DE69021002T2

DE69021002T2 - Schimärische Hepadnavirus-Kernantigenproteine.

Info

Publication number: DE69021002T2
Application number: DE69021002T
Authority: DE
Inventors: Alan Louis Brown; Berwyn Ewart Clarke; David John Rowlands
Original assignee: Wellcome Foundation Ltd
Current assignee: Wellcome Foundation Ltd
Priority date: 1989-09-19
Filing date: 1990-09-19
Publication date: 1995-11-23
Anticipated expiration: 2010-09-20
Also published as: JPH03216186A; CA2025598A1; AU626183B2; AU6269090A; JP3228737B2; CA2025598C; ES2075883T3; EP0421635B1; EP0421635A1; IE69265B1; DE69021002D1; DK0421635T3; IE903370A1; NZ235315A; US20030175296A1

Description

Die vorliegende Erfindung bezieht sich auf den Aufbau chimärer Hepadnavirus-Kernantigenproteine.
Hepatitis B-Virus ist ein Hepadnavirus-Virus mit einem teilweise doppelsträngigen Genom aus 3200 Nucleotiden. Die virale DNA ist von dem viralen kodierten Kernantigen (HBcAg) umgeben, welches von dem in ähnlicher Weise kodierten Oberflächenantigen umschlossen ist (Robinson, Ann. Rev. Microbiolog. 31, 357-377, 1977). Eine Entfernung des Oberflächenantigens durch eine milde Behandlung mit einem Detergens führt zu einem Kernteilchen mit einem Durchmesser von 27 nm, das aus HBcAg und der viralen DNA besteht. HBcAg wurde in mikrobiologischen Zellen als natives Polypeptid und als Derivat, das mit den acht terminalen Resten von beta- Galactosidase verschmolzen ist, exprimiert (siehe z. B. Murray et al., EMBO J. 3, 645,650, 1984).
Bei Synthese in E. coli ordnet sich das Kernprotein selbstständig zu 27-nm-Teilchen an, die unter dem Elektronenmikroskop sichtbar gemacht werden können (Cohen und Richmond, Nature, 296, 677-678, 1982) und die bei Labortieren immunogen sind (Stahl et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 79, 1606-1610, 1982). Die Aminosäuresequenz des Kernantigens zeigt zum Carboxyende hin einen Bereich, der mit jenem, der in Protaminen gefunden wird (DNA-bindende Proteine) homolog ist. Durch Schlußfolgerung hieraus vermutet man, daß dieser Teil des Moleküls bei der Anordnung der Kernteilchen mit der DNA in Wechselwirkung tritt (Paek et al., Nature, 282, 575- 579, 1979).
Die Verwendung von rekombinanten Teilchen, die Hepatitis B- Kernantigen und heterologe Proteinsequenzen als starke immunogene Einheiten enthalten, ist wohl dokumentiert. Wir haben früher gezeigt, daß die Anfügung von heterologen Sequenzen an das Aminoende des Proteins zu der spontanen Anordnung von partikulären Strukturen führt, an deren Oberfläche das heterologe Epitop mit hoher Dichte exponiert wird und die hoch immunogen sind, wenn Versuchstiere damit geimpft werden (Clarke et al., Nature, 330, 381-384, 1987). Ähnliche Resultate wurden von anderen Gruppen, die unser System benutzen, berichtet (z. B. Chang et al., 2nd International Symposium on positive strand RNA viruses, Wien, Österreich, 1989, Abstract 010)
Nachfolgende Experimente anderer Gruppen zeigten, daß es auch möglich ist, annähernd 40 Aminosäuren aus dem Carboxyende des Proteins durch heterologe Sequenzen zu ersetzen und die Teilchen-Morphogenese aufrechtzuerhalten (Stahl & Murray, Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 86, 6283-6287, 1989). Darüber hinaus sind diese Teilchen auch immunogen, wenn auch offensichtlich weniger als die Fusionen am Aminoende.
Trotz der Tatsache, daß diese Fusionsteilchen ausgezeichnete Immunantworten gegen das dort angefügte Epitop induzieren, verbleibt noch Raum für eine Verbesserung in verschiedenen Punkten. Erstens, die Immunantworten gegen das zugesetzte Epitop, obgleich ausgezeichnet, lassen sich nicht mit den parallelen Antworten, die gegen die HBcAg-Sequenzen erzeugt werden, vergleichen. Zweitens, sowohl bei den Fusionen am Amino- wie auch am Carboxyende besitzt das angefügte Epitop eine ihm innewohnende Flexibilität, da es nur an einem Ende kovalent gebunden ist. Dies kann für konformationsstarre Epitope nachteilig sein. Drittens, ein Modell der Struktur des Hepatitis B-Kernantigen hat vorausgesagt, daß sowohl das Amino- wie auch das Carboxyende des Proteins natürlicherweise im Inneren der Teilchen liegt (Argos & Fuller, EMBO J. 1, 819-824, 1988). Es ist nur die ihnen innewohnende hydrophile Natur der meisten heterologen Epitope, welche sie an die Oberfläche führt.
Wir haben nun einen Bereich hoher Immunogenität in einer Oberflächenregion von HBcAg-Teilchen ausfindig gemacht. Es wurde ein Vektor, der HBcAg kodiert und eine Restriktionsstelle in diesem Bereich hoher Immunogenität aufweist, konstruiert. An der Restriktionsstelle wurden fremde Sequenzen eingefügt, die es ermöglichen, daß chimäre HBcAg-Proteine exprimiert werden. Die chimären Proteine ordnen sich selbstständig zu Teilchen mit einem auf ihrer Oberfläche exponierten Fremdepitop an.
