウスの免疫応答を要約したものである。

第Ｖ人動物における免疫応答−抗体価の測定至ロー１異種エピトープがＨＩＶ起源でありそして／またはＴ−細胞エピトープがＨＢＶ −プレーＳＩ起源であるペプチドの発現に使われるベクターの説明プラスミドｐＨ’ＢＩＩＨ２Ｋ７”Ｏモーター、ｐＢＲ３２２残基およびＨＢＶ−３−遺伝子を含むプラスミドｐＨＢ１をＢｇｌＩＩおよびＸｂａｌで消化した。

２つの分子が予想され、ゲル電気泳動後、１方の５５０ｂｐの断片（プレーＳおよびＳの５′端部分をコードしている）を除去し、そして目的の６．３５０ｋｂの断片（ｐＢＲ，プロモーターおよびＳ遺伝子の部分を含む）を単離し、そして連結のためドしている合成オリゴヌクレオチドＤ　Ｎ　Ａ配列（ＮＳ　１８８５ −２０２２＞　（第１表のオリゴＮα１３１）および該ＨＩＶ断片の上流の開始シグナルと正しいリーディングフレームにおいて連結させた。

プラスミドｐＨＢＩ２．　ｐＨＢＩ３．　ｐＨＢＩ４．　ｐ）ｌＢＩ５．　ｐ）ｌＢＩ６．　ｐＨＢＩ７゜ｐＨＢＩＢ、　ｐＨＢＩ９．　ｐＨＢ１１０前述したのと同じやり方でプラスミドｐＨＢＩ２−ｐＨＢ１１０を調製した。それらは、前記ＤＮＡ配列が異なるＨＩＶエピトープをコードしている（それぞれ第１表のオリゴヌクレオチドＮα１３３．１３５．１３７．１３９．１４１．１４３．１４５．１４７および１４９）という点だけ異なる。

プラスミドｐＨＢＩＩＳＩプラスミドｐＨＢ１１をＥｃｏＲｌで線状化し、そしてネオマイシン耐性遺伝子の上流にＭＴ−プロモーターを含有するプラスミドｐＭＴ−ｎｅｏＫ　（前記）から単離されたＥｃｏＲＩ断片と連結させた。

フラスミｔ’　ｐＨＢＩ３５１　ｐＨＢ１１０ｓ１プラスミド゛ｐＨＢ１１５１について記載されたものと同じ方法により、プラスミドｐＨＢＩ２ｓ１．　ｐＨＢＩ３５１．　ｐＨＢＩ３５１．　ｐＨＢＩ３５１゜ｐ）ｌＢＩ６ｓ１．　ｐＨＢＩ３５１．　ｐＨＢＩ３５１．　ｐＨＢＩ３５１およびｐＨＢ１１０ｓ１を調製した。

プラスミドｐＨＢ１１５２プラスミドｐＨＢ１１をＥｃｏＲＩで線状化し、そしてｅｇｐｔ選択遺伝子の上流にＭＴプロモーターを含有するプラスミドｐＭＴｅｇｐｔ（前記）から単離された第二〇ＥｃｏＲＩ断片と連結せしめた。

プラスミドｐＨＢＩＩＡプラスミドｐＨＢ１１をＥｃｏＲＩで線状にし、そして選択／増幅遺伝子を含むプラスミドｐｄｈｆｒ３．２から単離されたＥｃｏＲＩ断片と連結せしめた。

プラスミドｐＨＴ２ＢＩＩＢｇｌＩＩおよびＸｂａＩでの消化および５ｓｏｂｐの断片の除去後に誘導されたプラスミドｐＨ８１（前記）を、対応する粘着末端を有するＨＢＶ−プレ３１ −Ｔ細胞エピトープおよび旧Ｖｇｐ１６０の１つのエピトープをコードしている２ｏｏｂｐの合成オリゴヌクレオチド−Ｄ　Ｎ　Ａ配列（第１表のオリゴヌクレオチド患２０１）並びにＴ細胞エピトープの上流の開始シグナルと、正しいリーディングフレームにおいて連結せしめた。２つの合成オリゴヌクレオチド（Ｎα １７５およびＮα１３１）を最初に連結してこの２００ｂＰのオリゴヌクレオチドを得た。

劃」」− 宿主細胞への所望のプラスミドの遺伝子移入（トランスフェクション）による抗原産生受容細胞の生産（異種ＨＩＶエピトープおよびＴ−細胞エビトープ）（１）まず受容細胞をプラスミドｐＨＢＰ２Ｓ２（粒子形成ポリペプチドの遺伝子配列を含む）でトランスフェクトした。高レベルの単量体を発現する細胞クローンを見つけた。その同定されたクローンに向けてプラスミドｐＨＢ１１５１およびｐＵＴＩＢを用いて第二のトランスフェクション（同時トランスフェクション）を行った。イムノアッセイにより新しい細胞クローンを分析し、前記の異種重合体粒子を分泌している細胞を検出した。

（２）プラスミドｐＨＢＰ２ｓ１と共にプラスミドｐＨ７２Ｂ１１の混合物で受容細胞をトランスフェクト（同時トランスフェクション）した、トランスフェクション後、増殖した細胞クローンをイムノアッセイにより分析し、前記の異種重合体粒子を分泌している細胞クローンを検出した。

（３）次のプラスミドの組合せを受容細胞のトランスフェクションに使った時に同じ異種重合体抗原が得られるだろうニーｐＨＢＰ２ｓ１　＋ｐＨＴｌＢ１１ −ｐＨＢＰ２ｓ１　＋ｐＨＴ３Ｂ１１ −ｐＨＢＰ２Ａ　＋ｐＨ７３Ｂ１１＝ｐＨＢＰ２ｓ２　＋（ｐＨＢ１１ｓ１＋ｐＵ７３Ｂ）−ｐＨＢＰ２Ｓ２　＋　（ｐＨＢ１１ｓ１＋ｐＵ７３Ｂ）プラスミドｐＨＢＩ２　ｐＨＢ１１０を、ｐＨＢ１１について君己載されたのと同様にして使うことができる。

