DE3852105T2 - Verfahren zur herstellung von aprotinin und aprotinin-homologen in hefe. - Google Patents
Verfahren zur herstellung von aprotinin und aprotinin-homologen in hefe.Info
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Description
- Die vorliegende Erfindung betrifft ein Verfahren zur Herstellung von Aprotinin und Homologen desselben in Hefe, synthetische Gene, die solche Produkte kodieren, Expressionsvektoren und transformierte Hefezellen.
- Aprotinin (Rinderpankreas-Trypsininhibitor, BPTI) ist ein Polypeptid, das von verschiedenen Rinderorganen und -geweben, wie etwa Lymphknoten, Pankreas, Lunge, Ohrspeicheldrüse, Milz und Leber, sekretiert wird. Es ist ein einzelkettiges Polypeptid, das aus 58 Aminosäureresten besteht, vernetzt durch drei Disulfidbrücken, mit der folgenden Sequenz:
- Die drei Disulfidbrücken sind angeordnet zwischen Cys(5)- Cys(55), Cys(14)-Cys(38) bzw. Cys(30)-Cys(51).
- Aprotinin wird für die Behandlung von akuter Pankreatitis, verschiedener Schocksyndrom-Zuständen hyperfibrinolytischer Blutung und Myocardinfarzierung eingesetzt. Die Applikation von Aprotinin in hohen Dosen verringert den Blutverlust in Verbindung mit Herzchirurgie signifikant.
- Aprotinin kann aus verschiedenen Rinderorganen oder -geweben extrahiert werden, wie etwa Lunge, Pankreas und Ohrspeicheldrüsen. In der vorliegenden Beschreibung wird das so erhaltene Aprotinin als natives Aprotinin bezeichnet. Extraktion aus tierischen Geweben ist ein mühsames Verfahren und erfordert große Mengen des Rinderorgans oder -gewebes. Ein weit bequemeres Verfahren zur kommerziellen Produktion wäre ein Fermentationsverfahren, bei dem ein Gen, das für Aprotinin kodiert, in einen geeigneten Mikroorganismus mittels rekombinanter DNA- Techniken eingebaut und der Mikroorganismus in einem geeigneten Nährstoffmedium kultiviert wird, um das gewünschte Produkt zu produzieren, das er in das Medium in reifer Form sekretiert.
- Ein Gen für Aprotinin ist an die Kodierungssequenz für das Signalpeptid der alkalischen Phosphatase von E. coli gebunden und in E. coli unter der Kontrolle des Promotors der alkalischen Phosphatase exprimiert worden (Mark, C.B. et al., The Journal of Biological Chemistry 261 (1986) 7115-7118). Ein synthetisches Gen, das die Proteinsequenz von Met-Aprotinin kodiert, ist ebenfalls in einem E. coli-Expressionsvektor kloniert worden (von Wilcken-Bermann, B. et al., The EMBO Journal 5 (1986) 3219-3225). Die Produktion von Aprotinin und Aprotinin-Homologen ist auch in der veröffentlichten Europäischen Patentschrift Nr. 238,993 und in der Britischen Patentanmeldung Nr. 2,188,933 beschrieben.
- Ein Problem bei der Produktion von kleinen fremden Proteinen in E. coli ist jedoch die Tatsache, daß solche Proteine leicht von den Wirts-Proteasen abgebaut werden können. Auch der Aufbau korrekter Disulfidbrücken und korrekter Faltung können ein Problem in E. coli sein.
- Es ist gezeigt worden, daß Hefen in der Lage sind, kleine Proteine mit etwa derselben Größe wie Aprotinin zu exprimieren und zu reifen. In der EP-Patentanmeldung Nr. 0 163 529 A ist die Produktion von Insulin-Vorläufern mit korrekt angeordneten Disulfidbrücken beschrieben und in der EP-Patentanmeldung Nr. 0 189 998 A ist die Produktion von Glucagon, einem einzelkettigen Polypeptid mit 29 Aminosäureresten, beschrieben.