Dementsprechend stellt die vorliegende Erfindung Teilchen bereit, die aus einem chimären Hepadnavirus-Kernprotein aufgebaut sind, das eine fremde Aminosäuresequenz aufweist, die ein Epitop enthält, das in die Aminosäuresequenz von Rest 75 bis Rest 85 für den Fall, daß das Kernantigen HBcAg ist, oder in die entsprechende Aminosäuresequenz für den Fall eines anderen Hepadnavirus-Kernantigen, eingefügt ist oder diese ganz oder teilweise ersetzt. Die HBcAg-Reste sind nach Ono et al., Nucl. Acid. Res. 11 1747-1757, 1983 numeriert. Entsprechende Reste des Kernproteins eines anderen Hepadnavirus können bestimmt werden, indem die Sequenzen von HBcAg und des anderen Kernprotein miteinander vergleicht.
Die chimären Proteinteilchen können verwendet werden, um einen für das Epitop auf dem chimären Protein spezifischen Antikörper zu erzeugen. Ein Antikörper kann daher in einem Säugetier erzeugt werden, indem dem Säugetier eine wirksame Menge der Teilchen verabreicht wird, die aus dem chimären Protein bestehen, wobei die fremde Sequenz ein Epitop enthält, das fähig ist, einen Antikörper der gewünschten Spezifität zu induzieren. Die chimären Proteinteilchen können zu diesem Zweck als eine Komponente einer pharmazeutischen oder veterinärmedizinischen Zusammensetzung, die auch einen pharmazeutischen oder veterinärmedizinisch akzeptablen Träger oder ein pharmazeutisch oder veterinärmedizinisch akzeptables Verdünnungsmittel enthält, angeboten werden.
Die Erfindung stellt außerdem einen Expressionvektor bereit, der eine DNA-Sequenz enthält, welche ein Hepadnavirus- Kernprotein kodiert und (a) eine Restriktionsstelle innerhalb der Sequenz, die die HBcAg-Aminosäurereste 75 bis 85 oder die entsprechende Sequenz des Kernproteins eines anderen Hepadnavirus kodiert, oder (b) zwei Restriktionsstellen hat, die dieses Sequenz oder einen Teil dieser Sequenz, die die HBcAg-Aminosäurereste 75 bis 85 oder die entsprechende Sequenz des Proteins eines anderen Hepadnavirus kodiert, flankieren. Wenn die HBcAg-Kodons 75 bis 85 oder ihre entsprechenden Kodons für das Kernprotein eines anderen Hepadnavirus vollständig oder teilweise deletiert wurden, befindet sich die Restriktionsstelle geeigneterweise in der verbleibenden Sequenz. Wenn zwei Restriktionsstellen bereitgestellt werden, werden sie normalerweise durch dasselbe Restriktionsenzym geschnitten.
Ein derartiger Expressionsvektor kann in einem Wirt bereitgestellt werden. Der Vektor liefert einen Ausgangspunkt für die Herstellung eines Vektors, der fähig ist, das chimäre Protein der Erfindung zu exprimieren. Zu diesem Zweck ist eine DNA-Sequenz zu konstruieren, welche das chimäre Protein kodiert. Es ist insbesondere ein Vektor erforderlich, der eine solche DNA-Sequenz beinhaltet und fähig ist, wenn er sich in einem geeigneten Wirt befindet, das chimäre Protein zu exprimieren.
Ein Vektor, der fähig ist, das chimäre Protein zu exprimieren, wird hergestellt, indem eine DNA-Sequenz, die die fremde Sequenz kodiert, in einen Vektor, welcher ein Hepadnavirus-Kernprotein kodiert und welcher eine Restriktionsstelle oder -stellen (a) oder (b), wie oben erwähnt, aufweist, eingefügt wird. Eine Restriktionsstelle (a) tritt vorzugsweise an den HBcAg-Kodons 80 und 81 oder an den entsprechenden Kodons für das Kernprotein eines anderen Hepadnavirus auf. Der resultierende Vektor, der das chimäre Protein kodiert, wird typischerweise in einem kompatiblen Wirt bereitgestellt.
Um das chimäre Protein zu erhalten, wird ein Wirt unter solchen Bedingungen kultiviert, daß das chimäre Protein exprimiert wird. Der Wirt ist mit einem Expressionsvektor, der das chimäre Protein kodiert, ausgestattet. Das chimäre Protein fügt sich selbst ständig zu Teilchen zusammen, wenn es exprimiert wird und kann dann isoliert werden. Diese Teilchen sind den 27-nm-Kernteilchenn sehr ähnlich, die aus HBcAg und viraler DNA bestehen, und durch Denaturierung von Hepatitis B-Virus erhalten werden können. Das fremde Epitop ist an der äußeren Teilchenoberfläche exponiert.
Das chimäre Protein enthält eine fremde Aminosäuresequenz, die ein Epitop umfaßt. Mit "fremd" ist gemeint, daß die Sequenz nicht Teil der Sequenz des Hepadnavirus-Kernproteins ist. Die fremde Sequenz, die die HBcAg-Aminosäurereste 78 bis 85 ganz oder teilweise ersetzt oder in diese eingefügt ist, ist daher weder ein Teil noch das gesamte Insert aus den 39 Aminosäuren nahe der vorhergesagten Position des HBel-Epitops von Vogel-Hepatitis-Viren, insbesondere von Viren aus Enten (Feitelson und Miller, Proc. Natl., Acad. Sci. USA, 85, 6162- 6166, 1988). Der Hepadnavirus-Kernprotein-Teil des chimären Proteins ist typischerweise ein Säugetier-Hepadnavirus- Kernantigen, insbesondere das humane HBcAg oder Waldhühner WHCAG. Es kann Hepatitis B-Virus adw Serotyp HBcAg verwendet werden.