全てのその後の手順は前述したように行った。

１１表Ｃｓ’Ｃ１勾配後の所望のエピトープの測定抗体を用いたＥＬＩＳＡによる測定１０−１２　１．７２１　０．５８１　０．８７１開１ユ例１６に記載の異種重合体ワクチンでの免疫処置後の動物における免疫応答ａ、抗−ＨＢｓ応答の検出オスのＢａ１ｂ／ｃマウスを、所望の濃度の抗原を含む０．５ｍ！の懸濁液で腹腔内に免疫処置した。２８日後、そのマウスを出血させ、そしてプラズマ血清を６．００Ｏｒｐｍでの３０分間の遠心により分離した。血清の抗体含量を抗−ＨＢｓ　“サンドインチ”アッセイを使って測定した。ウェルをＨＢｓＡｇ　（・サブタイプａｄｗおよびａｙｗ）でコートした。血清プラズマおよび適当な対照を該ウェルに添加し、そしてインキュベートした。洗浄後、マウス抗体の第二の決定基と結合するペルオキシダーゼ接合）ＩＢｓＡｇを加えた。非結合の酵素接合抗原を洗浄により除去し、そして固相上の酵素活性を測定した。過酸化水素および色原体の酵素触媛反応を希硫酸の添加により止めた。色の強度は試料の抗− ＨＢｓ抗体濃度に比例し、これを−緒の負および正の対照血清の色の強度と未知試料の色の強度との光度比較により測定した。

ｂ、抗−ＨＡ　Ｖ−エピトープ応答の検出ペプチドの“サンドインチ”アッセイにおいて、所望の異種エピトープ（ＨＡＶ）を表わすペプチドでコートし、次いでウシ血清アルブミンを含む緩衝液で飽和させた。動物の血清プラズマおよび適当な対照をインキュベートし、酵素を接合した抗−マウス■ｇＧ抗体との第二のインキュベーションにより結合を検出した。非結合の抗体を洗浄により除き、そして前述のようにして酵素活性を測定した。

Ｃ０抗−ＨＢＶ−プレーＳＩ　Ｔ−細胞エピトープ応答の検出ペプチドの“サンドインチ”アッセイにおいて、所望のＴ−細胞エピトープ（プレーＳ、）を表わすペプチドでウェルをコートし、次いでウシ血清アルブミンを含む緩衝液で飽和させた。動物の血清プラズマおよび適当な対照をインキュベートし、そして酵素が接合した抗−マウスＩｇＧ抗体との第二のインキュベーションにより、結合を検出した。非結合の該抗体を洗浄により除き、そして前述のようにして酵素活性を測定した。

第ｉｔ動物における免疫応答−測定された抗体価〔例１６（１））２０　１．２２０　１．１７２　０．７７５玉■鷹、動物における免疫応答−測定された抗体価［例１６（２）］２１　１．４１０　１．３２１　０．９２５貫上主異種エピトープが他の起源であるペプチドの発現に使われるベクタープラスミドｐＨＢＨ３Ｈ２−プロモーター、ｐＢＲ３２２残基およびＨＢｓＡｇ遺伝子を含むプラスミドｐＨ８１をＢｇｌｌＩおよびＸｂａＩで消化した。２つの分子が生じ、ゲル電気泳動後、１方の５ｓｏｂｐの断片を除きそして目的の断片（Ｈ２−プロモーター、ｐ、ＢＲ部分およびＳ−遺伝子の部分を含む）を単離し、連結のための対応する粘着末端を有する、マラリアのＴ−細胞エピトープおよびそれの上流の開始シグナルをコードしている合成オリゴヌクレオチド（第１表のオリゴヌクレオチドＮｏ、１５５　）と、正しいリーディングフレームにおいて連結せしめた。

プラスミドｐＨＢＨ１およびｐＨＲＨ２ｐＨＢＨ３について記載されたのと同じやり方で、この２つのプラスミドを調製した。プラスミドｐＨＢＨ１は、マラリアＢ−細胞エピトープをコードしているオリゴヌクレオチド（第１表のオリゴヌクレオチドＮαｌ５５）を担持しており、そしてプラスミドｐＨＢ）１２は口蹄疫のエピトープをコードしているオリゴヌクレオチド（第１表のオリゴヌクレオチドＮα１６１）を担持している。

プラスミドｐＨＢＨ１ｓ１．　ｐＨＢＨ３５１，ｐＨＢＨ３５１これらのプラスミドは、前述したようにｐＨＢＨｌ、　ｐＨＢＨ２およびｐＨＢＨ３にネ１マイシン耐性遺伝子を付加することにより補宿主細胞中への所望のプラスミドの遺伝子移入（トランスフェクション）による抗原産生受容細胞の生産受容細胞をまずプラスミドｐＵＴＩＢおよびｐＨＢＰ２Ｓ２でトランスフェクト　（同時トランスフェクション）した。所望の単量体の安定した発現を有する細胞クローンを見つけた。その同定されたクローンに対してプラスミドｐＵＴ２ＢおよびｐＨＢＨ３５１を用いて第二のトランスフェクション（同時トランスフェクション）を行った。

その後の全ての手順は前述したものと同様に行われた。

里■表ＣｓＣ１，勾配後の所望のエピトープの測定抗体を用いたＥＬＩＳＡによる測定１０−１３　１．６８７　０．７８５　０．６４３　０．９２５翌しし史例２０に記載の異種重合体ワクチンでの免疫処置後の動物における免疫応答ａ）上記に記載したのと同様にして抗−ＨＢｓ応答および抗−）ＩＢＶ−プレー３１応答の検出を行った。

ｂ）抗−マラリア（ハイブリッドポリペプチド−Ｂ細胞エピトープ）応答の検出ペプチドサンドイッチアッセイのウェルを、所望のＢ−細胞エピトープ（マラリア）を表わすペプチドでコートし、次いでウシ血清アルブミンを含む緩衝液で飽和させた。該動物の血清プラズマおよび適当な対照をインキュベートし、酵素が接合した抗−マウス−１ｇＧ抗体との第二のインキュベーションにより、結合を検出した。非結合の抗体を洗浄により除き、そして前述のように酵素活性を測定した。

