JP2806958B2 - アプロチニン相同体及び酵母におけるアプロチニン及びアプロチニン相同体の生成方法 - Google Patents

アプロチニン相同体及び酵母におけるアプロチニン及びアプロチニン相同体の生成方法

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Description

【発明の詳細な説明】 発明の分野 本発明は、酵母におけるアプロチニン及びその相同体
の生成方法、そのような生成物をコードする合成遺伝
子、発現ベクター及び形質転換された酵母細胞に関す
る。本発明はまた、新規のアプロチニン相同体にも関す
る。
発明の背景 アプロチニン（ウシ膵臓トリプシン阻害剤、BPTI）
は、いくつかのウシの器官及び組織、たとえばリンパ
節、膵臓、肺、耳下線、脾臓及び肝臓により分泌される
ポリペプチドである。それは、３個のジスルフィド架橋
により架橋される58個のアミノ酸残基から成る一本鎖ポ
リペプチドであり、下記配列を有する： それらの３個のジスルフィド架橋は、Cys（５）−Cys
（55）,Cys（14）−Cys（38）及びCys（30）−Cys（5
1）の間にそれぞれ位置する。
アプロチニンは、急性膵臓炎、ショック性症候群の種
々の状態、高フィブリン溶解性出血及び心筋梗塞の治療
のために使用される。高い投与量でのアプロチニンの投
与は、心臓手術に関係する血液の損失を有意に減じる。
アプロチニンは、種々のウシ器官又は組織、たとえば
肺、膵臓及び耳下線から抽出され得る。本明細書におい
ては、そのようにして得られたアプロチニンは、天然の
アプロチニンとして言及される。動物組織からの抽出
は、厄介な工程であり、そして多量のウシ器官又は組織
を必要とする。より便利な商業的生成方法は、発酵方法
であり、ここで、アプロチニンをコードする遺伝子が組
換えDNA技法により適切な微生物中に組込まれ、そして
その微生物が適切な栄養培地中で培養され、それが培地
中に成熟形で分泌する所望する生成物が生成される。
アプロチニンのための遺伝子は、E.コリのアルカリホ
スファターゼシグナルペプチドのためのコード配列に融
合され、そしてそのアルカリホスファターゼプロモータ
ーの制御下でE.コリ中に発現されて来た（Marks,C.B.な
ど.,The Journal of Biological Chemistry 261（198
6）7115〜7118）。また、Met−アプロチニンのタンパク
質配列をコードする合成遺伝子は、E.コリの発現ベクタ
ーにクローン化されて来た（Von Wilcken−Bernann,B.
など.,The EMBO Journal ５（1986）3219〜3225）。ア
プロチニン及びアプロチニン相同体の生成法はまた、ヨ
ーロッパ特許第238,993明細書及びイギリス特許出願第
2,188,933号に記載される。
しかしながら、E.コリにおける小さな外来性タンパク
質の生成に関する問題は、そのようなタンパク質が宿主
のプロテアーゼにより分解されやすい事実である。ま
た、正しいジスルフィド架橋及び正しい折りたたみの確
立がE.コリにおける問題であるかも知れない。
酵母がアプロチニンとほぼ同じ大きさの小さなタンパ
ク質を発現し、そして成熟せしめることができることは
示されている。EP−特許出願第0163529A号においては、
正しく配置されたジスルフィト架橋を有するインシュリ
ン前駆体の生成法が記載され、そしてEP−特許出願第01
89998A号においては、グルカゴン、すなわち29個のアミ
ノ酸残基の一本鎖ポリペプチドの生成法が記載される。
これらの方法によれば、酵母のリーダーペプチドに結
合される所望するタンパク質から成る一次生成物が、酵
母に発現される。分泌の間、この一次生成物は、Kex2酵
素によりプロセッシングされ（Julius,D.など、Cell 32
（1983）839〜852）、そして成熟又は成熟された生成物
としても言及されるそのプロセッシングされた生成物が
培地中に分泌される。発現された一次生成物のプロセッ
シングは、成熟生成物のＮ−末端での１対の塩基性アミ
ノ酸（Lys−Arg）で生じる。
Ｎ−末端アミノ酸として塩基性アミノ酸（Arg）を有
するアプロチニンの場合、“三重塩基性”切断部位が発
現された融合生成物に存在するので、Kex2プロセッシン
グ部位Lys−Argがアプロチニン配列の初めのArg残基の
前に挿入される場合、問題が生じるであろう。またアプ
ロチニン分子における一対の塩基性アミノ酸（Lys（4
1）−Arg（42））は、酵母細胞内のKex2酵素のための可
能性ある切断部位である。
発明の要約 酵母におけるアプロチニン又はその相同体の生成方法
を提供することが本発明の目的であり、これにより、多
量の正しく折りたたまれ且つ成熟せしめられたタンパク
質が培地に分泌される。
本発明は、正しく配置されたジスルフィド架橋を有す
るアプロチニン及びあるその相同体が、そのような生成
物をコードするDNA配列により形質転換された酵母株の
培養により高い収率で生成され得る驚くべき発見に基づ