- Mit diesen Verfahren wird in Hefe ein Primärprodukt exprimiert, das aus dem gewünschten Protein besteht, das mit einem Hefe-Leaderpeptid verknüpft ist. Während der Sekretion wird das Primärprodukt mittels des Kex2-Enzyms verarbeitet (Julius, D. et al., Cell 32 (1983) 839-852) und das verarbeitete Produkt, das auch als das reife oder gereifte Produkt bezeichnet wird, wird dann in das Medium sekretiert. Die Verarbeitung des exprimierten Primärproduktes tritt an einem Paar basischer Aminosäuren (Lys-Arg) am N-terminalen Ende des reifen Produktes auf.
- Im Falle von Aprotinin, das eine basische Aminosäure (Arg) als die N-terminale Aminosäure besitzt, könnten Probleme auftreten, wenn die Kex2-Verarbeitungsstelle Lys-Arg vor dem ersten Arg-Rest der Aprotininsequenz inseriert ist, da eine "dreifach basische" Spaltungsstelle im exprimierten Fusionsprodukt vorhanden wäre. Auch könnte das Paar basischer Aminosäuren im Aprotininmolekül (Lys (41)-Arg (42)) eine potentielle Spaltungsstelle für das Kex2-Enzym in den Hefezellen sein.
- Es ist das Ziel der vorliegenden Erfindung, ein Verfahren zur Herstellung von Aprotinin oder Homologen desselben in Hefe zur Verfügung zu stellen, durch das hohe Mengen an korrekt gefaltetem und gereiftem Protein in das Medium sekretiert werden.
- Die Erfindung beruht auf der überraschenden Entdeckung, daß Aprotinin und bestimmte Homologe desselben in hohen Ausbeuten mit korrekt angeordneten Disulfidbrücken durch Kultivierung eines Hefestammes produziert werden können, der mit einer DNA- Sequenz transformiert ist, die solche Produkte kodiert.
- Gemäß einem ersten Aspekt der vorliegenden Erfindung wird ein Verfahren zur Produktion hoher Ausbeuten von Aprotinin oder Homologen desselben in Hefe durch Kultivierung eines Hefestammes zur Verfügung gestellt, der einen replizierbaren Expressionsvektor enthält, der ein synthetisches Gen enthält, das Aprotinin oder Homologe desselben kodiert, gebunden an eine DNA-Sequenz, die ein Signal- und Leaderpeptid kodiert, das für die Sekretion des Aprotinins oder Aprotinin-Homologs sorgt, in einem geeigneten Nährstoffmedium, gefolgt von der Gewinnung des Aprotinins oder Aprotinin-Homologs aus dem Kulturmedium.
- Gemäß einem zweiten Aspekt der vorliegenden Erfindung wird ein replizierbarer Expressionsvektor zur Verfügung gestellt, der eine DNA-Sequenz umfaßt, die Aprotinin oder ein Aprotinin-Homolog kodiert, gebunden an eine DNA-Sequenz, die ein Signal- und Leaderpeptid kodiert, das für die Sekretion des Aprotinins oder Aprotinin-Homologs sorgt, der die Expression des Aprotinins oder seines Homologs in Hefe ermöglicht.
- Gemäß einem dritten Aspekt der vorliegenden Erfindung wird ein Hefestamm zur Verfügung gestellt, der mit diesem replizierbaren Expressionsvektor transformiert ist.
- Die mit der vorliegenden Erfindung hergestellten Aprotinine können charakterisiert werden durch die folgende Formel (I)
- X-Aprotinin(3-40)-Y-Z-Aprotinin(43-58) (I),
- in der X Arg-Pro, Pro oder Wasserstoff bedeutet, Aprotinin(3- 40) die Aminosäuresequenz von Aminosäurerest 3 bis 40 in nativem Aprotinin bedeutet, Y Lys ist, Z Arg oder Ser sein kann und Aprotinin(43-58) die Aminosäuresequenz von Aminosäurerest 43 bis 58 in nativem Aprotinin bedeutet.
- Die vorliegende Erfindung wird weiter durch Bezugnahme auf die beiliegenden Zeichnungen veranschaulicht werden, in denen:
- Fig. 1 ein synthetisches Gen zeigt, das Aprotinin(3- 58) kodiert;
- Fig. 2 die Konstruktion der Plasmide pKFN374 und pKFN375 veranschaulicht;
- Fig. 3 die Konstruktion von Plasmid pMT 636 veranschaulicht;
- Fig. 4 ein synthetisches Gen darstellt, das Aprotinin(3-58,42 Ser) kodiert;
- Fig. 5 die Konstruktion der Plasmide pKFN414 und pKFN416 veranschaulicht;
- Fig. 6 ein synthetisches Gen darstellt, das Aprotinin(1-58) kodiert; und
- Fig. 7 ein synthetisches Gen darstellt, das Aprotinin(1-58,42 Ser) kodiert.