Ｃ）マラリアＢ−細胞エビトープについて前述したのと同様に抗−マラリア−ニー細胞エピトープ応答の検出を行った。

ただし、アッセイのウェルをコートするのに、所望のＴ−細胞エピトープ（マラリア）を表わす特異的なペプチドを用いた。

玉Ｘ表動物における免疫応答−測定された抗体価２０　３．００５　１．′ｒ５０　０．８７７　２．１０７貫じＬＬ一般的方法本発明を実施するのに有用な一般的方法は、（１）　Ｍｅｔｈｏｄｓｏｆ　Ｅｎｚ　ｍｏｌｏ　＋　１５２巻、“分子クローニング技法へのガイド”、Ｂｅｒｇｅｒおよびに’ｉａｍｅ１ｍ（Ａｃａｄｅｇ＋ｉｃ　Ｐｒｅｓｓ　１９８７）および（２）Ｍａｎｉａｔｉｓら、“分子クローニング：研究マニュアル”、（ＣｏｌｄＳｐｒｉｎｇ　Ｈａｒｂｏｒ　Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ　１９８２）の中に見い出され、この両方とも引用により本明細書に組みこまれる。使用する特定の技術を以下に記載する。

１）エンドヌクレアーゼによる消化および断片の単離使用する制限エンドヌクレアーゼ：　Ｂｇｌ　ＩＦ　、　Ｂａ＋ａＨＩ　、　Ｈｉｎｄｍ　、　ＥｃｏＲＩ　、　ＸｂａＩ　、　ＭｓｔＩＩ　、　ＸｈｏＩ　、ＰｆｌＭＩは、それら独自の制限緩衝液（ＩＯＸ）と共にＧｉｂｃｏ／ＢＲＬから商業的に入手可能であった。

他に指摘しない限り、次のように制限消化を行いそして断片を単離した。

一最終体積８ｉｌｌまでエッペンドルフ試験管に蒸留水を加える；一適当な１０×消化緩衝液ＩＪ！１を添加する；−制限酵素１＃（５−１０Ｕを含む）を添加しそして注意深く混合するニー該反応試験管を３７°Ｃで１時間インキュベートする；−最終濃度１０ｍＭまで０．５　Ｍ　ＥＤＴＡ（ｐＨ８，０）を加えることにより消化を停止させ゛る；Ｄ　Ｎ　Ａを直接ゲル上で分析する場合には、ＩＪ！ｌのゲル−ローディング色素ｍ　（Ｍａｎｉａｔｉｓ）を添加し、混合し、そして０．８％アガロースゲルの溝の中に該試料を負荷する。

アガロースゲルは普通０．８％アガロース、１×泳動緩衝液（ＴＢＥ、　Ｍａｎｉａｔｉｓ）を含む。断片（約１００−１０００ｂｐ）をアガロースゲルから単離する場合、該アガロースを１．２〜１．４％に増加させた。

２）コンピテントバクテリア細胞濃厚な一晩の培養物から、１　ｍｌのバクテリア細胞の懸濁液を１００ｄの新しい増殖培地（Ｌ−プロス）に添加した。その細胞を３７°ＣでＯＤ６゜。＝０．７の密度まで増殖させた。この密度は５００Ｉｎｌのアーレンマイヤーフラスコ中で激しく振とうさせながら２時間以内に到達された。該培養物を氷上で１０分間冷やすことにより増殖を止めた。この培養物から、３ｄを指数のバクテリア細胞を３．　ＯＯＯｒｐｍで５分間収得するために取り出した。この細胞を１０ｍＭ　Ｔｒｉｓ、　ｐＨ８，０、中の５０ｍＭ　ＣａＣｊｌ！。

１、５　ｄ中に再懸濁し、氷上でさらに１５分間インキュベートした。３．０００ｒｐｎ＋での５分間の遠心により該細胞を再度・収得し、そして１０ｍＭ　Ｔｒｉｓ＋　ｐ）１８．０中の５０ｍＭ　ＣａＣ１ｚ　２００ｊｔｌ中に再懸濁し、そして直接使用した。

３）コンピテントバクテリア細胞の形質転換形質転換せしめるためのＤＮＡをＩＯＤＩＭ　Ｔｒｉｓ＋　ｐＨ７−５＋　１ｍＭＥＤＴＡ　７０４中に懸濁し、そしてこれをＤ　Ｎ　Ａ取込み用の２００Ｉのバクテリア細胞懸濁液に゛添加した。その混合物を氷上で３０分間インキュベートし、次いでＩＩｄのＬ−ブロスを加えた。その混合物を４２℃で２分間および３７°Ｃで４０分間インキュベートした。

インキュベーション後、５０ｇアンピシリン／ｄ寒天を含む寒天プレート上に、プレートあたり５０−３００ｄの細胞Ｆ！濁液の量で細胞をまいた。該寒天プレートを３７°Ｃで一晩インキユベートした。このインキュベーション期間の後、１つに単離されたバクテリアコロニーが形成された。

４）プラスミドＤ　Ｎ　Ａの単離１ｊ２のプラスミド保有細胞をＬ−プロス中０．５のＯＤ、。。

値まで増殖させ、２００ｔｒｇ／ｍｌのクロラムフェニコールで２０時時間幅させた。次いでこの培養物をＪＡ−１０ロ一ター中４℃にて２０分間４．ＯＯＯｒｐｍで遠心した。ベレットを１８ｄの冷２５％ショＷｆＲ１５０ｍＭ　Ｔｒｉｓ（ｐＨ８，０）中に再懸濁し、２５０　ｄのア。

−レンマイヤーフラスコに移し、そして氷上に維持した。６ｍｋの２５０ｍＭ　Ｔｒｉｓ、　ｐＨ８，０、中の５■／ｄリゾチームを添加し、そしてその混合物を１０−１５分間放置しておいた。６ｄの２５０ｍＭＥＤＴＡ、　ｐＨ８，０、を加え、穏やかに混合し、そして氷上で１５分間インキュベートした。３０ｄの洗剤（０，０１％Ｔｒ−ｉｔｏｎ　Ｘ−１００：　６０ｍＭ　ＥＤＴＡ、　ｐＨ８，ｏ　；　５０ｍＭ　Ｔｒｉｓ、　ｐＨ８，０）を添加し、そしてその混合物を氷上で３０分間インキュベートした。インキュベーション後、該混合物を５Ｗ２８０一ター中４℃にて９０分間２５．００Ｏｒｐｍで遠心した。

上清液にプロナーゼを２５０ｘ／ｄまで加え、そして３７℃で３０分間インキュベートした。この溶液を、１０ｍＭ　Ｔｒｉｓ。

ｐＨ８，０，１＋ｎＭ　ＥＤＴＡで平衡化された１／２体積のフェノールで１回フェノール抽出した。水相を取り出した。次に酢酸ナトリウムを３００１の最終濃度まで加え、続いて３体積の冷１ｏ。

