FI104428B

FI104428B - Menetelmä aprotiniinin ja aprotiniinihomologien tuottamiseksi hiivassa

Info

Publication number: FI104428B
Application number: FI900991A
Authority: FI
Inventors: Kjeld Norris; Soeren Erik Bjoern; Fanny Norris
Original assignee: Novo Nordisk As
Priority date: 1987-08-28
Filing date: 1990-02-27
Publication date: 2000-01-31
Also published as: ATE113986T1; NO900920D0; DE3852105D1; DE3852105T2; DK450187D0; NO177967B; JP2806958B2; NO177967C; JPH03502519A; FI900991A0; WO1989001968A1; EP0375718A1; NO900920L; EP0375718B1

Description

104428

Menetelmä aprotiniinin ja aprotiniinihomologien tuottamiseksi hiivassa Tämä keksintö koskee menetelmää aprotiniinin ja sen homologien tuottamiseksi hii-5 vassa, sellaisia tuotteita koodaavia synteettisiä geenejä, ekspressiovektoreita ja transformoituja hiivasoluja. Keksintö koskee myös uusia aprotiniinihomologeja.

Aprotiniini (naudan haiman trypsiini-inhibiittori, BPTI) on polypeptidi, jota useat naudan elimet ja kudokset erittävät, kuten imusolmukkeet, haima, keuhkot, korva-10 sylkirauhanen, perna ja maksa. Se on yhdestä ketjusta koostuva polypeptidiketju, jossa on 58 aminohappojäännöstä sitoutunut ristiin kolmella disulfidisillalla, joilla on seuraava sekvenssi:

Arg-Pro-Asp-Phe-Cys-Leu-Glu-Pro-Pro-Tyr-Thr-Gly-Pro-Cys-Lys-Ala-Arg-lle-Ile-15 12 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15 16 17 18 19

Arg-T yr-Phe-Tyr-Asn-Ala-Lys-Ala-Gly-Leu-Cys-Gln-Thr-Phe-Val-Tyr-Gly-Gly-20 21 22 23 24 25 26 27 28 29 30 31 32 33 34 35 36 37

Cys-Arg-Ala-Lys-Arg-Asn-Asn-Phe-Lys-Ser-AIa-Glu-Asp-Cys-Met-Arg-Thr-Cys-38 39 40 41 42 43 44 45 46 47 48 49 50 51 52 53 54 55 20 Gly-Gly-Ala 56 57 58

Kolme disulfidisiltaa sijaitsevat Cys(5)-Cys(55), Cys(14)-Cys(38) ja Cys(30)-Cys(51) välissä, vastaavasti.

25

Aprotiniinia käytetään akuutin haimatulehduksen, erilaisten shokki-oiretilojen, hy-perfibrinolyyttisen verenvuodon ja sydäninfarktin käsittelyyn. Kun aprotiniinia annetaan suurina annoksina, se vähentää merkittävästi veren hukkaa sydänkirurgiassa.

30 Aprotiniinia voidaan uuttaa erilaisista naudan elimistä tai kudoksista, kuten keuhkoista, haimasta ja korvasylkirauhasista. Tässä esityksessä täten saatuun aprotinii-niin viitataan luonnollisena aprotiniinina. Eläinkudoksesta eristäminen on vaivalloi-nen menetelmä ja se vaatii suuret määrät naudan elintä tai kudosta. Paljon mukavampi menetelmä kaupalliseen tuottoon olisi fermentaatiomenetelmä, jossa apro-35 tiniinia koodaava geeni liitetään sopivaan mikro-organismiin rekombinantti-DNA-tekniikoilla ja mikro-organismia kasvatetaan sopivalla ravintoalustalla, jotta se tuottaisi toivottua tuotetta, jota eritetään alustaan valmiissa muodossa.

2 104428

Aprotiniinigeeni on fuusioitu E. colin alkaliseen fosfataasisignaalipeptidin koodaus-sekvenssiin ja ilmennetään R colissa alkalisen fosfataasipromoottorin kontrollin alaisena (Marks, C.B. et al., The Journal of Biological Chemistry 261 (1986) 7115-7118). Met-aprotiniinin proteiinisekvenssiä koodaava synteettinen geeni on myös 5 kloonattu E, coli -ekspressiovektorille (von Wilcken-Bermann, B. et ai., The EMBO Journal 5 (1986) 3219-3225). Aprotiniinin ja aprotiniinihomologien tuotto on myös kuvattu EP-kuulutusjulkaisussa 238993 ja GB-patenttihakemuksessa 2 188 933.

Kuitenkin ongelmana tuotettaessa pieniä vieraita proteiineja E. colissa on tosiasia, 10 että sellaiset proteiinit ovat taipuvaisia joutua isännän proteaasien hajotettaviksi. Myös oikeiden disulfidisiltojen ja oikean laskostamisen aikaan saaminen saattaisi olla ongelma R colissa.

On osoitettu, että hiivat kykenevät ilmentämään ja valmistamaan pieniä proteiineja, 15 jotka ovat noin samankokoisia kuin aprotiniini. EP-patenttihakemuksessa 0163529A kuvataan insuliinien prekursorien tuotto oikein sijoittunein disulfidisilloin ja EP-patenttihakemuksessa 0189998A kuvataan glukagonin, yksi-ketjuisen polypeptidin, jossa on 29 aminohappoa, tuotto.

20 Näillä menetelmillä ilmennetään hiivassa primäärisiä tuotteita, jotka koostuvat toivotusta proteiinista, joka on liittynyt hiivan johtavaan peptidiin. Erityksen aikana primääristä tuotetta prosessoidaan Kex2-entsyymin avulla (Julius, D. et ai. Cell 32 (1983) 839-852) ja prossessoitu tuote, johon viitataan myös valmiina tai täysin kehittyneenä tuotteena, eritetään sitten alustaan. Ilmentyneen primäärisen tuotteen . 25 prosessointi tapahtuu emäksisessä aminohappoparissa (Lys-Arg) valmiin tuotteen N- terminaalissa.

Aprotiniinin, jolla on emäksinen aminohappo (Arg) N-terminaalisena aminohappona, tapauksessa saattaa ilmetä ongelmia, jos Kex2-prosessointikohta Lys-Arg liite-30 tään ennen aprotiniinisekvenssin ensimmäistä Arg-jäännöstä, koska silloin olisi "kolmoisemäs"-pilkkomiskohta ilmennetyssä fuusiotuotteessa. Emäksisten aminohappojen pari aprotiniinimolekyylissä (Lys(41)-Arg(42)) olisi myös mahdollinen Kex2-entsyymin pilkkomiskohta hiivasoluissa.

35 Tämän keksinnön tarkoitus on saada aikaan menetelmä aprotiniinin tai sen homologien tuottamiseksi hiivassa, joka erittää alustaan suuria määriä oikein laskostettua ja i| !l

• I

3 104428 valmista proteiinia. Tämä on saatu aikaan siten kuin on esitetty oheisissa patenttivaatimuksissa.

