DE3650101T2 - Analoga von Insulin und deren Herstellungsmethode. - Google Patents
Analoga von Insulin und deren Herstellungsmethode.Info
- Publication number
- DE3650101T2 DE3650101T2 DE3650101T DE3650101T DE3650101T2 DE 3650101 T2 DE3650101 T2 DE 3650101T2 DE 3650101 T DE3650101 T DE 3650101T DE 3650101 T DE3650101 T DE 3650101T DE 3650101 T2 DE3650101 T2 DE 3650101T2
- Authority
- DE
- Germany
- Prior art keywords
- human insulin
- insulin
- amino acid
- chain
- ala
- Prior art date
- Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
- Expired - Lifetime
Links
- NOESYZHRGYRDHS-UHFFFAOYSA-N insulin Chemical compound N1C(=O)C(NC(=O)C(CCC(N)=O)NC(=O)C(CCC(O)=O)NC(=O)C(C(C)C)NC(=O)C(NC(=O)CN)C(C)CC)CSSCC(C(NC(CO)C(=O)NC(CC(C)C)C(=O)NC(CC=2C=CC(O)=CC=2)C(=O)NC(CCC(N)=O)C(=O)NC(CC(C)C)C(=O)NC(CCC(O)=O)C(=O)NC(CC(N)=O)C(=O)NC(CC=2C=CC(O)=CC=2)C(=O)NC(CSSCC(NC(=O)C(C(C)C)NC(=O)C(CC(C)C)NC(=O)C(CC=2C=CC(O)=CC=2)NC(=O)C(CC(C)C)NC(=O)C(C)NC(=O)C(CCC(O)=O)NC(=O)C(C(C)C)NC(=O)C(CC(C)C)NC(=O)C(CC=2NC=NC=2)NC(=O)C(CO)NC(=O)CNC2=O)C(=O)NCC(=O)NC(CCC(O)=O)C(=O)NC(CCCNC(N)=N)C(=O)NCC(=O)NC(CC=3C=CC=CC=3)C(=O)NC(CC=3C=CC=CC=3)C(=O)NC(CC=3C=CC(O)=CC=3)C(=O)NC(C(C)O)C(=O)N3C(CCC3)C(=O)NC(CCCCN)C(=O)NC(C)C(O)=O)C(=O)NC(CC(N)=O)C(O)=O)=O)NC(=O)C(C(C)CC)NC(=O)C(CO)NC(=O)C(C(C)O)NC(=O)C1CSSCC2NC(=O)C(CC(C)C)NC(=O)C(NC(=O)C(CCC(N)=O)NC(=O)C(CC(N)=O)NC(=O)C(NC(=O)C(N)CC=1C=CC=CC=1)C(C)C)CC1=CN=CN1 NOESYZHRGYRDHS-UHFFFAOYSA-N 0.000 title claims description 210
- 108090001061 Insulin Proteins 0.000 title claims description 89
- 102000004877 Insulin Human genes 0.000 title claims description 88
- 229940125396 insulin Drugs 0.000 title claims description 82
- PBGKTOXHQIOBKM-FHFVDXKLSA-N insulin (human) Chemical class C([C@@H](C(=O)N[C@@H](CC(C)C)C(=O)N[C@H]1CSSC[C@H]2C(=O)N[C@H](C(=O)N[C@@H](CO)C(=O)N[C@H](C(=O)N[C@H](C(N[C@@H](CO)C(=O)N[C@@H](CC(C)C)C(=O)N[C@@H](CC=3C=CC(O)=CC=3)C(=O)N[C@@H](CCC(N)=O)C(=O)N[C@@H](CC(C)C)C(=O)N[C@@H](CCC(O)=O)C(=O)N[C@@H](CC(N)=O)C(=O)N[C@@H](CC=3C=CC(O)=CC=3)C(=O)N[C@@H](CSSC[C@H](NC(=O)[C@H](C(C)C)NC(=O)[C@H](CC(C)C)NC(=O)[C@H](CC=3C=CC(O)=CC=3)NC(=O)[C@H](CC(C)C)NC(=O)[C@H](C)NC(=O)[C@H](CCC(O)=O)NC(=O)[C@H](C(C)C)NC(=O)[C@H](CC(C)C)NC(=O)[C@H](CC=3NC=NC=3)NC(=O)[C@H](CO)NC(=O)CNC1=O)C(=O)NCC(=O)N[C@@H](CCC(O)=O)C(=O)N[C@@H](CCCNC(N)=N)C(=O)NCC(=O)N[C@@H](CC=1C=CC=CC=1)C(=O)N[C@@H](CC=1C=CC=CC=1)C(=O)N[C@@H](CC=1C=CC(O)=CC=1)C(=O)N[C@@H]([C@@H](C)O)C(=O)N1[C@@H](CCC1)C(=O)N[C@@H](CCCCN)C(=O)N[C@@H]([C@@H](C)O)C(O)=O)C(=O)N[C@@H](CC(N)=O)C(O)=O)=O)CSSC[C@@H](C(N2)=O)NC(=O)[C@H](CCC(N)=O)NC(=O)[C@H](CCC(O)=O)NC(=O)[C@H](C(C)C)NC(=O)[C@@H](NC(=O)CN)[C@@H](C)CC)[C@@H](C)CC)[C@@H](C)O)NC(=O)[C@H](CCC(N)=O)NC(=O)[C@H](CC(N)=O)NC(=O)[C@@H](NC(=O)[C@@H](N)CC=1C=CC=CC=1)C(C)C)C1=CN=CN1 PBGKTOXHQIOBKM-FHFVDXKLSA-N 0.000 claims description 127
- 101000976075 Homo sapiens Insulin Proteins 0.000 claims description 97
- 125000000539 amino acid group Chemical group 0.000 claims description 62
- 238000006467 substitution reaction Methods 0.000 claims description 45
- 239000002243 precursor Substances 0.000 claims description 39
- 238000000034 method Methods 0.000 claims description 29
- 240000004808 Saccharomyces cerevisiae Species 0.000 claims description 22
- 239000000243 solution Substances 0.000 claims description 20
- 150000001413 amino acids Chemical group 0.000 claims description 17
- AYFVYJQAPQTCCC-GBXIJSLDSA-N L-threonine Chemical compound C[C@@H](O)[C@H](N)C(O)=O AYFVYJQAPQTCCC-GBXIJSLDSA-N 0.000 claims description 16
- 230000000694 effects Effects 0.000 claims description 16
- 238000006243 chemical reaction Methods 0.000 claims description 15
- 239000004473 Threonine Substances 0.000 claims description 14
- 238000002360 preparation method Methods 0.000 claims description 14
- 229960002898 threonine Drugs 0.000 claims description 14
- -1 L-threonine ester Chemical class 0.000 claims description 13
- 238000004519 manufacturing process Methods 0.000 claims description 13
- AYFVYJQAPQTCCC-UHFFFAOYSA-N Threonine Natural products CC(O)C(N)C(O)=O AYFVYJQAPQTCCC-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 12
- 108090000765 processed proteins & peptides Proteins 0.000 claims description 12
- 108091028043 Nucleic acid sequence Proteins 0.000 claims description 11
- 210000004899 c-terminal region Anatomy 0.000 claims description 9
- 230000007935 neutral effect Effects 0.000 claims description 8
- 230000008569 process Effects 0.000 claims description 8
- 102000004142 Trypsin Human genes 0.000 claims description 7
- 108090000631 Trypsin Proteins 0.000 claims description 7
- 230000015572 biosynthetic process Effects 0.000 claims description 7
- 239000012588 trypsin Substances 0.000 claims description 7
- 239000002609 medium Substances 0.000 claims description 6
- 239000007864 aqueous solution Substances 0.000 claims description 5
- 238000000338 in vitro Methods 0.000 claims description 5
- 230000001851 biosynthetic effect Effects 0.000 claims description 4
- 239000001963 growth medium Substances 0.000 claims description 4
- 230000002255 enzymatic effect Effects 0.000 claims description 3
- 102000003670 Carboxypeptidase B Human genes 0.000 claims description 2
- 108090000087 Carboxypeptidase B Proteins 0.000 claims description 2
- 235000015097 nutrients Nutrition 0.000 claims description 2
- 150000003839 salts Chemical class 0.000 claims description 2
- 239000000126 substance Substances 0.000 claims description 2
- 239000011541 reaction mixture Substances 0.000 claims 1
- 108090000623 proteins and genes Proteins 0.000 description 38
- 239000013612 plasmid Substances 0.000 description 35
- 239000012634 fragment Substances 0.000 description 25
- 239000004026 insulin derivative Substances 0.000 description 23
- 235000014680 Saccharomyces cerevisiae Nutrition 0.000 description 21
- 238000010276 construction Methods 0.000 description 19
- DTQVDTLACAAQTR-UHFFFAOYSA-N Trifluoroacetic acid Chemical compound OC(=O)C(F)(F)F DTQVDTLACAAQTR-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 18
- 239000000203 mixture Substances 0.000 description 14
- 108020004414 DNA Proteins 0.000 description 12
- 239000000539 dimer Substances 0.000 description 11
- 229940024606 amino acid Drugs 0.000 description 10
- 230000035772 mutation Effects 0.000 description 10
- 230000009466 transformation Effects 0.000 description 10
- 241000588724 Escherichia coli Species 0.000 description 9
- 229940123452 Rapid-acting insulin Drugs 0.000 description 9
- 108010026951 Short-Acting Insulin Proteins 0.000 description 9
- 239000006228 supernatant Substances 0.000 description 9
- FBPFZTCFMRRESA-FSIIMWSLSA-N D-Glucitol Natural products OC[C@H](O)[C@H](O)[C@@H](O)[C@H](O)CO FBPFZTCFMRRESA-FSIIMWSLSA-N 0.000 description 8
- 238000002703 mutagenesis Methods 0.000 description 8
- 231100000350 mutagenesis Toxicity 0.000 description 8
- 229920000642 polymer Polymers 0.000 description 8
- 239000000600 sorbitol Substances 0.000 description 8
- 210000004027 cell Anatomy 0.000 description 7
- 239000000047 product Substances 0.000 description 7
- 108020004705 Codon Proteins 0.000 description 6
- ISWSIDIOOBJBQZ-UHFFFAOYSA-N Phenol Chemical compound OC1=CC=CC=C1 ISWSIDIOOBJBQZ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 6
- FAPWRFPIFSIZLT-UHFFFAOYSA-M Sodium chloride Chemical compound [Na+].[Cl-] FAPWRFPIFSIZLT-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 6
- 238000005119 centrifugation Methods 0.000 description 6
- 102000004196 processed proteins & peptides Human genes 0.000 description 6
- 102000053602 DNA Human genes 0.000 description 5
- 238000001712 DNA sequencing Methods 0.000 description 5
- 102000003960 Ligases Human genes 0.000 description 5
- 108090000364 Ligases Proteins 0.000 description 5
- 108700005078 Synthetic Genes Proteins 0.000 description 5
- 230000009471 action Effects 0.000 description 5
- AVKUERGKIZMTKX-NJBDSQKTSA-N ampicillin Chemical compound C1([C@@H](N)C(=O)N[C@H]2[C@H]3SC([C@@H](N3C2=O)C(O)=O)(C)C)=CC=CC=C1 AVKUERGKIZMTKX-NJBDSQKTSA-N 0.000 description 5
- 229960000723 ampicillin Drugs 0.000 description 5
- 230000003111 delayed effect Effects 0.000 description 5
- 238000002347 injection Methods 0.000 description 5
- 239000007924 injection Substances 0.000 description 5
- 102000004169 proteins and genes Human genes 0.000 description 5
- 238000003786 synthesis reaction Methods 0.000 description 5
- 239000007222 ypd medium Substances 0.000 description 5
- 241001524679 Escherichia virus M13 Species 0.000 description 4
- ROHFNLRQFUQHCH-YFKPBYRVSA-N L-leucine Chemical compound CC(C)C[C@H](N)C(O)=O ROHFNLRQFUQHCH-YFKPBYRVSA-N 0.000 description 4
- 108090000279 Peptidyltransferases Proteins 0.000 description 4
- IXKSXJFAGXLQOQ-XISFHERQSA-N WHWLQLKPGQPMY Chemical compound C([C@@H](C(=O)N[C@@H](CC=1C2=CC=CC=C2NC=1)C(=O)N[C@@H](CC(C)C)C(=O)N[C@@H](CCC(N)=O)C(=O)N[C@@H](CC(C)C)C(=O)N1CCC[C@H]1C(=O)NCC(=O)N[C@@H](CCC(N)=O)C(=O)N[C@@H](CC(O)=O)C(=O)N1CCC[C@H]1C(=O)N[C@@H](CCSC)C(=O)N[C@@H](CC=1C=CC(O)=CC=1)C(O)=O)NC(=O)[C@@H](N)CC=1C2=CC=CC=C2NC=1)C1=CNC=N1 IXKSXJFAGXLQOQ-XISFHERQSA-N 0.000 description 4
- JLCPHMBAVCMARE-UHFFFAOYSA-N [3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[5-(2-amino-6-oxo-1H-purin-9-yl)-3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[5-(2-amino-6-oxo-1H-purin-9-yl)-3-[[5-(2-amino-6-oxo-1H-purin-9-yl)-3-hydroxyoxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxyoxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(5-methyl-2,4-dioxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxyoxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(5-methyl-2,4-dioxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(4-amino-2-oxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(5-methyl-2,4-dioxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(5-methyl-2,4-dioxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(4-amino-2-oxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(4-amino-2-oxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(4-amino-2-oxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(4-amino-2-oxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methyl [5-(6-aminopurin-9-yl)-2-(hydroxymethyl)oxolan-3-yl] hydrogen phosphate Polymers Cc1cn(C2CC(OP(O)(=O)OCC3OC(CC3OP(O)(=O)OCC3OC(CC3O)n3cnc4c3nc(N)[nH]c4=O)n3cnc4c3nc(N)[nH]c4=O)C(COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3CO)n3cnc4c(N)ncnc34)n3ccc(N)nc3=O)n3cnc4c(N)ncnc34)n3ccc(N)nc3=O)n3ccc(N)nc3=O)n3ccc(N)nc3=O)n3cnc4c(N)ncnc34)n3cnc4c(N)ncnc34)n3cc(C)c(=O)[nH]c3=O)n3cc(C)c(=O)[nH]c3=O)n3ccc(N)nc3=O)n3cc(C)c(=O)[nH]c3=O)n3cnc4c3nc(N)[nH]c4=O)n3cnc4c(N)ncnc34)n3cnc4c(N)ncnc34)n3cnc4c(N)ncnc34)n3cnc4c(N)ncnc34)O2)c(=O)[nH]c1=O JLCPHMBAVCMARE-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 4
- 238000010521 absorption reaction Methods 0.000 description 4
- 150000001875 compounds Chemical class 0.000 description 4
- 238000010254 subcutaneous injection Methods 0.000 description 4
- 239000007929 subcutaneous injection Substances 0.000 description 4
- 239000000725 suspension Substances 0.000 description 4
- LENZDBCJOHFCAS-UHFFFAOYSA-N tris Chemical compound OCC(N)(CO)CO LENZDBCJOHFCAS-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 4
- CSCPPACGZOOCGX-UHFFFAOYSA-N Acetone Chemical compound CC(C)=O CSCPPACGZOOCGX-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- UXVMQQNJUSDDNG-UHFFFAOYSA-L Calcium chloride Chemical compound [Cl-].[Cl-].[Ca+2] UXVMQQNJUSDDNG-UHFFFAOYSA-L 0.000 description 3
- WQZGKKKJIJFFOK-GASJEMHNSA-N Glucose Natural products OC[C@H]1OC(O)[C@H](O)[C@@H](O)[C@@H]1O WQZGKKKJIJFFOK-GASJEMHNSA-N 0.000 description 3
- 101710163270 Nuclease Proteins 0.000 description 3
- 108091034117 Oligonucleotide Proteins 0.000 description 3
- 108010076181 Proinsulin Proteins 0.000 description 3
- 108020004682 Single-Stranded DNA Proteins 0.000 description 3
- HEMHJVSKTPXQMS-UHFFFAOYSA-M Sodium hydroxide Chemical compound [OH-].[Na+] HEMHJVSKTPXQMS-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 3
- 108700015934 Triose-phosphate isomerases Proteins 0.000 description 3
- 239000007983 Tris buffer Substances 0.000 description 3
- 238000007792 addition Methods 0.000 description 3
- 238000005571 anion exchange chromatography Methods 0.000 description 3
- 239000011230 binding agent Substances 0.000 description 3
- 239000001110 calcium chloride Substances 0.000 description 3
- 235000011148 calcium chloride Nutrition 0.000 description 3
- 229910001628 calcium chloride Inorganic materials 0.000 description 3
- 206010061592 cardiac fibrillation Diseases 0.000 description 3
- 230000006240 deamidation Effects 0.000 description 3
- 238000009795 derivation Methods 0.000 description 3
- 206010012601 diabetes mellitus Diseases 0.000 description 3
- 108010052305 exodeoxyribonuclease III Proteins 0.000 description 3
- 230000002600 fibrillogenic effect Effects 0.000 description 3
- 238000011049 filling Methods 0.000 description 3
- 239000008103 glucose Substances 0.000 description 3
- 238000009396 hybridization Methods 0.000 description 3
- 230000007062 hydrolysis Effects 0.000 description 3
- 238000006460 hydrolysis reaction Methods 0.000 description 3
- 238000003780 insertion Methods 0.000 description 3
- 230000037431 insertion Effects 0.000 description 3
- 125000000956 methoxy group Chemical group [H]C([H])([H])O* 0.000 description 3
- 229920001184 polypeptide Polymers 0.000 description 3
- 108091008146 restriction endonucleases Proteins 0.000 description 3
- 230000003248 secreting effect Effects 0.000 description 3
- 238000012163 sequencing technique Methods 0.000 description 3
- 238000002741 site-directed mutagenesis Methods 0.000 description 3
- 239000011780 sodium chloride Substances 0.000 description 3
- XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N water Substances O XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- 229920001817 Agar Polymers 0.000 description 2
- 102000012410 DNA Ligases Human genes 0.000 description 2
- 108010061982 DNA Ligases Proteins 0.000 description 2
- ZGTMUACCHSMWAC-UHFFFAOYSA-L EDTA disodium salt (anhydrous) Chemical compound [Na+].[Na+].OC(=O)CN(CC([O-])=O)CCN(CC(O)=O)CC([O-])=O ZGTMUACCHSMWAC-UHFFFAOYSA-L 0.000 description 2
- PEDCQBHIVMGVHV-UHFFFAOYSA-N Glycerine Chemical compound OCC(O)CO PEDCQBHIVMGVHV-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 101001027925 Homo sapiens Metastasis-associated protein MTA1 Proteins 0.000 description 2
- VEXZGXHMUGYJMC-UHFFFAOYSA-N Hydrochloric acid Chemical compound Cl VEXZGXHMUGYJMC-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- ROHFNLRQFUQHCH-UHFFFAOYSA-N Leucine Natural products CC(C)CC(N)C(O)=O ROHFNLRQFUQHCH-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 102100037517 Metastasis-associated protein MTA1 Human genes 0.000 description 2
- 102100033598 Triosephosphate isomerase Human genes 0.000 description 2
- PTFCDOFLOPIGGS-UHFFFAOYSA-N Zinc dication Chemical compound [Zn+2] PTFCDOFLOPIGGS-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 239000008272 agar Substances 0.000 description 2
- 125000001931 aliphatic group Chemical group 0.000 description 2
- 125000003118 aryl group Chemical group 0.000 description 2
- 230000027455 binding Effects 0.000 description 2
- 229940041514 candida albicans extract Drugs 0.000 description 2
- 238000012512 characterization method Methods 0.000 description 2
- 238000004140 cleaning Methods 0.000 description 2
- 238000001816 cooling Methods 0.000 description 2
- 230000008034 disappearance Effects 0.000 description 2
- 238000012869 ethanol precipitation Methods 0.000 description 2
- 238000000605 extraction Methods 0.000 description 2
- 238000002523 gelfiltration Methods 0.000 description 2
- 125000002349 hydroxyamino group Chemical group [H]ON([H])[*] 0.000 description 2
- 238000001802 infusion Methods 0.000 description 2
- RLSSMJSEOOYNOY-UHFFFAOYSA-N m-cresol Chemical compound CC1=CC=CC(O)=C1 RLSSMJSEOOYNOY-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 235000012054 meals Nutrition 0.000 description 2
- 239000012528 membrane Substances 0.000 description 2
- LXCFILQKKLGQFO-UHFFFAOYSA-N methylparaben Chemical compound COC(=O)C1=CC=C(O)C=C1 LXCFILQKKLGQFO-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 239000000178 monomer Substances 0.000 description 2
- 239000002773 nucleotide Substances 0.000 description 2
- 125000003729 nucleotide group Chemical group 0.000 description 2
- 239000008188 pellet Substances 0.000 description 2
- 239000002244 precipitate Substances 0.000 description 2