％エタノールを撹拌しながら加えた。その混合物を一２０°Ｃに一晩保存した。

該混合物を解凍しそして遠心した。ペレットを６ｄの１０ｍＭＴｒｉｓ、　１０ｍＭ　ＥＤＴＡ、　ｐＨ８，０中に再懸濁した。９．４ｇのＣ５Ｃｊ２および０．６５ｄの６■／−臭化エチジウムを加え、そして無菌の再蒸留水で体積を１０ｄに合わせた。その１０ｍ！アリコートをベックマンのヒートシール性勾配管に入れ、そしてＴｉ７０．１ベックマンローター中５０．　ＯＯＯｒｐｍで４８時間遠心した。

プラスミドのバンドをＵＶで目に見えるようにし、そしてシリンジおよび１８ゲージの針を用いて該試験管の側面に穴をあけることにより取り出した。等量のイソブタノールでの十分な抽出によりプラスミド画分から臭化エチジウムを除去した。次に咳画分を（１）ワンロフトの２２の１０ｍＭ　Ｔｒｉｓ。

ｐＨ７，４，１ｍＭ　ＥＤＴＡ、　ｐＨ７，５，５ｍＭ　ＮａＣ１に対して４° Ｃにて２時間以上透析し；そして（２）上記のように平衡化された１／３体積のフェノールで１回フェノール抽出した。次いで酢酸ナトリウムを最終濃度３０抛りまで添加し、続いて２体積の１００％エタノールを添加した。沈澱は一２０° Ｃで一晩、または−７０°Ｃで３０分間で形成した。

５）ミニ−プラスミド調製バクテリアの一晩培養物１　ｍｌをエッペンドルフ管に入れ、そして２０分間遠心した。上）青を除去した。５０ｍＭグルコース、２５ｍＭ　Ｔｒｉｓ（ｐ）１８．０）、　１０ｍＭ　ＥＤＴＡ（ｐ）１８．０）　１００．Ｊをペレットに添加し、渦動により混合し、そして室温で５分間インキュベートした。０．２　Ｎ　＋ｖ　ａ　ＯＨ＋　１％ＳＤＳ　２００ｍを添加し、渦動により混合し、そして氷上で５分間インキュベートした。　１５０ｉの３Ｍ酢酸ナトリウム（ｐＨ４，８）を添加し、渦動により混合し、そして氷上で５分間インキュベートした。

１３．　ＯＯＯｒｐｍでの５分間の遠心の後、上清を新しいエッペンドルフ管にデカンテーションした。３容の１００％エタノールを補充し、よく混合し、そして−８０°Ｃで３０分間インキュベートし、次いで１３．　ＯＯＯｒｐｍで１０分間遠心した。エタノールを除去し、そのペレットを７０％エタノールで洗浄し、凍結乾燥し、そして２０Ｊｌｌの蒸留水に溶かした。このプラスミドＤＮＡ溶液５Ｉを制限酵素分析に直接使用した。

６）ニックトランスレーションニックトランスレーションは、Ｒｉｇｂｙら、Ｊ、ＭＯｌ、Ｂ１０１．１月、３．　ｐｐ、２３７−２５１．１９７７に従って行なった。これは引用により本明細書中に組み込まれる。Ｄ　Ｎ　Ａの３２ｐ−ラベル化用の反応混合物は、５０ｍ？Ｉ　Ｔｒｉｓ、　ｐＨ７，８＋　５ｍ１ｌ　ＭｇＣｆｚ　、１０ｍＭメルカプトエタノール、０．１　ｍＭ　ｄＡＴＰ、　０．１ｍＭ　ｄＧＴＰ、　０．１ｍＭ　□ｄＴＴＰ。

５０μＣｉ　”Ｐ−ｄＣＴＰ、　１０単位のＤ　Ｎ　ＡポリメラーゼＩ、１■／　ｍｌのＤＮａｓｅ　Ｉの２Ｘ１０−’倍希釈液３Ｉを存する全体積３０Ｉ中に０．５　ｗのＨＢＶ断片を含有し、そしてこれを１５°Ｃで９０分間インキュベートすると、３　Ｘｌ０−’　〜１２Ｘ１０−”全ｃｐｍ、即ちＩ　ＸＩＯ’　〜５　Ｘ１０’ｃｐｉ／Ｉ！ｇＤＮＡを与える。

７）サザンプロット分析本発明のベクターの宿主細胞ゲノム内での構成を特徴づけるために、本発明の粒子を生産する細胞系から染色体Ｄ　Ｎ　Ａを単離し、そして適当な制限酵素で消化し、そしてサザンの方法（Ｊ、Ｍｏ１．Ｂｉｏｌ、、　９８巻、第５０３−５１７頁、１９７５）　（これは引用により本明細書中に組み込まれる）により、 ″２Ｐ−ラベル化Ｄ　Ｎ　Ａブロー・ブを使って分析した。制限酵素ＢｇｌＩＩによる染色体Ｄ　Ｎ　Ａ　（２０ｐｇ）の消化の後、生じた断片を０．７％アガロースゲル電気泳動により分離した。その後、３６０ｎｍのＵＶ光への１０分間の暴露並びに０．５　Ｍ　ＮａＯＨおよびＩＭ　ＮａＣ／！の溶液中での４５分間のインキュベーションによりＤ　Ｎ　Ａを変性させた。０．５Ｍ　Ｔｒｉｓ＋　１．５Ｍ　ＮａＣｊ！、　ｐ）１７．５中での６０分間のインキュベーションにより該ゲルを中和した。繊維のドライペーパータオルでニトロセルロースフィルターの上を覆って該ゲルを通して３Ｍ　ＮａＣｊｌ！　、０．３　Ｍクエン酸ナトリウム（２０×ＳＳＣ＞中に浸すことにより、ＤＮＡをニトロセルロースフィルターに移した。該ニトロセルロースフィルターを８０°Ｃの真空オーブン中に２時間維持した。ｐ）ＩＢＶのＢｇｌＩＩ断片からの放射性ＤＮＡプローブ（２，８ｋｂ）をニックトランスレーションにより調製した。