Keksintö perustuu sellaiseen yllättävään havaintoon, että aprotiniinia ja sen tiettyjä 5 homologeja voidaan tuottaa suurina määrinä niin, että siinä on oikein sijaitsevat di-sulfidisillat, kasvattamalla hiivakantaa, joka on transformoitu sellaisia tuotteita koo-daavalla DNA-sekvenssillä.

Tämän keksinnön ensimmäisen suoritusmuodon mukaisesti saadaan menetelmä, jos-10 sa tuotetaan suuria saantoja aprotiniinia tai sen homologeja hiivassa kasvattamalla hiivakantaa, jossa on replikoituva ekspressiovektori, joka sisältää synteettisen geenin, joka koodaa aprotiniinia tai sen homologia, sopivalla ravintoalustalla, minkä jälkeen aprotiniini tai sen homologi saadaan kasvatusalustasta.

15 Tämän keksinnön toisen suoritusmuodon mukaisesti saadaan DNA-sekvenssi, joka koostuu synteettisestä geenistä, joka koodaa aprotiniinia tai sen homologeja.

Tämän keksinnön kolmannen suoritusmuodon mukaisesti saadaan replikoituva ekspressiovektori, jossa on DNA-sekvenssi, joka koodaa aprotiniinia tai aprotiniiniho-20 mologia ja DNA-sekvenssi, joka sallii aprotiniinin tai sen homologin ilmenemisen hiivassa.

Tämän keksinnön neljännen suoritusmuodon mukaisesti saadaan hiivakanta, joka on transformoitu tällä replikoituvalla ekspressiovektorilla.

25 Tällä keksinnöllä tuotettuja aprotiniineja voidaan luonnehtia seuraavalla kaavalla (I) X-aprotiniini(3-40)-Yn-Zm-aprotiniini(43-58) (I) 30 jossa X tarkoittaa Arg-Pro, Pro on vety, aprotiniini(3-40) tarkoittaa aminohapposekvenssiä aminohappojäännöksestä 3-40 luonnon aprotiniinista, Y voi olla Lys tai ei-emäksinen aminohappojäännös, esim. Ser, Thr tai Ala, Z voi olla Arg tai ei-emäksinen aminohappojäännös, esim. Ser, Thr tai Ala, sekä n että m ovat 0 tai 1 ja aprotiniini(43-58) tarkoittaa aminohapposekvenssiä aminohappojäännöksestä 43-58 35 luonnon aprotiniinissa.

: · < 4 104428 Tämä keksintö on kohdistettu myös uusiin aprotiniinihomologeihin, joilla on seu-raava kaava (II).

X'-aprotiniini(3-40)-Y'n-Z'm-aprotiniini(43-58) (II) 5 jossa X' tarkoittaa Pro:ta tai vetyä, aprotiniini(3-40) tarkoittaa aminohapposekvenssiä aminohappojäännöksestä 3-43 luonnon aprotiniinissa, Y' on Lys tai ei-emäksinen aminohappojäännös, Z' voi olla Arg tai ei-emäksinen aminohappojäännös, sillä ehdolla, että ainakin Y1 tai Z' on ei-emäksinen aminohappojäännös, sekä n että m ovat 10 0 tai 1 ja aprotiniini(43-58) tarkoittaa aminohapposekvenssiä aminohappojäännök sestä 43-58 luonnon aprotiniinissa.

Tätä keksintöä kuvataan lisää viittaamalla mukana oleviin piirroksiin, joissa: 15 Kuvioi osoittaa synteettisen geenin, joka koodaa aprotiniini(3-58):aa;

Kuvio 2 kuvaa plasmidien pKFN374 ja pKFN375 rakenteen;

Kuvio 3 kuvaa plasmidin pMT 636 rakenteen;

Kuvio 4 osoittaa synteettisen geenin, joka koodaa aprotiniini(3-58,42 Ser):ä;

Kuvio 5 kuvaa plasmidien pKFN414 ja pKFN416 rakenteen; 20 Kuvio 6 osoittaa synteettisen geenin, joka koodaa aprotiniini (l-58):aa ja Kuvio 7 osoittaa synteettisen geenin, joka koodaa aprotiniini(l-58,42 Ser):ä.

Eritystarkoituksia varten DNA-sekvenssi, joka koodaa toivottua aprotiniinia tai aprotiniinihomologia, fuusioidaan DNA-sekvenssiin, joka koodaa signaali- tai joh-25 tavaa peptidisekvenssiä. Transformoitu mikro-organismi pilkkoo signaali- tai johtavat peptidit pois ilmennetyn proteiinituotteen soluista erittämisen aikana, jolloin varmistetaan toivotun tuotteen yksinkertaisempi eristysmenetelmä. Hyvin sopiva johtava peptidi systeemi hiivalle on hiivan MFal johtava sekvenssi tai osa siitä (Kurjan, J. ja Herskowitz, I., Cell 30 (1982) 933-943) tai johtava sekvenssi, joka on 30 kuvattu DK-patenttihakemuksessa 4638/87. Kuitenkin mitä tahansa signaali- tai f 9 johtavaa sekvenssiä, joka johtaa eritykseen hiivassa, voidaan käyttää ja tämän keksinnön ei ole suunniteltu rajoittuvan spesifiseen erityssysteemiin.

Ilmenemistarkoituksia varten promoottorisekvenssi asetetaan ylävirtaan halutun 35 proteiinituotteen DNA-sekvenssille, Edullisesti käytetään promoottoria geenistä, joka on synnynnäinen hiivaisäntäorganismissa, esim. TPI- (trioosifosfaatti-isomeraasi) geenin promoottori. Halutun tuotteen DNA-sekvenssiä seuraa transkriptioterminaat- 5 104428 tori sekvenssi, edullisesti terminaattorisekvenssi geenistä, joka on synnynnäinen isäntähiivaorganismille, esim. TPI-geenin tai MFal-geenin terminaattori.

DNA-sekvenssi, joka koodaa aprotiniinia tai aprotiniinihomologia ja joka on fuu-5 sioitunut sopivaan promoottori-, signaali-, johtavaan ja terminaattorisekvenssiin liitetään ekspressiovektoriin aprotiniinin tai aprotiniinihomologin ilmenemistä varten hiivassa.

Ekspressiovektori voi olla plasmidi, joka kykenee replikoitumaan itsenäisesti hiivas-10 sa tai kykenee liittymään hiivan kromosomiin. Isäntäorganismi voi edullisesti stabilisoida plasmidin plasmidin katoamista vastaan liittämällä isäntäsolujen elinkyvylle tai normaalille kasvulle olennainen geeni, esim. geeni, joka koodaa solun jakautumista, soluseinän biosynteesiä, proteiinisynteesiä, jne.