- 108020003175 receptors Proteins 0.000 description 2
- 102000005962 receptors Human genes 0.000 description 2
- 239000001509 sodium citrate Substances 0.000 description 2
- NLJMYIDDQXHKNR-UHFFFAOYSA-K sodium citrate Chemical compound O.O.[Na+].[Na+].[Na+].[O-]C(=O)CC(O)(CC([O-])=O)C([O-])=O NLJMYIDDQXHKNR-UHFFFAOYSA-K 0.000 description 2
- 239000012138 yeast extract Substances 0.000 description 2
- VHJLVAABSRFDPM-UHFFFAOYSA-N 1,4-dithiothreitol Chemical compound SCC(O)C(O)CS VHJLVAABSRFDPM-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- BDKLKNJTMLIAFE-UHFFFAOYSA-N 2-(3-fluorophenyl)-1,3-oxazole-4-carbaldehyde Chemical compound FC1=CC=CC(C=2OC=C(C=O)N=2)=C1 BDKLKNJTMLIAFE-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- RZVAJINKPMORJF-UHFFFAOYSA-N Acetaminophen Chemical compound CC(=O)NC1=CC=C(O)C=C1 RZVAJINKPMORJF-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- QTBSBXVTEAMEQO-UHFFFAOYSA-M Acetate Chemical compound CC([O-])=O QTBSBXVTEAMEQO-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 1
- FJVAQLJNTSUQPY-CIUDSAMLSA-N Ala-Ala-Lys Chemical compound C[C@H](N)C(=O)N[C@@H](C)C(=O)N[C@H](C(O)=O)CCCCN FJVAQLJNTSUQPY-CIUDSAMLSA-N 0.000 description 1
- 241000193830 Bacillus <bacterium> Species 0.000 description 1
- 108010023063 Bacto-peptone Proteins 0.000 description 1
- 101100148606 Caenorhabditis elegans pst-1 gene Proteins 0.000 description 1
- 241000700199 Cavia porcellus Species 0.000 description 1
- 108020004638 Circular DNA Proteins 0.000 description 1
- KRKNYBCHXYNGOX-UHFFFAOYSA-K Citrate Chemical compound [O-]C(=O)CC(O)(CC([O-])=O)C([O-])=O KRKNYBCHXYNGOX-UHFFFAOYSA-K 0.000 description 1
- 108091026890 Coding region Proteins 0.000 description 1
- 206010010071 Coma Diseases 0.000 description 1
- 102000005593 Endopeptidases Human genes 0.000 description 1
- 108010059378 Endopeptidases Proteins 0.000 description 1
- JZDHUJAFXGNDSB-WHFBIAKZSA-N Glu-Ala Chemical group OC(=O)[C@H](C)NC(=O)[C@@H](N)CCC(O)=O JZDHUJAFXGNDSB-WHFBIAKZSA-N 0.000 description 1
- 108060003199 Glucagon Proteins 0.000 description 1
- 108091027305 Heteroduplex Proteins 0.000 description 1
- JVTAAEKCZFNVCJ-UHFFFAOYSA-M Lactate Chemical compound CC(O)C([O-])=O JVTAAEKCZFNVCJ-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 1
- NPBGTPKLVJEOBE-IUCAKERBSA-N Lys-Arg Chemical group NCCCC[C@H](N)C(=O)N[C@H](C(O)=O)CCCNC(N)=N NPBGTPKLVJEOBE-IUCAKERBSA-N 0.000 description 1
- 239000001888 Peptone Substances 0.000 description 1
- 108010080698 Peptones Proteins 0.000 description 1
- 108010005991 Pork Regular Insulin Proteins 0.000 description 1
- GLEOIKLQBZNKJZ-WDSKDSINSA-N Pro-Asp Chemical compound OC(=O)C[C@@H](C(O)=O)NC(=O)[C@@H]1CCCN1 GLEOIKLQBZNKJZ-WDSKDSINSA-N 0.000 description 1
- 108010076504 Protein Sorting Signals Proteins 0.000 description 1
- 108020004511 Recombinant DNA Proteins 0.000 description 1
- 241000282887 Suidae Species 0.000 description 1
- 101000993800 Sus scrofa Insulin Proteins 0.000 description 1
- PNVLWFYAPWAQMU-CIUDSAMLSA-N Val-Ile Chemical compound CC[C@H](C)[C@@H](C(O)=O)NC(=O)[C@@H](N)C(C)C PNVLWFYAPWAQMU-CIUDSAMLSA-N 0.000 description 1
- 239000002253 acid Substances 0.000 description 1
- 230000002378 acidificating effect Effects 0.000 description 1
- 230000001154 acute effect Effects 0.000 description 1
- 239000011543 agarose gel Substances 0.000 description 1
- 238000004220 aggregation Methods 0.000 description 1
- 230000002776 aggregation Effects 0.000 description 1
- 125000003158 alcohol group Chemical group 0.000 description 1
- 230000001476 alcoholic effect Effects 0.000 description 1
- 125000003545 alkoxy group Chemical group 0.000 description 1
- 125000003368 amide group Chemical group 0.000 description 1
- 239000012736 aqueous medium Substances 0.000 description 1
- 238000003556 assay Methods 0.000 description 1
- 210000003719 b-lymphocyte Anatomy 0.000 description 1
- 210000000227 basophil cell of anterior lobe of hypophysis Anatomy 0.000 description 1
- WQZGKKKJIJFFOK-VFUOTHLCSA-N beta-D-glucose Chemical compound OC[C@H]1O[C@@H](O)[C@H](O)[C@@H](O)[C@@H]1O WQZGKKKJIJFFOK-VFUOTHLCSA-N 0.000 description 1
- 230000004071 biological effect Effects 0.000 description 1
- 239000008280 blood Substances 0.000 description 1
- 210000004369 blood Anatomy 0.000 description 1
- 239000007853 buffer solution Substances 0.000 description 1
- 239000006172 buffering agent Substances 0.000 description 1
- VSGNNIFQASZAOI-UHFFFAOYSA-L calcium acetate Chemical compound [Ca+2].CC([O-])=O.CC([O-])=O VSGNNIFQASZAOI-UHFFFAOYSA-L 0.000 description 1
- 239000001639 calcium acetate Substances 0.000 description 1
- 235000011092 calcium acetate Nutrition 0.000 description 1
- 229960005147 calcium acetate Drugs 0.000 description 1
- 238000005341 cation exchange Methods 0.000 description 1
- 239000007979 citrate buffer Substances 0.000 description 1
- 238000002425 crystallisation Methods 0.000 description 1
- 230000008025 crystallization Effects 0.000 description 1
- 238000012258 culturing Methods 0.000 description 1
- 238000005520 cutting process Methods 0.000 description 1
- 238000012217 deletion Methods 0.000 description 1
- 230000037430 deletion Effects 0.000 description 1
- 238000003795 desorption Methods 0.000 description 1
- 230000029087 digestion Effects 0.000 description 1
- 238000006471 dimerization reaction Methods 0.000 description 1
- 230000000447 dimerizing effect Effects 0.000 description 1
- 238000001962 electrophoresis Methods 0.000 description 1
- 238000005516 engineering process Methods 0.000 description 1
- 150000002148 esters Chemical class 0.000 description 1
- 230000029142 excretion Effects 0.000 description 1
- 239000013613 expression plasmid Substances 0.000 description 1
- 239000013604 expression vector Substances 0.000 description 1
- 125000000524 functional group Chemical group 0.000 description 1
- 229930182830 galactose Natural products 0.000 description 1
- 239000011521 glass Substances 0.000 description 1
- 235000011187 glycerol Nutrition 0.000 description 1
- 239000008187 granular material Substances 0.000 description 1
- 238000003505 heat denaturation Methods 0.000 description 1
- 238000010438 heat treatment Methods 0.000 description 1
- 239000008241 heterogeneous mixture Substances 0.000 description 1
- 230000003345 hyperglycaemic effect Effects 0.000 description 1
- 238000001727 in vivo Methods 0.000 description 1
- 238000010348 incorporation Methods 0.000 description 1
- 208000015181 infectious disease Diseases 0.000 description 1
- 230000000977 initiatory effect Effects 0.000 description 1
- 230000003914 insulin secretion Effects 0.000 description 1
- 238000009630 liquid culture Methods 0.000 description 1
- 230000004807 localization Effects 0.000 description 1
- 239000008176 lyophilized powder Substances 0.000 description 1
- 238000012423 maintenance Methods 0.000 description 1
- 239000003550 marker Substances 0.000 description 1
- 239000000463 material Substances 0.000 description 1
- 230000035800 maturation Effects 0.000 description 1
- 230000002503 metabolic effect Effects 0.000 description 1
- 235000010270 methyl p-hydroxybenzoate Nutrition 0.000 description 1
- 238000002156 mixing Methods 0.000 description 1
- 238000010369 molecular cloning Methods 0.000 description 1
- 210000000496 pancreas Anatomy 0.000 description 1
- 230000037361 pathway Effects 0.000 description 1
- 235000019319 peptone Nutrition 0.000 description 1
- 239000003016 pheromone Substances 0.000 description 1
- 150000008300 phosphoramidites Chemical class 0.000 description 1
- 230000000704 physical effect Effects 0.000 description 1
- 238000013492 plasmid preparation Methods 0.000 description 1
- 229940057838 polyethylene glycol 4000 Drugs 0.000 description 1
- 238000006116 polymerization reaction Methods 0.000 description 1
- 239000011148 porous material Substances 0.000 description 1
- 230000035935 pregnancy Effects 0.000 description 1
- 238000002953 preparative HPLC Methods 0.000 description 1
- 239000003755 preservative agent Substances 0.000 description 1
- 230000010076 replication Effects 0.000 description 1
- 238000004007 reversed phase HPLC Methods 0.000 description 1
- 239000000523 sample Substances 0.000 description 1
- 239000007261 sc medium Substances 0.000 description 1
- 238000012868 site-directed mutagenesis technique Methods 0.000 description 1
- 235000017281 sodium acetate Nutrition 0.000 description 1
- 229940087562 sodium acetate trihydrate Drugs 0.000 description 1
- 239000002904 solvent Substances 0.000 description 1
- 238000005556 structure-activity relationship Methods 0.000 description 1
- 238000007920 subcutaneous administration Methods 0.000 description 1
- 238000001356 surgical procedure Methods 0.000 description 1
- 230000002194 synthesizing effect Effects 0.000 description 1
- 238000013518 transcription Methods 0.000 description 1
- 230000035897 transcription Effects 0.000 description 1
- 230000005030 transcription termination Effects 0.000 description 1
- 239000013598 vector Substances 0.000 description 1
- YZYKBQUWMPUVEN-UHFFFAOYSA-N zafuleptine Chemical compound OC(=O)CCCCCC(C(C)C)NCC1=CC=C(F)C=C1 YZYKBQUWMPUVEN-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 239000011701 zinc Substances 0.000 description 1
- 229910052725 zinc Inorganic materials 0.000 description 1
- 239000011592 zinc chloride Substances 0.000 description 1
- 235000005074 zinc chloride Nutrition 0.000 description 1
- JIAARYAFYJHUJI-UHFFFAOYSA-L zinc dichloride Chemical compound [Cl-].[Cl-].[Zn+2] JIAARYAFYJHUJI-UHFFFAOYSA-L 0.000 description 1
Classifications
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07K—PEPTIDES
- C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
- C07K14/435—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans
- C07K14/575—Hormones
- C07K14/62—Insulins
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
- C12N15/09—Recombinant DNA-technology
- C12N15/63—Introduction of foreign genetic material using vectors; Vectors; Use of hosts therefor; Regulation of expression
- C12N15/79—Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts
- C12N15/80—Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts for fungi
- C12N15/81—Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts for fungi for yeasts
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
- A61K38/00—Medicinal preparations containing peptides
Landscapes
- Health & Medical Sciences (AREA)
- Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
- Chemical & Material Sciences (AREA)
- Genetics & Genomics (AREA)
- Organic Chemistry (AREA)
- Zoology (AREA)
- Engineering & Computer Science (AREA)
- Molecular Biology (AREA)
- Biochemistry (AREA)
- Biophysics (AREA)
- General Health & Medical Sciences (AREA)
- General Engineering & Computer Science (AREA)
- Biotechnology (AREA)
- Wood Science & Technology (AREA)
- Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
- Biomedical Technology (AREA)
- Mycology (AREA)
- Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
- Endocrinology (AREA)
- Toxicology (AREA)
- Medicinal Chemistry (AREA)
- Diabetes (AREA)
- Gastroenterology & Hepatology (AREA)
- Plant Pathology (AREA)
- Physics & Mathematics (AREA)
- Microbiology (AREA)
- Peptides Or Proteins (AREA)
- Medicines That Contain Protein Lipid Enzymes And Other Medicines (AREA)
- Preparation Of Compounds By Using Micro-Organisms (AREA)
- Medicines Containing Material From Animals Or Micro-Organisms (AREA)
Description
- Die vorliegende Erfindung betrifft neuartige Humaninsulin-Analoga, die gekennzeichnet sind durch ein schnelles Auftreten der Wirkung bei subkutaner Injektion, und injizierbare Insulin-Lösungen, die solche Insulin-Analoga enthalten, und Verfahren zur Herstellung der neuartigen Insulin-Analoga.
- Bei der Behandlung von Diabetes mellitus sind der Fachwelt viele Arten von Insulin-Zubereitungen vorgeschlagen worden. Einige dieser Zubereitungen sind schnellwirkend und andere haben eine mehr oder weniger verzögerte Wirkung.
- Schnellwirkende Insulin-Zubereitungen können in akuten Situationen verwendet werden, wie etwa hyperglykämisches Koma, während eines chirurgischen Eingriffes, während der Schwangerschaft und bei schweren Infektionen. Außerdem können mehrfache, tägliche Injektionen von schnellwirkenden Insulin-Zubereitungen die Kontrolle bei Diabetikern verbessern, bei denen sich erwiesen hat, daß die Kontrolle mit längerwirkendem Insulin schwierig ist.
- In den letzten Jahren hat ein steigendes Interesse an einer Insulin-Behandlung bestanden, die sich an die Insulin-Sekretion aus den Beta-Zellen des gesunden Organismus annähert, d. h. Zufuhr von Insulin in Verbindung mit Mahlzeiten und Aufrechterhaltung eines Insulin-Basisspiegels. Klinische Untersuchungen haben gezeigt, daß Diabetiker nahezu normale Insulin- und Glucose-Konzentrationen mittels einer täglichen Injektion von Insulin mit verzögerter Wirkung erreichen können, um das Grundbedürfnis abzudecken, ergänzt durch Injektionen kleinerer Mengen (Bolus) schnellwirkenden Insulins vor den Hauptmahlzeiten.
- Schnellwirkende Insuline können auch in Mischungen mit mittel- und langwirkenden Insulinen zur Behandlung von Diabetikern verwendet werden, die eine stärkere Initialwirkung, zusätzlich zur verzögerten Wirkung von mittel- und langwirkenden Insulinen benötigen.
- Schließlich wird schnellwirkendes Insulin in kontinuierlichen Insulin-Zuführsystemen verwendet.
- Durch subkutane Injektion von schnellwirkenden Insulin-Lösungen ist eine anfängliche Verzögerung in der Absorption beobachtet worden (Binder, Diabetes Care 7, No. 2 (1984), 188- 199). Eine Verzögerung in der Absorption, die zu einem langsameren Auftreten der Wirkung führt, ist jedoch unerwünscht, wenn eine strikte metabolische Kontrolle angestrebt wird. Die Mischung von schnellwirkenden Insulin-Lösungen mit längerwirkenden Insulin- Zubereitungen kann außerdem zu verringerter Absorptionsgeschwindigkeit des schnellwirkenden Insulins führen.
- Demgemäß besteht ein Bedürfnis nach schnellwirkenden Insulin- Lösungen mit einem schnelleren Auftreten der Wirkung bei subkutaner Injektion und einer verbesserten Mischbarkeit mit verzögerten Insulin-Zubereitungen.
- Ein weiterer Nachteil bekannter schnellwirkender Insulin- Lösungen ist die Neigung von Insulin, in den Insulin-Lösungen, die für kontinuierliche Insulin-Zufuhr verwendet werden, zu fibrillieren und auszufallen, wodurch mechanische Teile und Zuführkatheter verstopft werden.
- Schließlich besteht ein Bedürfnis nach alternativen Insulin- Zubereitungen für die Behandlung von Patienten, die gegenüber normalem Insulin resistent sind.
- Es ist die Aufgabe der vorliegenden Erfindung, neuartige schnellwirkende Insulin-Lösungen mit einer oder mehreren der folgenden verbesserten Eigenschaften zur Verfügung zu stellen:
- 1) schnelleres Auftreten der Wirkung bei subkutaner Injektion oder anderen Verabreichungswegen
- 2) verbesserte Mischbarkeit mit verzögerten Insulin- Zubereitungen
- 3) verringerte Neigung zur Fibrillation, wenn verwendet in implantierbaren Zuführsystemen, und
- 4) verwendbar für die Behandlung von resistenten Patienten (niedrige Affinität für vorbestehende Antikörper).
- Die Ziele dieser Erfindung werden mit injizierbaren wäßrigen Lösungen der hierin nachstehend beschriebenen neuartigen Humaninsulin-Analoga erreicht.
- Eine große Anzahl von Insulin-Analoga ist in der Vergangenheit beschrieben worden. Märki et al. (Hoppe-Seyler's Z. Physiol. Chem., 360 (1979), 1619-1632) beschreiben die Synthese von Analoga von Humaninsulin, die sich von Humaninsulin durch den Ersatz einer einzelnen Aminosäure in den Positionen 2, 5, 6, 7, 8 und 11 der A-Kette und 5, 7, 13 und 16 der B-Kette unterscheiden, was neue Einsichten in die fesselnde Struktur-Aktivität-Beziehung von Insulin lieferte. Weitere Studien modifizierten den Hauptrezeptorbindungsbereich in Insulin (B(22)- B(26)), um die Auswirkung einer solchen Mutation auf die Rezeptorbindungsaktivität zu untersuchen. Die bekannten Humaninsulin-Analoga werden jedoch nicht die von den jetzigen Erfindern gewünschten Eigenschaften zeigen. US-Patent No. 3883496 betrifft verschiedene Substitutionen im Insulin-Molekül, während Chemiker-Zeitung, 100. Jahrgang (1976), Nr. 3, Seite 20, B(9)→Ala und B(10)→Ala offenbart, sowie Ala-Substitutionen an B(9) und B(27); B(9), B(27) und B(28); Bb(10) und B(28) B(5) und B(28) B(5) , B(10) , B(27) und B(28) B(5) B(9), Bb(27) und B(28); B(5), B(9), B(10), B(27) und B(28); etc.etc. Keines dieser Dokumente offenbart jedoch schnellwirkende Analoga von Insulin.