８亥Ｄ　Ｎ　Ａブローフ゛とのハイブリダイゼーションのために、３ｇニトロセルロースフィルタ− イゼーション混合物：５０％ホルムアミド、５ＸＳＳＣ，５０１リン酸ナトリウム（ｐＨ７。Ｏ　）　、５　ＸＤｅｎｈａｒｄｔ溶液、２５０ｎ／　ｍｌの変性されたサケ***ＤＮＡを含むプラスチックバッグ中に封入した。この混合物中で該フィルターを４５°Ｃにて４時間インキュベートし、その後プレハイブリダイゼーション混合物をハイブリダイゼーション混合物＝５０％ホルムアミド、５　ＸＳＳＣ　、２　０ｄリン酸ナトリウム（ｐＨ７．０）、１×Ｄｅｎｈａｒｄｔ溶液、１００ｇ／ｍの変性されたサケ***ＤＮＡ，５Ｘ１０’ｃｐｍ／ＩｎＩｌの３２ｐ−プローブ゛により置き換えた。言亥ハイフ゛リダイゼーション混合物中４５°Ｃにて１８時間インキュベートシタ後、＝亥フィルターを５０″Ｃ（７）０．　Ｉ　ＸＳＳＣ　、０．　１％ＳＤＳ中で３回、各５分間づつ洗浄した。

該フィルターを６０″Ｃで１０分間乾燥し、ぞして２つの映像強化スクリーンの間の２つのＸ線フィルムに暴露し、−　８　０　’Ｃに維持した．第一のＸ線フィルムは３日間の露出後に現像し第二のＸ線フィルムは７日間の露出後に現像する。

８）トランスフェクション用の哺乳類細胞およびＤ　Ｎ　Ａ沈澱物の調製受容細胞（ＣＩ２？　、Ｌ−またはＣ）１０−細胞（ＡＴＣＣがら入手可能）〕を、１１日にペトリ皿（皿あたり１−２Ｘ１０’細胞数、φ１０ｃｍ）中の標準的な増殖培地（ＤＭＥＭ＋５％ウシ胎児血清、グルコースおよびグルタミン）中に接種した。翌日培地を除去しく該細胞にＤＮＡ沈澱物を添加する４時間前）、そして細胞をＩＸＰＢＳで２回洗浄した。次いでＦＣＳを含まない８　ｍｌのＤＭＥＭ　（Ｈｅｐｅｓで補充−最終濃度１０ｍＭ）を添加した。４時間後、Ｄ　Ｎ　Ａ沈澱物（下記のようにして調製されたもの）を該細胞に添加した。再び４時間後、培地を除去し、３ｄのグリセロール−混合物（５０−の２ｘＨＢＳ緩衝液、３０ｄのグリセロール、１２０Ｉｄの蒸留水）を添加した。３７°Ｃにて３分間のインキュベーション後すぐにグリセロールー混合物を除去し、そして細胞をＩＸＰＢｓで洗った。１０％ＦＳＣを含む８ｄのＤＭＥＭ中で細胞を一晩培養した。

翌日、トリプシン−ＥＤＴ八溶液溶液、０２５％トリプシン＋ＩＩｌ１ＭＥＤＴＡ　）で処理することにより細胞を皿から回収した。その後、浄し、１０％ＦＣＳを含むＤＭＥＭ中に懸濁し、そして２４コスター−ウェルのプレートに分配した（一枚の皿から細胞を一枚の２４−ウェルのプレートへ）。細胞が十分に増殖した時、選択培地を添加した〔例えば、０．５−１■／ｄの濃度のネオマイシン、またはＣｌ２７、Ｌ−もしくはＣＯＯ−細胞（ＡＴＣＣから入手可能）（ｅｇｐｔ、）を含んで成る培地〕。培地は毎週交換した。最初の増殖している細胞コロニーが２週間後に見られた。

１０ｔｔｇのプラスミドＤＮＡおよび２０Ｉ！ｇのキャリヤーＤＮＡ（サケ*** ＤＮＡ、仔牛胸腺ＤＮＡ）にＴＥ−緩衝液（１０ｍＭ　Ｔｒｉｓ−ＨＣｊｌ！、　１ｍＭ　ＥＤＴＡ、　ｐＨ７，０５）を最終体積４４０Ｊ１！まで添加し、そして６０Ｉｉ１の２ＭＣａＣｆｚと一緒に混合した。次いで同量の２　ＸＨＢＳ　（Ｈｅｐｅｓ　５０ｍＭ、　ＮａＣｆ　２８０ｍＭ、　ＮａｚＨＰＯ４１，５ｍＭ、　ｐＨ７，０５）を添加し、そしてよ（混合した。この沈・澱溶液を３７ ℃にて３０分間インキュベートし、そしてトランスフェクトすべき細胞に直接添加した。

上記から、発明の精神および範囲から逸脱することなく、前記の組成物および方法において種々の変更を行うことができることは当業者にとって明らかであろう。従って、本発明は、その精神および本質的な゛特徴から逸脱することな（他の特定の形式において具体的に記載され得る。それ故、本実施態様は全ての点で限定としてでなく例示としてみなされるべきであり、本発明の範囲は上の記載よりもむしろ請求の範囲により指示され、そして請求の範囲の意味および同等の範囲内で行うあらゆる変更を、その中に包含するつもりである。

国際調査報告香り１１−一門−ｍｅ−＾帥−電１・１・ＰＣＴ／ＥＰ８８１００５５０ｔｍ、ａａ。Ｍ４１　Ａ＃ｍａｌｉＭお、　ＰＣτ／ＥＰ　８１１１００５５０国際調査報告