Es kann irgendein fremdes Epitop, d. h. ein Epitop, das kein Epitop eines Hepadnavirus-Kernproteins ist, als Teil des chimären Proteins exponiert werden. Das Epitop ist eine Sequenz aus Aminosäureresten, die fähig sind, einen Antikörper zu erzeugen. Das Epitop kann ein Epitop sein, das fähig ist, einen neutralisierenden Antikörper zu erzeugen, z. B. ein Epitop eines infektösen Agenzes oder Krankheitserregers, wie z. B. Virus oder Bakterium. Es kann ein Epitop eines nicht-infektösen Agenzes wie eines Wachstumshormons sein. Die fremde Sequenz kann Wiederholungen eines Epitops umfassen, z. B. bis zu acht oder bis zu vier Kopien eines Epitops. Zwei Kopien eines Epitops können demnach in der fremden Sequenz vorliegen. Eine fremde Sequenz kann zwei oder mehrere verschiedene Epitope, z. B. drei oder vier, enthalten.
Als Beispiele für Viren, deren Epitope präsentiert werden können, können Hepatitis A-Virus, Hepatitis B-Virus, Influenza-Virus, Virus der Maul- und Klauenseuche, Poliovirus (PV), Herpes simplex-Virus, Tollwutvirus, Katzenleukämie- Virus, humaner Immundefizienzvirus Typ 1 (HIV-1), HIV-2, Affen-Immundefizienzvirus (SIV), humaner Rhinovirus (HRV), Dengue-Virus und Gelbfiebervirus genannt werden. Das Epitop, das durch das chimäre Protein präsentiert wird, kann daher ein Epitop von HBsAg, der pre-S-Region von HBsAg oder von HRV2 sein.
Die fremde Sequenz in dem chimären Protein kann bis zu 100, z. B. bis zu 50, Aminosäurereste lang sein. Die fremde Sequenz kann demnach bis zu 40, bis zu 30, bis zu 20 oder bis zu 10 Aminosäurereste lang sein. Die fremde Sequenz umfaßt das Epitop, gegen welches ein Antikörper induziert werden soll. Die fremde Sequenz kann an einem oder beiden Enden des Epitops auch weitere Aminosäurereste enthalten.
Wenn weitere Aminosäurereste vorliegen, können diese durch die Manipulationen, die notwendig sind, um DNA, die ein gewünschtes fremdes Epitop kodiert, in einen Vektor einzufügen, der ein Hepadnavirus-Kernantigen kodiert, bestimmt werden. Sie können die Aminosäuren sein, die das Epitop natürlicherweise flankieren. An einem oder beiden Enden des fremden Epitops können bis zu 10, z. B. bis zu 4 weitere Aminosäuren bereitgestellt sein.
Die fremde Sequenz wird in die Sequenz der HBcAg-Reste von 75 bis 85 oder der entsprechenden Reste eines anderen Hepadnavirus-Kernproteins eingefügt. Am bevorzugtesten ist es, die fremde Sequenz zwischen die HBcAg-Aminosäurereste 80 und 81 oder zwischen die entsprechenden Reste eines anderen Hepadnavirus-Kernproteins einzufügen. Alternativ kann die Sequenz der Kernproteinreste ganz oder teilweise durch die fremde Sequenz ersetzt werden. HBcAg-Aminosäurereste 75 bis 85 oder 80 und 81 oder entsprechende Reste eines anderen Hepadnavirus-Kernproteins können demnach durch die fremde Sequenz ersetzt werden. Wo eine fremde Sequenz die native Kernproteinsequenz ganz oder teilweise ersetzt, ist die eingefügte fremde Sequenz im allgemeinen nicht kürzer als die HBcAg-Sequenz, die sie ersetzt.
Es kann eine zweite fremde Aminosäuresequenz an das N-Ende oder C-Ende der Aminosäuresequenz des Kernproteins fusioniert sein. Diese zweite fremde Sequenz kann auch ein Epitop umfassen. Dieses Epitop kann mit dem Epitop, das die HBcAG- Aminosäurereste 75 bis 85 oder die entsprechenden Reste des Kernproteins eines anderen Hepadnavirus ganz oder teilweise ersetzt oder in dieses eingefügt ist (das erste Epitop), identisch oder aber von diesem verschieden sein. Als zweites Epitop kann irgendein fremdes Epitop vorhanden sein, wie es oben im Zusammenhang mit dem ersten Epitop beschreiben ist. Die Länge und der Aufbau der fremden Sequenz, die das zweite Epitop enthält, kann ebenfalls so sein, wie es im Zusammenhang mit dem ersten Epitop beschrieben ist.
Zur Herstellung des chimären Proteins wird zunächst ein Expressionsvektor konstruiert. So wird eine DNA-Sequenz, die das gewünschte chimäre Protein kodiert, bereitgestellt. Es wird ein Expressionsvektor hergestellt, der die DNA-Sequenz beinhaltet und der fähig ist, das chimäre Protein zu exprimieren, wenn er sich in einem geeigneten Wirt befindet. Es werden geeignete transkriptionale und translationale Kontrollelemente bereitgestellt, einschließlich eines Promotors für die DNA-Sequenz, einer transkriptionalen Abbruchstelle sowie translationaler Start- und Stopkodons. Die DNA-Sequenz wird im korrekten Leserahmen bereitgestellt, so daß es möglich ist, daß die Expression des Polypeptids in einem mit dem Vektor verträglichen Wirt erfolgt.
Aus einem HBcAg-Expressionsvektor, der wie oben beschrieben, eine Restriktionsstelle (a) oder zwei Restriktionsstellen (b) aufweist, kann ein geeigneter Vektor, der zur Expression des chimären Proteins fähig ist, konstruiert werden.