- Für Sekretionszwecke wird die DNA-Sequenz, die das gewünschte Aprotinin oder Aprotinin-Homolog kodiert, an eine DNA-Sequenz gebunden, die eine Signal- und Leaderpeptid-Sequenz kodiert. Die Signal- und Leaderpeptide werden von dem transformierten Mikroorganismus während der Sekretion des exprimierten Proteinproduktes aus den Zellen abgespalten, was ein einfacheres Isolationsverfahren des gewünschten Produktes gewährleistet. Ein gut geeignetes Leaderpeptid-System für Hefe ist die Hefe- MFα1-Leadersequenz oder ein Teil derselben (Kurjan, J. und Herskowitz, I., Cell 30 (1982) 933-943) oder ein Leader, der in der Dänischen Patentanmeldung Nr. 4638/87 beschrieben ist. Jede Signal- oder Leadersequenz, die für Sekretion in Hefe sorgt, kann jedoch eingesetzt werden und es ist nicht daran gedacht, die vorliegende Erfindung auf ein spezifisches Sekretionssystem zu beschränken.
- Für Expressionszwecke ist flußaufwärts der DNA-Sequenz für das gewünschte Proteinprodukt eine Promotorsequenz angeordnet. Vorzugsweise wird ein Promotor aus einem Gen verwendet, das dem Hefe-Wirtsorganismus eigen ist, z. B. der Promotor des TPI(Triosephosphat-Isomerase)-Gens. Der DNA-Sequenz für das gewünschte Produkt wird eine Transkriptionsterminatorsequenz folgen, vorzugsweise eine Terminatorsequenz aus einem Gen, das dem Wirtshefeorganismus eigen ist, z. B. der Terminator des TPI-Gens oder des MFα1-Gens.
- Die DNA-Sequenz, die das Aprotinin oder Aprotinin-Homolog kodiert, gebunden an geeignete Promotor-, Signal-, Leader- und Terminatorsequenzen, wird in einen für die Expression des Aprotinins oder Aprotinin-Homologs in Hefe geeigneten Expressionsvektor inseriert.
- Der Expressionsvektor kann ein Plasmid sein, das zu unabhängiger Replikation in Hefe in der Lage ist oder zu Integration in das Hefe-Chromosom in der Lage ist. Das Plasmid kann vorzugsweise gegen Plasmidverlust durch den Wirtsmikroorganismus durch Einbau eines Gens stabilisiert werden, das für die Lebensfähigkeit oder das normale Wachstum der Wirtszellen wesentlich ist, z. B. eines Gens, das für Zellteilung, Zellwand- Biosynthese, Proteinsynthese, etc. kodiert.
- Wie in der vorliegenden Beschreibung verwendet, bedeutet Aprotinin(1-58) Aprotinin mit der Aminosäuresequenz von nativem Aprotinin, wohingegen Aprotinin(3-58) ein Aprotinin-Homolog bedeutet, dem die ersten zwei N-terminalen Aminosäurereste fehlen. Aprotinin(1-58,42 Ser) bedeutet ein Aprotinin-Homolog, in dem Arg in Position 42 durch Ser ersetzt worden ist, und Aprotinin(3-58,42 Ser) bedeutet ein Aprotinin-Homolog, dem die ersten zwei N-terminalen Aminosäurereste fehlen und bei dem außerdem Arg in Position 42 durch Ser ersetzt ist.
- Die Verfahren zur Transformation von Hefe und zur Kultivierung von transformierten Hefestämmen, die in der Praxis der Erfindung verwendet werden können, sind diejenigen, die auf diesem Gebiet bekannt sind, wie etwa diejenigen, die in den oben genannten EP-Patentanmeldungen Nrn. 0 163 529 A und 0 189 998 A beschrieben sind.
- Um mögliche Komplikationen während der Sekretion zu minimieren, die durch eine "dreifach basische" Spaltungsstelle am N- terminalen Ende des Aprotinin-Gens verursacht werden, wurde ein Aprotinin-Homolog hergestellt, dem die ersten zwei N-terminalen Aminosäurereste (Arg-Pro) fehlen.