Claims

【特許請求の範囲】

１．複数の第一のペプチド単量体および複数の第二のペプチド単量体を含んで成る免疫原性粒子であって、前記第一のペプチド単量体の各々は、分泌の際に直径少なくとも１０ｎｍの粒子を形成するであろうペプチドの実質的部分に相当するアミノ酸配列、および異種エピトープに相当するアミノ酸配列を含んで成り；前記第二のペプチド単量体の各々は、分泌の際に直径少なくとも１０ｎｍの粒子を形成するであろうペプチドの実質的部分に相当するアミノ酸配列を含んで成り、そして前記第二のペプチド単量体の各々は、異種エピトープに相当するアミノ酸配列を含んでおらず；ここで前記第一のペプチド単量体と前記第二のペプチド単量体は同一ではなく互いに結合することができるような、前記免疫原性粒子。
２．複数の第一のペプチド単量体、複数の第二のペプチド単量体および複数の第三のペプチド単量体を含んで成る免疫原性粒子であって、前記第一のペプチド単量体の各々は、分泌の際に直径少なくとも１０ｎｍの粒子を形成するであろうペプチドの実質的部分に相当するアミノ酸配列、および異種エピトーブに相当するアミノ酸配列を含んで成り；前記第二のペプチド単量体の各々は、分泌の際に直径少なくとも１０ｎｍの粒子を形成するであろうペプチドの実質的部分に相当するアミノ酸配列を含んで成り、且つ前記第二のペプチド単量体の各々は、異種エピトーブに相当するアミノ酸配列を含んでおらず；そして前記第三のペプチド単量体の各々は、分泌の際に直径少なくとも１０ｎｍの粒子を形成するであろうペプチドの実質的部分に相当するアミノ酸配列、およびＴ− 細胞エピトープに相当するアミノ酸配列を含んで成り；ここで前記第一のペプチド単量体、前記第二のペプチド単量体および前記第三のペプチド単量体は互いに結合することができる、前記免疫原性粒子。
３．複数の第一のペプチド単量体および複数の第二のペプチド単量体を含んで成る免疫原性の粒子であって、前記第一のペプチド単量体の各々は、分泌の際に直径少なくとも１０ｎｍの粒子を形成するであろうペプチドの実質的部分に相当するアミノ酸配列、異種エピトープに相当するアミノ酸配列、およびＴ−細胞エピトープに相当するアミノ酸配列を含んで成り；前記第二のペプチド単量体の各々は、分泌の際に直径少なくとも１０ｎｍの粒子を形成するであろうペプチドの実質的部分に相当するアミノ酸配列を含んで成り、そして前記第二のペプチド単量体の各々は、異種エピトープに相当するアミノ酸配列を含んでおらず；ここで前記第一のペプチド単量体および前記第二のペプチド単量体は互いに結合することができる、前記免疫原性粒子。
４．前記分泌の際に直径少なくとも１０ｎｍの粒子を形成するであろうペプチドが、ＨＢＶＳペプチド、ＨＢＶコア抗原、ポリオ表面抗原、Ａ型肝炎表面抗原、．Ａ型肝炎コア抗原、ＨＩＶ表面抗原およびＨＩＶコア抗原から成る群から選択される、請求項１，２または３に記載の免疫原性粒子。
５．複数の第一のペプチド単量体および複数の第二のペプチド単量体を含んで成る免疫原性の粒子であって、前記第一のペプチド単量体の各々は、ＨＢＶＳペプチドの実質的部分に相当するアミノ酸配列、および異種エピトーブに相当するアミノ酸配列を含んで成り；前記第二のペプチド単量体の各々は、ＨＢＶＳペプチドの実質的部分に相当するアミノ酸配列を含んで成り、且つ前記第二のペプチド単量体の各々は異種エピトープに相当するアミノ酸列を含んでおらず；ここで前記第一のペプチド単量体と前記第二のペプチド単量体は同ーではなく互いに結合することができる、前記免疫原性粒子。
６．複数の第一のペプチド単量体、複数の第二のペプチド単量体および複数の第三のペプチド単量体を含んで成る免疫原性粒子であって、前記第一のペプチド単量体の各々は、ＨＢＶＳペプチドの実質的部分に相当するアミノ酸配列、および異種エピトープに相当するアミノ酸配列を含んで成り；前記第二のペプチド単量体の各々は、ＨＢＶＳペプチドの実質的部分に相当するアミノ酸配列を含んで成り、且つ前記第二のペプチド単量体の各々は異種エピトープに相当するアミノ酸配列を含んでおらず；そし，て前記第三のペプチド単量体の各々は、ＨＢＶＳペプチドの実質的部分に相当するアミノ酸配列、およびＴ−細胞エピトーブに相当するアミノ酸配列を含んで成り；ここで前記第一のペプチド単量体、前記第二のペプチド単量体および前記第三のペプチド単量体は互いに結合することができる、前記免疫原性粒子。
７．複数の第一のペプチド単量体および複数の第二のぺプチド単量体を含んで成る免疫原性粒子であって、前記第一のペプチド単量体の各々は、ＨＢＶＳペプチドの実質的部分に相当するアミノ酸配列、異種エピトーブに相当するアミノ酸配列、およびＴ−細胞エピトープに相当するアミノ酸配列を含んで成り；前記第二のペプチド単量体の各々は、ＨＢＶＳペプチドの実質的部分に相当するアミノ酸配列を含んで成り；ここで前記第一のペプチド単量体と前記第二のペプチド単量体は互いに結合することができる、前記免疫原性粒子。
８．前記第一のペプチド単量体の各々が、ＨＢＶＳペプチドのエピトープに相当するアミノ酸配列を含んで成る、請求項５，６または７に記載の免疫原性粒子。
９．前記第二のペプチド単量体が、ＨＢＶＳペプチドの全部に相当するアミノ酸配列を含んで成る、請求項５，６または７に記載の免疫原性粒子。
１０．前記異種エピトープがウイルス性エピトープである、請求項５，６または７に記載の免疫原性粒子。
１１．前記ウイルス性エピトープが、Ａ型肝炎エピトープ、非−Ａ型肝炎エピトープ、非−Ｂ型肝炎エピトープ、ＨＩＶエピトープ、ポリオエピトープおよび口蹄疫ウイルスエピトープから成る群から選択される、請求項１０に記載の免疫原性粒子。
１２．前記異種エピトープが、寄生体のエピトープである、請求項５，６または７に記載の免疫原性粒子。