An der Restriktionsstelle (a) oder anstelle der DNA-Sequenz, die durch die Restriktionsstellen (b) flankiert wird, kann eine DNA-Sequenz, die die fremde Aminosäuresequenz kodiert, in den HBcAg-Expressionsvektor eingefügt werden. Der HBcAg- Expressionsvektor wird mit der geeigneten Restriktionsendonuclease (den geeigneten Restriktionsendonucleasen) verdaut und dephosphoryliert. Die DNA-Sequenz, die die fremde Sequenz kodiert, wird in den geschnittenen Expressionsvektor ligatisiert. Die eingefügte DNA-Sequenz wird typischerweise nach Standardtechniken der Oligonucleotidsynthese hergestellt.
Eine oder jede Restriktionsstelle im HBcAg-Expressionsvektor wird vorzugsweise in der HBcAg-kodierenden Sequenz so bereitgestellt, daß die HBcAg-Aminosäuresequenz nicht verändert wird. Eine Restriktionsstelle (a) kann an den HBcAg-Kodons 80 und 81 oder den entsprechenden Kodons für ein anderes Hepadnavirus-Kernprotein auftreten. Vorzugsweise ist eine Nhei-Stelle an den Kodons 80 und 81 der HBcAgkodierenden Sequenz bereitgestellt. E. coli XL-1 Blue, der Plasmid pPV-Nhe in sich birgt, das ein HBcAg- Expressionsvektor, der mit einer derartigen Nhei-Stelle versehen ist, ist, wurde bei der National Collection von Industrial and Marine Bacteria, Aberdeen, GB am 12. September 1989 mit der Hinterlegungsnummer NCIMB 40210 hinterlegt.
Eine Einführung einer neuen Restriktionsstelle kann nach einem von zwei Wegen erreicht werden. Sie kann erstens durch Ersatz eines kleinen Restriktionsfragments, das diesen Bereich kodiert, durch eine Reihe von synthetischen Oligonucleotiden, die diesen Bereich kodieren, und Einbauen der neuen Restriktionsstelle erreicht werden (siehe Beispiel 1).
Sie kann zweitens durch eine "site-directed" Mutagenese desselben kodierenden Bereichs erreicht werden. Dies kann typischerweise durch anfängliches Subklonieren eines Restriktionsfragments, das diesen Bereich darstellt, in einen Vektor wie z. B. M13mp18, der eine Einzelstrang-DNA produzieren kann, durchgeführt werden. Eine "site-directed" Mutagenese kann dann unter Verwendung von spezifischen fehlgepaarten synthetischen Oligonucleotiden nach Standardmethoden erfolgen. Ein solches mutiertes Restriktionsfragment kann dann in einem geeigneten Expressionsvektor wieder in das Elterngen zurückgebracht werden.
Die Expressionsvektoren, die das chimäre Protein kodieren, werden in einem geeigneten Wirt bereitgestellt. Dann wird das chimäre Protein exprimiert. Zellen, die den Vektor beherbergen, werden wachsengelassen/kultiviert, um so zu ermöglichen, daß die Expression abläuft. Das chimäre Protein, das exprimiert wird, fügt sich selbst zu Teilchen zusammen. Die chimären Teilchen können dann isoliert werden. Die vorliegende Erfindung stellt somit auch folgendes bereit:
- einen Wirt, der mit einem Vektor transformiert ist,
welcher eine DNA-Sequenz enthält, die chimäres Protein gemäß der Erfindung kodiert, so daß das chimäre Protein darin exprimiert werden kann;
- ein Verfahren zur Herstellung eines solchen Wirts,
welches ein Transformieren eines Wirts mit einem verträglichen Expressionsvektor, der eine DNA-Sequenz enthält, die chimäres Protein gemäß der vorliegenden Erfindung kodiert, umfaßt; und
- ein Verfahren zur Herstellung von Teilchen aus chimärem Protein gemäß der Erfindung, welches Kultivieren eines transformierten Wirts der Erfindung unter derartigen Bedingungen, daß das chimäre Protein darin exprimiert wird, und Isolierung der Teilchen, die aus dem so gebildeten chimären Protein bestehen, umfaßt.
Es kann irgendein geeignetes Wirt-Vektor-System angewendet werden. Der Vektor kann ein Plasmid sein. In diesem Fall kann ein bakterieller oder ein Hefewirt verwendet werden, z. B. E. coli oder S. cerevisiae. Alternativ kann der Vektor ein viraler Vektor sein. Dieser kann verwendet werden, um Zellen einer Säugetierzellinie wie z. B. Eierstockzellen eines chinesischen Hamsters (CHO), einer Transfektion zu unterziehen, um eine Polypeptidexpression zu bewirken.
Das chimäre Protein kann als Impfstoff für Mensch oder Tier eingesetzt werden. Es kann in irgendeiner geeigneten Weise verabreicht werden. Die Wahl ob ein oraler Weg oder ein parenteraler Weg wie z. B. subkutane, intravenöse oder intramuskuläre Verabreichung erfolgt, sowie die Wahl der Dosis hängen vom Zweck der Impfung ab, und davon, ob ein Mensch oder ein Säugetier geimpft werden. Ähnliche Kriterien bestimmen den physiologisch akzeptablen Träger oder das physiologisch akzeptable Verdünnungsmittel, der (das) bei der Impfstoffherstellung verwendet wird. Es können übliche Formulierungen, Träger oder Verdünnungsmittel eingesetzt werden. Typischerweise wird das Fusionsprotein allerdings in einer Menge von 1 bis 1000 ug pro Dosis, bevorzugter 10 bis 100 ug pro Dosis entweder auf oralem oder parenteralem Wege verabreicht.
Die folgenden Beispiele erläutern die Erfindung.
Fig. 1 zeigt Plasmid pBc404. B, E und P bezeichnen Restriktionsstellen für BamHI, EcoRI bzw. PstI; tac bezeichnet den tac-Promotor; ori bezeichnet den Ursprung der Replikation; bla bezeichnet β-Lactamase und SD bezeichnet die Shine-Dalgarno-Sequenz.
Fig. 2 zeigt die Konstruktion von Plasmid pPV-Nhe.