- Es ist bekannt, daß sulfatierte Insuline eine beträchtlich niedrigere Neigung zu Fibrillation besitzen (Albisser et al., Desired Characteristics of insulin to be used in infusion pumps. In: Gueriguian J.L. et al., Hrg. US Pharmacopeial Convention, Rockville, Maryland, S. 84-95) und eine niedrige Antigenität zeigen. Sulfatierte Insuline sind jedoch eine heterogene Mischung von wenigstens neun unterschiedlichen Insulin- Derivaten, die im Mittel 4,5 Sulfatestergruppen pro Molekül enthalten. Sulfatierte Insuline besitzen außerdem eine verringerte Insulin-Aktivität, die bei etwa 20% der Aktivität von nativem Insulin liegt. Ein weiterer Nachteil von sulfatierten Insulinen, verglichen mit nativem Insulin, ist, daß sie unnötigerweise Aminosäurereste enthalten, die chemisch modifiziert sind, d. h. Aminosäuren, die natürlicherweise nicht auftreten.
- Es ist daher eine weitere Aufgabe der vorliegenden Erfindung, Insulin-Analoga zur Verfügung zu stellen, die homogen sind, eine höhere biologische Aktivität besitzen als sulfatierte Insuline und die außerdem vorzugsweise nur natürlich auftretende Aminosäuren enthalten.
- Mit "Insulin-Analoga", wie hierin verwendet, ist eine Verbindung gemeint, die eine Molekularstruktur besitzt, die ähnlich zu derjenigen von Humaninsulin ist, einschließlich der Disulfidbrücken zwischen A(7)Cys und B(7)Cys und zwischen A(20)Cys und B(19)Cys und eine interne Disulfidbrücke zwischen A(6)Cys und A(11)Cys und mit Insulin-Aktivität.
- Die vorliegende Erfindung beruht auf der überraschenden Tatsache, daß bestimmte Insulin-Analoga, in denen wenigstens einer der Aminosäurereste von Humaninsulin ersetzt worden ist durch natürlich auftretende Aminosäurereste, die gewünschte schnellwirkende Aktivität zeigt.
- In ihrem breitesten Aspekt stellt die vorliegende Erfindung neuartige, schnellwirkende Humaninsulin-Analoga zur Verfügung, gebildet durch Ersetzen von einem oder mehreren der Aminosäurereste von Humaninsulin durch natürlich auftretende Aminosäurereste, die zu weniger Selbstassoziation zu Dimeren, Tetrameren, Hexameren oder Polymeren führen und dieselbe Ladung oder eine größere negative Ladung bei neutralem pH als diejenige von Humaninsulin besitzen.
- Um eine verringerte Neigung zu Selbstassoziation zu Dimeren, Tetrameren, Hexameren oder Polymeren bereitzustellen, werden bestimmte Reste von Humaninsulin vorzugsweise durch andere Aminosäurereste ersetzt, die hydrophiler sind als der natürliche Aminosäurerest an der entsprechenden Position im Molekül. Auch wird an bestimmten Positionen im Insulin-Molekül die Substitution durch einen sperrigeren Aminosäurerest zu einer verringerten Neigung der Insulin-Moleküle führen, zu Dimeren, Tetrameren, Hexameren und Polymeren zu assoziieren.
- Genauer gesagt stellt die vorliegende Erfindung neuartige Insulin-Derivate mit der folgenden allgemeinen Formel (I) zur Verfügung:
- A-Kette
- B-Kette
- worin wenigstens ein, aber nicht mehr als sieben der Xe dieselben oder verschiedene Aminosäurerestsubstitutionen sind, deren Nettofunktion es ist, dem Molekül dieselbe Ladung oder eine größere negative Ladung bei neutralem pH als diejenige von Humaninsulin zu verleihen, wobei die restlichen Xe die natürlichen Aminosäurereste von Humaninsulin an der entsprechenden Position im Insulin-Molekül sind, mit der Maßgabe, daß es wenigstens eine Substitution in der B-Kette gibt und daß, wenn X in Position in B(5) Ala ist, X in Position B(9) Leu ist, X in Position B(10) Asn oder Leu ist, X in Position B(12) Asn oder X in Position B(26) Ala ist, dann wenigstens eines der restlichen Xe verschieden ist von den Aminosäureresten von Humaninsulin an der entsprechenden Position im Insulin-Molekül, und mit der weiteren Maßgabe, daß X in Position B(5) nicht Asp sein kann und X in Position B(12) nicht Glu sein kann, und wobei ein oder mehrere Aminosäurereste von den N- und/oder C-terminalen Enden der A- und/oder B-Kette entfernt worden sein können, mit der zusätzlichen Maßgabe, daß, wenn x in einer oder mehreren der Positionen B(1), B(2), B(5), B(9), B(10), B(27) oder B(28) Ala ist, dann wenigstens eines von allen Xen, ausgenommen jedem X, das in Position B(1), B(2), B(5), B(9), B(10), B(27) und/oder B(28) Ala ist, verschieden ist von den Aminosäureresten von Humaninsulin an der entsprechenden Position im Insulin-Molekül, und Verfahren zur Herstellung solcher Insulin-Analoga.
- Vorzugsweise ist wenigstens ein Großteil der Aminosäurerestsubstitutionen hydrophiler als der Aminosäurerest an der entsprechenden Stelle im Humaninsulin-Molekül und bevorzugter sind alle Aminosäurerestsubstitutionen hydrophiler als die entsprechenden Humaninsulin-Aminosäurereste.
- Im Hinblick auf Hydrophilie wird Bezug genommen auf C. Frömmel, J. Theor. Biol. 111 (1984), 247-260 (Tabelle 1).
- Bezugnehmend auf die obige Formel I, sind 2 bis 4 Substitutionen am bevorzugtesten.
- Die Aminosäurerestsubstitutionen sind vorzugsweise ausgewählt aus der Gruppe, die aus Asp, Glu, Ser, Thr, His und Ile besteht, und sind bevorzugter negativ geladene Aminosäurereste, d. h. Asp und/oder Glu.
- Das neuartige Humaninsulin-Analog kann vorzugsweise Asp und/oder Glu anstelle einer oder mehrerer der Hydroxy-Aminosäuren von Humaninsulin oder anstelle einer oder mehrerer Gln oder Asn von Humaninsulin enthalten.
- Die neuartigen Humaninsulin-Analoga können außerdem vorzugsweise Ser und/oder Thr oder Asp und/oder Glu anstelle eines oder mehrerer der Aminosäurereste von Humaninsulin mit einer aliphatischen und/oder aromatischen Seitenkette enthalten.
- Die neuartigen Humaninsulin-Analoga können auch vorzugsweise His anstelle eines oder mehrerer der Aminosäurereste von Humaninsulin mit einer aliphatischen und/oder aromatischen Seitenkette oder anstelle einer oder mehrerer der Hydroxy-Aminosäuren von Humaninsulin enthalten.
- Bevorzugte Substitutionsstellen sind die Stellen B9, B10, B12, B26, B27 und B28, vorzugsweise B9, B12, B27 und B28, wobei in diesen Positionen eine Substitution ausreichend sein kann, um eine verringerte Neigung zur Selbstassoziation und eine schnellere Wirkung durch Verabreichung zu erhalten.
- Die Aminosäurerestsubstitution in Position B9 kann ausgewählt werden aus der Gruppe, die aus Asp, Pro, Glu, Ile, Leu, Val, His, Thr, Gln, Asn, Met, Tyr, Trp und Phe besteht, und bevorzugter aus der Gruppe, die aus Asp, Glu, Gln, Asn und His besteht.
- Die Aminosäurerestsubstitution in Position B12 kann ausgewählt werden aus der Gruppe, die aus Ile und Tyr besteht, kann aber nicht Glu sein. Die Aminosäurerestsubstitution in Position B10 kann ausgewählt werden aus der Gruppe, die aus Asp, Arg, Glu, Asn und Gln besteht, und in den Positionen B26, B27 und B28 sind die Aminosäurerestsubstitutionen vorzugsweise Asp oder Glu.
- In den restlichen Positionen des Insulin-Moleküls scheinen wenigstens zwei Substitutionen (vorzugsweise in Kombination mit den-obengenannten Positionen) notwendig zu sein, um die verbesserten Eigenschaften zu erhalten. In diesen Positionen können Substitutionen wie folgt vorgenommen werden:
- Position Bevorzugte Aminosäurerestsubstitutionen
- A8 His, Gly, Gln, Glu, Ser, Asn, Asp, Pro
- A9 Gly, Asp, Glu, Thr, His, Gln, Asn, Ala, Pro
- A10 Leu, Pro, Val, His, Ala, Glu, Asp, Thr, Gln, Asn
- A13 Pro, Val, Arg, His, Ma, Glu, Asp, Thr, Gly, Gln, Asn, Asp
- A21 Asp, Glu
- B1 Glu, Asp, Thr, Ser
- B2 Arg, His, Ala, Glu, Asp, Thr, Pro, Gly, Gln, Ser, Asn
- B5 Glu, Thr, Ser, Gln, Asn
- B14 Glu, Asp, Asn, Gln, Ser, Thr, Gly
- B16 Asp, Glu, Gln, Asn, Ser, Thr, His, Arg
- B17 Ser, Thr, Asn, Gln, Glu, Asp, His
- B18 Ser, Thr, Asn, Gln, His
- B20 Gln, Ser, Asn, Asp, Glu, Arg
- Weiter bevorzugte Verbindungen der vorliegenden Erfindung sind Insulin-Analoga, in denen Substitutionen an den folgenden Stellen vorliegen:
- B27, B12, B9, (B27+B9), (B27+A21), (B27+B12), (B12+A21), (B27+B17), (B27+A13), (B27+B16), (B27+A10), (B27+B28), (B27+B26), (B27+B10), (B27+B1), (B27+B2), (B27+B5), (B27+B14), (B27+B18), (B27+B20), (B12+B17), (B12+A10), (B12+A13), (B12+B16), (B12+B1), (B12+B2), (B12+B5) (B12+B10), (B12+B26) (B12+B28), (B9+B17), (B9+A13), (B9+B16), (B9+A8), (B9+A9) (B9+A10), (B9+B1), (B9+B2), (B9+B5), (B9+B10), (B9+B12) (B9+B14), (B9+B28), (B9+B18), (B9+B20), (B9+B26) (B27+B9+A21), (B9+B27+A8), (B27+B12+A21), (B27+B12+B9), (B9+B12+B27+B17), (B9+B12+B27+A13), (B9+B12+B27+B16) und (B12+B16+B17+B27+A10+A13).
- Bevorzugte Ausführungsformen der obigen Formel I sind wie folgt:
- A-Kette
- B-Kette
- A-Kette
- B-Kette
- A-Kette
- B-Kette
- in denen die Xe wie oben definiert sind.
- Bezugnehmend auf Formel I sind andere bevorzugte Insulin-Analoga gemäß der vorliegenden Erfindung solche, in denen X in Position B27 Glu ist, X in Position B12 Ile oder Tyr ist, X in Position A21 Asp ist und in Position B27 Glu ist, X in Position B9 Asp ist, x in Position A21 und in Position B9 Asp ist und in Position B27 Glu ist, X in Position A8 His ist, in Position B9 Asp ist und in Position B27 Glu ist, X in Position B10 Asp ist, X in Position B28 Asp ist oder X in Position B9 Asp ist und in Position B27 Glu ist.
- Gemäß einem zweiten Aspekt der vorliegenden Erfindung werden injizierbare Lösungen mit Insulin-Aktivität bereitgestellt. Die injizierbaren Insulin-Lösungen dieser Erfindung enthalten die oben beschriebenen Humaninsulin-Analoga oder ein pharmazeutisch annehmbares Salz derselben in wäßriger Lösung vorzugsweise bei neutralem pH. Das wäßrige Medium kann durch Zugabe von zum Beispiel Natriumchlorid und Glycerin isotonisch gemacht werden. Auch Puffer, wie etwa ein Acetat oder Citrat, und Konservierungsstoffe, wie etwa m-Kresol, Phenol oder Methyl-4-hydroxybenzoat, können zugesetzt werden. Die Insulin- Lösungen können außerdem Zink-Ionen enthalten.
- Human- oder Schweineinsulin können in den bisher der Fachwelt bekannten schnellwirkenden Insulin-Lösungen durch die Humaninsulin-Analoga dieser Erfindung ersetzt werden.
- Nach dem Auftauchen der rekombinanten DNA-Technologie sind die Möglichkeiten für das Protein-Engineering enorm geworden. Mit der sogenannten ortsspezifischen Mutagenesetechnik ist es möglich, ein Gen zu verändern, das für ein natürlich auftretendes Protein kodiert, indem irgendeines oder mehrere der Codons im nativen Gen durch (ein) Codon(s) für (eine) andere natürlich auftretende Aminosäure(n) ersetzt werden. Alternativ kann das modifizierte Gen durch chemische Synthese der gesamten DNA- Sequenz mit gut bekannter Technik hergestellt werden. Der Zweck solch einer Manipulation eines Gens für ein natürliches Protein wird typischerweise sein, die Eigenschaften des natürlichen Proteins in der einen oder anderen Zielrichtung zu verändern.
- Die neuartigen Insulin-Analoga können hergestellt werden, indem das Proinsulin-Gen durch Ersatz von (einem) Codon(s) an der geeigneten Stelle im nativen Human-Proinsulin-Gen durch (ein) Codon(s), das (die) die gewünschte(n) Aminosäurerestersatzverbindung(en) kodiert (kodieren), verändert wird oder indem die gesamte DNA-Sequenz, die das gewünschte Humaninsulin-Analog kodiert, synthetisiert wird. Das neuartige, modifizierte oder synthetische Gen, das das gewünschte Insulin- Analog kodiert, wird dann in einen geeigneten Expressionsvektor inseriert, der, wenn er in einen geeigneten Wirtsorganismus, z. B. E. coli, Bacillus oder eine Hefe, transferiert wird, das gewünschte Produkt erzeugt. Das exprimierte Produkt wird dann aus den Zellen oder der Kulturbrühe isoliert, abhängig davon, ob das exprimierte Produkt aus den Zellen sekretiert wird oder nicht.
- Neuartige Insulin-Analoga können auch durch chemische Synthese mit Verfahren hergestellt werden, die analog sind zu dem von Märki et al. (Hoppe-Seyler's Z. Physiol. Chem., 360 (1979), 1619-1632) beschriebenen Verfahren. Sie können auch aus getrennt in vitro hergestellten A- und B-Ketten gebildet werden, die die geeigneten Aminosäurerestsubstitutionen enthalten, woraufhin die modifizierten A- und B-Ketten durch Aufbau von Disulfidbrücken gemäß bekannten Verfahren miteinander verknüpft werden (z. B. Chance et al., In: Rick DH, Gross E (Hrg.) Peptides: Synthesis - Structure - Function. Proceedings of the seventh American peptid symposium, Illinois, S. 721-728).
- Die neuartigen Insulin-Analoga werden vorzugsweise hergestellt, indem ein biosynthetischer Vorläufer der allgemeinen Formel II:
- A-Kette
- B-Kette
- worin eine Peptidkette mit n natürlich auftretenden Aminosäureresten ist, R Lys oder Arg ist, n eine ganze Zahl von 0 bis 33 ist, m 0 oder 1 ist und die Xe wie oben definiert sind, mit der Maßgabe, daß die Peptidkette -Qn-R- nicht zwei benachbarte basische Aminosäurereste enthält, mit einem L-Threoninester in der Gegenwart von Trypsin oder einem Trypsinderivat zur Reaktion gebracht wird, gefolgt von der Umwandlung des erhaltenen Threoninesters des Humaninsulin-Analogs in das Humaninsulin-Analog mit bekannten Verfahren. Diese sogenannte "Transpeptidations"-Reaktion ist beschrieben in US-Patentschrift No. 4,343,898 (deren Offenbarungen durch Bezugnahme hierin einbezogen werden).
- Durch die Transpeptidationsreaktion wird das überbrückende -(Qn-R)m- zwischen Aminosäure 29 in der B-Kette und Aminosäure 1 in der A-Kette herausgeschnitten und eine Threoninestergruppe wird an das C-terminale Ende von B29Lys gekoppelt.
- Die Vorläufer der obigen Formel II können mit einem Verfahren hergestellt werden, das analog ist zu dem in EP-Patentanmeldung 0 163 529 A beschriebenen Verfahren, deren Offenbarung durch Bezugnahme hierin einbezogen ist. Mit diesem Verfahren wird eine DNA-Sequenz, die den fraglichen Vorläufer kodiert, in ein geeignetes Expressionsvehikel inseriert, das, wenn es in Hefe transferiert wird, in der Lage ist, die gewünschte Verbindung mit richtig angeordneten Disulfidbrücken zu exprimieren und zu sekretieren. Das exprimierte Produkt wird dann aus der Kulturbrühe isoliert.
- Die vorliegenden Insulin-Analoga können auch hergestellt werden, indem ein biosynthetischer Vorläufer der allgemeinen Formel III:
- A-Kette
- B-Kette
- worin V und T jeweils Lys oder Arg sind und die Xe wie oben definiert sind, in wäßriger Lösung mit Trypsin und Carboxypeptidase B zur Reaktion gebracht wird und das Humaninsulin-Analog aus der Reaktionslösung gewonnen wird.
- Die Vorläufer der obigen Formel III können mit einem Verfahren hergestellt werden, das analog ist zu dem in EP-Patentanmeldung Nr. 86 302 133.3 beschriebenen Verfahren, deren Offenbarung durch Bezugnahme hierin einbezogen ist. Mit diesem Verfahren wird eine DNA-Sequenz, die den Vorläufer kodiert, in ein geeignetes Hefe-Expressionsvehikel inseriert, das, wenn es in Hefe transferiert wird, in der Lage ist zur Expression und Sekretion des exprimierten Produktes mit richtig angeordneten Disulfidbrücken in das Kulturmedium.
- Gemäß einem dritten Aspekt der vorliegenden Erfindung wird ein Verfahren zur Herstellung der neuartigen Insulin-Analoga zur Verfügung gestellt, wobei mit diesem Verfahren ein Hefestamm, der ein replizierbares Expressionsvehikel enthält, das eine DNA-Sequenz umfaßt, die einen Vorläufer des Insulin-Analogs kodiert, in einem geeigneten Nährstoffmedium kultiviert wird und der Vorläufer aus dem Kulturmedium gewonnen und in das neuartige Insulin-Analog durch enzymatische und chemische invitro-Umwandlung umgewandelt wird.
- Die vorliegende Erfindung ist auch gerichtet auf neuartige Vorläufer der neuartige Insulin-Analoga, DNA-Sequenzen, die solche neuartigen Vorläufer kodieren, Expressionsvehikel, die solche DNA-Sequenzen enthalten, und Hefestämme, die mit solchen Expressionsvehikeln transformiert sind.
- Es ist beabsichtigt, daß die vorliegende Erfindung bestimmte Derivationen oder weitere Substitutionen der Insulin-Analoga umfaßt, vorausgesetzt, daß solche Derivationen oder weiteren Substitutionen keine wesentliche Auswirkung auf das oben beschriebene Ziel der Erfindung haben. Es ist demgemäß möglich, eine oder mehrere der funktionalen Gruppen in den Aminosäureresten zu derivatisieren. Beispiele für solche Derivation ist die der se bekannte Umwandlung von Säuregruppen im Insulinmolekül in Ester- oder Amidgruppen, die Umwandlung von Alkoholgruppen in Alkoxygruppen oder umgekehrt und die selektive Desamidierung. Als ein Beispiel kann A21Asn durch Hydrolyse in saurem Medium zu A21Asp desamidiert werden oder B3Asn kann in neutralem Medium zu B3Asp desamidiert werden.
- Es ist überdies möglich, die vorliegenden Insulin-Analoga zu modifizieren, indem Aminosäurereste an den N- oder C-terminalen Enden entweder hinzugefügt oder entfernt werden. Den Insulin-Analoga der vorliegenden Erfindung können bis zu vier Aminosäurereste am N-terminalen Ende der B-Kette und bis zu fünf Aminosäurereste am C-terminalen Ende der B-Kette fehlen, ohne signifikante Auswirkung auf die Gesamteigenschaften des Insulin-Analogs. Beispiele für solche modifizierten Insulin- Analoga sind Insulin-Analoga, denen der B1Phe- oder der B30Thr-Aminosäurerest fehlt.