１３．前記寄生体のエピトープが、マラリア寄生体のエビトープである、請求項１２に記載の免疫原性粒子。
１４．前記異種エピトープが、第１表中に記載のヌクレオチド配列のいずれか１つによりコードされるアミノ酸配列を有する、請求項５，６または７に記載の免疫原性粒子。
１５．前記Ｔ−細胞エピトープが、第１表中に記載のヌクレオチド配列のいずれか１つによりコードされるアミノ酸配列を有する、請求項５，６または７に記載の免疫原性粒子。
１６．単量体コード領域を含んで成る組換えＤＮＡ分子であって、前記単量体コード領域は第一のＤＮＡ配列および第二のＤＮＡ配列を含んで成り、前記第一のＤＮＡ配列は、ＨＢＶＳペプチドの全部ではなく実質的部分に相当するアミノ酸配列の発現をコードしており；前記第二のＤＮＡ配列は、異種エピトープに相当するアミノ酸配列の発現をコードしており；前記第一のＤＮＡ配列および第二のＤＮＡ配列は、（１）同じリーディングフレーム内にあり、（２）単一のペプチドのそれぞれ別々の領域をコーκしており、そして（３）前記組換えＤＮＡ分子において前記単量体コード領域の外側に置かれた発現調節配列に作用可能に連結されている、前記組換えＤＮＡ分子。
１７．前記単量体コード領域が、本質的に前記第一のＤＮＡ配列および前記第二のＤＮＡ配列から成る、請求項１６に記載の組換えＤＮＡ分子。
１８．第一のＤＮＡ配列および第二のＤＮＡ配列を含んで成る組換えＤＮＡ分子であって、前記第一のＤＮＡ配列は、ＨＢＶＳペプチドの実質的部分に相当するアミノ酸配列の発現をコードしており；前記第二のＤＮＡ配列は、Ｔ−細胞エピトープに相当するアミノ酸配列をコードしており；前記第一のＤＮＡ配列および第二のＤＮＡ配列は、（１）同じリーディングフレーム内にあり、（２）単一ペプチドのそれぞれ別々の領域をコードしており、そして（３）前記組換えＤＮＡ分子に発現調節配列に作用可能に連結されている、前記組換えＤＮＡ分子。
１９．第一のＤＮＡ配列、第二のＤＮＡ配列および第三のＤＮＡ配列を含んで成る組換えＤＮＡ分子であって、前記第一のＤＮＡ配列は、ＨＢＶＳペプチドの実質的部分に相当するアミノ酸配列の発現をコードしており；前記第二のＤＮＡ配列は、異種エビトープに相当するアミノ酸配列の発現をコードしており；前記第三のＤＮＡ配列は、Ｔ−細胞エピトープに相当するアミノ酸配列をコードしており；前記第一のＤＮＡ配列および第二のＤＮＡ配列は、（１）同じリーディングフレーム内にあり、（２）単一ペプチドのそれぞれ別々の領域をコードしており、そして（３）前記組換えＤＮＡ分子において発現調節配列に作用可能に連結されている、前記組換えＤＮＡ分子。
２０．請求項１６，１７．１８または１９に記載の組換えＤＮＡ分子を用いてトランスフェクトされた宿主細胞。
２１．第一の組換えＤＮＡ分子および第二の組換えＤＮＡ分子を用いて同時トランスフエクトされた宿主細胞であって、前記第一の組換えＤＮＡ分子は請求項１６，１７，１８または１９に記載の組換えＤＮＡ分子であり、そして前記第二の組換えＤＮＡ分子はＨＢＶＳペプチドのアミノ酸配列の実質的部分に相当するアミノ酸配列の発現をコードするＤＮＡ配列を含んで成るような、前記宿主細胞。
２２．前記第二の組換えＤＮＡ分子が、ＨＢＶＳペプチドのアミノ酸配列の全部に相当するアミノ酸配列の発現をコードするＤＮＡ配列を含んで成る、請求項２１に記載の宿主細胞。
２３．第一の分離した領域および第二の分離した領域を含んで成るペプチドであって、前記第一の領域が異種エピトープのアミノ酸配列に相当し；前記第二の領域がＨＢＶＳペプチドの全部ではなく実質的部分に相当する、ペプチド。
２４．前記ペプチドが、本質的に前記第一の分離した領域および前記第二の分離した領域から成る、請求項２３に記載のペプチド。
２５．第一の分離した領域および第二の分離した領域を含んで成るペプチドであって、前記第一の領域がＴ−細胞エピトープのアミノ酸配列に相当し；前記第二の領域がＨＢＶＳペプチドの実質的部分に相当するような、ペプチド。
２６．第一の分離した領域、第二の分離した領域および第三の分離した領域を含んで成るペプチドであって、前記第一の領域が異種エピトープのアミノ酸配列に相当し；前記第二の領域がＴ− 細胞エピトープのアミノ酸配列に相当し；そして前記第三の領域がＨＢＶＳペプチドの実質的部分に相当するような、ペプチド。
２７．調製物の投与の際に免疫応答を誘発せしめるのに十分な濃度の請求項１，２，３，５，６，７または１１に記載の免疫原性粒子、および適当なキャリヤーを含んで成る、医薬調製物。
２８．抗体の生産に有用な調製物であって、個体への調製物の投与の際に抗体の生産を誘発せしめるのに十分な濃度の請求項１，２，３，５，６，７または１１に記載の免疫原性粒子、および適当なキャリヤーを含んで成る、医薬鋼製物。
２９．抗体の生産に有用な調製物であって、個体への調製物の投与の際に抗体の生産を誘発せしめるのに十分な濃度の請求項２３，２４，２５または２６に記載のペプチド、および適当なキャリヤーを含んで成る、医薬調製物。
３０．トランスフェクトされた宿主細胞を生産する方法であって、コンピテントにされている宿主細胞をＤＮＡの取込みのために用意し；前記宿主細胞を、請求項１６，１７，１８または１９に記載の組換えＤＮＡ分子を含んで成る第一のＤＮＡ調製物に暴露し；適当な条件下で、前記宿主細胞が前記第一のＤＮＡ調製物からＤＮＡを取り込むのを許容し；そして外来ＤＮＡを取り込んだ宿主細胞について選択する；ことを含んで成る方法。
３１．前記宿主細胞を前記第一のＤＮＡ調製物に暴露する前に、ＨＢＶＳペプチドのアミノ酸配列を含むペプチドをコードするＤＮＡ配列を含んで成る第二のＤＮＡ調製物に暴露し、そして適当な条件下で前記宿主細胞が前記第二のＤＮＡ調製物からＤＮＡを取り込むのを許容することをさらに含んで成る、トランスフェクトされた宿主細胞を生産するための請求項３０に記載の方法。