15 Kuten tässä keksinnössä on käytetty, aprotiniini(l-58) tarkoittaa aprotiniinia, jolla on luonnon aprotiniinin aminohapposekvenssi, kun taas aprotiniini(3-58) tarkoittaa aprotiniinihomologia, jolta puuttuu ensimmäiset kaksi N-terminaalista aminohappo-jäännöstä. Aprotiniini( 1-58,42 Ser) tarkoittaa aprotiniinihomologia, jossa Arg asemassa 42 on korvattu Ser:llä ja aprotiniini (3-58,42 Ser) tarkoittaa aprotiniinihomo-20 logia, jolta puuttuu ensimmäiset kaksi N-terminaalista aminohappojäännöstä ja lisäksi niillä on Arg asemassa 42 korvattu Ser:llä.

Menetelmät, joita voidaan käyttää toteutettaessa keksintöä hiivan transformoimi-seksi ja transformoitujen hiivakantojen viljelemiseksi, ovat alalla tunnettuja, kuten . 25 sellaiset kuin on kuvattu edellä mainituissa EP-patenttihakemuksissa 0163529A ja 0189998A.

Jotta minimoitaisiin erityksen aikana mahdolliset komplikaatiot, joita "kolmois-emäs"-pilkkomiskohta aprotiniinigeenin N-terminaalisessa päässä aiheuttaa, tuotet-30 tiin aprotiniinihomologi, jolta puuttuu ensimmäiset kaksi N-terminaalista aminohappojäännöstä (Arg-Pro).

Jotta vältettäisiin tai minimoitaisiin myös mahdollinen aprotiniinin Kex2-pilkkomi-nen Lys(41)-Arg(42):ssa, voidaan valmistaa aprotiniinihomologi, jossa on yksi tai 35 molemmat aminohappojäännökset Lys(41) ja Arg(42) korvattu ei-emäksisellä ami-nohappojäännöksellä. Edullinen tämän tyypin aprotiniinihomologi on sellainen, jos-·” sa on Ser asemassa 42 Arg:n sijasta.

6 104428

Yllättäen osoitettiin, että lukuunottamatta tosiasiaa, että luonnon aprotiniinissa on N-terminaalinen emäksinen aminohappojäännös ja kaksiemäksinen sekvenssi, hiivat ▼ kykenevät silti ilmentämään ja erittämään tuotetta, joka on identtinen luonnon apro-tiniinin kanssa ilman aprotiniinigeenin muokkausta.

5 Näillä uusilla aprotiniinihomologeilla on samat spesifiset inhibiittoritehokkuudet naudan trypsiiniä vastaan kuin luonnon aprotiniinilla ja niitä voidaan sen mukaisesti käyttää korvaamaan luonnon aprotiniinia.

10 Keksinnön yhdisteiden spesifinen inhibiittoritehokkuus mitattiin seuraamalla bent-soyyliarginiini-p-nitroanilidin trypsiinihydrolyysin (ΒΑΡΝΑ) inhibitiota spektro-metrisellä analyysillä, kuten Erlanger, B.F., Kokonski, N. ja Cohen, W. kuvaavat,

Arch. Biochem. Biophys. 95, (1961) 271.

15 Näitä aprotiniinihomologeja koodaavat DNA-sekvenssit tehdään edullisesti oligo-nukleotidisynteesillä käyttämällä tunnettuja tekniikkoja, koska tämä mahdollistaa valita kodonit, joiden tiedetään olevan edullisia hiivailmentämiselle.

Seuraavat synteettiset geenit on rakennettu: 20

AspPheCysLeuGluProProTyrThrGlyProCysLysAlaArgllelleArg

GATTTCTGTTTGGAACCTCCATACACTGGTCCATGTAAAGCTAGAATCATCAGA

CTAAAGACAAACCTTGGAGGTATGTGACCAGGTACATTTCGATCTTAGTAGTCT

25 TyrPheTyrAsnAlaLysAlaGlyLeuCysGlnThrPheValTyrGlyGlyCys TACTTCTACAACGCCAAGGCTGGTTTGTGTCAAACTTTCGTTTACGGTGGCTGC ATGAAGATGTTGCGGTTCCGACCAAACACAGTTTGAAAGCAAATGCCACCGACG

ArgAiaLysArgAsnAsnPheLysSerAiaGluAspCysMetArgThrCysGly 30 AGAGCTAAGAGAAACAACTTCAAGTCTGCTGAAGACTGCATGAGAACTTGTGGT r. TCTCGATTCTCTTTGTTGAAGTTCAGACGACTTCTGACGTACTCTTGAACACCA

GlyAla

GGTGCC

35 CCACGG joka koodaa aprotiniini(3-58):aa,

' * I

104428 7

AspPheCysLeuGluProProTyrThrGlyProCysLysAlaArgllelleArg

GATTTCTGTTTGGAACCTCCATACACTGGTCCATGTAAAGCTAGAATCATCAGA

CTAAAGACAAACCTTGGAGGTATGTGACCAGGTACATTTCGATCTTAGTAGTCT

5 TyrPheTyrAsnAlaLysAlaGlyLeuCysGlnThrPheValTyrGlyGlyCys TACTTCTACAACGCCAAGGCTGGTTTGTGTCAAACTTTCGTTTACGGTGGCTGC ATGAAGATGTTGCGGTTCCGACCAAACACAGTTTGAAAGCAAATGCCACCGACG

ArgAlaLysSerAsnAsnPheLysSerAlaGluAspCysMetArgThrCysGly 10 AGAGCTAAGTCCAACAACTTCAAGTCTGCTGAAGACTGCATGAGAACTTGTGGT TCTCGATTCAGGTTGTTGAAGTTCAGACGACTTCTGACGTACTCTTGAACACCA