- Auch können natürlich auftretende Aminosäureste an einem oder mehreren Enden der Polypeptidketten hinzugefügt werden, vorausgesetzt, daß dies keinen signifikanten Einfluß auf das oben beschriebene Ziel hat.
- Solche Deletionen oder Additionen an den Enden der Polypeptidkette der vorliegenden Insulin-Analoga können in vitro auf den Insulin-Analoga mit Aminosäuresubstitutionen gemäß der vorliegenden Erfindung ausgeführt werden. Alternativ kann das Gen für die neuartigen Insulin-Analoga gemäß der vorliegenden Erfindung modifiziert werden, indem Codons, die den zusätzlichen Aminosäureresten bzw. fehlenden Aminosäureresten an den Enden der Polypeptidkette entsprechen, entweder hinzugefügt oder entfernt werden.
- Die Abkürzungen, die für die Aminosäuren verwendet werden, sind diejenigen, die in J.Biol.Chem. 243 (1968), 3558 angegeben sind. Die Aminosäuren befinden sich in der L-Konfiguration.
- Wie im folgenden Text verwendet, bedeutet B(1-29) eine verkürzte B-Kette von Humaninsulin von B1Phe bis B29Lys und A(1- 21) bedeutet die A-Kette von Humaninsulin.
- Die Substitution(en), die gemäß der Praxis der Erfindung im Humaninsulin-Molekül vorgenommen ist (sind), ist (sind) mit einem Präfix angegeben, das sich auf Humaninsulin bezieht. Als ein Beispiel bedeutet B27Glu-Humaninsulin ein Humaninsulin- Analog, in dem Thr in Position 27 in der B-Kette durch Glu ersetzt worden ist. B27Glu,B9Asp-Humaninsulin bedeutet ein Humaninsulin-Analog, in dem Thr in Position 27 in der B-Kette durch Glu ersetzt worden ist und Ser in Position 9 in der B- Kette durch Asp ersetzt worden ist. B27Glu,B(1-29)-Ala-Ala- Lys-A(1-21)-Humaninsulin bedeutet einen Vorläufer für das Insulin-Analog (siehe Formel II), in dem Thr in Position 27 in der verkürzten B-Kette (siehe oben) durch Glu ersetzt worden ist und in dem die B(1-29)-Kette und die A-Kette (A(1-21)) durch die Peptidsequenz Ala-Ala-Lys verbunden sind. Sofern nicht anders angegeben, soll verstanden werden, daß die B(1- 29)-Kette und A(1-21)-Kette durch Disulfidbrücken zwischen A(7)Cys und B(7)Cys bzw. zwischen A(20)Cys und B(19)Cys verbunden sind wie in Humaninsulin und daß die A-Kette die interne Disulfidbrücke zwischen A(6)Cys und A(11)Cys enthält.
- Wie bereits betont worden ist, ist das Ziel dieser Erfindung, schnellwirkende, injizierbare Insulin-Lösungen zur Verfügung zu stellen. Im Bestreben, dieses Ziel zu erreichen, erkannten die gegenwärtigen Erfinder zuallererst, daß beträchtliche Unterschiede zwischen Insulin in einem Depot oder Bolus und Insulin im Kreislauf bestehen, einschließlich bemerkenswerterweise einem vollständig unvermeidbaren Unterschied in der Insulin-Konzentration. Genauer gesagt ist Insulin im Blutstrom hochverdünnt, wobei es 10&supmin;¹¹ bis 10&supmin;&sup8; M ist, und liegt in monomerer Form vor, wobei möglicherweise etwas Insulin in dimerer Form vorliegt. Das sehr viel konzentriertere Insulin, das in den B-Zellkörnern der Bauchspeicheldrüse gespeichert ist, und in der üblicherweise verabreichbaren Lösung liegt größtenteils, wenn nicht hauptsächlich, in der nicht-aktiven hexameren Form vor, zum Beispiel als das gut bekannte 2-Zink-Hexamer.
- Es ist bekannt, daß Humaninsulin in Lösung in vielen molekularen Formen existiert, nämlich das Monomer, das Dimer, das Tetramer und das Hexamer (Blundell et al., in Advances in Protein Chemistry, Academic Press, New York und London, Vol. 26, S. 279-330, 1972), wobei die oligomeren Formen bei hohen Insulinkonzentrationen begünstigt sind und das Monomer die aktive Form von Insulin ist. Das Tetramer und Hexamer sind keine aktiven Formen und sogar das Dimer kann nicht aktiv sein. Das Konzept, das dieser Erfindung zugrundeliegt, ist die Überzeugung des Erfinders, daß das auf diesem Gebiet anerkannte Phänomen der verzögerten Absorption (Binder, Diabetes Care 7, Nr. 2 (1984), 188-199) zu einem großen Teil der Zeit zugeschrieben werden kann, die erforderlich ist, damit das Insulin aus der hexameren, tetrameren und dimeren Form in die (aktive) monomere Form disassoziiert.
- Die Humaninsulin-Analoga dieser Erfindung erreichen ihre schnelle Wirkung durch eine molekulare Struktur, die nicht ohne weiteres für Dimer-, Tetramer-, Hexamer- oder Polymer- Bildung anfällig ist, d. h. mit einer verringerten Neigung, sich mit oder ohne das Vorhandensein von Zink-Ionen zu Dimer, Tetrameren, Hexameren oder Polymeren selbst zu assoziieren.
- Es ist seit langem aus den beträchtlichen Unterschieden in der Aminosäuresequenz von Spezies zu Spezies, die im Insulin existieren, erkannt worden, daß nicht alle Aminosäurereste, die im Insulin-Molekül vorhanden sind, für die Insulin-Aktivität entscheidend sind und daß einige der Aminosäuren, die für die Insulin-Aktivität nicht wesentlich sind, wichtig sind für die physikalischen Eigenschaften des Insulin-Moleküls. Tatsächlich ist bekannt, daß Meerschweinchen-Insulin nicht in der Lage ist zu dimerisieren. Sulfatiertes Insulin und Tetranitrotyrosin- Insulin dimerisieren nicht. So können viele der Aminosäurereste im Humaninsulin-Molekül ohne substantielle Abnahme in der Insulin-Aktivität verändert werden. Die Aminosäuresubstitutionen im Humaninsulin-Molekül, die hierin betrachtet werden, sind darauf gerichtet, die Bildung von Dimeren, Tetrameren, Hexameren oder Polymeren ohne Zerstörung der Insulin- Aktivität zu verhindern.
- Die Aminosäurereste in den Positionen in der A-Kette und der B-Kette von Formel I, in denen Substitutionen vorgenommen werden können, sind nicht entscheidend für die Insulin-Aktivität, sie sind aber wichtig für die Fähigkeit von Humaninsulin, zu Dimeren, Tetrameren, Hexameren oder Polymeren zu aggregieren, oder für die Löslichkeit des Humaninsulins. Die vorliegenden Aminosäurerestsubstitutionen stören die Kontakte von Atom zu Atom zwischen benachbarten Insulin-Molekülen, die die Aggregation zu Dimeren, Tetrameren, Hexameren oder Polymeren erleichtern.
- Wie man für Substitutionszwecke erwarten könnte, sind Veränderungen in bestimmten Positionen im Humaninsulin-Molekül effektiver als andere. Im großen und ganzen kann eine einzelne Substitution, die in der B-Kette vorgenommen wird, ausreichend sein, um die Selbstassoziierungsneigung zu verringern, wohingegen wenigstens zwei Veränderungen von anderen Resten erforderlich sein können. Die Substitutionen in der A-Kette dienen hauptsächlich dazu, die Löslichkeit des dissoziierten Moleküls zu verbessern. Bevorzugte Positionen zur Durchführung von Aminosäurerestsubstitutionen sind B9, B12, B10, B26, B27 und B28 allein, in Kombination miteinander oder zusammen mit Substitutionen an anderen Stellen im Insulin-Molekül, wie angegeben in Formel I.
- Augenscheinlich soll der Ersatz eines ungeladenen oder positiv geladenen Aminosäurerestes durch einen oder mehrere negativ geladene Aminosäurereste die Ladung des Humaninsulin-Analogs bei neutralem pH negativer machen und den isoelektrischen Punkt gegenüber Humaninsulin senken. Charakteristischerweise haben die Humaninsulin-Analoga dieser Erfindung dieselbe oder eine negativere Ladung (bei neutralem pH) und einen niedrigeren isoelektrischen Punkt als Humaninsulin.
- Im großen und ganzen werden 1 bis 3 Substitutionen das unmittelbare Ziel dieser Erfindung erreichen, nämlich ein Insulin mit schnellerer Wirkung bereitzustellen, und solche stellen bevorzugte Ausführungsformen der Erfindung dar. Durch die Verwendung von 2-3 Substitutionen kann eine verbesserte Mischbarkeit bei geschützten Insulin-Zubereitungen erreicht werden. Es wird jedoch als vorteilhaft angenommen, daß die unmittelbaren Ziele dieser Erfindung auch durch eine größere Anzahl von Substitutionen als 3 erreicht werden kann, da wünschenswerte sekundäre Ziele dadurch erreicht werden können.
- Insbesondere kann ein zusätzlicher Substitutionsgrad, z. B. das Vorhandensein von 4 oder 5 Ersatz-Aminosäureresten, zu einem Humaninsulin-Analog führen, das ebenfalls in geringerem Maße der Fibrillation öder Grenzflächenpolymerisation unterliegt, eine besonders wünschenswerte Eigenschaft, wenn die Insulin- Lösung für kontinuierliche Infusion gedacht ist. Im großen und ganzen werden für das Humaninsulin-Analog dieser Erfindung nicht mehr als etwa 7 Substitutionen im Insulin-Molekül in Betracht gezogen. Bevorzugt sind 2-4 Substitutionen.
- Gene, die die Vorläufer der vorliegenden Insulin-Analoga kodieren, können durch Modifikation von Genen, die die obigen Insulin-Vorläufer mit Formel (II) (oder III), in denen alle Xe die Aminosäurereste von Humaninsulin sind, kodieren, durch ortsspezifische Mutagenese hergestellt werden, um Codons zu inserieren oder durch Codons zu ersetzen, die die gewünschte Mutation kodieren. Eine DNA-Sequenz, die den Vorläufer des Insulin-Analogs kodiert, kann auch durch enzymatische Synthese aus Oligonukleotiden hergestellt werden, die insgesamt oder teilweise dem Insulin-Analog-Vorläufer-Gen entsprechen.
- DNA-Sequenzen, die ein Gen mit der gewünschten Mutation des Insulin-Gens enthalten, werden dann mit Fragmenten kombiniert, die für den TPI-Promotor (TPIp) (T. Alber und G. Kawasaki. Nucleotide Sequence of the Triose Phosphate Isomerase Gene of Saccharomyces cerevisiae. J. Mol.Applied Genet. 1 (1982) 419- 434), die MFα1-Leadersequenz (J. Kurjan und I. Herskowitz,. Structure of a Yeast Pheromone Gene (MFα1): A Putative α-Factor Precursor Contains four Tandem Copies of Mature α-Factor. Cell 30 (1982) 933-943) und die Transkriptionsterminationssequenz aus TPI von S. cerevisiae (TPIT) kodieren. Diese Fragmente liefern Sequenzen, um eine hohe Transkriptionsrate für das den Vorläufer kodierende Gen zu gewährleisten, und liefern auch eine Vorsequenz, die die Lokalisierung des Vorläufers in den sekretorischen Weg hinein und seine letztendliche Exkretion in das Nährmedium bewirken kann. Die Expressionseinheiten sind außerdem mit dem Hefe-2u-Replikationsursprung und einem selektionierbaren Marker, LEU2, versehen.
- Während der in-vivo-Reifung des α-Faktors in Hefe werden die letzten (C-terminalen) sechs Aminosäuren des MFα1-Leaderpeptids (Lys-Arg-Glu-Ala-Glu-Ala) aus dem α-Faktor-Vorläufer durch die sequentielle Wirkung einer Endopeptidase, die die Lys-Arg-Sequenz erkennt, und einer Aminodipeptidase, die die Glu-Ala-Reste entfernt, entfernt (Julius, D. et al. H Cell 32 (1983) 839-852). Um das Erfordernis der Hefe-Aminodipeptidase zu eliminieren, wurde die Sequenz, die für das C-terminale Glu-Ala-Glu-Ala des MF Leaders kodiert, durch in-vitro-Mutagenese aus der MFα1-Leadersequenz entfernt. Im folgenden Text bedeutet "MFα1-Leader" die gesamte Leader-Sequenz, wohingegen MFal-Leader(minus Glu-Ala-Glu-Ala) eine Leader-Sequenz bedeutet, in der die C-terminale Glu-Ala-Glu-Ala-Sequenz entfernt worden ist.
- Ein Codon-optimiertes Hefe-Strukturgen für B(1-29)-Ala-Ala- Lys-A(1-21) -Humaninsulin wurde wie folgt konstruiert.
- Die folgenden 10 Oligonukleotide wurden auf einem automatischen DNA-Synthesizer unter Verwendung von Phosphoramidit-Chemie auf einem Glasträger mit kontrollierter Porengröße synthetisiert (S.L. Beaucage und M.H. Caruthers (1981) Tetrahydron Letters 22, 1859-1869):
- 5 Duplizes A-E wurden aus den obigen 10 Oligonukleotiden gebildet, wie in Fig. 1 angegeben.
- 20 pmol von jeder der Duplizes A-E wurde aus den entsprechenden Paaren 5'-phosphorylierter Oligonukleotide I-X durch Erhitzen für 5 min bei 90ºC, gefolgt von Abkühlen auf Raumtemperatur über einen Zeitraum von 75 min, gebildet. Das 33- mer (X) in Duplex E war nicht 5'-phosphoryliert, um Dimerisation um die selbstkomplementären xbaI-Einzelstrangenden während der Ligation zu vermeiden. Die fünf Duplizes wurden vermischt und mit T4-Ligase behandelt. Das synthetische Gen wurde als eine 182/183 bp-Bande nach Elektrophorese der Ligationsmischung auf einem 2%igen Agarosegel isoliert.
- Das erhaltene synthetische Gen ist in Fig. 1 dargestellt.
- Das synthetische Gen wurde an ein 4 kb langes Kpn1-EcoR1-Fragment und ein 8 kb langes xba1-Kpn1-Fragment aus pMT644 und ein 0,3 kb langes EcoRl-Hga1-Fragment aus pKFN9 ligiert, um die folgende Struktur zu ergeben: TPI-MFal-Leader-B(1-29)-Ala-Ala- Lys-A(1-21)-TPIT.
- Plasmid pMT644 enthält die DNA-Sequenz TPIp-MFα1-Leader-B(1- 29)-A(1-21)-TPIT und die Konstruktion ist in der dänischen Patentschrift Nr. 1293/85 beschrieben. Die Konstruktion von Plasmid pKFN9 ist im folgenden beschrieben.
- Die Ligationsmischung wurde verwendet, um den kompetenten E. coli-Stamm (r&supmin;, m&spplus;) (MT172) zu transformieren. 30 ampicillinresistente Kolonien wurden auf Platten transferiert, die Minimalmedium M9 enthielten (T. Maniatis et al., Molecular Cloning, Cold Spring Harbor Laboratory, 1982, S. 68), was zu 8 Leu&spplus;-Kolonien führte. Maxam-Gilbert-Sequenzierung eines 32pxba1-EcoR1-Fragments zeigte, daß drei Plasmide ein Gen mit der gewünschten Sequenz enthielten. Ein Plasmid pKFN27 wurde für die weitere Verwendung ausgewählt.
- Die Konstruktion von pKFN27 ist in Fig. 2 veranschaulicht.
- $er Zweck der Konstruktion von Plasmid pKFN9 war, ein Plasmid zu erhalten, das eine Hga1-Stelle unmittelbar nach der MFα1- Leadersequenz enthielt. Plasmid pMTs44 (dessen Konstruktion in der dänischen Patentschrift Nr. 278/85 beschrieben ist) wurde mit xba1 geschnitten und etwa 250 Basen wurden von den 3'-Enden mit ExoIII-Nukleasebehandlung entfernt. Ein synthetischer 32-merer Insertionsprimer GGATAAAAGAGAGGCGCGTCTGAAGCTCACTC, der eine Hga1-Sequenz enthielt, wurde an die teilweise einzelsträngige DNA anneliert. Eine doppelsträngige zirkuläre DNA wurde hergestellt durch Einfüllen mit Klenow-Poylmerase und Ligation mit T4-Ligase. Nach Transformation von E. coli (r&supmin;, m&spplus;) (MT 172) wurden Kolonien, die mutiertes Plasmid enthielten, durch Koloniehybridisierung mit 5'-³²P-markiertem 32-meren Insertionsprimer identifiziert. Das Auftreten einer neuen Hga1- Stelle wurde durch Schneiden mit Restriktionsenzym (EcoR1+Hga1, Hind3+Hga1) bestätigt. Nach Retransformation wurde ein "reines" mutantes pKFN9 für die weitere Verwendung ausgewählt. Die Konstruktion von pKFN9 ist in Fig. 3 veranschaulicht.
- B27Glu-Humaninsulin wurde hergestellt durch Transpeptidation von B27Glu,B(1-29)-Ala-Ala-Lys-A(1-21)-Humaninsulin mit Thr- OBut und Acidolyse des erhaltenen Threoninesters mit Trifluoressigsäure. Die Herstellung bestand aus den folgenden Schritten:
- Plasmid pKFN27 wurde in der einzigen xba1-Stelle unmittelbar flußabwärts des synthetischen Insulin-Vorläufer-Gens linearisiert. Um die xba1-Stelle nicht durch den unten beschriebenen Einfüllschritt zu zerstören, wurde ein 19-merer Hind3-Xba1- Doppelstranglinker
- an jedes Ende des linearisierten Plasmids ligiert. Der Linker war am xba1-Einzelstrangende 5'-phosphoryliert, wurde aber am Hind3-Ende nicht-phosphoryliert belassen, wodurch die Polymerisation des Linkers während des Ligationsschrittes und die Zirkularisierung der DNA vermieden wurde, siehe Fig. 4.
- 5'-Mononukleotide wurden von den 3'-Enden der erhaltenen linearen doppelsträngigen DNA mit Hilfe einer ExoIII-Nukleasebehandlung entfernt. Die ExoIII-Nukleasebehandlung wurde bei 23ºC unter Bedingungen durchgeführt, unter denen etwa 250 Nukleotide von jedem 3'-Ende der DNA entfernt wurden (L. Guo und R. Wu (1983), Methods in Enzymology 100, 60-96).
- Ein 5'-phosphorylierter 25-merer Mutageneseprimer d(GTTTCTTCTACGAACCTAAGGCTGC) wurde an die Mutationsstelle anneliert. Nach Einfüllen mit Klenow-Polymerase in der Gegenwart von T4-Ligase wurde die doppelsträngige DNA mit xba1 verdaut. Dann wurde zirkuläre Heteroduplex-DNA mit der Mutation in einem Strang mit T4-Ligase gebildet.
- Die Ligationsmischung wurde in E. coli (r&supmin;, m&spplus;) (MT172) transformiert, selektionierend auf Ampicillinresistenz.
- Mutanten wurden durch Koloniehybridisierung mit dem 5'-³²P-markierten 25-meren Mutageneseprimer identifiziert. Nach Retransformation wurde durch DNA-Sequenzierung des 0,5 kb langen xba1-EcoR1-Fragments (A. Maxam und W. Gilbert (1980) Methods in Enzymology 65, 499-560) gezeigt, daß Plasmid pKFN37 aus einer der resultierenden Kolonien die gewünschte Mutation enthielt.
- S. cerevisiae-Stamm MT663 (E2-7B X E11-3C a/α, Δtpi/Δtpi, pep 4-3/pep 4-3) wurde auf YPGaL (1% Bacto-Hefeextrakt, 2% Bacto- Pepton, 2% Galactose, 1% Lactat) bis zu einer OD660nm von 0,6 gezüchtet.