３２．前記宿主細胞を前記第一のＤＮＡ調製物に暴露した後に、ＨＢＶＳペプチドのアミノ酸配列を含むペプチドをコードするＤＮＡ配列を含んで成る第二のＤＮＡ調製物に暴露し、そして適当な条件下で前記宿主細胞が前記第二のＤＮＡ調製物からＤＮＡを取り込むのを許容することをさらに含んで成る、トランスフェクトされた宿主細胞を生産するための請求項３０に記載の方法＞
３３．前記第一のＤＮＡ調製物が、ＨＢＶＳペプチドのアミノ酸配列を含むペプチドをコードしているＤＮＡ分子をさらに含んで成る、トランスフェクトされた宿主細胞を生産するための請求項３０に記載の方。
３４．ペプチドの生産方法であって、請求項１６，１７，１８または１９に記載の組換えＤＮＡ分子を調製し；前記組換えＤＮＡ分子を用いて宿主細胞をトランスフェクトし；前記宿主細胞によるタンパク質の発現および分泌を許容する条件下で前記宿主細胞を培養し；そして前記組換えＤＮＡ分子内のＤＮＡ配列の発現の結果として生産されたペプチドを回収する；ことを含んで成る方法。
３５．前記組換えＤＮＡ分子内のＤＮＡ配列の発現の結果として生産されたペプチドが、前記組換えＤＮＡ分子の完全なコード領域よりも少ない部分に相当するアミノ酸配列を含有する、請求項３４に記載のペプチドの生産方法。
３６．免疫原性粒子の生産方法であって、請求項１６，１７，１８または１９に記載の組換えＤＮＡ分子を調製し；前記組換えＤＮＡ分子を用いて宿主細胞をトランスフェクトし；前記宿主細胞によるペプチドの発現および分泌を許容する条件下で前記宿主細胞を培養し；そして適当な条件下で前記宿主細胞内での外来ＤＮＡの発現の結果として生産されたペプチド単量体の会合を許容する；ことを含んで成る方法。
３７．前記組換えＤＮＡ分子を用いて前記宿主細胞をトランスフェクトする前に、ＨＢＶＳペプチドのアミノ酸配列を含むペプチドをコードしているＤＮＡ分子を用いて前記宿主細胞をトランスフェクトすることをさらに含んで成る、請求項３６に記載の免疫原性粒子の生産方法。
３８．前記組換えＤＮＡ分子を用いて前記宿主細胞をトランスフェクトした後に、ＨＢＶＳペプチドのアミノ酸配列を含むペプチドをコードしているＤＮＡ分子を用いて前記宿主細胞をトランスフェクトすることをさらに含んで成る、請求項３６に記載の免疫原性粒子の生産方法。
３９．前記組換えＤＮＡ分子およびＨＢＶＳペプチドのアミノ酸配列を含むペプチドをコードしているＤＮＡ分子を用いて、前記宿主細胞を同時にトランスフェクトすることをさらに含んで成る、請求項３６に記載の免疫原性粒子の生産方法。
４０．医薬調製物の製造方法であって、請求項１６，１７，１８または１９に記載の組換えＤＮＡ分子を調製し；前記組換えＤＮＡ分子を用いて宿主細胞をトランスフェクトし；前記宿主細胞によるタンパク質の発現および分泌を許容する条件下で前記宿主細胞を培養し；適当な条件下で前記宿主細胞内でのＤＮＡ配列の発現の結果として生産されたペプチドの会合を許容し、免疫原性粒子を形成せしめ；そして前記免疫原性粒子が個体への前記調製物の投与の際に抗体の生産を誘発せしめるのに十分な濃度で存在するように、前記免疫原性粒子を適当なキャリヤーと配合する；ことを含んで成る方法。
４１．前記組換えＤＮＡ分子を用いて前記宿主細胞をトランスフェクトする前に、ＨＢＶＳペプチドのアミノ酸配列を含むペプチドをコードしているＤＮＡ分子を用いて前記宿主細胞をトランスフェクトすることをさらに含んで成る、請求項４０に記載の医薬調製物の製造方法。
４２．前記組換えＤＮＡ分子を用いて前記宿主細胞をトランスフェクトした後で、ＨＢＶＳペプチドのアミノ酸配列を含むペプチドをコードしているＤＮＡ分子を用いて前記宿主細胞をトランスフェクトすることをさらに含んで成る、請求項４０に記載の医薬調製物の製造方法。
４３．前記組換えＤＮＡ分子およびＨＢＶＳペプチドのアミノ酸配列を含むペプチドをコードしているＤＮＡ分子を用いて前記宿主細胞を同時にトランスフェクトすることをさらに含んで成る、請求項４０に記載の医薬調製物の製造方法。
４４．抗体の生産に有用な調製物の製造方法であって、請求項１６，１７，１８または１９に記載の組換えＤＮＡ分子を調製し；前記組換えＤＮＡ分子を用いて宿主細胞をトランスフェクトし；前記宿主細胞によるタンパク質の発現および分泌を許容する条件下で前記宿主細胞を培養し；適当な条件下で前記宿主細胞内でのＤＮＡ配列の発現の結果として生産されたペプチドの会合を許容し、免疫原性粒子を形成せしめ；そして前記免疫原性粒子が個体への前記調製物の投与の際に抗体の生産を誘発せしめるのに十分な濃度で存在するように、前記免疫原性粒子を適当なキャリヤーと配合する；ことを含んで成る方法。
４５．前記組換えＤＮＡ分子を用いて前記宿主細胞をトランスフェクトする前に、ＨＢＶＳペプチドのアミノ酸配列を含むペプチドをコードしているＤＮＡ分子を用いて前記宿主細胞をトランスフェクトすることをさらに含んで成る、請求項４４に記載の抗体の生産に有用な調製物の製造方法。
４６．前記組換えＤＮＡ分子を用いて前記宿主細胞をトランスフェクトした後で、ＨＢＶＳペプチドのアミノ酸配列を含むペプチドをコードしているＤＮＡ分子を用いて前記宿主細胞をトランスフェクトすることをさらに含んで成る、請求項４４に記載の抗体の生産に有用な調製物の製造方法。
４７．前記組換えＤＮＡ分子およびＨＢＶＳペプチドのアミノ酸配列を含むペプチドをコードしているＤＮＡ分子を用いて前記宿主細胞を同時にトランスフェクトすることをさらに含んで成る、請求項４４に記載の抗体の生産に有用な調製物の製造方法。