- Um mögliche Kex2-Spaltung von Aprotinin an Lys(41)-Arg(42) zu vermeiden oder zu minimieren, kann auch ein Aprotinin-Homolog hergestellt werden, in dem einer oder beide der Aminosäurereste Lys(41) und Arg(42) durch einen nicht-basischen Aminosäurerest ersetzt worden sind. Ein bevorzugtes Aprotinin-Homolog dieser Art ist eines mit Ser in Position 42 anstelle von Arg.
- Überraschenderweise ist außerdem nachgewiesen worden, daß ungeachtet der Tatsache, daß natives Aprotinin einen N-terminalen basischen Aminosäurerest enthält und eine zweibasige Sequenz enthält, Hefen immer noch in der Lage sind, ein Produkt zu exprimieren und zu sekretieren, das mit nativem Aprotinin identisch ist, ohne Modifikation des Aprotinin-Gens.
- Die vorliegenden neuartigen Aprotinin-Homologe haben dieselbe spezifische inhibitorische Wirkung gegenüber Rinder-Trypsin wie natives Aprotinin und können demgemäß als ein Ersatzstoff für natives Aprotinin verwendet werden.
- Die spezifische inhibitorische Wirkung der Verbindungen der Erfindung wurden durch Verfolgung der Inhibition der Trypsin- Hydrolyse von Benzoyl-arginin-p-nitroanilid (BAPNA) mit spektrometrischer Analyse gemessen, wie beschrieben von Erlanger, B. F., Kokonski, N., und Cohen, W., Arch.Biochem.Biophys. 95, (1961) 271.
- Die DNA-Sequenzen, die die vorliegenden Aprotinin-Homologe kodieren, werden vorzugsweise durch Oligonukleotid-Synthese unter Verwendung bekannter Techniken hergestellt, weil dies es möglich macht, Codons auszuwählen, von denen bekannt ist, daß sie für Hefeexpression bevorzugt sind.
- Die folgenden synthetischen Gene sind konstruiert worden:
- welches Aprotinin(3-58) kodiert,
- welches Aprotinin(3-58,42 Ser) kodiert,
- welches Aprotinin(1-58) kodiert, und
- welches Aprotinin(1-58,42 Ser) kodiert.
- Das synthetische Gen für Aprotinin(3-58) wurde aus einer Anzahl von Oligonukleotiden durch Ligation konstruiert.
- Die Oligonukleotide wurden auf einem automatischen DNA-Synthesizer unter Verwendung von Phosphoramidit-Chemie auf einem Glasträger mit kontrollierter Porengröße synthetisiert (Beaucage, S.L., und Caruthers, M.H., Tetrahedron Letters 22 (1981) 1859-1869).
- Die folgenden 10 Oligonukleotide wurden synthetisiert:
- 5 Duplizes A-E wurden aus den obigen 10 Oligonukleotiden gebildet, wie in Fig. 1 dargestellt.
- 20 pmol von jedem der Duplizes A- E wurden aus den entsprechenden Paaren von 5'-phosporylierten Oligonukleotiden I-X durch Erhitzen für 5 min bei 90ºC, gefolgt von Abkühlung auf Raumtemperatur über einen Zeitraum von 75 Minuten, gebildet. Die fünf Duplizes wurden vermischt und mit T4-Ligase behandelt. Das synthetische Gen wurde als eine 176 bp-Bande nach Elektrophorese der Ligationsmischung auf einem 2%igen Agarosegel isoliert. Das erhaltene synthetische Gen ist in Fig. 1 dargestellt.
- Das synthetische Gen wurde an ein 330 bp langes EcoRI-Hgal- Fragment aus Plasmid pKFN9, das für die MFα1-Signal- und -Leader-Sequenz(1-85) kodiert, und an das große EcoRI-XbaI- Fragment aus puC19 ligiert. Die Konstruktion von pKFN9, das eine HgaI-Stelle unmittelbar nach der MFal-Leadersequenz enthält, ist in EP-Patentanmeldung Nr. 0 214 826 beschrieben.