REFERENZBEISPIEL:

Herstellung von HBcAg, das an seinem N- Ende mit einer kurzen Verlängerung versehen ist, die PV1 Mahoney VPL-Reste 95 bis 104 enthält.
Aus dem Elternplasmid pbc404, das in Fig. 1 dargestellt ist, wurde ein Expressionsplasmid pPV404 hergestellt. E. coli Jmlol, das pbc404 in sich birgt, war am National Collection of Industrial and Marine Bacteria, Aberdeen, BG am 9. Februar 1989 unter der Hinterlegungsnummer NCIMB 40111 hinterlegt worden. Synthetische Oligonucleotide, die die Aminosäuren 95 bis 104 von VP1 aus PV1 Mahoney darstellen, wurden unter Verwendung von T4-Ligase nach Standardverfahren in pBC404 ligatisiert. Dies führte zu pPV404. Die synthetischen Oligonucleotide, wie sie sich zusammenlagern, und die kodierende Sequenz der N-terminalen Verlängerungen waren wie folgt: KERN LINKER POLIOVIRUS

BEISPIEL 1: Herstellung von Plasmid pPV-Nhe

Es wurde eine Reihe von Peptiden mit einer Länge von 20 Aminosäuren chemisch synthetisiert. Diese Peptide überlappten einander in 10 Aminosäuren und stellten zusammen die gesamte Aminosäuresequenz des Kernproteins von Hepatitis B-Virus und Serotyp dar. Jedes dieser Peptide in Carbonatbeschichtungspuffer wurde verwendet, um Mikrotiterplatten zu bedecken und wurde mit Seren aus Meerschweinchen in einer Enzym-gekoppelten Immunadsorbensassay-Analyse (ELISA) verwendet. Die Meerschweinchen waren mit bakteriell exprimierten Hepatitis B-Kernteilchen geimpft worden.
Eines der Peptide, das den Aminosäuren 71 bis 90 entsprach, ergab eine extrem kräftige Reaktion. Dies zeigte, daß Kernteilchen in vivo Antikörperbildung ausgelöst hatten, welche mit der linearen Peptidsequenz reagierten. Die Sequenz entsprach grob dem angegebenen HBel-Epitop von Hepatitis B- Kernteilchen (Williams und LeBouvier, Bibilotheca Haematologica 42, 71-75, 1976). Unsere Resultate legten nahe, daß der Ersatz dieses immundominanten Bereichs von HBcAg durch ein fremdes Epitop oder das Einfügen eines fremden Epitops in diesen immundominanten Bereich von HBcAg zu einem chimären Protein führen kann, das in Bezug auf das fremde Epitop verstärkte Immunogenität zeigte. Wir führten daher die Einfügung fremder Sequenzen in die adw-Kernsequenz durch.
Die Strategie, die wir verfolgten, ist in Fig. 2 dargestellt. Das Ausgangsplasmid war Plasmid pPV404. Dieses Plasmid exprimiert in Bakterien große Mengen an chimären Teilchen, welche bei Tieren hoch immunogen sind. Die Strategie beinhaltete die Einführung einer einzigen NheI- Restriktionsstelle an den Aminosäure-Positionen 80-81 in Kerngen. Dies führt zu keiner Aminosäureänderung im Kernprotein. Die Art der Mutation ist unten gezeigt:
Aminosäure L E D P A S R D L
adw TTG GAA GAT CCA GCA TCC AGG GAT CTA
adw-NheI TTG GAA GAT CCA GCT AGC AGG GAT CTA Nhel Zunächst wurde Plasmid pPV404 mit Restriktionsenzymen XbaI und AccIII verdaut, was zu zwei Fragmenten mit 3,96 kbp und 340 bp führte. Diese Fragmente wurden durch Elektrophorese auf Agarose mit niedrigem Schmelzpunkt aufgetrennt und herausgeschnitten; das kleinere Fragment wurde dann mit XhoII weiter verdaut, was zu 3 Fragmenten führten, wie in Fig. 2 gezeigt ist.
Gleichzeitig wurden zwei Oligonucleotide mit Sequenzen, wie sie in Fig. 2 gezeigt sind, synthetisiert. Diese Oligonucleotide wurden nach Standardverfahren miteinander gepaart und phosphoryliert, so daß sie eine Linker-Sequenz mit XhoII-kompatiblen versetzten Enden und einer inneren Nhei-Stelle darstellten. Diese Oligonucleotide wurden dann mit Hilfe von Standardverfahren in das 340-bp-Fragment ligatisiert, wo sie das natürliche 19-bp-XhoII-Fragment ersetzten. Dieses ligatisierte Material wurde dann wieder in das große 3,96-kbp-Fragment ligatisiert und mit Standardverfahren in E. coli, Stamm XL-1 Blue, transformiert.
Das Muster dieser Strategie schließt nicht aus, daß sich das natürliche 19-bp-XhoII-Fragment wieder selbst in den Vektor eingefügen kann. Zur Auswahl von Bakterien, die Plasmide, die die neue Nhei-Stelle enthalten, beherbergen, wurde eine Kultur aus allen rekombinanten Klonen, die während der Transformation erzeugt wurden, hergestellt. Diese Kultur wurde dann verwendet, um Plasmid-DNA, die die gesamte "Bank" von Kolonien repräsentiert, zu extrahieren. Nach einer Caesiumchlorid-Reinigung wurde diese DNA mit NheI verdaut.
Nur die rekombinanten Plasmiden, die den neuen Linker tragen, würden auf diesem Weg verdaut werden, was zu einer Linearisierung dieser Population führt. Daher wurde lineare DNA aus dem Rest der unverdauten Plasmidmoleküle durch Agarosegel-Elektrophorese gereinigt und nach erneuter Ligation zurück in E. coli transformiert, um so einen Pool von Nhei-positiven Tranformanten zu erzeugen. Einzelne Klone wurden durch Restriktionskartieren analysiert. Jene Klone, bei denen festgestellt wurde, daß sie eine Nhei-Stelle eingefügt enthielten, wurden durch DNA-Sequenzierung weiter charakterisiert. Die Restriktionskarte eines der resultierenden pPV-Nhe-Klone, das die korrekte Sequenz besaß, ist in Fig. 2 dargestellt.
Wie bereits vorher festgestellt, bestätigte die Durchführung des Experiments die Beibehaltung der korrekten HBcAg- Aminosäuresequenz. Es war daher nicht überraschend, daß eine Expressionsanalyse nach Induktion mit Isopropyl-beta-D- thiogalactopyranosid (IPTG) das Vorliegen einer hohen Ausbeute an PV-HBcAg-Teilchen bestätigte.

BEISPIEL 2: HERSTELLUNG VON PARTIKEL, DIE AUS CHIMÄRISCHEM HBcAg- PROTEINEN BESTEHEN

Die Fähigkeit von pPV-Nhe, heterologe Sequenzen zu exprimieren, wurde ursprünglich durch Einfügung von Epitopen aus humanem Rhinovirus Typ 2 (HRV2) und Hepatitis B- Oberflächenantigen (HBsAg) beurteilt. Dies wurde durch Einfügen von synthetischen Oligonucleotiden, die jede Sequenz, die von den kohäsiven Enden von NheI flankiert wird, kodieren, in Nhel von verdautem und dephosphoryliertem pPV- Nhe erreicht. Die an der NheI-Stelle von pPV-Nhe eingefügten Sequenzen sind nachfolgend dargestellt: Epitop
Plasmide, die mit den synthetischen Oligonucleotiden ligatisiert waren, wurden in E. coli, Stamm XL-1 Blue, transformiert. Jedes neue Konstrukt wurde so geplant, daß eine diagnostische innere Restriktionsstelle vorhanden war, die ein schnelles Durchmustern der resultierenden Klone erlaubte. Die inneren Restriktionsstellen waren MluI für HRV2 und Sphi für HBsAg. Resultierende Klone, die richtige Restriktionsstellen enthielten, wurden in Nährbrühe in hoher Dichte kultiviert, und eine Expression chimärer Proteine wurde durch Zusatz von IPTG zu dem Medium induziert. Nach anschließendem Inkubieren für 6 bis 8 Stunden bei 37ºC wurden die Bakterienzellen durch Zentrifugieren gesammelt, nach Standardverfahren lysiert und exprimierte Proteine wurden durch PAGE, Western-Blotting und ELISA analysiert. Das Vorliegen von Teilchenstrukturen wurde durch Zentrifugieren mit Saccharose-Dichtegradient bestimmt.
Die Expression von chimären Proteinen, die entweder das HRV2- Epitop oder das HBsAg enthielten, wurde beobachtet. Die chimären Proteine fügten sich selbst zu Teilchen zusammen.
Eine detaillierte Expressionsanalyse am HRV2-Epitopaufbau mittels Western-Blotting zeigte, daß die Expressionsspiegel in Bakterien sehr hoch waren, daß die Teilchenformation beibehalten wurde und daß das chimäre Protein mit Anti-HRV2- Seren reagierte. Eine ELISA-Analyse zeigte außerdem, daß das HRV2-Epitop an der Teilchenoberfläche exponiert war.