GlyAla

GGTGCC

15 CCACGG joka koodaa aprotiniini (3-58,42 Ser):ä,

ArgProAspPheCysLeuGluProProTyrThrGlyProCysLysAlaArglle

AGGCCTGATTTCTGTTTGGAACCTCCATACACTGGTCCATGTAAAGCTAGAATC

TCCGGACTAAAGACAAACCTTGGAGGTATGTGACCAGGTACATTTCGATCTTAG

20

IleArgTyrPheTyrAsnAlaLysAlaGlyLeuCysGlnThrPheValTyrGly

ATCAGATACTTCTACAACGCCAAGGCTGGTTTGTGTCAAACTTTCGTTTACGGT

TAGTCTATGAAGATGTTGCGGTTCCGACCAAACACAGTTTGAAAGCAAATGCCA

• _ 25 GlyCysArgAlaLysArgAsnAsnPheLysSerÄlaGluAspCysMetArgThr

GGCTGCAGAGCTAAGAGAAACAACTTCAAGTCTGCTGAAGACTGCATGAGAACT CCGACGTCTCGATTCTCTTTGTTGAAGTTCAGACGÄCTTCTGACGTACTCTTGA

CysGlyGlyAla 30 TGTGGTGGTGCC

» » acacCACCACGG joka koodaa aprotiini( 1-58):aaja * · 8 104428

ArgProAspPheCysLeuGluProProTyrThrGlyProCysLysAlaArglle

AGGCCTGATTTCTGTTTGGAACCTCCATACACTGGTCCATGTAAAGCTAGAATC

TCCGGACTAAAGACAAACCTTGGAGGTATGTGACCAGGTACATTTCGATCTTAG

5 IleArgTyrPheTyrAsnAlaLysAlaGlyLeuCysGlnThrPheValTyrGly ATCAGATACTTCTACAACGCCAAGGCTGGTTTGTGTCAAACTTTCGTTTACGGT TAGTCTATGAAGATGTTGCGGTTCCGACCAAACACAGTTTGAAAGCAAATGCCA

GlyCysArgAlaLysSerAsnAsnPheLysSerAlaGluAspCysMetArgThr 10 GGCTGCAGAGCTAAGTCCAACAACTTCAAGTCTGCTGAAGACTGCATGAGAACT CCGACGTCTCGATTCAGGTTGTTGAAGTTCAGACGACTTCTGACGTACTCTTGA

CysGlyGlyAla

TGTGGTGGTGCC

15 ACACCACCACGG joka koodaa aprotiini( 1-58,42 Ser):ä.

Esimerkki 1

Aprotiniini(3-58):n tuotto 20 Aprotiniini(3-58):n synteettinen geeni tehtiin lukuisista oligonukleotideistä ligaatiol-la.

Oligonukleotidit syntetisoitiin automaattisella DNA-syntetisaattorilla käyttämällä fosforamidiittikemiaa kontrolloidulla huokoisella lasipidikkeellä (Beaucage, S.L. ja 25 Caruthers, M.H., Tetrahedron Letters 22 (1981) 1859-1869).

Syntetisoitiin 10 seuraavaa oligonukleotidiä:

I: AAAGAGATTTCTGTTTGGAACCTCCATACACTGGTCC

30 37meeri

Π: TT AC AT GGACC AGT GT AT GGAGGTT CC AAAC AGAAACT

38meeri

35 III: ATGTAAAGCTAGAATCATCAGATACTTCTACAACG

35meeri 9 104428 IV: CTTGGCGTTGTAGAAGT AT CT GATGATTCT AGCT 34meeri

V: CCAAGGCTGGTTTGTGTCAAACTTTCGTTTACGGTGGCT

5 39meeri VI: CTCTGCAGCCACCGTAAACGAAAGTTTGACACAAACCAGC 40meeri

10 Vn: GCAGAGCTAAGAGAAACAACTTCAAGT

27meeri VIII: AGCAGACTTGAAGTTGTTTCTCTTAG 26meeri 15 IX: CTGCTGAAGACTGCATGAGAACTTGTGGTGGTGCCTAAT 39meeri

X: CTAGATTAGGCACCACCACAAGTTCTCATGCAGTCTTC

20 38meeri 5 dupleksia A-E muodostettiin edellä olevista oligonukleotideistä, kuten kuviossa 1 nähdään.

10 104428 (Maxam, A. ja Gilbert, W., Methods Enzymol. 65 (1980) 499-560), osoitettiin että saatujen pesäkkeiden plasmidit sisälsivät oikean DNA-sekvenssin aprotiniini(3-5 8): He.

5 Plasmidi pKNF305 valittiin lisäkäyttöön. Plasmidin pKFN305 rakenne on kuvattu kuviossa 2.

pKFN305 pilkottiin EcoRIilla ja Xbalillä ja 0,5 kb fragmentti ligoitiin 9,5 kb Ncol-Xbal-fragmenttiin pMT636:lta ja 1,4 kb NcoI-EcoRI-fragmenttiin pMT636:Ita, jol-10 loin saatiin pKFN374-plasmidi, ks. kuvio 2. Plasmidi pMT636 tehtiin pMT608:sta deletoimalla LEU-2-geeni ja pMT479:stä, katso kuvio 3. pMT608 on kuvattu EP-patenttihakemuksessa 195691. pMT479 on kuvattu EP-patenttihakemuksessa 163529. pMT479 sisältää Schizo. pombe TPI-geenin (POT), cerevisiae trioosifos-faatti-isomeraasipromoottorin ja terminaattorin, TPIP ja TPIT (Alber, T. ja Kawasa-15 lei, G. J.Mol. Appi. Gen. 1 (1982) 419-434). Plasmidilla pKFN374 on seuraava sekvenssi: TPIp-MFa 1 -signaali-johtava( 1 -85)-aprotiniini(3-58)-TPIT, 20 jossa MFal on SL cerevisiaen risteytymistekijä alfa 1 koodaussekvenssi (Kurjan, J. ja Herskowitz, I., Cell 30, (1982) 933-943), signaali-johtava(l-85) tarkoittaa, että sekvenssissä on MFal signaali-johtavan sekvenssin ensimmäiset 85 aminohappo-jäännöstä ja aprotiniini(3-58) synteettinen sekvenssi, joka koodaa aprotiniinijohdan-naista, jolta puuttuvat ensimmäiset kaksi aminohappojäännöstä.

25 SL cerevisiae -kantaa MT663 (E2-7B XE11-36 a/α, Atpi Atpi, pep 4-3/pep 4-3) kasvatettiin YPGahlla (1 % Bacto hiivaekstrakti, 2 % Bacto peptoni, 2 % galaktoosi, 1 % laktaatti) OD60onm = 0,6 asti.