- Die Ligationsmischung wurde verwendet, um einen kompetenten E. coli-Stamm (r&supmin; , m&spplus;) zu transformieren, selektionierend auf Ampicillinresistenz. Sequenzierung eines ³²P-XbaI-EcoRI-Fragmentes (Maxam, A. und Gilbert, W., Methods Enzymol. 65 (1980) 499-560) zeigte, daß Plasmide aus den resultierenden Kolonien die korrekte DNA-Sequenz für Aprotinin(3-58) enthielten.
- Ein Plasmid pKFN30s wurde für weitere Verwendung ausgewählt. Die Konstruktion von Plasmid pKFN30s ist in Fig. 2 veranschaulicht.
- pKFN30s wurde mit EcoRI und xbaI geschnitten und das 0,5 kb lange Fragment wurde an das 9,5 kb lange Ncol-Xbal-Fragment aus pMT636 und das 1,4 kb lange NcoI-EcoRI-Fragment aus pMT636 ligiert, was zu Plasmid pKFN374 führte, siehe Fig. 2. Plasmid pMT636 wurde aus pMT608 nach Deletion des LEU-2-Gens und aus pMT479 konstruiert, siehe Fig. 3. pMT608 ist beschrieben in der EP-Patentanmeldung Nr. 195691. pMT479 ist beschrieben in der EP-Patentanmeldung Nr. 163529. pMT479 enthält das Schizo. pombe-TPI-Gen (POT), den E. cerevisiae-Triosephosphat-Isomerase-Promotor und -Terminator, TPIP und TPIT (Alber, T. und Kawasaki, G. J.Mol.Appl.Gen. 1 (1982) 419-434). Plasmid pKFN374 enthält die folgende Sequenz:
- TPIP-MFα1-Signal-Leader(1-85)-Aprotinin (3-58)-TPIT,
- in der MFα1 die Kodierungssequenz für den S. cerevisiae-Reifungsfaktor Alpha 1 ist (Kurjan, J. und Herskowski, I., Cell 30, (1982) 933-943), Signal-Leader(1-85) bedeutet, daß die Sequenz die ersten 85 Aminosäurereste der MFal-Signal-Leadersequenz enthält, und Aprotinin(3-58) die synthetische Sequenz ist, die ein Aprotinin-Derivat kodiert, dem die ersten zwei Aminosäurereste fehlen.
- S. cerevisiae-Stamm MT663 (E2-7B XEII-36 a/α, ΔtpiΔtpi, pep 4- 3/pep 4-3) wurde auf YPGaL (1% Bacto-Hefeextrakt, 2% Bacto- Pepton, 2% Galactose, 1% Lactat) bis zu einer O.D. bei 600 nm von 0,6 gezüchtet.
- 100 ml Kultur wurden durch Zentrifugation geerntet, mit 10 ml Wasser gewaschen, erneut zentrifugiert und erneut in 10 ml einer Lösung suspendiert, die 1,2 M Sorbit, 25 mM Na&sub2;EDTA pH = 8,0 und 6,7 mg/ml Dithiotreit enthielt. Die Suspension wurde bei 30ºC für 15 Minuten inkubiert, zentrifugiert und die Zellen erneut in 10 ml einer Lösung suspendiert, die 1,2 M Sorbit, 10 mM Na&sub2;EDTA, 0,1 M Natriumcitrat, pH = 5,8, und 2 mg Novozym® 234 enthielt. Die Suspension wurde bei 30ºC für 30 Minuten inkubiert, die Zellen durch Zentrifugation gesammelt, in 10 ml 1,2 M Sorbit und 10 ml CAS (1,2 M Sorbit, 10 mM CaCl&sub2;, 10 mM Tris-HCl (Tris = Tris(hydroxymethyl)aminomethan), pH = 7,5) gewaschen und erneut in 2 ml CAS suspendiert. Für die Transformation wurden 0,1 ml in CAS erneut suspendierte Zellen mit ungefähr 1 ug Plasmid pKFN374 vermischt und bei Raumtemperatur für 15 Minuten stehengelassen. 1 ml (20% Polyethylenglykol 4000, 10 mM CaCl&sub2;, 10 mM Tris-HCl, pH = 7,5) wurde zugegeben und die Mischung für weitere 30 Minuten bei Raumtemperatur stehengelassen. Die Mischung wurde zentrifugiert und der Pellet in 0,1 ml SOS (1,2 M Sorbit, 33% v/v YPD, 6,7 mM CaCl&sub2;, 14 ug/ml Leucin) erneut suspendiert und bei 30ºC für 2 Stunden inkubiert. Die Suspension wurde dann zentrifugiert und der Pellet in 0,5 ml 1,2 M Sorbit erneut suspendiert. Anschließend wurden 6 ml Top-Agar (das SC-Medium von Sherman et al., (Methods in Yeast Genetics, Cold Spring Harbor Laboratory, 1981), das 1,2 M Sorbit plus 2,5% Agar enthielt) bei 52ºC zugegeben und die Suspension auf Platten gegossen, die dasselbe mit Agar verfestigte, sorbithaltige Medium enthielt. Transformante Kolonien wurden nach 3 Tagen bei 30ºC ausgewählt, erneut isoliert und verwendet, um Flüssigkulturen zu starten. Ein solcher Transformant, KFN322, wurde für weitere Charakterisierung ausgewählt.