- 100 ml Kultur wurden durch Zentrifugation geerntet, mit 10 ml Wasser gewaschen, erneut zentrifugiert und erneut in 10 ml 1,2 M Sorbit, 25 mM Na&sub2;EDTA pH = 8,0, 6,7 mg/ml Dithiotreit suspendiert. Die Suspension wurde bei 30ºC für 15 Minuten inkubiert, zentrifugiert und die Zellen in 10 ml 1,2 M Sorbit, 10 mM Na&sub2;EDTA, 0,1 M Natriumcitrat pH = 5,8, 2 mg Novozym® 234 erneut suspendiert. Die Suspension wurde bei 30ºC für 30 Minuten inkubiert, die Zellen durch Zentrifugation gesammelt, in 10 ml 1,2 M Sorbit und in 10 ml CAS (1,2 M Sorbit, 10 mM CaCl&sub2;, 10 mM Tris (Tris = Tris(hydroxymethyl)-aminomethan) pH = 7,5) gewaschen und in 2 ml CAS erneut suspendiert. Zur Transformation wurden 0,1 ml der in CAS erneut suspendierten Zellen mit ungefähr 1 ug Plasmid pKFN27 vermischt und bei Raumtemperatur für 15 Minuten stehengelassen. 1 ml 20%iges Polyethylenglykol 4000, 10 mM CaCl&sub2;, 10 mM Tris pH = 7,5 wurde zugegeben und die Mischung für weitere 30 Minuten bei Raumtemperatur stehengelassen. Die Mischung wurde zentrifugiert und der Pellet in 0,1 ml SOS (1,2 M Sorbit, 33% Vol-% YPGaL, 6,7 mM CaCl&sub2;, 14 ug/ml Leucin) erneut suspendiert und bei 30ºC für 2 Stunden inkubiert. Die Suspension wurde dann zentrifugiert und der Pellet in 0,5 ml 1,2 M Sorbit erneut suspendiert. 6 ml Topagar (das SC-Medium von Sherman et al., (Methods in Yeast Generics, Cold Spring Harbor Laboratory, 1981), wobei Leucin weggelassen wurde und 1,2 M Sorbit plus 2,5% Agar enthalten waren) wurden bei 52ºC zugegeben und die Suspension auf Platten gegossen, die dasselbe mit Agar verfestigte, sorbithaltige Medium enthielten. Transformante Kolonien wurden nach 3 Tagen bei 30ºC aussortiert, erneut isoliert und verwendet, um Flüssigkulturen zu starten. Ein solcher Transformant KFN40 (=MT663/pKFN37) wurde für die weitere Charakterisierung ausgewählt.
- Hefestamm KFN40 wurde auf YPD-Medium (1% Hefeextrakt, 2% Pepton (beides von Difco Laboratories) und 2% Glucose) gezüchtet. Eine 10 ml-Kultur des Stammes wurde bei 30ºC bis zu einer OD600 von 26 gerüttelt. Nach Zentrifugation wurde der Überstand durch Umkehrphasen-HPLC analysiert und 13,5 mg/l Vorläufer wurden gefunden.
- Das Analog im Überstand wurde auf einer Kationenaustauschsäule bei niedrigem pH konzentriert, gefolgt von Desorption mit einer geeigneten Pufferlösung. Kristallisation wurde mit einem alkoholischen Citratpuffer durchgeführt.
- 0,2 mol (47,1 g) Thr-OBut, HOAC wurden in DMF gelöst, um 100 ml Lösung zu ergeben, 50 ml 76,5 Vol.-%iges DMF in Wasser wurden zugegeben und 10 g rohes B27Glu,B(1-29)-Ala-Ala-Lys-A(1-21)- Humaninsulin wurden in der Mischung gelöst, die bei 12ºC thermostatisiert wurde. Dann wurde 1 g Trypsin in 25 ml 0,05 M Calciumacetat zugegeben und nach 24 h bei 12ºC wurde die Mischung zu 2 Liter Aceton zugegeben und die ausgefällten Peptide wurden durch Zentrifugation isoliert und im Vakuum getrocknet. Das B27Glu,B30Thr-OBut-Humaninsulin wurde auf einer präparativen HPLC-Säule mit Silica-C18 als Säulenmaterial gereinigt.
- Das B27Glu,B30Thr-OBut-Humaninsulin wurde in 10 ml Trifluoressigsäure gelöst. Nach 2 Stunden bei Raumtemperatur wurde die Lösung lyophilisiert. Das lyophilisierte Pulver wurde in 400 ml 47,5 mM Natriumcitrat bei pH 7 gelöst. Die Peptide wurden bei pH 5,5 nach Zugabe von 2,4 ml 1 M ZnCl&sub2; ausgefällt, durch Zentrifugation isoliert und im Vakuum getrocknet. Das Produkt wurde durch Anionenautauschchromatographie gereinigt und durch Gelfiltration entsalzt. Ausbeute: 1,7 g B27Glu-Humaninsulin.
- B9Asp-Humaninsulin wurde durch Transpeptidation von B9Asp,B(1- 29)-Ala-Ala-Lys-A(1-21)-Humaninsulin mit Thr-OBut und Acidolyse des erhaltenen Threoninesters mit Trifluoressigsäure hergestellt.
- Dieses Gen wurde in derselben Art und Weise, wie für das Gen beschrieben, das B27Glu,B(1-29)-Ala-Ala-Lys-A(1-21)-Humaninsulin kodiert, durch ortsspezifische Mutagenese von pKFN27 konstruiert, gesteuert durch einen 23-meren Mutageneseprimer d(CTTGTGCGGTGACCACTTGGTTG). Es wurde gezeigt, daß Plasmid pKFN38 die gewünschte Mutation enthielt.
- Plasmid pKFN38 wurde in S. cerevisiae-Stamm MT663 mit demselben Verfahren wie in Beispiel 2, 11 transformiert und ein transformanter KFN41 wurde isoliert.
- Hefestamm KFN41 wurde auf YPD-Medium gezüchtet, wie in Beispiel 2, III beschrieben. 2,5 mg/l des Insulin-Analog-Vorläufers wurden im Überstand gefunden.
- 7,4 g rohes B9Asp,B(1-29)-Ala-Ala-Lys-A(1-21)-Humaninsulin wurde einer Transpeptidase unterzogen, wie beschrieben in Beispiel 2, IV, um B9Asp,B30Thr-OBut-Humaninsulin zu ergeben.
- Das B9Asp,B30Thr-But-Humaninsulin wurde zu B9Asp-Humaninsulin umgewandelt, wie in Beispiel 2, V beschrieben. Ausbeute: 0,83 g B9Asp-Humaninsulin.
- B9Asp,B27Glu-Humaninsulin wurde durch Transpeptidation von B9Asp,B27Glu,B(1-21)-Ala-Ala-Lys-A(1-21)-Humaninsulin mit Thr- OBut und Acidolyse des erhaltenen Threoninesters mit Trifluoressigsäure hergestellt.
- Ein 367 bp langes EcoR1-Hind3-Fragment aus pKFN38 (siehe Beispiel 3) und ein 140 bp langes Hind3-Xba1-Fragment aus pKFN37 (siehe Beispiel 2) wurden an das große xba1-EcoR1-Fragment von Plasmid pUC13 ligiert (dieses Plasmid wurde konstruiert, wie für pUC8 und pUC9 von Vieira et al., (1982), Gene 19, 259-268 beschrieben). Die Ligationsmischung wurde in E. coli (MT 172) transformiert, selektionierend auf Ampicillinresistenz. Plasmide wurden aus einer Anzahl von Transformanten hergestellt und durch Verdauung mit Pst1 und mit Hind3 analysiert. Das 0,5 kb lange xba1-EcoR1-Fragment aus einem Plasmid, das die richtigen Restriktionsenzymmuster zeigte, wurde an ein 7,8 kb langes xba1-Kpn1-Fragment und ein 4,3 kb langes Kpn1-EcoR1-Fragment, beide aus pMT644 (beschrieben in der dänischen Patentanmeldung Nr. 1293/84), ligiert. Die Ligationsmischung wurde in E. coli (MT172) transformiert, selektionierend auf Ampicillinresistenz. Durch DNA-Sequenzierung eines 0,5 kb langen Xbal- EcoR1-Fragmentes wurde gezeigt, daß Plasmid pKFN43 aus einer der resultierenden Kolonien das Gen für den gewünschten Insulin-Derivat-Vorläufer enthielt. Die Konstruktion von pKFN43 ist in Fig. 5 veranschaulicht.
- Plasmid pKFN38 wurde in S. cerevisiae-Stamm MT663 mit demselben Verfahren wie in Beispiel 2, II transformiert und ein transformanter KFN44 wurde isoliert.
- Hefestamm KFN44 wurde auf YPD-Medium gezüchtet, wie in Beispiel 2, III beschrieben. 7,3 mg/l des Insulin-Analog-Vorläufers wurden im Überstand gefunden.
- 12,7 g rohes B9Asp,B27Glu,B(1-29)-Ala-Ala-Lys-A(1-21)-Humaninsulin wurden einer Transpeptidase unterzogen, wie in Beispiel 2, IV beschrieben, um B9Asp,B27Glu,B30Thr-OBut-Humaninsulin zu ergeben.
- Das B9Asp,B27Glu,B30Thr-OBut-Humaninsulin wurde zu B9Asp, B27Glu, B30Thr-Humaninsulin umgewandelt und gereinigt, wie in Beispiel 2, V beschrieben. Ausbeute: 1,0 g B9Asp, B27Glu-Humaninsulin.
- A8His,B9Asp,B27Glu-Humaninsulin wurde durch Transpeptidation von A8His,B9Asp,B27Glu,B(1-29)-Ala-Ala-Lys-A(1-21)-Humaninsulin mit Thr-OBut und Acidolyse des erhaltenen Threoninesters mit Trifluoressigsäure hergestellt, wie in Beispiel 2 beschrieben.
- Dieses Gen wurde durch oligonukleotidgerichtete Mutagenese unter Verwendung eines Verfahrens mit Duplizes mit Lücken (Y. Morinaga, T. Franceschini, S. Inouye, und M. Inouye (1984), Biotechnology 2, 636-639) konstruiert. Das von pUC13 abgeleitete Plasmid, das die MFα1-Leadersequenz und den B9Asp, B27Glu-Humaninsulin-Vorläufer kodiert (Fig. 5), wurde mit HpaI und xbaI geschnitten. Das große Fragment wurde mit dem mit NdeI linearisierten Plasmid vermischt. Nach Hitzedenaturierung und Abkühlung enthielt die Mischung Duplizes mit Lücke mit einem einzelsträngigen "Fenster" in der Region, die dem Insulin-Vorläufer-Gen entspricht (HpaI-Xbal). Der 37- mere Mutagenese-Mismatchprimer d(GAACAATGCTGTCACTCCATCTGCTCCTTGTACCAAT) wurde an die Duplex mit Lücke hybridisiert, gefolgt von Einfüllen mit Klenow-Polymerase und Ligation. Die Mischung wurde verwendet, um E. coli (MT172) zu transformieren, selektionierend auf Ampicillinresistenz. Mutanten wurden durch Koloniehybridisierung mit einer 18-meren 5'-³²p-markierten Sonde d (AATGCTGTCACTCCATCT) identifiziert. Nach Retransformation wurde durch DNA-Sequenzierung eines 0,5 kb langen xbaI-EcoRI-Fragmentes gezeigt, daß ein Plasmid aus einer der resultierenden Kolonien die gewünschte Mutation enthielt. Dieses Plasmid wurde zur Konstruktion des Hefeplasmids pKFN 102 verwendet, wie in Beispiel 4 für die Konstruktion von pKFN43 beschrieben.
- Plasmid pKFN102 wurde in S. cerevisiae-Stamm MT663 mit demselben Verfahren wie in Beispiel 2, 11 transformiert und ein transformanter KFN109 wurde isoliert.
- Hefestamm KFN109 wurde auf YPD-Medium gezüchtet, wie in Beispiel 2, 111 beschrieben. 21,5 mg/l des Insulin-Analog-Vorläufers wurden im Überstand gefunden.
- 22,0 g rohes A8His,B9Asp,B27Glu,B(1-29)-Ala-Ala-Lys-A(1-21)- Humaninsulin wurde einer Transpeptidase unterzogen, umgewandelt und gereinigt, wie in Beispiel 2, IV-V beschrieben. Ausbeute: 4,0 g A8HisB9AspB27Glu-Humaninsulin.
- B12Ile-Humaninsulin wurde hergestellt durch Transpeptidation von B12Ile,B(1-29)-Ala-Ala-Lys-A(1-21)-Humaninsulin mit Thr- OBut und Acidolyse des erhaltenen Threoninesters mit Trifluoressigsäure, wie beschrieben in Beispiel 2.
- Ein 0,5 kb langes EcoRl-Xba1-Fragment von pMTs98 (die Konstruktion von Plasmid pMT598 ist beschrieben in EP-Patentanmeldung Nr. 0 163 529 A), das MFα1-Leader(minus Glu-Ala-Glu- Ala)-B(1-29)-Ala-Ala-Lys-(1-21) kodiert, wurde in Phage M13 mp10 RF inseriert, die mit xba1-EcoR1 geschnitten worden war, und die entsprechende Einzelstrang-DNA wurde aus der rekombinanten Phage M13 mp10 gereinigt. Die Einzelstrang-Matrizen- DNA wurde an einen 27-meren Mutagenese-Primer NOR-92 d(GTAGAGAGCTTCGATCAGGTGTGAGCC) und einen universellen M13-Sequenzierungsprimer d(TCCCAGTCACGACGT) hybridisiert. Die Primer wurden durch dNTPs und Klenow-Polymerase verlängert und mit T4-DNA-Ligase ligiert. Der Mutagenese-Primer KFN92 wurde gewählt, um eine BstN1-Stelle (einzeln im xba1-EcoR1-Fragment) zu zerstören. Daher wurde die Mischung, um gegen nicht-mutiertes EcoR1-Xba1-Fragment zu selektionieren, mit BstN1 und anschließend mit EcoR1 und Xba1 geschnitten und an mit EcoR1 und Xba1 geschnittenen pUC13-Vektor ligiert. Aus einem der erhaltenen Transformanten wurde ein Plasmid, pMT760, ausgewählt, dem die BstN1-Stelle in der Insulin-Kodierungssequenz fehlte. Die gewünschte mutierte Sequenz wurde durch Maxam-Gilbert-DNA- Sequenzierung verifiziert. Plasmid pMT760 enthält eine 0,5 kb lange EcoR1-Xba1-Sequenz, die demselben Fragment aus pMT598 (siehe oben) entspricht, abgesehen von einer Mutation bei B12 (Val-Ile). Diese mutierte Sequenz wurde dann durch Ligation des 0,5 kb langen EcoR1-Xba1-Fragments von pMT760 an ein 7,8 kb langes xba1-Kpn1- und ein 4,3 kb langes Kpn1-EcoR1-Fragment aus pMT644 überführt, um pMTA zu ergeben.
- Plasmid pMTA wurde in Hefestamm MT663 transformiert, wie in Beispiel 2, II beschrieben, und der transformante Stamm MTA wurde gezüchtet, wie in Beispiel 2, III beschrieben. 10,4 mg/l des Insulin-Analog-Vorläufers wurden im Überstand gefunden. 10 g des rohen Analog-Vorläufers wurden einer Transpeptidation unterzogen, umgewandelt und gereinigt, wie beschrieben in Beispiel 2, IV-V. Ausbeute: 1,3 g B12Ile-Humaninsulin.
- B12Tyr-Humaninsulin kann hergestellt werden durch Transpeptidation von B12Tyr,B(1-29)-Ala-Ala-Lys-A(1-21)-Humaninsulin mit Thr-OBut und Acidolyse des erhaltenen Threoninesters mit Trifluoressigsäure, wie in Beispiel 2 beschrieben.
- Das Gen wurde mit einem Verfahren konstruiert, das analog ist zu dem Verfahren zur Herstellung des Gens, das B12Ile,B(1-29)- Ala-Ala-Lys-A(1-21)-Humaninsulin kodiert, mit der einzigen Ausnahme, daß anstelle von KFN92 der Primer KFN93 d (GTAGAGAGCTTCGTACAGGTGTGAGCC) verwendet wurde.
- Die Schritte II-III wurden durchgeführt, wie beschrieben in Beispiel 2. 1,7 mg/l des Insulin-Analog-Vorläufers wurden im Überstand gefunden. Der rohe Analog-Vorläufer kann einer Transpeptidase unterzogen, umgewandelt und gereinigt werden, wie in Beispiel 2, IV-V beschrieben, um B12Tyr-Humaninsulin zu ergeben.
- B10Asp-Humaninsulin wurde hergestellt durch Transpeptidation von B10Asp,B(1-29)-Ala-Ala-Lys-A(1-21)-Humaninsulin mit Thr- OBut und Acidolyse des erhaltenen Threoninesters mit Trifluoressigsäure, wie beschrieben in Beispiel 2.
- Das Gen wurde mit einem Verfahren konstruiert, das analog ist zu dem Verfahren zur Herstellung des Gens, das B12Ile,B(1-29)- Ala-Ala-Lys-A(1-21)-Humaninsulin kodiert, mit der einzigen Ausnahme, daß anstelle von KFN92 der Primer KFN94 d (AGCTTCCACCAGATCTGAGCCGCACAG) verwendet wurde.
- Die Schritte II-III wurden durchgeführt, wie in Beispiel 2 beschrieben. 36 mg/l des Insulin-Analog-Vorläufers wurden im Überstand gefunden. Der rohe Analog-Vorläufer wurde einer Transpeptidase unterzogen, umgewandelt und gereinigt, wie in Beispiel 2, IV-V beschrieben. Ausbeute: 7,6 g B10Asp-Humaninsulin.
- B28Asp-Humaninsulin wurde durch Transpeptidation von B28Asp,B(1-29)-Ala-Ala-Lys-A(1-21)-Humaninsulin mit Thr-OMe und Hydrolyse des erhaltenen Threoninesters bei einem pH von etwa 8 bis 12 hergestellt.
- Ein 0,5 kb langes EcoR1-Xba1-Fragment von pMT 462 (die Konstruktion von Plasmid pMT 462 ist beschrieben in der dänischen Patentanmeldung Nr. 1257/86), das das MFα1-Leader(minus Glu- Ala-Glu-Ala)-B-C-A kodiert, d. h. das Human-Proinsulin-Gen, dem der modifizierte MFα1-Leader vorangeht, wurde in mit xba1- EcoR1 geschnittene Phage M13 mp10 RF inseriert und die entsprechende Einzelstrang-DNA wurde aus der rekombinanten Phage M13 mp10 gereinigt. Die Einzelstrang-Matrizen-DNA wurde an einen 41-meren Mutagenese-Primer NOR205 d (TTCCACAATGCCCTTAGCGGCCTTGTCTGTGTAGAAGAAGC) und einen universellen M13-Sequenzierungsprimer d (TCCCAGTCACGACGT) hybridisiert. Die Primer wurden durch dNTPs und Klenow-Polymerase verlängert und mit T4-DNA-Ligase ligiert.
- Nach Phenolextraktion, Ethanolausfällung und erneuter Suspension wurde die DNA mit den Restriktionsenzymen Apa 1, Xba1 und EcoR1 geschnitten. Nach einer weiteren Phenolextraktion, Ethanolausfällung und erneuten Suspension wurde die DNA an mit EcoR1-Xba1 geschnittenen pUC13 ligiert. Die Ligationsmischung wurde in einen E. coli (r&supmin;, m&spplus;)-Stamm transformiert und Plasmide wurden aus einer Anzahl von Transformanten hergestellt. Plasmid-Zubereitungen wurden mit EcoR1 und xba1 geschnitten und diese Zubereitungen, die Banden bei sowohl 0,5 als auch 0,6 kb zeigten, wurden in E. coli retransformiert. Aus der Retransformation wurde ein Transformant, der nur pU13 mit einem 0,5 Insert enthielt, ausgewählt.