30 Kerättiin 100 ml viljelmää sentrifugoimalla, pestiin 10 ml :11a vettä, sentrifugoitiin uudestaan ja suspendoitiin uudestaan 10 ml:aan liuosta, jossa oli 1,2 M sorbitolia, 25 mM Na2EDTA:ta pH = 8,0 ja 6,7 mg/ml ditiotreitolia. Seosta inkuboitiin 30 °C:ssa 15 min, sentrifugoitiin ja solut suspendoitiin uudestaan 10 ml:aan liuosta, jossa oli 1,2 M sorbitolia, 10 mM Na2EDTA:ta, 0,1 M natriumsitraattia, pH = 5,8 ja 35 2 mg NovozymR 234. Seosta inkuboitiin 30 °C:ssa 30 min, solut kerättiin sentrifu goimalla, pestiin 10 ml:ssa 1,2 M sorbitolia ja 10 ml:ssa CAS (1,2 M sorbitoli, 10 f mM CaCl2, 10 mM Tris HC1 (Tris = Tris(hydroksimetyyli)aminometaani) pH = 7,5) 104428 n ja suspendoitiin uudestaan 2 ml:aan CAS:a. Transformaatiota varten 0,1 ml CAS:iin uudelleen suspendoituja soluja sekoitettiin noin 1 pg kanssa pKFN374-plasmidia ja jätettiin huoneenlämpötilaan 15 min. Lisättiin 1 ml (20 % polyetyleeniglykoli 4000, 10 mM CaCl2, 10 mM Tris HC1, pH = 7,5) ja seoksen annettiin seistä vielä 30 min 5 huoneenlämpötilassa. Seos sentrifugoitiin ja pelletti suspendoitiin uudestaan 0,1 ml:aan SOS:a (1,2 M sorbitoli, 33 % v/v YPD, 6,7 mM CaCh, 14 pg/ml leusii-ni) ja inkuboitiin 30 °C:ssa 2 h. Sitten seosta sentrifugoitiin ja pelletti suspendoitiin uudestaan 0,5 ml:aan 1,2 M sorbitolia. Sitten lisättiin 6 ml pehmeäagaria (Sherman et ai., SC-alusta (Methods in Yeast Genetics, Cold Spring Harbor Laboratory, 10 1981), jossa oli 1,2 M sorbitoli plus 2,5 % agari) 52 °C:ssa ja seos kaadettiin peh- mytagarmaljoihin, joissa oli samaa agarilla kovetettua, sorbitolia sisältävää alustaa. Transformanttipesäkkeet kerättiin 3 d kuluttua 30 °C:ssa, eristettiin uudelleen ja käytettiin aloittamaan nesteviljelmiä. Eräs sellainen transformantti, KFN322 valittiin lisäluonnehtimista varten.

15

Hiivakantaa KFN322 kasvatettiin YPD-alustalla (1% hiivaekstrakti, 2 % peptoni (Difco Laboratoriot) ja 2 % glukoosi). 10 ml viljelmää, jossa oli kanta, ravisteltiin 30 °C:ssa OD6oomn = 32. Sentrifugaation jälkeen supematantti analysoitiin FPLC-io-ninvaihtokromatografialla. Hiivasupematantti suodatettiin 0,22 pm MillexR GV-20 suodatinyksikön läpi ja lisättiin 1 ml MonoS-kationinvaihtopylvääseen (0,5 x 0,5 cm), joka oli tasapainotettu 20 mM Bicinellä, pH 8,7. Sen jälkeen, kun pylväs 011 pesty tasapainotuspuskurilla, pylväs eluoitiin lineaarisella NaCl-gradientilla (ΟΙ M) tasapainotuspuskurissa. Tiypsiini-inhibiittoriaktiivisuus määritettiin eluoiduis-ta fraktioista spektrofotometrisellä määrityksellä ja lisäksi absorptiointegraatiolla 25 280 nm:ssä E,%28o(aprotiniini) = 8,3

Saanto oli noin 3 mg/1 aprotiniini(3-58):aa.

30 \ Aminohappoanalyysiä ja N-terminaalisekvensointia varten hiivasupematantti (7 ml) säädettiin pH 8,7:ksi 0,1 M NaOH:lla ja suodatettiin (0,22 pm). Q-Sepharose-anioninvaihtopylväästä (1x4 cm) ulos virtaava neste, joka tasapainotettiin 20 mM Bicinellä, pH 8,7, lisättiin MonoS-kationinvaihtopylvääseen (0,5 x 5 cm). Kationin-35 vaihtokromatografia suoritettiin kuten edellä kuvattiin. Gradientissa eluoidun apro-tiniini(3-58):n konsentraatio mitattiin kromatografoimalla uudestaan MonoS:ssä ja eluoimalla jyrkällä NaCl-gradientilla. Kerättyjä fraktioita konsentroitiin lisää tyhji- 12 104428 ösentrifugaatiossa noin 100 pl:aan ja laitettiin RP-HPLC-pylvääseen (Vydac C4, 4,6 x 250 mm). Eluaatio suoritettiin CH3CN-gradientilla 0,1 % TFA:ssa. Kerätyt fraktiot konsentroitiin noin 100 pl:aan tyhjiösentrifugaatiolla ja otettiin näytteitä N-ter-minaalisekvensointia ja aminohappoanalyysiä varten.

5 N-terminaalisekvensoinnilla saatiin seuraava sekvenssi:

Asp-Phe-Cys-Leu-Glu-Pro-Pro-Tyr-Thr-Gly-Pro-Cys-Lys-Ala-Arg-Ile-Ile-Arg 10 mikä vahvisti, että N-terminaali on oikea.

Aminohappoanalyysi nähdään seuraavassa taulukossa 1. Tästä taulukosta on ilmeistä, että tuotteella on odotettu aminohappokoostumus, so. vähemmän Arg.a ja Pro.ta. Hieman alentunut Ile-sisältö voidaan todennäköisemmin lukea epätäydellisen 15 Ile( 18)-Ile( 19)-hydrolyysin ansioksi (tämä tunnetaan hyvin alalla). Myös Pro ja Arg ovat hieman odotettua korkeampia. Tämä on nähty myös aprotiniinilla itsellään (taulukko 1, toinen palsta).

Kun verrataan edellä mainitulla Erlanger et al:n menetelmällä, aprotiniini(3-58):n 20 spesifisen aktiivisuuden havaittiin olevan identtinen koevirheen puitteissa luonnon aprotiniinin spesifisen aktiivisuuden kanssa.

Esimerkki 2

Aprotiniini(3-58,42 Ser) tuottaminen 25

Aprotiniini(3-58,42 Ser):n synteettinen geeni rakennettiin kuten esimerkissä 1 on kuvattu. Tarkoituksena korvata Arg(42) Ser:llä, käytettiin seuraavia oligonukleotide-jä Vila ja Villa Vilin ja Villin sijasta:

30 Vila: GCAGAGCTAAGTCCAACAACTTCAAGT

27meeri

Villa: AGCAGACTTGAAGTTGTTGGACTTAG 26meeri 35 13 104428

Saatu synteettinen geeni nähdään kuviossa 4. Tämä geeni fuusioituneena MFal-signaali-johtava(l-85)-sekvenssiin kloonattiin pUC19:stä johdettuun plasmidiin pKFN306 (katso kuvio 2).

5 Seuraamalla esimerkin 1 menetelmää saatiin plasmidi pKFN-375, jolla oli seuraava rakenne

TPIp-MFal-signaali-johtava(l-85)-aprotiniini(3-58,42 Ser)-TPIT

10 jossa aprotiniini(3-58,42 Ser) on synteettinen geeni, joka koodaa aprotiniinijohdan-naista, jolta puuttuu ensimmäiset kaksi aminohappojäännöstä ja jossa on Ser Arg:n sijasta asemassa 42.