- Hefestamm KFN322 wurde auf YPD-Medium (1% Hefeextrakt, 2% Papton (von Difco Laboratories) und 2% Glucose) gezüchtet. Eine 10 ml-Kultur des Stammes wurde bei 30ºC bis zu einer O.D. bei 600 nm von 32 gerüttelt. Nach Zentrifugation wurde der Überstand durch FPLC-Ionenaustauschchromatographie analysiert. Der Hefe-Überstand wurde durch eine 0,22 um-Millex®-GV-Filtereinheit filtriert und 1 ml wurde auf eine MonoS-Kationenaustauschsäule (0,5·5 cm) aufgebracht, die mit 20 mM Bicine, pH 8,7, äquilibriert worden war. Nach Waschung mit Äquilibrationspuffer wurde die Säule mit einem linearen NaCl-Gradienten (0-1 M) in Äquilibrationspuffer eluiert. Trypsininhibitoraktivität wurde in den eluierten Fraktionen durch spektrophotometrischen Test quantifiziert und außerdem durch Integration der Absorption bei 280 nm aus
- E&sub2;&sub8;&sub0;1%(Aprotinin) = 8,3
- Die Ausbeute betrug etwa 3 mg/Liter Aprotinin(3-58).
- Für die Aminosäureanalyse und N-terminale Sequenzierung wurde der Hefe-Überstand (7 ml) mit 0,1 M NaOH auf pH 8,7 eingestellt und filtriert (0,22 um). Der Ablauf aus einer Q-Sepharose-Anionenaustauschsäule (1·4 cm), die mit 20 mM Bicine, pH 8,7, äquilibriert worden war, wurde auf eine MonoS-Kationenaustauschsäule (0,5·5 cm) aufgebracht. Die Kationenaustauschchromatographie wurde durchgeführt, wie oben beschrieben. Die Konzentration des Gradienten-eluierten Aprotinins(3- 58) wurde durch erneute Chromatographie auf MonoS und Elution mit einem steilen NaCl-Gradienten erreicht. Die gesammelten Fraktionen wurden durch Vakuumzentrifugation weiter auf etwa 100 ul konzentriert und auf eine RP-HPLC-Säule aufgebracht (Vydac C4, 4,6·250 mm). Die Elution wurde mit einem CH&sub3;CN- Gradienten in 0,1% TFA durchgeführt. Die gesammelten Fraktionen wurden auf etwa 100 ul durch Vakuumzentrifugation konzentriert und Proben wurden genommen für die N-terminale Sequenzierung und Aminosäureanalyse.
- Durch N-terminale Sequenzierung wurde die folgende Sequenz gefunden:
- die bestätigt, daß das N-terminale Ende korrekt ist.
- Die Aminosäureanalyse ist in folgender Tabelle 1 dargestellt. Aus dieser Tabelle wird deutlich, daß das Produkt die erwartete Aminosäurezusammensetzung besitzt, d. h. weniger Arg und Pro. Der leicht verringerte Gehalt an Ile kann höchstwahrscheinlich unvollständiger Hydrolyse von Ile(18)-Ile(19) zugeschrieben werden (dies ist auf diesem Gebiet gut bekannt). Pro und Arg sind auch leicht höher als erwartet. Dies sieht man jedoch auch bei Aprotinin selbst (Tabelle 1, zweite Spalte)'.