- Aus einem der erhaltenen Transformanten wurde ein Plasmid pMT881 mit der gewünschten Mutation bei B28 (Pro Asp) ausgewählt. Die mutierte Sequenz wurde durch Maxam-Gilbert-DNA- Sequenzierung verifiziert. Die mutierte Sequenz wurde dann durch Ligation eines 0,5 kb langen EcoR1-Xba1-Fragmentes von pMT881 an ein 7,8 kb langes xba1-Kpn1- und ein 4,3 kb langes Kpn1-EcoR1-Fragment aus pMT644 auf ein Hefe-Expressionsplasmid überführt, um pMTA1 zu ergeben.
- Plasmid pMTA1 wurde in S. cerevisiae-Stamm MT663 mit demselben Verfahren wie in Beispiel 2, II transformiert und ein transformanter MTA1 wurde isoliert.
- Hefestamm MTA1 wurde auf YPD-Medium gezüchtet, wie in Beispiel 2, III beschrieben. 7,2 mg/l des Insulin-Analog-Vorläufers wurden im Überstand gefunden.
- Das rohe B28Asp,B(1-29)-Ala-Ala-Lys-A(1-21) wurde einer Transpeptidation unterzogen, wie beschrieben in Beispiel 2, IV, durch Ersetzen von Thr-OBut durch Thr-OMe, um B28Asp,B30Thr- OMe-Humaninsulin zu ergeben.
- Das B28Asp,B30Thr-OMe-Humaninsulin wurde in Wasser bis 1% (w/v) dispergiert und wurde durch Zugabe von 1 N Natriumhydroxid bis zu einem pH-Wert von 10,0 gelöst. Der pH-Wert wurde für 24 Stunden bei 25ºC bei 10,0 konstant gehalten. Das gebildete B28Asp-Humaninsulin wurde ausgefällt durch Zugabe von Natriumchlorid bis etwa 8% (w/v), Natriumacetat-Trihydrat bis etwa 1,4% (w/v) und Zinkacetat-Dihydrat bis etwa 0,01% (w/v), gefolgt von der Zugabe von 1 N Salzsäure bis pH 5,5. Der Niederschlag wurde durch Zentrifugation isoliert und durch Anionenaustauschchromatographie gereinigt und durch Gelfiltration entsalzt. Ausbeute: 0,2 g B28Asp-Humaninsulin.
- A21Asp, B9Asp, B27Glu-Humaninsulin wurde hergestellt aus B9Asp,B27Glu-Humaninsulin durch selektive Desamidierung (Hydrolyse einer 5%igen Lösung für 14 Tage bei 37ºC, pH 2,5). Das desamidierte Produkt wurde durch Anionenaustauschchromatographie isoliert.
- B27Glu,A21Asp-Humaninsulin wurde hergestellt durch Transpeptidation von B27Glu,A21Asp,B(1-29)-Ala-Ala-Lys-A(1-21) mit ThrOBut und Acidolyse des erhaltenen Threoninesters mit Trifluoressigsäure, wie beschrieben in Beispiel 2.
- B27GluA2iAspB(1-29)-Ala-Ala-Lys-A(1-21) wurde hergestellt aus B27Glu,B(1-29)-Ala-Ala-Lys-A(1-21) (siehe Beispiel 2) durch Desamidierung, wie beschrieben in Beispiel 10.
- Bestimmung der Molekulargewichte (Gutfreund H. Biochemical Journal 42 (544) 1948).
- Methode: Knauer-Membran-Osmometer Typ: 1.00
- Membran: Schleicher and Schüll Type: R52
- Lösungsmittel: 0,05 M NaCl pH 7,5 Temp.: 21ºC
- Ergebnisse: Alle Arten von Insulin wurden bei einer Konzentration von 4 mg/ml gemessen. Tabelle 1
- Insulinart Molekulargewicht
- kDalton
- Human-2Zn-Insulin 36 ± 2
- Zn-freies Humaninsulin 29 ± 1
- Zn-freies B27Glu-Humaninsulin 22 ± 1
- - - B12Ile-Humaninsulin 17 ± 1
- - - B27Glu,A21Asp-Humaninsulin 8 ± 1
- - - B9ASp,B27Glu-Humaninsulin 6 ± 1
- - - B9Asp-Humaninsulin 6 ± 1
- - - B9Asp,B27Glu,A21Asp-Humaninsulin 6 ± 1
- - - B9AsP,B27Glu,A8His-Humaninsulin 9 ± 3
- - - B10Asp-Humaninsulin 12 ± 1
- - - B28Asp-Humaninsulin 9 ± 2
- Aus der obigen Tabelle 1 wird deutlich, daß die Humaninsulin- Analoga ein merkbar verringertes Molekulargewicht besitzen, verglichen mit Humaninsulin, was bedeutet, daß die Selbstassoziierung zu Dimeren, Tetrameren und Hexameren weniger ausgeprägt ist und in mehreren Fällen sogar fehlt. Tabelle 2 Halbwertszeit und biologische Potenz Humaninsulin-Analog T&sub1;/&sub2;*(% von Humaninsulin Biologische Potenz** % von Humaninsulin (95% Vertr.-Intervall)
- * Zeit bis zum 50%igen Verschwinden von der Injektionsstelle (subkut.) in Schweinen. Verfahren gemäß Binder 1969 (Acta Pharinacol. Toxicol (Anhang 2) 27 : 1-87)
- ** Mouse Blood Glucose Assay gemäß European Pharmacopocia.
- Aus der obigen Tabelle 2 wird deutlich, daß die Zeit bis zum 50%igen Verschwinden der Insulin-Analoga von der Injektionsstelle beträchtlich verringert ist, wenn verglichen mit Humaninsulin.
- Die biologische Potenz der Insulin-Analoga ist vergleichbar mit Humaninsulin oder nur geringfügig verringert.
- Reinigung der 0,8 kbbande Reinigung der 0,3 kbbande
- Gen Gen Glucagon Leader
- Insertionsprimer
- Klenow-Polymerase
- T4-Ligase MFα1-Leader Gen
- Mut. -Primer
- Klenow-Polymerase
Claims (14)
1. Schnellwirkende Analoga von Humaninsulin, dadurch
gekennzeichnet, daß sie die Formel I besitzen
A-Kette
B-Kette
worin wenigstens ein, aber nicht mehr als sieben der Xe
dieselben oder verschiedene Aminosäurerestsubstitutionen
sind, deren Nettofunktion es ist, dem Molekül dieselbe
Ladung oder eine größere negative Ladung bei neutralem pH
als diejenige von Humaninsulin zu verleihen, wobei die
restlichen Xe die natürlichen Aminosäurereste von
Humaninsulin an der entsprechenden Position im Insulin-Molekül
sind, mit der Maßgabe, daß es wenigstens eine Substitution
in der B-Kette gibt und daß, wenn X in Position B(5) Ala
ist, X in Position B(9) Leu ist, X in Position B(10) Asn
oder Leu ist, X in Position B(12) Asn ist oder X in
Position B(26) Ala ist, dann wenigstens eines der restlichen
Xe verschieden ist von den Aminosäureresten von
Humaninsulin an der entsprechenden Position im Insulin-Molekül, und
mit der weiteren Maßgabe, daß X in Position B(5) nicht Asp
sein kann und X in Position B(12) nicht Glu sein kann, und
wobei ein oder mehrere Aminosäurereste von den N- und/oder
C-terminalen Enden der A- und/oder B-Kette entfernt worden
sein können, mit der zusätzlichen Maßgabe, daß, wenn X in
einer oder mehreren der Positionen B(1), B(2), B(5), B(9),
B(10), B(27) oder B(28) Ala ist, dann wenigstens eines von
allen Xen, mit Ausnahme von jedem X, das in Position B(1),
B(2), B(5), 3(9), B(10), B(27) und/oder B(28) Ala ist,
verschieden ist von den Aminosäureresten von Humaninsulin
an der entsprechenden Position im Insulin-Molekül.
2. Analoga von Insulin nach Anspruch 1, wobei die
Aminosäurerestsubstitutionen hydrophiler sind als der Aminosäurerest
von Humaninsulin an der entsprechenden Position im
Insulin-Molekül.
3. Analoga von Humaninsulin nach Anspruch 1, wobei die
Aminosäuresubstitutionen ausgewählt sind aus der Gruppe, die
aus Asp, Glu, Ser, Thr, His und Ile besteht.
4. Analoga von Humaninsulin nach Anspruch 1, wobei die
Aminosäurerestsubstitutionen Asp und/oder Glu sind.
5. Analoga von Humaninsulin nach Anspruch 1, wobei wenigstens
ein X in Position B(9), 3(10), B(12), B(26), B(27) oder
B(28) verschieden ist von dem Aminosäurerest an der
entsprechenden Stelle im Molekül von Humaninsulin.
6. Analoga von Humaninsulin nach Anspruch 1, wobei wenigstens
ein X in Position 3(9), 3(12), 3(27) oder 3(28)
verschieden ist von dem Aminosäurerest an der entsprechenden
Stelle im Molekül von Humaninsulin.
7. Analog von Humaninsulin nach Anspruch 1, wobei X in
Position
B27 Glu ist, X in Position 312 Ile oder Tyr ist, X in
Position A21 Asp ist und in Position B27 Glu ist, X in
Position B9 Asp ist, X in Position A21 und in Position B9
Asp und in Position B27 Glu ist, X in Position A8 His ist,
in Position B9 Asp ist und in Position B27 Glu ist, x in
Position B10 Asp ist, x in Position 39 Asp ist und in
Position B27 Glu ist oder X in Position 328 Asp ist.
8. Analoga von Humaninsulin nach Anspruch 1,
dadurchgekennzeichnet, daß ihnen bis zu vier Aminosäurereste am
N-Terminus der B-Kette und/oder bis zu fünf Aminosäurereste am
C-terminalen Ende der 3-Kette fehlen.
9. Analoga von Humaninsulin nach Anspruch 8, dadurch
gekennzeichnet, daß ihnen der B(1)-Aminosäurerest und/oder der
B(30)-Aminosäurerest fehlt.
10. Ein Verfahren zur Herstellung von Analoga von Humaninsulin
nach Anspruch 1, wobei ein Hefestamm, der ein
replizierbares Expressionsvehikel enthält, das eine DNA-Sequenz
umfaßt, die einen Vorläufer des Analogs von Insulin
kodiert, in einem geeigneten Nährstoffmedium kultiviert wird
und der Vorläufer aus dem Kulturmedium gewonnen und in das
neuartige Analog von Insulin durch enzymatische und
chemische in-vitro-Umwandlung umgewandelt wird.
11. Ein Verfahren zur Herstellung von Analoga von
Humaninsulin nach Anspruch 1, wobei ein biosynthetischer Vorläufer
der allgemeinen Formel II
A-Kette
B-Kette
worin eine Peptidkette mit n natürlich auftretenden
Aminosäureresten ist, R Lys oder Arg ist, n eine ganze Zahl
von 0 bis 33 ist, m 0 oder 1 ist und die Xe wie oben
definiert sind, mit der Maßgabe, daß die Peptidkette -Qn-R-
nicht zwei benachbarte basische Aminosäurereste enthält,
mit einem L-Threoninester in der Gegenwart von Trypsin
oder einem Trypsin-Derivat zur Reaktion gebracht wird,
gefolgt von der Umwandlung des erhaltenen Threoninesters
des Analogs von Humaninsulin in das Analog von
Humaninsulin mit bekannten Verfahren.
12. Ein Verfahren zur Herstellung von Analoga von
Humaninsulin nach Anspruch 1, wobei ein biosynthetischer Vorläufer
der allgemeinen Formel III
A-Kette
B-Kette
worin V und T jeweils Lys oder Arg sind und die Xe wie
oben definiert sind, mit Trypsin und Carboxypeptidase B in
wäßriger Lösung zur Reaktion gebracht wird und das Analog
von Humaninsulin aus der Reaktionsmischung gewonnen wird.
13. Ein Verfahren zur Herstellung von Analoga von
Humaninsulin nach Anspruch 1, wobei die Analoga von Insulin, die
die geeigneten Aminosäuresubstitutionen enthalten, gemäß
bekannten Verfahren chemisch synthetisiert werden oder A-
und 3-Ketten, die die geeignete Aminosäuresubstitution
enthalten, gemäß bekannten Verfahren chemisch
synthetisiert werden und die modifizierten A- und 3-Ketten
miteinander durch Aufbau von Disulfidbrücken zwischen A(7)Cys
und B(7)Cys und zwischen A(20)Cys und B(19)Cys und der
internen A-Kettenbrücke zwischen A(6)Cys und A(11)Cys
verknüpft werden.
14. Injizierbare Lösungen mit Insulin-Aktivität, dadurch
gekennzeichnet, daß sie ein Analog von Humaninsulin nach
Anspruch 1 oder ein pharmazeutisch annehmbares Salz
desselben in wäßriger Lösung, vorzugsweise bei neutralem pH,
enthalten.
Applications Claiming Priority (2)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| DK395685A DK395685D0 (da) | 1985-08-30 | 1985-08-30 | Peptider |
| DK467785A DK467785D0 (da) | 1985-10-14 | 1985-10-14 | Peptider |
Publications (2)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| DE3650101D1 DE3650101D1 (de) | 1994-11-24 |
| DE3650101T2 true DE3650101T2 (de) | 1995-02-23 |
Family
ID=26067291
Family Applications (2)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| DE3650101T Expired - Lifetime DE3650101T2 (de) | 1985-08-30 | 1986-08-29 | Analoga von Insulin und deren Herstellungsmethode. |
| DE2000175008 Active DE10075008I2 (de) | 1985-08-30 | 1986-08-29 | Analoga von Insulin und deren Herstellungsmethode. |
Family Applications After (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| DE2000175008 Active DE10075008I2 (de) | 1985-08-30 | 1986-08-29 | Analoga von Insulin und deren Herstellungsmethode. |
Country Status (25)
| Country | Link |
|---|---|
| US (1) | US5618913A (de) |
| EP (1) | EP0214826B1 (de) |
| JP (1) | JP2662390B2 (de) |
| KR (1) | KR940000756B1 (de) |
| CN (1) | CN1029977C (de) |
| AR (1) | AR241801A1 (de) |
| AT (1) | ATE113061T1 (de) |
| AU (1) | AU593274B2 (de) |
| CA (1) | CA1306212C (de) |
| CS (1) | CS275613B6 (de) |
| DD (1) | DD268976A5 (de) |
| DE (2) | DE3650101T2 (de) |
| ES (1) | ES2001624A6 (de) |
| FI (1) | FI102182B1 (de) |
| GR (1) | GR862233B (de) |
| HU (1) | HU206518B (de) |
| IE (1) | IE66138B1 (de) |
| IL (1) | IL79887A (de) |
| LU (1) | LU90484I2 (de) |
| NL (1) | NL990042I2 (de) |
| NO (2) | NO177009C (de) |
| NZ (1) | NZ217406A (de) |
| PH (1) | PH25772A (de) |
| PT (1) | PT83278B (de) |
| YU (2) | YU46023B (de) |
Families Citing this family (219)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| DK437786D0 (da) * | 1986-09-12 | 1986-09-12 | Nordisk Gentofte | Insulinprecursorer |
| CA1339416C (en) * | 1987-02-25 | 1997-09-02 | Liselotte Langkjaer | Insulin derivatives |
| US4992417A (en) * | 1987-07-17 | 1991-02-12 | Mount Sinai School Of Medicine | Superactive human insulin analogues |
| US4992418A (en) * | 1987-07-17 | 1991-02-12 | Mount Sinai School Of Medicine | Superactive human insulin analogue-[10-Aspartic Acid-B]Human Insulin |
| CA1340772C (en) * | 1987-12-30 | 1999-09-28 | Patricia Tekamp-Olson | Expression and secretion of heterologous protiens in yeast employing truncated alpha-factor leader sequences |
| US5149777A (en) * | 1988-07-20 | 1992-09-22 | Novo Nordisk A/S | Human insulin analogs and preparations containing them |
| DE3837825A1 (de) * | 1988-11-08 | 1990-05-10 | Hoechst Ag | Neue insulinderivate, ihre verwendung und eine sie enthaltende pharmazeutische zubereitung |
| AU641631B2 (en) * | 1988-12-23 | 1993-09-30 | Novo Nordisk A/S | Human insulin analogues |
| US5716927A (en) * | 1988-12-23 | 1998-02-10 | Novo Nordisk A/S | Insulin analogs having a modified B-chain |
| US5514646A (en) * | 1989-02-09 | 1996-05-07 | Chance; Ronald E. | Insulin analogs modified at position 29 of the B chain |
| US5208217A (en) * | 1989-04-20 | 1993-05-04 | Mount Sinai School Of Medicine Of The City University Of New York | Hepatospecific insulin analogues |
| EP0469084B1 (de) * | 1989-04-20 | 1995-04-05 | Mount Sinai School Of Medicine Of The City University Of New York | Hepatospezifische insulin-analoga |
| DK155690D0 (da) * | 1990-06-28 | 1990-06-28 | Novo Nordisk As | Nye peptider |
| DK158390D0 (da) * | 1990-07-02 | 1990-07-02 | Novo Nordisk As | Nye peptider |
| DK10191D0 (da) * | 1991-01-22 | 1991-01-22 | Novo Nordisk As | Hidtil ukendte peptider |
| DK33591D0 (de) * | 1991-02-27 | 1991-02-27 | Novo Nordisk As | |
| CA2071382A1 (en) * | 1991-06-21 | 1992-12-22 | David N. Brems | Insulin analogs |
| CZ158895A3 (en) * | 1992-12-18 | 1995-12-13 | Lilly Co Eli | Insulin analog, process of its preparation and pharmaceutical composition containing thereof |
| JP2837956B2 (ja) * | 1993-06-21 | 1998-12-16 | ノボ ノルディスク アクティーゼルスカブ | Ａｓｐ▲上Ｂ２８▼インスリン結晶 |
| DK72793D0 (da) * | 1993-06-21 | 1993-06-21 | Novo Nordisk As | Nyt produkt |
| US5504188A (en) * | 1994-06-16 | 1996-04-02 | Eli Lilly And Company | Preparation of stable zinc insulin analog crystals |
| US5461031A (en) * | 1994-06-16 | 1995-10-24 | Eli Lilly And Company | Monomeric insulin analog formulations |
| US5474978A (en) * | 1994-06-16 | 1995-12-12 | Eli Lilly And Company | Insulin analog formulations |
| US5547929A (en) * | 1994-09-12 | 1996-08-20 | Eli Lilly And Company | Insulin analog formulations |
| AU3562195A (en) * | 1994-10-04 | 1996-04-26 | Novo Nordisk A/S | Preparations containing aspb28 human insulin and nicotinamide |
| US5597893A (en) * | 1994-10-31 | 1997-01-28 | Eli Lilly And Company | Preparation of stable insulin analog crystals |
| US5646242A (en) * | 1994-11-17 | 1997-07-08 | Eli Lilly And Company | Selective acylation of epsilon-amino groups |
| US5693609A (en) * | 1994-11-17 | 1997-12-02 | Eli Lilly And Company | Acylated insulin analogs |
| YU18596A (sh) * | 1995-03-31 | 1998-07-10 | Eli Lilly And Company | Analogne formulacije monomernog insulina |
| US5631347A (en) * | 1995-06-07 | 1997-05-20 | Eli Lilly And Company | Reducing gelation of a fatty acid-acylated protein |
| US5700904A (en) * | 1995-06-07 | 1997-12-23 | Eli Lilly And Company | Preparation of an acylated protein powder |