Hiivakanta MT663 transformoitiin plasmidilla pKFN375, kuten edellä on kuvattu, ja 15 transformoidun kannan KFN324 kasvattaminen antoi noin 12 mg/1 aprotiniini-(3-58,42 Ser):ä.

Kun suoritettiin N-terminaalin sekvensointi, kuten edellä on kuvattu, vahvistettiin seuraava N-terminaalisekvenssi 20

Asp-Phe-Cys-Leu-Glu-Pro-Pro-Tyr-Thr-Gly-Pro-Cys-Lys-Ala-Arg-Ile-Ile-Arg-Tyr-

Phe so. oikea sekvenssi.

25

Aminohappoanalyysi nähdään taulukossa 1 ja se vahvistaa odotetun aminohappo-koostumuksen, so. vähemmän Pro:a ja Arg:a ja enemmän Ser:ä (katso myös edellä olevat huomautukset esimerkissä 1).

30 Kun verrataan edellä mainitulla Erlanger et al:n menetelmällä, aprotiniini(3-58,42 Ser):n spesifisen aktiivisuuden havaittiin olevan identtinen koevirheen puitteissa luonnon aprotiniinin spesifisen aktiivisuuden kanssa.

14 104428

Esimerkki 3

Aprotiniini(l-58):n tuotto

Kuviossa 5 näkyvä synteettinen dupleksi ligoitiin 330 bp:n EcoRI-Hgal-fragmenttiin 5 plasmidilta pKFN9, joka koodaa MF-al-signaali ja johtavaa sekvenssiä ja 144 bp:n Avall-Xbal-fragmenttiin pKFN305:ltä ja suureen EcoRI-Xbal-fragmenttiin pUC19:ltä.

Ligaatioseosta käytettiin transformoimaan kompetenttia E. coli-kantaa (r‘, m+), joka 10 selektoi ampisilliiniresistenssille. Kun sekvensoitiin 32P-leimattu Xbal-EcoRI-frag-mentti, osoitettiin että saatujen pesäkkeiden plasmidit sisälsivät oikean DNA-sek-venssin aprotiniini(l-58):lle.

Plasmidi pKFN414 valittiin lisäkäyttöön. Plasmidin pKFN414 rakenne kuvataan 15 kuviossa 5.

Seuraamalla esimerkin 1 menetelmää saatiin plasmidi pKFN-418, jolla oli seuraava rakenne:

20 TPIP-MFal-signaali-johtava(l-85)-aprotiniini(l-58)-TPIT

Hiivakanta MT663 transformoitiin plasmidilla pKFN418, kuten edellä on kuvattuja transformoidun kannan KFN385 kasvattaminen antoi noin 1-13 mg/1 aprotiniini( 1-58):aa.

25

Kun verrataan edellä mainitulla Erlanger et al:n menetelmällä, aprotiniini(l-58):n, joka tuotettiin tämän keksinnön mukaisesti, spesifisen aktiivisuuden havaittiin olevan identtinen koevirheen puitteissa luonnon aprotiniinin spesifisen aktiivisuuden kanssa.

30

Esimerkki 4

Aprotiniini(l-58,42 Ser):n tuotto

Plasmidi pKFN416, jossa on aprotiniini( 1-58,42 Ser):n geeni, rakennettiin kuten 35 esimerkissä 3 kuvattiin. Seuraamalla esimerkin 1 menetelmää saatiin hiivaplasmidi pKFN420, jolla oli seuraava rakenne: 15 104428

TPIP-MFal-signaali-johtava(l-85)-aprotiniini(l-58,42 Ser)-TPIT

Hiivakanta MT663 transformoitiin plasmidilla pKFN420, kuten edellä on kuvattu, ja transformoidun kannan KFN387 kasvattaminen antoi noin 1-13 mg/1 aprotiniini(l-5 58,42 Ser):ä.

Kun verrataan edellä mainitulla Erlanger et al:n menetelmällä, aprotiniini( 1-58,42 Ser):n spesifisen aktiivisuuden havaittiin olevan identtinen koevirheen puitteissa luonnon aprotiniinin spesifisen aktiivisuuden kanssa.

10

Taulukko 1

Aminohappo Aprotiniini Aprotiniini Aprotiniini Aprotiniini (teoreett.) (havaittu) (3-58) (3-58,42 Ser) ____(havaittu) (havaittu)

Asx__5__5,00__4,96 5,02

Thr_ 3__2^6__2,83 2,85

Ser__1 0,94 0,97__1,78

Glx__3 3,04__001__3,02

Pro__4 4,18__3,15__3,19

Gly__6 5,95 6,00__5,99

Ala__6 5,85__093__6,01

Cys__6 5,20__O03__5,41

Vai__1_ 0,99__0^8__0,98 : Met__1__0^3_____085__0,96

He__2__039__Ml__1,50

Leu__2 1,97____2,03

Tyr__4 3,84__080__3,82

Phe__4 3,98__092__3,96 - Lys__4 3,92__4^02__3,93

Arg__6 6,39 5,20__4,28

Yhteensä__58__56,33__54,04__54,73 ;

Claims

104428

1. Menetelmä aprotiniinin tai sen homologin tuottamiseksi hiivassa, tunnettu siitä, että kasvatetaan hiivakantaa, jossa on replikoitava ekspressiovektori vektorin 5 sisältäessä aprotiniinia tai sen homologia koodaavan DNA-sekvenssin fuusioituna DNA-sekvenssiin, joka koodaa signaali- ja johtopeptidiä, joka huolehtii aprotiniinin tai sen homologin erittymisestä sopivalla ravintoalustalla ja erittyneen aprotiniinin tai aprotiniinihomologin talteenottamisen.

2. Patenttivaatimuksen 1 mukainen menetelmä, tunnettu siitä, että DNA-sek- venssi koodaa aprotiniini(3-58):aa, jolla DNA-sekvenssillä on seuraava sekvenssi: AspPheCysLeuGluProProTyrThrGlyProCysLysAlaArgllelleArg GATTTCTGTTTGGAACCTCCATACACTGGTCCATGTAAAGCTAGAATCATCAGA 15 CTAAAGACAAACCTTGGAGGTATGTGACCAGGTACATTTCGATCTTAGTAGTCT TyrPheTyrAsnAlaLysAlaGlyLeuCysGlnThrPheValTyrGlyGlyCys TACTTCTACAACGCCAAGGCTGGTTTGTGTCAAACTTTCGTTTACGGTGGCTGC ATGAAGATGTTGCGGTTCCGACCAAACACAGTTTGAAAGCAAATGCCACCGACG 20 Ar gAl aLy s Ar gAs nAs nPheLy s S e r AI aGluAspCy sMe t Ar gThr Cy sGl y AGAGCTAAGAGAAACAACTTCAAGTCTGCTGAAGACTGCATGAGAACTTGTGGT TCTCGATTCTCTTTGTTGAAGTTCAGACGACTTCTGACGTACTCTTGAACACCA