- Wenn verglichen mit dem oben genannten Verfahren von Erlanger et al., wurde festgestellt, daß die spezifische Aktivität von Aprotinin(3-58) innerhalb des experimentellen Fehlers identisch war mit der spezifischen Aktivität von nativem Aprotinin.
- Ein synthetisches Gen für Aprotinin(3-58&sub1;42 Ser) wurde konstruiert, wie in Beispiel I beschrieben. Mit dem Ziel, Arg(42) durch Ser zu ersetzen, wurden die folgenden Oligonukleotide VIIa und VIIIa anstelle von VII und VIII verwendet:
- Das erhaltene synthetische Gen ist in Fig. 4 dargestellt. Dieses Gen, gebunden an eine MFα1-Signal-Leader(1-85)-Sequenz wurde in ein von pUC19 abgeleitetes Plasmid pKFN306 (siehe Fig. 2) kloniert.
- Unter Befolgung der Vorgehensweise von Beispiel 1 wurde ein Plasmid pKFN375 erhalten, das die folgende Konstruktion enthielt
- TPIP-MFα1-Signal-Leader(1-85)-Aprotinin (3-58,42 Ser)-TPIT,
- in der Aprotinin(3-58,42 Ser) das synthetische Gen ist, das ein Aprotinin-Derivat kodiert, dem die ersten zwei Aminosäurereste fehlen und das ein Ser anstelle von Arg in Position 42 enthält.
- Hefestamm MT663 wurde mit Plasmid pFKN37s transformiert, wie oben beschrieben, und das Kultivieren des transformierten Stammes pKFN324 ergab etwa 12 mg/Liter Aprotinin(3-58,42 Ser).
- N-terminale Sequenzierung, durchgeführt wie oben beschrieben, bestätigte die folgende N-terminale Sequenz
- d. h. die korrekte Sequenz.
- Die Aminosäureanalyse ist in Tabelle 1 dargestellt und bestätigt die erwartete Aminosäurezusammensetzung, d. h. weniger Pro und Arg und mehr Ser (siehe auch die obigen Bemerkungen in Beispiel 1).
- Wenn verglichen mit dem oben genannten Verfahren von Erlanger et al., wurde festgestellt, daß die spezifische Aktivität von Aprotinin(3-58,42 Ser) innerhalb des experimentellen Fehlers identisch war mit der spezifischen Aktivität von nativem Aprotinin.
- Die synthetische Duplex, die in Fig. 5 dargestellt ist, wurde an ein 330 bp langes EcoRI-HgaI-Fragment aus Plasmid pKFN9, das für die MFα1-Signal- und -Leader-Sequenz kodierte, und an das 144 bp lange AvaII-XbaI-Fragment aus pKFN30s und an das große EcoRI-XbaI-Fragment aus puC19 ligiert.
- Die Ligationsmischung wurde verwendet, um einen kompetenten E. coli-Stamm (r&supmin; m&spplus;) zu transformieren, selektionierend auf Ampicillinresistenz. Sequenzierung eines ³²P-markierten XbaI-EcoRI Fragmentes zeigte, daß Plasmide aus den resultierenden Kolonien die korrekte DNA-Sequenz für Aprotinin(1-58) enthielten.
- Ein Plasmid pKFN414 wurde für weitere Verwendung ausgewählt. Die Konstruktion von Plasmid pKFN414 ist in Fig. 5 veranschaulicht.
- Unter Befolgung der Vorgehensweise von Beispiel 1 wurde ein Hefeplasmid pKFN418 erhalten, das die folgende Konstruktion enthielt:
- TPIP-MFα1-Signal-Leader(1-85)-Aprotinin(1-58)-TPIT.
- Hefestamm MT633 wurde mit Plasmid pKFN418 transformiert, wie oben beschrieben. Das Kultivieren des transformierten Stammes KFN385 ergab etwa 1-13 mg/l Aprotinin(1-58).
- Wenn verglichen mit dem obengenannten Verfahren von Erlanger et al., wurde festgestellt, daß die spezifische Aktivität von Aprotinin(1-58), das gemäß diesem Beispiel hergestellt war, innerhalb des experimentellen Fehlers identisch war mit der spezifischen Aktivität von nativem Aprotinin.