| PL189964B1 (pl) * | 1996-06-20 | 2005-10-31 | Novo Nordisk As | Wodny preparat insuliny, środek farmaceutyczny dopodawania pozajelitowego oraz sposób poprawiania chemicznej stabilności preparatów insuliny |
| US20030069177A1 (en) | 2000-05-16 | 2003-04-10 | Genentech, Inc. | Method for treating cartilage disorders |
| CO4750643A1 (es) | 1997-06-13 | 1999-03-31 | Lilly Co Eli | Formulacion estable de la insulina que contiene l-arginina y protamina |
| DE19726167B4 (de) | 1997-06-20 | 2008-01-24 | Sanofi-Aventis Deutschland Gmbh | Insulin, Verfahren zu seiner Herstellung und es enthaltende pharmazeutische Zubereitung |
| BR9813111A (pt) | 1997-10-24 | 2000-08-15 | Lilly Co Eli | Composições de insulina insolúveis |
| US6531448B1 (en) * | 1997-12-23 | 2003-03-11 | Eli Lilly And Company | Insoluble compositions for controlling blood glucose |
| KR20010041238A (ko) * | 1998-02-23 | 2001-05-15 | 뉴로크린 바이오사이언시즈 인코퍼레이티드 | 인슐린의 펩티드 동족체를 사용하는 당뇨병의 치료 방법 |
| DE19825447A1 (de) * | 1998-06-06 | 1999-12-09 | Hoechst Marion Roussel De Gmbh | Neue Insulinanaloga mit erhöhter Zinkbildung |
| US6933272B1 (en) | 1998-09-22 | 2005-08-23 | Erik Helmerhorst | Use of non-peptidyl compounds for the treatment of insulin related ailments |
| AUPP609198A0 (en) * | 1998-09-22 | 1998-10-15 | Curtin University Of Technology | Use of non-peptidyl compounds for the treatment of insulin related ailments |
| EP1141014B1 (de) | 1999-01-06 | 2004-12-08 | Genentech, Inc. | Mutierte variante des insulin-ähnlichen wachstumsfaktor-i (igf-i) |
| IL143834A0 (en) | 1999-01-06 | 2002-04-21 | Genentech Inc | Insulin-like growth factor (igf) i mutant variants |
| US6746853B1 (en) * | 1999-05-19 | 2004-06-08 | Xencor, Inc. | Proteins with insulin-like activity useful in the treatment of diabetes |
| CN1125081C (zh) | 1999-09-08 | 2003-10-22 | 中国科学院上海生物化学研究所 | 重组天然和新型人胰岛素及其制备方法 |
| US7022674B2 (en) * | 1999-12-16 | 2006-04-04 | Eli Lilly And Company | Polypeptide compositions with improved stability |
| DK1265630T3 (da) | 2000-03-24 | 2006-10-09 | Genentech Inc | Anvendelse af insulin til behandling af brusksygdomme |
| JP2003532691A (ja) * | 2000-05-05 | 2003-11-05 | ノボ ノルディスク アクティーゼルスカブ | 重症疾患神経障害 |
| AR025646A1 (es) * | 2000-09-13 | 2002-12-04 | Beta Lab Sa | Cepa de levaduras metilotroficas recombinantes productoras de un precursor de insulina, construcciones de adn y metodo para obtener la cepa. |
| US7202059B2 (en) | 2001-02-20 | 2007-04-10 | Sanofi-Aventis Deutschland Gmbh | Fusion proteins capable of being secreted into a fermentation medium |
| US7638618B2 (en) | 2001-02-20 | 2009-12-29 | Sanofi-Aventis Deutschland Gmbh | Nucleic acids encoding a hirudin and pro-insulin as superscretable peptides and for parallel improvement of the exported forms of one or more polypeptides of interest |
| DE10114178A1 (de) | 2001-03-23 | 2002-10-10 | Aventis Pharma Gmbh | Zinkfreie und zinkarme Insulinzubereitungen mit verbesserter Stabilität |
| EP1444219A1 (de) | 2001-10-12 | 2004-08-11 | Novo Nordisk A/S | Substituierte piperidine und deren verwendung zur behandlung von krankheiten, die mit dem histamin-h3-rezeptor in zusammenhang stehen |
| PL210437B1 (pl) | 2001-11-19 | 2012-01-31 | Novo Nordisk As | Sposób wytwarzania związków insuliny |
| GB0206792D0 (en) | 2002-03-22 | 2002-05-01 | Leuven K U Res & Dev | Normoglycemia |
| DE10227232A1 (de) | 2002-06-18 | 2004-01-15 | Aventis Pharma Deutschland Gmbh | Saure Insulinzubereitungen mit verbesserter Stabilität |
| US7193035B2 (en) | 2002-10-29 | 2007-03-20 | Sanofi-Aventis Deutschland Gmbh | Crystals of insulin analogs and processes for their preparation |
| US7871607B2 (en) * | 2003-03-05 | 2011-01-18 | Halozyme, Inc. | Soluble glycosaminoglycanases and methods of preparing and using soluble glycosaminoglycanases |
| ATE482747T1 (de) | 2003-04-11 | 2010-10-15 | High Point Pharmaceuticals Llc | Neue amide derivate und deren pharmazeutische verwendungen |
| CA2529023A1 (en) | 2003-06-27 | 2005-01-06 | Novo Nordisk A/S | High moisture barrier container for medical liquid compositions |
| EP1644411A2 (de) * | 2003-07-11 | 2006-04-12 | Novo Nordisk A/S | Stabilisierte insulinzusammensetzungen |
| US20060183667A1 (en) * | 2003-07-11 | 2006-08-17 | Novo Nordisk A/S | Stabilised insulin compositions |
| WO2005012346A1 (en) * | 2003-07-25 | 2005-02-10 | Conjuchem, Inc. | Long lasting insulin derivatives and methods thereof |
| ES2402592T3 (es) | 2003-08-05 | 2013-05-07 | Novo Nordisk A/S | Nuevos derivados de insulina |
| KR101159559B1 (ko) | 2003-08-05 | 2012-06-26 | 노보 노르디스크 에이/에스 | 신규의 인슐린 유도체 |
| EP1684793B1 (de) * | 2003-11-13 | 2011-09-21 | Novo Nordisk A/S | Pharmazeutische zusammensetzung umfassend eine insulinotrope glp-1(7-37) analoge, asp(b28)-insulin, und eine oberflächenaktive verbindung |
| US20060287221A1 (en) | 2003-11-13 | 2006-12-21 | Novo Nordisk A/S | Soluble pharmaceutical compositions for parenteral administration comprising a GLP-1 peptide and an insulin peptide of short time action for treatment of diabetes and bulimia |
| HUE038395T2 (hu) | 2003-11-20 | 2018-10-29 | Novo Nordisk As | Propilén-glikol tartalmú peptidkészítmények, amelyek elõállításra és injekciós eszközökben történõ alkalmazásra optimálisak |
| EP1692168B1 (de) | 2003-12-03 | 2011-07-20 | Novo Nordisk A/S | Einzelketteninsulin |
| ATE483580T1 (de) | 2003-12-22 | 2010-10-15 | Novo Nordisk As | Durchsichtiger, flexibler, undurchlässiger kunststoffbehälter zur lagerung von pharmazeutischen flüssigkeiten |
| ES2642214T3 (es) | 2004-01-21 | 2017-11-15 | Novo Nordisk Health Care Ag | Conjugación de péptidos mediante transglutaminasa |
| NZ553263A (en) | 2004-07-19 | 2010-06-25 | Biocon Ltd | Insulin-oligomer conjugates, formulations and uses thereof |
| US7958926B2 (en) | 2004-11-04 | 2011-06-14 | Hunter Douglas Inc. | Single-Track stacking panel covering for an architectural opening |
| US7833513B2 (en) | 2004-12-03 | 2010-11-16 | Rhode Island Hospital | Treatment of Alzheimer's Disease |
| EP1846446B1 (de) | 2005-02-02 | 2013-06-26 | Novo Nordisk A/S | Insulinderivate |
| ES2490243T3 (es) | 2005-02-02 | 2014-09-03 | Novo Nordisk A/S | Derivados de insulina |
| CN103110635A (zh) | 2005-07-04 | 2013-05-22 | 海波因特制药有限责任公司 | 组胺h3受体拮抗剂 |
| EP1910317B1 (de) | 2005-07-20 | 2013-07-03 | Eli Lilly And Company | 1-amino-verbundene verbindungen |
| WO2007020256A1 (en) | 2005-08-16 | 2007-02-22 | Novo Nordisk A/S | Method for making mature insulin polypeptides |
| PL1926749T3 (pl) | 2005-09-14 | 2011-12-30 | Sanofi Aventis Deutschland | Cięcie prekursorów insuliny przez wariant trypsyny |
| US7863329B2 (en) | 2005-11-17 | 2011-01-04 | Eli Lilly And Company | Glucagon receptor antagonists, preparation and therapeutic uses |
| EP1969004B1 (de) | 2005-12-28 | 2011-08-10 | Novo Nordisk A/S | Ein acyliertes insulin und zink enthaltende zusammensetzungen und verfahren zur herstellung dieser zusammensetzungen |
| WO2007081824A2 (en) * | 2006-01-06 | 2007-07-19 | Case Western Reserve University | Fibrillation resistant proteins |
| US20090069216A1 (en) * | 2006-02-21 | 2009-03-12 | Novo Nordisk A/S | Single-Chain Insulin Analogues and Pharmaceutical Formulations Thereof |
| WO2007096431A1 (en) | 2006-02-27 | 2007-08-30 | Novo Nordisk A/S | Insulin derivatives |
| JP5312054B2 (ja) | 2006-03-15 | 2013-10-09 | ノボ・ノルデイスク・エー／エス | アミリンとインスリンの混合物 |
| AU2007229492B2 (en) | 2006-03-28 | 2011-11-03 | High Point Pharmaceuticals, Llc | Benzothiazoles having histamine H3 receptor activity |
| PL2049475T3 (pl) | 2006-04-24 | 2012-08-31 | Lilly Co Eli | Pirolidynony podstawione cykloheksylem jako inhibitory 11-betahydrokysterydu dehydrogenazy 1 |
| US8796205B2 (en) | 2006-05-09 | 2014-08-05 | Novo Nordisk A/S | Insulin derivative |
| MX2008014061A (es) | 2006-05-09 | 2008-11-14 | Novo Nordisk As | Derivado de insulina. |
| EA016026B1 (ru) | 2006-05-29 | 2012-01-30 | ХАЙ ПОЙНТ ФАРМАСЬЮТИКАЛЗ, ЭлЭлСи | 3-(1,3-бензодиоксол-5-ил)-6-(4-циклопропилпиперазин-1-ил)пиридазин, его соли и сольваты и его применение в качестве антагониста н3 рецептора гистамина |
| EP2021368A4 (de) * | 2006-06-08 | 2010-01-20 | Diabecore Medical Inc | Derivatisierte insulinoligomere |
| DE102006031955A1 (de) * | 2006-07-11 | 2008-01-17 | Sanofi-Aventis Deutschland Gmbh | Verfahren zur Herstellung von Insulinanaloga mit dibasischem B-Kettenende |
| DE102006031962A1 (de) | 2006-07-11 | 2008-01-17 | Sanofi-Aventis Deutschland Gmbh | Amidiertes Insulin Glargin |
| JP5550338B2 (ja) | 2006-07-31 | 2014-07-16 | ノボ・ノルデイスク・エー／エス | ペグ化持続型インスリン |
| US9018161B2 (en) * | 2006-09-22 | 2015-04-28 | Novo Nordisk A/S | Protease resistant insulin analogues |
| EP2074140B8 (de) * | 2006-10-04 | 2015-10-28 | Case Western Reserve University | Fibrillationsresistentes insulin und insulinanaloga |
| WO2008049711A1 (en) * | 2006-10-27 | 2008-05-02 | Novo Nordisk A/S | Peptide extended insulins |
| US10100098B2 (en) | 2006-12-13 | 2018-10-16 | Stelis Biopharma Private Limited | Insulin production methods and proinsulin constructs |
| US20120214963A1 (en) * | 2011-02-23 | 2012-08-23 | Elona Biotechnologies | Aspart proinsulin compositions and methods of producing aspart insulin analogs therefrom |
| JP5496082B2 (ja) | 2007-04-30 | 2014-05-21 | ノボ・ノルデイスク・エー／エス | タンパク質組成物を乾燥させる方法、乾燥タンパク質組成物、及び乾燥タンパク質を含有する薬学的組成物 |
| WO2008139496A1 (en) * | 2007-05-16 | 2008-11-20 | Bigtec Private Limited | Recombinant human insulin and a method thereof |
| US20110144010A1 (en) | 2007-06-01 | 2011-06-16 | Novo Nordisk A/S | Spontaneously Dispersible Preconcentrates Including a Peptide Drug in a Solid or Semisolid Carrier |
| WO2008145730A1 (en) | 2007-06-01 | 2008-12-04 | Novo Nordisk A/S | Stable non-aqueous pharmaceutical compositions |
| JP5552046B2 (ja) | 2007-06-13 | 2014-07-16 | ノボ・ノルデイスク・エー／エス | インスリン誘導体を含有する薬学的製剤 |
| WO2009021955A1 (en) | 2007-08-13 | 2009-02-19 | Novo Nordisk A/S | Rapid acting insulin analogues |
| WO2009021956A2 (en) * | 2007-08-13 | 2009-02-19 | Novo Nordisk A/S | Rapid acting insulin analogues |
| ES2548304T3 (es) | 2007-08-15 | 2015-10-15 | Novo Nordisk A/S | Análogos de la insulina que contienen una fracción acilo y alquilenglicol |
| ES2526924T3 (es) | 2007-08-15 | 2015-01-16 | Novo Nordisk A/S | Insulinas con una fracción acilo que comprende unidades repetitivas de aminoácidos que contienen alquilenglicol |
| NZ603812A (en) | 2007-11-20 | 2014-06-27 | Ambrx Inc | Modified insulin polypeptides and their uses |
| RU2524423C2 (ru) | 2008-01-09 | 2014-07-27 | Санофи-Авентис Дойчланд Гмбх | Новые производные инсулина с чрезвычайно замедленным профилем время/действие |
| PL2254906T3 (pl) | 2008-03-18 | 2017-04-28 | Novo Nordisk A/S | Stabilizowane względem proteaz, acylowane analogi insuliny |
| CN102065903B (zh) | 2008-04-01 | 2015-02-18 | 诺沃-诺迪斯克有限公司 | 胰岛素清蛋白缀合物 |
| WO2009129250A2 (en) * | 2008-04-14 | 2009-10-22 | Case Western Reserve University | Meal-time insulin analogues of enhanced stability |
| BRPI0911571A2 (pt) * | 2008-04-22 | 2018-04-03 | Univ Case Western Reserve | método para tratar um mamífero, análogo de insulina, ácido nucléico e célula hospedeira |
| TWI394580B (zh) | 2008-04-28 | 2013-05-01 | Halozyme Inc | 超快起作用胰島素組成物 |
| TWI451876B (zh) | 2008-06-13 | 2014-09-11 | Lilly Co Eli | 聚乙二醇化之離脯胰島素化合物 |
| KR20120129875A (ko) * | 2008-07-31 | 2012-11-28 | 케이스 웨스턴 리저브 유니버시티 | 염소화 아미노산을 갖는 인슐린 유사체 |
| US9200053B2 (en) | 2008-07-31 | 2015-12-01 | Case Western Reserve University | Insulin analogues containing penta-fluoro-Phenylalanine at position B24 |
| WO2011072288A2 (en) | 2009-12-11 | 2011-06-16 | Case Western Reserve University | Insulin analogues with chlorinated amino acids |
| RU2458989C1 (ru) | 2008-08-07 | 2012-08-20 | Байокон Лимитид | Способ получения аналогов инсулина из их соответствующих предшественников (варианты) |
| DE102008053048A1 (de) | 2008-10-24 | 2010-04-29 | Sanofi-Aventis Deutschland Gmbh | Kombination von einem Insulin und einem GLP-1-Agonisten |
| DE102009038210A1 (de) | 2009-08-20 | 2011-03-03 | Sanofi-Aventis Deutschland Gmbh | Kombination von einem Insulin und einem GLP-1-Agonisten |
| DE102008051834A1 (de) | 2008-10-17 | 2010-04-22 | Sanofi-Aventis Deutschland Gmbh | Kombination von einem Insulin und einem GLP-1-Agonisten |
| CA2740685C (en) * | 2008-10-17 | 2018-09-11 | Sanofi-Aventis Deutschland Gmbh | Combination of an insulin and a glp-1 agonist |
| RU2540922C2 (ru) | 2008-10-30 | 2015-02-10 | Ново Нордиск А/С | Лечение сахарного диабета с использованием инъекций инсулина с частотой менее одного раза в день |
| MX2011005037A (es) | 2008-11-21 | 2011-06-16 | High Point Pharmaceuticals Llc | Compuestos de adamantilo benzamida. |
| US9018190B2 (en) | 2009-03-27 | 2015-04-28 | Adocia | Functionalized oligosaccharides |
| FR2943538B1 (fr) | 2009-03-27 | 2011-05-20 | Adocia | Formulation a action rapide d'insuline recombinante humaine |
| MY159865A (en) | 2009-07-06 | 2017-02-15 | Sanofi Aventis Deutschland | Aqueous insulin preparations containing methionine |
| EP2451471A1 (de) | 2009-07-06 | 2012-05-16 | Sanofi-Aventis Deutschland GmbH | Langsamwirkende insulinzubereitungen |
| TW201105346A (en) | 2009-07-06 | 2011-02-16 | Sanofi Aventis Deutschland | Heat-stable and vibration-stable insulin preparations |
| WO2011012718A1 (en) | 2009-07-31 | 2011-02-03 | Ascendis Pharma As | Prodrugs comprising an insulin linker conjugate |
| SG178195A1 (en) | 2009-07-31 | 2012-03-29 | Sanofi Aventis Deutschland | Long acting insulin composition |
| US8399407B2 (en) * | 2009-09-17 | 2013-03-19 | Case Western Reserve University | Non-standard insulin analogues |
| AU2010317995B2 (en) | 2009-11-13 | 2014-04-17 | Sanofi-Aventis Deutschland Gmbh | Pharmaceutical composition comprising a GLP-1 agonist, an insulin, and methionine |
| JP5973918B2 (ja) | 2009-11-13 | 2016-08-23 | サノフィ−アベンティス・ドイチュラント・ゲゼルシャフト・ミット・ベシュレンクテル・ハフツング | Ｇｌｐ−１アゴニスト及びメチオニンを含む薬学的組成物 |
| US8637096B2 (en) | 2009-12-04 | 2014-01-28 | Curtis C. Stojan | Compositions and method for enhancing insulin activity |
| EP2460527A1 (de) | 2010-01-21 | 2012-06-06 | Sanofi | Pharmazeutische Zusammensetzung zur Behandlung eines metabolischen Syndroms |
| UY33326A (es) | 2010-04-14 | 2011-12-01 | Sanofi Aventis | Conjugados de insulina-sirna |
| US20130143803A1 (en) | 2010-05-10 | 2013-06-06 | Novo Nordisk A/S | Process for the Preparation of Insulin-Zinc Complexes |
| JP5969469B2 (ja) | 2010-06-16 | 2016-08-17 | インディアナ ユニバーシティー リサーチ アンド テクノロジー コーポレーションＩｎｄｉａｎａ Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ Ｒｅｓｅａｒｃｈ Ａｎｄ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ | インスリン受容体に対して高い活性を示す単鎖インスリンアゴニスト |
| CA2802510A1 (en) * | 2010-06-23 | 2011-12-29 | Novo Nordisk A/S | Insulin derivatives containing additional disulfide bonds |
| DK2605789T3 (da) | 2010-08-17 | 2019-09-16 | Ambrx Inc | Modificerede relaxinpolypeptider og anvendelser deraf |
| JP6199186B2 (ja) | 2010-08-30 | 2017-09-20 | サノフィ−アベンティス・ドイチュラント・ゲゼルシャフト・ミット・ベシュレンクテル・ハフツング | ２型糖尿病の治療用の医薬の製造のためのａｖｅ００１０の使用 |
| EP2438930A1 (de) | 2010-09-17 | 2012-04-11 | Sanofi-Aventis Deutschland GmbH | Prodrug mit einem exendinbindenden Konjugat |
| RS59423B1 (sr) | 2010-10-27 | 2019-11-29 | Novo Nordisk As | Lečenje dijabetesa melitusa korišćenjem insulinskih injekcija davanih u različitim intervalima ubrizgavanja |
| BR112013010345A2 (pt) | 2010-10-27 | 2017-07-25 | Novo Nordisk As | tratamento de diabetes melitus usando as injeções de insulina administradas com intervalos de variação da injeção |