BEISPIEL 3: HERSTELLUNG VON WEITEREN PARTIKULÄREN CHIMÄREN HBcAg-PROTEINEN

Es wurden weitere Epitope in pPV-Nhe eingefügt. Synthetische Oligonucleotide wurden miteinander ligatisiert, um ein DNA- Fragment herzustellen, das das Epitop kodierte und kohäsive Nhei-Enden hatte. Das DNA-Fragment wurde in NheI- aufgeschlossenes und dephosphoryliertes pPV-Nhe-eingefügt. Plasmide, die mit dem DNA-Fragment ligatisiert waren, wurden in E. coli, Stamm XL-1 Blue transformiert.
In Nährbrühe wurden Klone in hoher Dichte kultiviert und eine Expression von chimärem Protein durch Zusatz von IPTG zu dem Medium induziert. Nach anschließendem Inkubieren für 6 bis 8 Stunden bei 37ºC wurden die bakteriellen Zellen durch Zentrifugieren gesammelt, nach Standardverfahren lysiert und exprimierte Proteine durch PAGE, Western-Blotting und/oder ELISA analysiert. Das Vorliegen von Teilchenstrukturen wurden durch Zentrifugieren von Saccharose-Dichtegradient bestimmt.
Auf diesem Weg wurden chimäre Proteine, die die folgenden Epitope darstellen, erhalten. In jedem Fall wurde das Epitop aufgrund des Klonierungsverfahrens von A-S-Resten flankiert.
1. QE1-Aminosäurereste 15 bis 47 aus der PreSl-Region des Hepatitis B-Virus (HBV). Diese Region ist an Virus-Zell- Wechselwirkungen beteiligt. Die Sequenz wurde aus dem adw-Serotyp abgeleitet. (a) Synthetische Oligonucleotide (b) Kodierende Sequenz
2. QM2-133-144 aus der Pre-S2-Region von HBV. Diese Region ist ein folgendes Epitop in HBV und kann Schimpansen vor einer Infektion schützen. Die Sequenz wurde aus dem adw- Serotyp abgeleitet. (a) Synthetische Oligonucleotide (b) Kodierende Sequenz
3. QEl-120-153 aus der Pre-S2-Region von HBV. Dies ist eine größere Version von 2. Die Sequenz wurde von dem adw- Serotyp abgeleitet. (a) Synthetische Oligonucleotide (b) Kodierende Sequenz
4. pPDI-110-148, ein Couplex-Epitop aus HBsAg. (a) Synthetische Oligonucleotide (b) Kodierende Sequenz
5. pPAI-VPI 101-110 HAV (Hepatitis A-Virus) (a) Synthetische Oligonucleotide (b) Kodierende Sequenz (a) Synthetische Oligonucleotide (b) Kodierende Sequenz
7. pPA3-VP3 61-83 HAV (a) Synthetische Oligonucleotide (b) Kodierende Sequenz
8. pPA4-VPI 160-182 HAV (a) Synthetische Oligonucleotide (b) Kodierende Sequenz
9. pPAS-VP2 40-60 HAV (a) Synthetische Oligonucleotide (b) Kodierende Sequenz
(b) Kodierende Sequenz
10. Aminosäuren 735-752 aus gp4l von HIV-1. Dies ist ein starkes neutralisierendes Epitop für HIV. (a) Synthetische Oligonucleotide (b) Kodierende Sequenz
11. Epitop aus Katzenleukämie-Virus 9p70 (197-219), beteiligt an der Induktion von neutralisierenden Antikörpern. (a) Synthetische Oligonucleotide (b) Kodierende Sequenz

BEISPIEL 4: HERSTELLUNG VON CHIMÄREM PROTEIN MIT EINEM HRV2-EPITOP AM AMINOENDE, DAS ZWISCHEN DIE HBcAg-RESTE 80 UND 81 LIGATISIERT IST

Oligonucleotide, die das HRV2-VP2-Epitop kodieren, das in Beispiel 2 gezeigt ist, wurden in den pPV-Nhe-Vektor eingefügt, wie dies in jenem Beispiel spezifiziert ist. Der rekombinante Vektor wurde mit EcoRI und BamHI verdaut. Mittels Elektrophorese auf Agarosegel mit niedrigem Schmelzpunkt wurde eine Bande von annähernd 4,4 kb gereinigt. Synthetische Oligonucleotide, die die Aminosäuren 156 bis 170 von VP2 aus HRV2 darstellen, wurden mit Standardverfahren unter Verwendung von T4-Ligase in den rekombinanten Vektor ligatisiert. Die synthetischen Oligonucleotide, wie sie sich paaren, und die kodierende Sequenz der N-terminalen Verlängerung waren wie folgt:
1. AATTCAGTTAAAGCGGAAACGCGTTTG
2. AACCCAGATCTGCAACCGACCGAATGCCGG
3. GATCCCGGCATTCGGTCGGTTGCA
Das resultierende Plasmid wurde in E. coli Stamm XL-1 Blue transformiert. Klone wurden mit hoher Dichte in Nährbrühe kultiviert. Eine Expression von chimärem Protein wurde, wie in Beispiel 2 beschrieben, erreicht. Exprimierte Proteine wurden durch PAGE, Western-Blotting und ELISA analysiert. Das Vorliegen von Teilchenstrukturen wurde durch Zentrifugieren mit Saccharose-Dichtegradient bestimmt.