- Ein Plasmid pKFN416, das ein Gen für Aprotinin(1-58,42 Ser) enthielt, wurde aus pKFN306 konstruiert, wie in Beispiel 3 beschrieben. Unter Befolgung der Vorgehensweise von Beispiel 1 wurde ein Hefeplasmid pKFN420 erhalten, das die folgende Konstruktion enthielt:
- TPIP-MFα1-Signal-Leader(1-85)-Aprotinin(1-58,42 Ser)-TPIT.
- Hefestamm MT663 wurde mit Plasmid pKFN420 transformiert, wie oben beschrieben. Das Kultivieren des transformierten Stammes KFN387 ergab etwa 1-13 mg/l Aprotinin(1-58,42 Ser).
- Wenn verglichen mit dem oben genannten Verfahren von Erlanger et al., wurde festgestellt, daß die spezifische Aktivität von Aprotinin(1-58,42 Ser) innerhalb des experimentellen Fehlers identisch war mit der spezifischen Aktivität von nativem Aprotinin. Tabelle 1 Aminosäure Aprotinin (theoretisch) (gefunden) Gesamt
Claims (15)
1. Ein Verfahren zur Herstellung von Aprotinin oder Homologen
desselben in Hefe, welches das Kultivieren eines
Hefestammes, der einen replizierbaren Expressionsvektor enthält,
wobei der Vektor eine DNA-Sequenz umfaßt, die Aprotinin
oder ein Aprotinin-Homolog kodiert, gebunden an eine DNA-
Sequenz, die ein Signal- und Leaderpeptid kodiert, das für
Sekretion des Aprotinins oder Aprotinin-Homologs sorgt, in
einem geeigneten Nährstoffmedium und die Gewinnung des
sekretierten Aprotinins oder Aprotinin-Homologs daraus
umfaßt.
2. Ein Verfahren nach Anspruch 1, wobei die DNA-Sequenz
Aprotinin(3-58) kodiert.
3. Ein Verfahren nach Anspruch 2, wobei die DNA-Sequenz die
folgende Sequenz besitzt:
oder eine funktionell äquivalente Sequenz.
4. Ein Verfahren nach Anspruch 1, wobei die DNA-Sequenz
Aprotinin(3-58,42 Ser) kodiert.
5. Ein Verfahren nach Anspruch 4, wobei die DNA-Sequenz die
folgende Sequenz besitzt:
oder eine funktionell äquivalente Sequenz.
6. Ein Verfahren nach Anspruch 1, wobei die DNA-Sequenz
Aprotinin(1-58) kodiert.
7. Ein Verfahren nach Anspruch 6, wobei die DNA-Sequenz die
folgende Sequenz besitzt:
oder eine funktionell äquivalente Sequenz.
8. Ein Verfahren nach Anspruch 1, wobei die DNA-Sequenz
Aprotinin(1-58,42 Ser) kodiert.
9. Ein Verfahren nach Anspruch 8, wobei die DNA-Sequenz die
folgende Nukleotidsequenz besitzt
oder eine funktionell äquivalente Sequenz.
10. Ein Vektor, der zu Replikation in Hefe in der Lage ist und
eine DNA-Sequenz umfaßt, die Aprotinin oder ein Aprotinin-
Homolog kodiert, gebunden an eine DNA-Sequenz, die ein
Signal- und Leaderpeptid kodiert, das für Sekretion des
Aprotinins oder Aprotinin-Homologs sorgt.
11. Ein Vektor nach Anspruch 10, wobei die DNA-Sequenz für
Aprotinin(3-58) kodiert und die folgende Sequenz besitzt
oder eine funktionell äquivalente Sequenz.
12. Ein Vektor nach Anspruch 10, wobei die DNA-Sequenz für
Aprotinin(3-58,42 Ser) kodiert und die folgende Sequenz
besitzt
oder eine funktionell äquivalente Sequenz.
13. Ein Vektor nach Anspruch 10, wobei die DNA-Sequenz für
Aprotinin(1-58) kodiert und die folgende Sequenz besitzt
oder eine funktionell äquivalente Sequenz.
14. Ein Vektor nach Anspruch 10, wobei die DNA-Sequenz für
Aprotinin(1-58,42 Ser) kodiert und die folgende Sequenz
besitzt
oder eine funktionell äquivalente Sequenz.
15. Ein Hefestamm, der mit einem Vektor nach Anspruch 10
transformiert ist.
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