| JP2013545782A (ja) | 2010-12-14 | 2013-12-26 | ノヴォ ノルディスク アー／エス | 長時間作用型インスリンと組み合わせた速効型インスリン |
| CN103459417B (zh) * | 2011-02-01 | 2018-04-10 | 诺沃—诺迪斯克有限公司 | 胰岛素的纯化 |
| WO2012104834A1 (en) | 2011-02-03 | 2012-08-09 | Pharmedica Ltd. | New oral dissolving films for insulin administration, for treating diabetes |
| WO2012115637A1 (en) * | 2011-02-23 | 2012-08-30 | Elona Biotechnologies | Aspart proinsulin compositions and methods of producing aspart insulin analogs |
| WO2012115638A1 (en) | 2011-02-23 | 2012-08-30 | Elona Biotechnologies | Glargine proinsulin compositions and methods of producing glargine insulin analogs therefrom |
| WO2012123519A2 (en) | 2011-03-15 | 2012-09-20 | Novo Nordisk A/S | Human insulin analogues and derivatives comprising cysteine substitutions |
| US9821032B2 (en) | 2011-05-13 | 2017-11-21 | Sanofi-Aventis Deutschland Gmbh | Pharmaceutical combination for improving glycemic control as add-on therapy to basal insulin |
| US20130011378A1 (en) | 2011-06-17 | 2013-01-10 | Tzung-Horng Yang | Stable formulations of a hyaluronan-degrading enzyme |
| EP2548570A1 (de) | 2011-07-19 | 2013-01-23 | Sanofi | Pharmazeutische Zusammensetzung zur Behandlung eines metabolischen Syndroms |
| RU2650616C2 (ru) | 2011-08-29 | 2018-04-16 | Санофи-Авентис Дойчланд Гмбх | Фармацевтическая комбинация для применения при гликемическом контроле у пациентов с сахарным диабетом 2 типа |
| TWI559929B (en) | 2011-09-01 | 2016-12-01 | Sanofi Aventis Deutschland | Pharmaceutical composition for use in the treatment of a neurodegenerative disease |
| US20130231281A1 (en) | 2011-11-02 | 2013-09-05 | Adocia | Rapid acting insulin formulation comprising an oligosaccharide |
| CN103443122B (zh) | 2011-12-15 | 2016-05-11 | 上海恒瑞医药有限公司 | 人胰岛素类似物及其酰化衍生物 |
| WO2013096386A1 (en) | 2011-12-20 | 2013-06-27 | Indiana University Research And Technology Corporation | Ctp-based insulin analogs for treatment of diabetes |
| MX2014012096A (es) | 2012-04-11 | 2014-11-21 | Novo Nordisk As | Formulaciones de insulina. |
| AU2013255880B2 (en) | 2012-05-01 | 2017-07-20 | Novo Nordisk A/S | Pharmaceutical composition |
| US20130315891A1 (en) | 2012-05-25 | 2013-11-28 | Matthew Charles | Formulations of human tissue kallikrein-1 for parenteral delivery and related methods |
| LT2854841T (lt) | 2012-06-04 | 2017-06-12 | Diamedica Inc. | Kalikreino 1 iš žmogaus audinio glikozilinimo izoformos |
| CN108383902A (zh) | 2012-09-26 | 2018-08-10 | 印第安纳大学研究及科技有限公司 | 胰岛素类似物二聚体 |
| ES2670969T3 (es) | 2012-11-13 | 2018-06-04 | Adocia | Formulación de acción rápida de insulina que comprende un compuesto aniónico sustituido |
| US9707276B2 (en) | 2012-12-03 | 2017-07-18 | Merck Sharp & Dohme Corp. | O-glycosylated carboxy terminal portion (CTP) peptide-based insulin and insulin analogues |
| WO2014093696A2 (en) | 2012-12-12 | 2014-06-19 | Massachusetts Institute Of Technology | Insulin derivatives for diabetes treatment |
| US9707275B2 (en) | 2012-12-19 | 2017-07-18 | Wockhardt Limited | Stable aqueous composition comprising human insulin or an analogue or derivative thereof |
| BR112015013223A2 (pt) | 2012-12-26 | 2017-07-11 | Wockhardt Ltd | composição farmacêutica |
| TWI641381B (zh) | 2013-02-04 | 2018-11-21 | 法商賽諾菲公司 | 胰島素類似物及／或胰島素衍生物之穩定化醫藥調配物 |
| RU2678134C2 (ru) | 2013-03-14 | 2019-01-23 | Индиана Юниверсити Рисерч Энд Текнолоджи Корпорейшн | Конъюгаты инсулин-инкретин |
| EP2991672A1 (de) | 2013-04-30 | 2016-03-09 | Novo Nordisk A/S | Neuartiges verabreichungsschema |
| JP2016531847A (ja) | 2013-09-30 | 2016-10-13 | ウォックハート リミテッド | 医薬組成物 |
| SI3055325T1 (en) | 2013-10-07 | 2018-05-31 | Novo Nordisk A/S | NEW DERIVATIVE ANALOGUE INSULINE |
| JP6723921B2 (ja) | 2014-01-09 | 2020-07-15 | サノフイＳａｎｏｆｉ | インスリンアナログおよび／またはインスリン誘導体の、グリセリンを含まない安定化された医薬製剤 |
| SG11201604706TA (en) | 2014-01-09 | 2016-07-28 | Sanofi Sa | Stabilized pharmaceutical formulations of insulin aspart |
| MX2016008979A (es) | 2014-01-09 | 2016-10-04 | Sanofi Sa | Formulaciones farmaceuticas estabilizadas de analogos de insulina y/o derivados de insulina. |
| FR3020947B1 (fr) | 2014-05-14 | 2018-08-31 | Adocia | Composition aqueuse comprenant au moins une proteine et un agent solubilisant, sa preparation et ses utilisations |
| US9795678B2 (en) | 2014-05-14 | 2017-10-24 | Adocia | Fast-acting insulin composition comprising a substituted anionic compound and a polyanionic compound |
| US9656017B2 (en) | 2014-06-20 | 2017-05-23 | Howard E. Greene | Infusion delivery devices and methods |
| WO2016001862A1 (en) | 2014-07-04 | 2016-01-07 | Wockhardt Limited | Extended release formulations of insulins |
| US10232020B2 (en) | 2014-09-24 | 2019-03-19 | Indiana University Research And Technology Corporation | Incretin-insulin conjugates |
| KR102569743B1 (ko) | 2014-10-06 | 2023-08-23 | 케이스 웨스턴 리저브 유니버시티 | 이상 단일 사슬 인슐린 유사체 |
| CN108064173B (zh) | 2014-11-21 | 2021-05-18 | 默沙东公司 | 胰岛素受体部分激动剂 |
| HRP20230470T1 (hr) | 2014-12-12 | 2023-07-21 | Sanofi-Aventis Deutschland Gmbh | Formulacija fiksnog omjera inzulin glargin/liksisenatid |
| AR102869A1 (es) | 2014-12-16 | 2017-03-29 | Lilly Co Eli | Composiciones de insulina de rápida acción |
| CN105884879A (zh) * | 2015-01-26 | 2016-08-24 | 漳州博欣生物技术有限公司 | 一种胰岛素类似物的化学合成方法 |
| TWI748945B (zh) | 2015-03-13 | 2021-12-11 | 德商賽諾菲阿凡提斯德意志有限公司 | 第２型糖尿病病患治療 |
| TW201705975A (zh) | 2015-03-18 | 2017-02-16 | 賽諾菲阿凡提斯德意志有限公司 | 第２型糖尿病病患之治療 |
| ES2908373T3 (es) | 2015-08-25 | 2022-04-28 | Novo Nordisk As | Nuevos derivados de insulina y los usos médicos de los mismos |
| JO3749B1 (ar) | 2015-08-27 | 2021-01-31 | Lilly Co Eli | تركيبات إنسولين سريعة المفعول |
| FR3043557B1 (fr) | 2015-11-16 | 2019-05-31 | Adocia | Composition a action rapide d'insuline comprenant un citrate substitue |
| EP3442997A2 (de) | 2016-04-15 | 2019-02-20 | Indiana University Research & Technology Corporation | Fgf21-c-endpeptid-optimierung |
| GB201607918D0 (en) | 2016-05-06 | 2016-06-22 | Arecor Ltd | Novel formulations |
| EP3463429A4 (de) | 2016-05-24 | 2020-07-22 | Merck Sharp & Dohme Corp. | Insulinrezeptorteilagonisten und glp-1-analoga |
| US10689430B2 (en) | 2016-05-25 | 2020-06-23 | Merck Sharp & Dohme Corp. | Insulin receptor partial agonists |
| EP3495384A4 (de) | 2016-08-02 | 2020-02-26 | Jiangsu Hengrui Medicine Co., Ltd. | Acyliertes derivat von menschlichem insulin oder einem analogon davon |
| EP3518893A1 (de) | 2016-09-29 | 2019-08-07 | Arecor Limited | Neuartige formulierungen |
| TWI700091B (zh) | 2016-12-16 | 2020-08-01 | 丹麥商諾佛 儂迪克股份有限公司 | 含胰島素醫藥組成物 |
| EP3592377A4 (de) | 2017-03-09 | 2021-02-17 | Diamedica Inc. | Darreichungsformen von gewebekallikrein 1 |
| GB201707187D0 (en) | 2017-05-05 | 2017-06-21 | Arecor Ltd | Novel formulations |
| GB201707188D0 (en) | 2017-05-05 | 2017-06-21 | Arecor Ltd | Novel formulations |
| GB201707189D0 (en) | 2017-05-05 | 2017-06-21 | Arecor Ltd | Novel formulations |
| CR20190522A (es) | 2017-06-01 | 2020-01-15 | Lilly Co Eli | Composiciones de insulina de rápida acción |
| EP3668892A1 (de) | 2017-08-17 | 2020-06-24 | Novo Nordisk A/S | Neuartige acylierte insulinanaloga und verwendungen dafür |
| US20210093775A1 (en) | 2018-04-04 | 2021-04-01 | Arecor Limited | Medical infusion pump system for the delivery of an insulin compound |
| CA3094237A1 (en) | 2018-04-04 | 2019-10-10 | Arecor Limited | Medical infusion pump system for the delivery of an insulin compound |
| IL277720B2 (en) | 2018-04-04 | 2024-03-01 | Arecor Ltd | A medical infusion pump system for administration of an insulin compound |
| US10335464B1 (en) | 2018-06-26 | 2019-07-02 | Novo Nordisk A/S | Device for titrating basal insulin |
| EP3845240A4 (de) * | 2018-09-12 | 2021-11-03 | Amphastar Nanjing Pharmaceuticals, Inc. | Neuartige proinsulin-aspart-struktur und verfahren zur herstellung von insulin-aspart |
| KR20200082618A (ko) | 2018-12-31 | 2020-07-08 | 주식회사 폴루스 | 인슐린 과발현용 램프 태그 및 이를 이용한 인슐린의 제조방법 |
| JP6995284B2 (ja) * | 2019-12-11 | 2022-01-14 | ノヴォ ノルディスク アー／エス | 新規インスリン類似体およびそれらの使用 |
| CN114901682B (zh) | 2019-12-30 | 2024-04-16 | 甘李药业股份有限公司 | 胰岛素衍生物 |
| US20240239859A1 (en) | 2019-12-30 | 2024-07-18 | Gan & Lee Pharmaceuticals Co., Ltd. | Long-Acting GLP-1 Compound |
| GB202004814D0 (en) | 2020-04-01 | 2020-05-13 | Arecor Ltd | Novel formulations |
| WO2023225534A1 (en) | 2022-05-18 | 2023-11-23 | Protomer Technologies Inc. | Aromatic boron-containing compounds and related insulin analogs |
Family Cites Families (15)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| DE2252157C3 (de) * | 1972-10-25 | 1976-03-18 | Hoechst Ag | Zwischenprodukte zur herstellung von insulin, insulin-analogen und -derivaten und verfahren zur herstellung von insulin, insulin analogen und derivaten |
| US4652525A (en) * | 1978-04-19 | 1987-03-24 | The Regents Of The University Of California | Recombinant bacterial plasmids containing the coding sequences of insulin genes |
| US4565785A (en) * | 1978-06-08 | 1986-01-21 | The President And Fellows Of Harvard College | Recombinant DNA molecule |
| US4411994A (en) * | 1978-06-08 | 1983-10-25 | The President And Fellows Of Harvard College | Protein synthesis |
| JPS55138391A (en) * | 1979-04-13 | 1980-10-29 | Shionogi & Co Ltd | New synthetic method of peptide derivative |
| IE50892B1 (en) * | 1980-02-11 | 1986-08-06 | Novo Industri As | Process for preparing insulin esters |
| US4340674A (en) * | 1980-05-05 | 1982-07-20 | The Upjohn Company | Cointegrate plasmids and their construction from plasmids of Escherichia and Streptomyces |
| US4351901A (en) * | 1980-03-24 | 1982-09-28 | Cetus Corporation | Method for single nucleotide alteration |
| DK319780A (da) * | 1980-07-24 | 1982-01-25 | Forenede Bryggerier As | Fremgangsmaade til enzymatisk udskiftning af b-30 aminosyren i insuliner |
| ZA824218B (en) * | 1981-06-29 | 1983-04-27 | Cetus Corp | Plasmid for producing human insulin |
| DK58285D0 (da) * | 1984-05-30 | 1985-02-08 | Novo Industri As | Peptider samt fremstilling og anvendelse deraf |
| US5008241A (en) * | 1985-03-12 | 1991-04-16 | Novo Nordisk A/S | Novel insulin peptides |
| DK129385A (da) * | 1985-03-22 | 1986-09-23 | Novo Industri As | Peptider og fremstilling deraf |
| DK134189D0 (da) * | 1989-03-20 | 1989-03-20 | Nordisk Gentofte | Insulinforbindelser |
| US5559094A (en) * | 1994-08-02 | 1996-09-24 | Eli Lilly And Company | AspB1 insulin analogs |
-
1986
- 1986-08-22 PH PH34177A patent/PH25772A/en unknown
- 1986-08-26 YU YU148486A patent/YU46023B/sh unknown
- 1986-08-28 CN CN86106574A patent/CN1029977C/zh not_active Expired - Lifetime
- 1986-08-29 NZ NZ217406A patent/NZ217406A/xx unknown
- 1986-08-29 DD DD29398186A patent/DD268976A5/de unknown
- 1986-08-29 IE IE231786A patent/IE66138B1/en not_active IP Right Cessation
- 1986-08-29 DE DE3650101T patent/DE3650101T2/de not_active Expired - Lifetime
- 1986-08-29 EP EP86306721A patent/EP0214826B1/de not_active Expired - Lifetime
- 1986-08-29 CS CS866310A patent/CS275613B6/cs not_active IP Right Cessation
- 1986-08-29 HU HU863754A patent/HU206518B/hu unknown
- 1986-08-29 AR AR86305098A patent/AR241801A1/es active
- 1986-08-29 NO NO863474A patent/NO177009C/no not_active IP Right Cessation
- 1986-08-29 ES ES8601507A patent/ES2001624A6/es not_active Expired
- 1986-08-29 US US06/901,821 patent/US5618913A/en not_active Expired - Lifetime
- 1986-08-29 DE DE2000175008 patent/DE10075008I2/de active Active
- 1986-08-29 GR GR862233A patent/GR862233B/el unknown
- 1986-08-29 CA CA000517255A patent/CA1306212C/en not_active Expired - Lifetime
- 1986-08-29 IL IL79887A patent/IL79887A/xx not_active IP Right Cessation
- 1986-08-29 PT PT83278A patent/PT83278B/pt unknown
- 1986-08-29 AT AT86306721T patent/ATE113061T1/de active
- 1986-08-29 KR KR1019860007225A patent/KR940000756B1/ko not_active IP Right Cessation
- 1986-08-29 AU AU62066/86A patent/AU593274B2/en not_active Expired
- 1986-08-29 JP JP61201906A patent/JP2662390B2/ja not_active Expired - Lifetime
- 1986-08-29 FI FI863512A patent/FI102182B1/fi not_active IP Right Cessation
-
1988
- 1988-01-11 YU YU4188A patent/YU46857B/sh unknown
-
1999
- 1999-12-06 NL NL990042C patent/NL990042I2/nl unknown
- 1999-12-21 LU LU90484C patent/LU90484I2/fr unknown
-
2000
- 2000-07-21 NO NO2000005C patent/NO2000005I1/no unknown
Also Published As
Similar Documents
| Publication | Publication Date | Title |
|---|---|---|
| DE3650101T2 (de) | Analoga von Insulin und deren Herstellungsmethode. | |
| DE68912777T2 (de) | Insulin-analoge. | |
| DE68928971T2 (de) | Lys(B28) Insuline. Analoge des menschlichen Insulins | |
| EP0885961B1 (de) | Neue Insulinderivate mit schnellem Wirkungseintritt | |
| DE69018920T2 (de) | Verwendung von dns-fragmenten, die ein signalpeptid kodieren zur sekretion von reifen proteinen in rekombinanten hefen, expressions-kassetten, transformierte hefen und verfahren zur herstellung dieser proteine. | |
| EP2229406B1 (de) | Neue insulinderivate mit extrem verzögertem zeit- / wirkungsprofil | |
| EP2229407B1 (de) | Neue insulinderivate mit extrem verzögertem zeit- / wirkungsprofil | |
| DE69015811T2 (de) | Insulinverbindungen. | |
| DE3486216T2 (de) | Hybrid-DNS-Synthesis von reifen insulinähnlichen Wachstumsfaktoren. | |
| DE68908491T2 (de) | Insulinvorläufer, deren Herstellung und DNA-Sequenzen, Expressionsvehikel und Primer und ein Prozess zur Herstellung von Humaninsulin und Analoge. | |
| DE69210011T2 (de) | Neue Insulinanaloge geeignet für die transdermale Anwendung | |
| DE3687500T2 (de) | Insulinabkoemmlinge und arzneimittel die diese enthalten. | |
| DE102008003566A1 (de) | Neue Insulinderivate mit extrem verzögertem Zeit-/ Wirkungsprofil | |
| DE69434909T2 (de) | Herstellung von humaninsulin | |
| EP1084248B1 (de) | Neue insulinanaloga mit erhöhter zinkbindung | |
| DE3536939A1 (de) | Biologisch aktive derivate des human-(gamma)-interferons, ihre herstellung und arzneimittel, die solche derivate enthalten | |
| DE68923496T2 (de) | Verfahren zur Herstellung von motilinähnlichen Polypeptiden und seine Expression. | |
| DE68927009T2 (de) | EXPRESSION UND PROZESSIERUNG VON ACETYLIERTEN FGFs IN HEFEN | |
| DE3884241T2 (de) | Analoge des Porcin-Wachstumshormones. | |
| RU2104305C1 (ru) | Аналоги инсулина человека, способ их получения, раствор для инъекций | |
| DE102008025007A1 (de) | Neue Insulinderivate mit extrem verzögertem Zeit-/ Wirkungsprofil | |
| DD290426A5 (de) | Human insulin analoge |
Legal Events
| Date | Code | Title | Description |
|---|---|---|---|
| 8364 | No opposition during term of opposition | ||
| V448 | Application of spc |
Free format text: PRODUCT NAME: INSULIN ASPART; REGISTRATION NO/DATE: EU/1/99/119/001 - EU/1/99/119/005; 19990907 Spc suppl protection certif: 100 75 008 Filing date: 20000306 |
|
| V457 | Spc granted |
Free format text: PRODUCT NAME: INSULIN ASPART; REGISTRATION NO/DATE: EU/1/99/119/001 - EU/1/99/119/005; 19990907 Spc suppl protection certif: 100 75 008 Filing date: 20000306 |
|
| R071 | Expiry of right |
Free format text: PRODUCT NAME: INSULIN ASPART; REGISTRATION NO/DATE: EU/1/99/119/001-005 19990907 Spc suppl protection certif: 10075008 Filing date: 20000306 Expiry date: 20060830 Extension date: 20110829 Effective date: 20120301 |