BEISPIEL 4: TIERVERSUCHE

IMMUNISIERUNGSPROTOKOLL

Weibliche Dunkin-Hartley-Meerschweinchen mit einem Gewicht von etwa 400 g wurden jeweils intramuskulär mit einer 0,5-ml- Dosis einer Präparation von chimärem HBcAg-Protein, das in unvollständigem Freund's Adjuvanz (IFA) formuliert war, geimpft. Gruppen aus vier Tieren wurden mit einer spezifizierten Dosis gereinigter Kernteilchen geimpft; und Booster-Impfungen erfolgten einmal entweder nach 56 oder 70 Tagen mit derselben ursprünglichen Dosis. Während des Experiments wurden in 14-tägigen Intervallen Blutproben entnommen.

ELISA

Antipeptid-, Antivirus- und Antiteilchen-Aktivität wurde durch eine Modifikation eines indirekten oder doppelten Antikörper-Sandwich-ELISA-Verfahrens in Serumproben gemessen. Im Sandwich-ELISA wurde polyklonales Antipeptidserum (1:200) verwendet, um Reihenverdünnungen von Teilchen in PBS und 2 % trockenem Milchpulver zu erhalten. Beim indirekten ELISA wurden 2 u/ml Peptid, Teilchen oder Virus direkt auf Mikrotiterplatten aufgetragen. In jedem Fall wurden die Platten gewaschen und mit Testserumproben inkubiert. Im Anschluß an eine 1- bis 2-stündige Inkubation bei 37ºC wurden die Platten erneut gewaschen, und Anti-IgG-Peroxidase wurde zugesetzt. Nach einer weiteren Stunde bei 37ºC wurden die Platten gewaschen und ein Enzymsubstrat (0,04 % o- Phenylendiamin und 0,004 % Wasserstoffperoxid in 0,1 M Phosphat- 0,05 M Citratpuffer) zugesetzt. Die resultierende Farbentwicklung wurde mit Schwefelsäure gestoppt und die A492 wurde in einem Titertek Multiskan (Handelsname: Flow Labs) gemessen.
Die A492-Werte, die mit Verdünnungen von Nach- Inokulationsproben erhalten wurden, wurden gegen den dekadischen Logarithmus der reziproken Antiserumverdünnung aufgetragen, dann wurde der Antikörpertiter unter Bezug auf einen negativen Standard (eine 1:10-Verdünnung eines Vor- Inkulationsserums) errechnet.

RESULTATE

1. Meerschweinchen wurden intramuskulär mit 20 ug oder 2 ug Teilchens die in Beispiel 3.1 erhalten wurden und aus chimärem PreS1-HBcAg-Protein bestanden, geimpft. In regelmäßigen Intervallen wurde Blut entnommen. In jedem Fall wurden ein Peptid, das aus dem PreS1-Insert im chimären HBcAg-Protein (392) bestand, HBcAg ohne Insert (Kontrolle) und Presl-HBcAg-Teilchen auf Platten für den Enzym-gekoppelten Immunadsorbentassay (ELISA) aufgetragen und dann gegen Verdünnungen der gesammelten Antisera analysiert. Die Resultate sind in Tabelle 1 aufgeführt. Es wurden hohe Spiegel an Antipeptid, Anti-HBcAg- und Anti-PreS1-HBcAg-Teilchen-Antikörper erreicht.
2. Das Verfahren war dasselbe wie in 1., außer:
- Meerschweinchen wurden mit Teilchen, die in Beispiel 1 erhalten worden waren und die aus einem chimären HBcAg-Protein mit kleinem PreS2-Epitop bestanden, geimpft;
- ein Peptid, das aus der PreS2-Insert (393) bestand, HBcAg, PreS2-HBcAg-Teilchen und von Hefe abgeleitete HBsAg-Teilchen mit eingebauten PreS2-Epitopen wurden auf ELISA-Platten aufgetragen.
Die Resultate sind in Tabelle 2 angegeben. In den Meerschweinchen wurden wieder sehr hohe Spiegel an Antikörper induziert.
3. Die Immunantworten, die durch Teilchen, die aus einem erfindungsgemäßen chimären HBcAg-Protein, in das ein HRV2 VP-Epitop eingefügt ist, bestanden ("Insert", Beispiel 2) und von Teilchen, die aus einem chimären HBcAg-Protein, in dem dasselbe HRV2 VP2-Epitop mit dem Aminoende von HBcAg ("terminal") fusioniert war, bestanden, bei Meerschweinchen und Kaninchen induziert wurden, wurden verglichen. Das "terminale" chimäre HBcAg-Protein war in Übereinstimmung mit dem Verfahren, das in der JP-A- 196299/88 beschrieben ist, hergestellt worden. Die Resultate sind in den Tabellen 3 und 4 dargestellt und sind ELISA-Endpunkt-Titer (log&sub1;&sub0;). Die ELISA-Platten wurden jeweils mit einem Peptid, das aus dem HRV2 VP2- Emitop oder HBV bestand, beschichtet. Das "insert" chimäre HBcAg-Protein ergab überragende Resultate: höherer Anti-HRV-Peptid-Titer und niedrigerer Anti-HBV- Titer.
4. Es wurden die neutralisierenden Antikörperreaktionen bei den oben beschrieben Meerschweinchen und Kaninchen von 3. betrachtet. Die Reaktionen der Tiere auf zwei Inokulationen der "Insert" Teilchen wurden besonders untersucht. Die Resultate sind in Tabelle 5 dargestellt.
5. Kaninchen und Meerschweinchen wurden intramuskulär mit Teilchen, die aus dem chimären HBsAg-139-147-Epitop- HBcAg-Protein von Beispiel 2 bestanden, geimpft. Es wurden die Antipeptid 139-147 (αpep448) und Anti-HBsAg (αHBsAg)-Reaktionen unter Verwendung von drei Teilchendosen bestimmt. Die Ergebnisse sind in Tabelle 6 gezeigt. Die angegebenen Daten zeigen Titer (log&sub1;&sub0;) vor einer ersten Booster-Impfung nach 42 Tagen und am letzten Tag der Blutentnahme, am 98. Tag. Hinsichtlich der Anti- HBsAg-Aktivität wurden gute Antikörperspiegel bei den letzten Blutentnahmen bei Kaninchen und insbesondere bei Meerschweinchen beobachtet. TABELLE 1 Gruppe ELISA-Endpunkt-Titer log&sub1;&sub0; * Mittel einer Individuengruppe TABELLE 2 REAKTION VON MEERSCHWEINCHEN AUF preS2 (QM2/PE3)-KERNE (kleines Epitop) a) 20ug-Dosis Tage nach der ersten Inokulation Testantigen Peptid QM2 Kerne a) 20ug-Dosis Arzneimittel nach der ersten Inokulation Testantigen Peptid QM2 Kerne * log&sub1;&sub0;-Endpunkt-Titer ** Inokulationen TABELLE 3 IMMUNOGENITÄTSVERGLEICH FÜR HBcAg/HRV-PEPTID-FUSIONSPROTEINPARTIKEL MIT "INSERT" UND "TERMINAL" EPITOP BEI MEERSCHWEINCHEN (a) Anti-HRV-Peptid Peptiddosis (ug) Tage nach dem Mal Tage nach Booster-Injektion insert terminal Anti-HRV * ELISA-Endpunkt-Titer (log&sub1;&sub0;) TABELLE 4 IMMUNOGENITÄTSVERGLEICH FÜR HBcAg/HRV-PEPTID-FUSIONSPROTEINPARTIKEL MIT "INSERT" UND "TERMINAL" EPITOP (a) Anti-HRV-Peptid Peptiddosis (ug) Tage nach dem Mal Tage nach Booster-Injektion insert terminal Anti-HRV N.D. = nicht bestimmt * ELISA-Endpunkt-Titer (log&sub1;&sub0;) TABELLE 5 (a) Meerschweinchen (b) Kaninchen Neutralisationstiter Peptiddosis (ug) 90 % Plaquereduzierung TABELLE 6 Inok. chimäres HBsAG 139-147 HBcAG-Protein Kaninchen Meerschweinchen