25 GlyAla GGTGCC CCACGG

3. TAGTCTATGAAGATGTTGCGGTTCCGACCAAACACAGTTTGAAAGCAAATGCCA ! G1yCysArgAlaLysSerAsnAsnPheLysSerAlaGluAspCysMetArgThr GGCTGCAGAGCTAAGTCCAACAACTTCAAGTCTGCTGAAGACTGCATGAGAACT CCGACGTCTCGATTCAGGTTGTTGAAGTTCAGACGACTTCTGACGTACTCTTGA 104428

3. Patenttivaatimuksen 1 mukainen menetelmä, tunnettu siitä, että DNA-sek-30 venssi koodaa aprotiniini(3-58,42 Ser):ä, jolla DNA-sekvenssillä on seuraava sekvenssi: 104428 AspPheCysLeuGluProProTyrThrGlyProCysLysAlaArgllelleArg GATTTCTGTTTGGAACCTCCATACACTGGTCCATGTAAAGCTAGAATCATCAGA CTAAAGACAAACCTTGGAGGTATGTGACCAGGTACATTTCGATCTTAGTAGTCT

4. Patenttivaatimuksen 1 mukainen menetelmä, tunnettu siitä, että DNA-sek-venssi koodaa aprotiniini(l-58):aa, jolla DNA-sekvenssillä on seuraava sekvenssi:

20 ArgProAspPheCysLeuGluProProTyrThrGlyProCysLysAlaArglle AGGCCTGATTTCTGTTTGGAACCTCCATACACTGGTCCATGTAAAGCTAGAATC TCCGGACTAAAGACAAACCTTGGAGGTATGTGACCAGGTACATTTCGATCTTAG IleArgTyrPheTyrAsnAlaLysAlaGlyLeuCysGlnThrPheValTyrGly 25 ATCAGATACTTCTACAACGCCAAGGCTGGTTTGTGTCAAACTTTCGTTTACGGT TAGTCTATGAAGATGTTGCGGTTCCGACCAAACACAGTTTGAAAGCAAATGCCA GlyCysArgAlaLysArgAsnAsnPheLysSerAlaGluAspCysMetArgThr GGCTGCAGAGCTAAGAGAAACAACTTCAAGTCTGCTGAAGACTGCATGAGAACT 30 CCGACGTCTCGATTCTCTTTGTTGAAGTTCAGACGACTTCTGACGTACTCTTGA _ I CysGlyGlyAla TGTGGTGGTGCC ACACCACCACGG 35 104428

5 CysGlyGlyAla TGTGGTGGTGCC ACACCACCACGG

5 GlyAla GGTGCC CCACGG tai DNA-sekvenssi koodaa aprotiniini(3-58,42 Ser):ä ja sillä on seuraava sekvenssi: ^ 10 AspPheCysLeuGluProProTyrThrGlyProCysLysAlaArgllelleArg GATTTCTGTTTGGAACCTCCATACACTGGTCCATGTAAAGCTAGAATCATCAGA CTAAAGACAAACCTTGGAGGTATGTGACCAGGTACATTTCGATCTTAGTAGTCT

15 TyrPheTyrAsnAlaLysAlaGlyLeuCysGlnThrPheValTyrGlyGlyCys TACTTCTACAACGCCAAGGCTGGTTTGTGTCAAACTTTCGTTTACGGTGGCTGC ATGAAGATGTTGCGGTTCCGACCAAACACAGTTTGAAAGCAAATGCCACCGACG ArgAlaLysSerAsnAsnPheLysSerAlaGluAspCysMetArgThrCysGly 20 AGAGCTAAGTCCAACAACTTCAAGTCTGCTGAAGACTGCATGAGAACTTGTGGT TCTCGATTCAGGTTGTTGAAGTTCAGACGACTTCTGACGTACTCTTGAACACCA ! GlyAla \ GGTGCC I • 25 CCACGG j tai DNA-sekvenssi koodaa aprotiniini(l-58,42 Ser):ä ja sillä on seuraava sekvenssi: ArgProAspPheCysLeuGluProProTyrThrGlyProCysLysAlaArglle 30 AGGCCTGATTTCTGTTTGGAACCTCCATACACTGGTCCATGTAAAGCTAGAATC TCCGGACTAAAGACAAACCTTGGAGGTATGTGACCAGGTACATTTCGATCTTAG j ..... { IleArgTyrPheTyrAsnAlaLysAlaGlyLeuCysGlnThrPheValTyrGly ATCAGATACTTCTACAACGCCAAGGCTGGTTTGTGTCAAACTTTCGTTTACGGT

5 CysGlyGlyAla TGTGGTGGTGCC ACACCACCACGG

5 GlyAla GGTGCC CCACGG

5 ArgProAspPheCysLeuGluProProTyrThrGlyProCysLysAlaArglle AGGCCTGATTTCTGTTTGGAACCTCCATACACTGGTCCATGTAAAGCTAGAATC TCCGGACTAAAGACAAACCTTGGAGGTATGTGACCAGGTACATTTCGATCTTAG IleArgTyrPheTyrAsnAlaLysAlaGlyLeuCysGlnThrPheValTyrGly 10 ATCAGATACTTCTACAACGCCAAGGCTGGTTTGTGTCAAACTTTCGTTTACGGT TAGTCTATGAAGATGTTGCGGTTCCGACCAAACACAGTTTGAAAGCAAATGCCA GlyCysArgAlaLysSerAsnAsnPheLysSerAlaGluAspCysMetArgThr GGCTGCAGAGCTAAGTCCAACAACTTCAAGTCTGCTGAAGACTGCATGAGAACT 15 CCGACGTCTCGATTCAGGTTGTTGAAGTTCAGACGACTTCTGACGTACTCTTGA CysGlyGlyAla TGTGGTGGTGCC ACACCACCACGG 20

5. Patenttivaatimuksen 1 mukainen menetelmä, tunnettu siitä, että DNA-sek-venssi koodaa aprotiniini(l-58,42 Ser):ä, jolla DNA-sekvenssillä on seuraava nu-kleotidisekvenssi

5 TyrPheTyrAsnAlaLysAlaGlyLeuCysGlnThrPheValTyrGlyGlyCys TACTTCTACAACGCCAAGGCTGGTTTGTGTCAAACTTTCGTTTACGGTGGCTGC ATGAAGATGTTGCGGTTCCGACCAAACACAGTTTGAAAGCAAATGCCACCGACG ArgAlaLysSerAsnAsnPheLysSerAlaGluAspCysMetArgThrCysGly 10 AGAGCTAAGTCCAACAACTTCAAGTCTGCTGAAGACTGCATGAGAACTTGTGGT TCTCGATTCAGGTTGTTGAAGTTCAGACGACTTCTGACGTACTCTTGAACACCA GlyAla GGTGCC 15 CCACGG

6. Vektori, joka kykenee replikoituinaan hiivassa ja sisältää aprotiniinia tai sen homologia koodaavan DNA-sekvenssin fuusioituna DNA-sekvenssiin, joka koodaa signaali- ja johtopeptidiä, joka sallii aprotiniinin tai aprotiniinihomologin erittymisen. 25

7. Patenttivaatimuksen 6 mukainen vektori, tunnettu siitä, että DNA-sekvenssi koodaa aprotiniini(3-58):aa ja sillä on seuraava sekvenssi: AspPheCysLeuGluProProTyrThrGlyProCysLysAlaArgllelleArg 30 GATTTCTGTTTGGAACCTCCATACACTGGTCCATGTAAAGCTAGAATCATCAGA * CTAAAGACAAACCTTGGAGGTATGTGACCAGGTACATTTCGATCTTAGTAGTCT TyrPheTyrAsnAlaLysAlaGlyLeuCysGlnThrPheValTyrGlyGlyCys TACTTCTACAACGCCAAGGCTGGTTTGTGTCAAACTTTCGTTTACGGTGGCTGC

35 ATGAAGATGTTGCGGTTCCGACCAAACACAGTTTGAAAGCAAATGCCACCGACG 104428 ArgAlaLysArgAsnAsnPheLysSerAlaGluAspCysMetArgThrCysGly AGAGCTAAGAGAAACAACTTCAAGTCTGCTGAAGACTGCATGAGAACTTGTGGT TCTCGATTCTCTTTGTTGAAGTTCAGACGACTTCTGACGTACTCTTGAACACCA

8. Patenttivaatimuksen 6 mukainen vektori, tunnettu siitä, että DNA-sekvenssi 10 koodaa aprotiniini(3-58,42 Ser):ä ja sillä on seuraava sekvenssi: AspPheCysLeuGluProProTyrThrGlyProCysLysAlaArgllelleArg GATTTCTGTTTGGAACCTCCATACACTGGTCCATGTAAAGCTAGAATCATCAGA CTAAAGACAAACCTTGGAGGTATGTGACCAGGTACATTTCGATCTTAGTAGTCT 15 TyrPheTyrAsnAlaLysAlaGlyLeuCysGlnThrPheValTyrGlyGlyCys TACTTCTACAACGCCAAGGCTGGTTTGTGTCAAACTTTCGTTTACGGTGGCTGC ATGAAGATGTTGCGGTTCCGACCAAACACAGTTTGAAAGCAAATGCCACCGACG

20 ArgAlaLysSerAsnAsnPheLysSerAlaGluAspCysMetArgThrCysGly AGAGCTAAGTCCAACAACTTCAAGTCTGCTGAAGACTGCATGAGAACTTGTGGT TCTCGATTCAGGTTGTTGAAGTTCAGACGACTTCTGACGTACTCTTGAACACCA GlyAla 25 GGTGCC CCACGG

9. Patenttivaatimuksen 6 mukainen vektori, tunnettu siitä, että DNA-sekvenssi koodaa aprotiniini(l-58):aa ja sillä on seuraava sekvenssi: 30 | φ * ArgProAspPheCysLeuGluProProTyrThrGlyProCysLysAlaArglle AGGCCTGATTTCTGTTTGGAACCTCCATACACTGGTCCATGTAAAGCTAGAATC TCCGGACTAAAGACAAACCTTGGAGGTATGTGACCAGGTACATTTCGATCTTAG

35 IleArgTyrPheTyrAsnAlaLysAlaGlyLeuCysGlnThrPheValTyrGly ATCAGATACTTCTACAACGCCAAGGCTGGTTTGTGTCAAACTTTCGTTTACGGT TAGTCTATGAAGATGTTGCGGTTCCGACCAAACACAGTTTGAAAGCAAATGCCA GlyCysArgAlaLysArgAsnAsnPheLysSerAlaGluAspCysMetArgThr GGCTGCAGAGCTAAGAGAAACAACTTCAAGTCTGCTGAAGACTGCATGAGAACT CCGACGTCTCGATTCTCTTTGTTGAAGTTCAGACGACTTCTGACGTACTCTTGA 104428

10. Patenttivaatimuksen 6 mukainen vektori, tunnettu siitä, että DNA-sekvenssi 10 koodaa aprotmiini( 1-5 8,42 Ser):ä ja sillä on seuraava sekvenssi: ArgProAspPheCysLeuGluProProTyrThrGlyProCysLysAlaArglle AGGCCTGATTTCTGTTTGGAACCTCCATACACTGGTCCATGTAAAGCTAGAATC TCCGGACTAAAGACAAACCTTGGAGGTATGTGACCAGGTACATTTCGATCTTAG 15 IleArgTyrPheTyrAsnAlaLysAlaGlyLeuCysGlnThrPheValTyrGly ATCAGATACTTCTACAACGCCAAGGCTGGTTTGTGTCAAACTTTCGTTTACGGT TAGTCTATGAAGATGTTGCGGTTCCGACCAAACACAGTTTGAAAGCAAATGCCA

20 GlyCysArgAlaLysSerAsnAsnPheLysSerAlaGluAspCysMetArgThr GGCTGCAGAGCTAAGTCCAACAACTTCAAGTCTGCTGAAGACTGCATGAGAACT CCGACGTCTCGATTCAGGTTGTTGAAGTTCAGACGACTTCTGACGTACTCTTGA CysGlyGlyAla : 25 TGTGGTGGTGCC ACACCACCACGG

11. DNA-sekvenssi koodaa aprotiniini(3-58):aa ja sillä on seuraava sekvenssi:

30 AspPheCysLeuGluProProTyrThrGlyProCysLysAlaArgllelleArg GATTTCTGTTTGGAACCTCCATACACTGGTCCATGTAAAGCTAGAATCATCAGA CTAAAGACAAACCTTGGAGGTATGTGACCAGGTACATTTCGATCTTAGTAGTCT TyrPheTyrAsnAlaLysAlaGlyLeuCysGlnThrPheValTyrGlyGlyCys

35 TACTTCTACAACGCCAAGGCTGGTTTGTGTCAAACTTTCGTTTACGGTGGCTGC ATGAAGATGTTGCGGTTCCGACCAAACACAGTTTGAAAGCAAATGCCACCGACG ArgAlaLysArgAsnAsnPheLysSerAlaGluAspCysMetArgThrCysGly AGAGCTAAGAGAAACAACTTCAAGTCTGCTGAAGACTGCATGAGAACTTGTGGT TCTCGATTCTCTTTGTTGAAGTTCAGACGACTTCTGACGTACTCTTGAACACCA 21 104428

12. Hiivakanta, joka on transformoitu patenttivaatimuksen 6 mukaisella vektorilla. 10