Claims

1. Teilchen bestehend aus chimärischem Hepadnavirus- Kernantigenprotein, das eine fremde Aminosäuresequenz hat, welche ein Epitop hat, das in die Aminosäuresequenz zwischen Rest 75 und Rest 85 für den Fall, daß das Kernantigen Hepatitis B-Kernantigen (HBcAg) ist, oder in die entsprechende Aminosäuresequenz für den Fall, daß das Kernantigen von einem anderen Hepadnavirus ist, eingefügt ist oder diese ganz oder teilweise ersetzt.

2. Teilchen nach Anspruch 1, in denen die fremde Aminosäuresequenz eine Länge von bis zu 40 Aminosäureresten hat.

3. Teilchen nach Anspruch 2, in denen die fremde Aminosäuresequenz eine Länge von bis zu 20 Aminosäureresten hat.

4. Teilchen nach einem der vorangehenden Ansprüche, in denen die fremde Aminosäuresequenz zwischen die HBcAg- Reste 80 und 81 oder zwischen die entsprechenden Reste des Kernproteins eines anderen Hepadnavirus eingefügt ist.

5. Teilchen nach einem der vorangehenden Ansprüche, in denen das Epitop das Epitop eines Krankheitserregers ist.

6. Teilchen nach Anspruch 5, in denen das Epitop ein Epitop des Hepatitis A-Virus, Hepatitis B-Virus, Influenza- Virus, Virus der Maul- und Klauenseuche, Poliovirus, Herpes simplex-Virus, Tollwutvirus, Katzenleukämie- Virus, humanen Immundefizienzvirus Typ 1 oder 2, Affen- Immundefizienzvirus, humanen Rhinovirus, Dengue-Virus oder Gelbfiebervirus ist.

7. Teilchen nach einem der vorangehenden Ansprüche, in denen eine zweite fremde Aminosäuresequenz an das N-Ende der Aminosäuresequenz des Kernproteins kondensiert ist.

8. Vektor, der eine DNA-Sequenz enthält, die ein chimärisches Protein wie es in einem der vorangehenden Ansprüche spezifiziert ist, kodiert und der, wenn er in einem geeigneten Wirt bereitgestellt wird, das chimärische Protein exprimiert.

9. Wirt, der mit einem Vektor gemäß Anspruch 8 transformiert ist, so daß das chimärische Protein darin exprimiert werden kann.

10. Verfahren zur Herstellung von Teilchen, wie sie in einem der Ansprüche 1 bis 7 beansprucht sind; wobei das Verfahren Kultivieren eines Wirts nach Anspruch 9 unter solchen Bedingungen, daß das chimärische Protein darin exprimiert wird, und Isolieren von Teilchen, die aus dem auf diese Weise gebildeten chimärischen Protein bestehen, umfaßt.

11. Verfahren zur Herstellung eines Wirts nach Anspruch 9,

wobei das Verfahren ein Transformieren eines Wirts mit einem verträglichen Expressionsvektor nach Anspruch 8 umfaßt.

12. Expressionsvektor, der eine DNA-Sequenz enthält, welche ein Hepadnavirus-Kernantigen kodiert und (a) eine Restriktionsstelle innerhalb der Sequenz, die die HBcAg- Aminosäurereste 75 bis 85 oder die entsprechende Sequenz des Kernproteins eines anderen Hepadnavirus kodiert, oder (b) zwei Restriktionsstellen hat, die diese Sequenz oder einen Teil dieser Sequenz flankieren.

13. Vektor nach Anspruch 12, in dem die Restriktionsstelle (a) an den HBcAg-Kodons 80 und 81 oder an den entsprechenden Kernprotein-Kodons eines anderen Hepadnavirus auftritt.

14. Vektor nach Anspruch 12, der pPV-Nhe (wie in der Hinterlegung NCJMB 40210 verborgen) ist.

15. Verfahren zur Herstellung eines Vektors, wie er in Anspruch 8 beansprucht ist, wobei das Verfahren

(i) Aufschließen eines Expressionsvektors, wie er in einem der Ansprüche 12 bis 14 beansprucht ist, mit der geeigneten Restriktions-Endonuclease (geeigneten Endonucleasen) derart, daß der Vektor an Restriktionsstelle (a) oder Restriktionsstelle (b) geschnitten wird;

(ii) Dephosphorylierung des aufgeschlossenen Vektors; (iii) Binden einer DNA-Sequenz, die eine fremde Aminosäuresequenz, welche ein Epitop enthält, kodiert, an den Vektor.

16. Pharmazeutische oder tiermedizinische Formulierung, die einen pharmazeutisch oder tiermedizinisch akzeptablen Trägerstoff oder ein pharmazeutisch oder tiermedizinisch akzeptables Verdünnungsmittel und als aktives Ingrediens Teilchen, wie sie in einem der Ansprüche 1 bis 7 beansprucht sind, enthält.