かれている。
本発明の第一の観点によれば、適切な栄養培地中にお
いて、アプロチニン又はその相同体をコードする合成遺
伝子を含む複製できる発現ベクターを含む酵母株を培養
し、次にその培養培地からアプロチニン又はアプロチニ
ン相同体を回収することによる、酵母におけるアプロチ
ニン又はその相同体を高い収率で生成するための方法が
提供される。
本発明の第二の観点によれば、アプロチニン又はその
相同体をコードする合成遺伝子を含んで成るDNA配列が
提供される。
本発明の第三の観点によれば、アプロチニン又はアプ
ロチニン相同体をコードするDNA配列及び酵母中におい
てアプロチニン又はその相同体の発現を可能にするDNA
配列を含んで成る複製可能な発現ベクターが提供され
る。
本発明の第四の観点によれば、前記複製可能な発現ベ
クターにより形質転換された酵母株が提供される。
本発明により生成されるアプロチニンは、次の式
（Ｉ）:X−アプロチニン（３−40）−Yn−Zm−アプロチ
ニン（43−58）（Ｉ）〔式中、ＸはArg−Pro,Pro又は水
素を意味し、アプロチニン（３−40）は天然のアプロチ
ニンにおけるアミノ酸残基３〜40からのアミノ酸配列を
意味し、ＹはLys又は非塩基性アミノ酸残基、たとえばS
er,Thr又はAlaであり、ＺはArg又は非塩基性アミノ酸残
基、たとえばSer,Thr又はAlaであり、ｎ及びｍはそれぞ
れ０又は１であり、そしてアプロチニン（43−58）は天
然のアプロチニンにおけるアミノ酸残基43〜58からのア
ミノ酸配列を意味する〕により特徴づけられる。
本発明はまた、次の式（II）： Ｘ′−アプロチニン（３−40）−Ｙ′ｎ−Ｚ′ｍ−ア
プロチニン（43−58）（II）〔式中、Ｘ′はPro又は水
素を意味し、アプロチニン（３−40）は天然のアプロチ
ニンにおけるアミノ酸残基３〜40からのアミノ酸配列を
意味し、Ｙ′はLys又は非塩基性アミノ酸残基を意味
し、Ｚ′はArg又は非塩基性アミノ酸残基を意味し（但
し、少なくともＹ′又はＺ′は非塩基性アミノ酸残基で
ある）、ｎ及びｍはそれぞれ０又は１であり、そしてア
プロチニン（43−58）は天然のアプロチニンにおけるア
ミノ酸残基43〜58からのアミノ酸配列を意味する〕 を有する新規のアプロチニン相同体もまた言及する。
図面の簡単な説明 本発明は次の添付図面によりさらに例示されるであろ
う： 第１図は、アプロチニン（３−58）をコードする合成
遺伝子を示し； 第２図は、プラスミドpKFN374及びpKFN375の構成法を
例示し； 第３図は、プラスミドpMT636の構成法を例示し； 第４図は、アプロチニン（３−58,42Ser）をコードす
る合成遺伝子を示し； 第５図は、プラスミドpKFN414及びpKFN416の構成法を
例示し； 第６図は、アプロチニン（１−58）をコードする合成
遺伝子を示し；そして 第７図は、アプロチニン（１−58,42Ser）をコードす
る合成遺伝子を示す。
好ましい態様の詳細な記載 分泌目的のためには、所望するアプロチニン又はアプ
ロチニン相同体をコードするDNA配列が、シグナル及び
リーダーペプチド配列をコードするDNA配列に融合され
る。シグナル及びリーダーペプチドは、所望する生成物
のより単純な単離方法を確保する細胞から、発現された
タンパク質生成物の分泌の間、形質転換された微生物に
より切断される。酵母のための十分に適したリーダーペ
プチドシステムは、酵母MFα１のリーダー配列又はその
一部（Kurjan,J.and Herskowitz,I.,Cell 30（1982）93
3〜943）又はデンマーク特許出願第4638/87号に記載さ
れるリーダーである。しかしながら、酵母における分泌
を付加するシグナル−又はリーダー配列が使用され得、
そして本発明は特定の分泌システムに限定されない。
発現目的のためには、プロモーター配列は、所望する
タンパク質生成物のためのDNA配列の上流に配置され
る。好ましくは、酵母宿主生物に固有の遺伝子からのプ
ロモーター、たとえばTPI−（トリオースリン酸イソメ
ラーゼ）遺伝子のプロモーターが使用される。所望する
生成物のためのDNA配列は、転写ターミネーター配列、
好ましくは宿主酵母生物に固有の遺伝子からのターミネ
ーター配列、たとえばTPI−遺伝子又はMFα１遺伝子の
ターミネーターの前に存在するであろう。
適切なプロモーター、シグナル、リーダー及びターミ
ネーター配列に融合されるアプロチニン又はアプロチニ
ン相同体をコードするDNA配列は、酵母においてアプロ
チニン又はアプロチニン相同体の発現のために発現ベク
ター中に挿入される。
発現ベクターは、酵母において独立した複製を行なう
ことができ又は酵母染色体中に組込まれ得るプラスミド
である。このプラスミドは、好ましくは、宿主細胞の生
存性又は正常な増殖のために不可欠な遺伝子、たとえば
細胞***、細胞壁生合成、タンパク質合成、等をコード
する遺伝子の導入により、宿主微生物によるプラスミド
損失に対して安定化され得る。
本明細書に使用される場合、アプロチニン（１−58）
は、天然のアプロチニンのアミノ酸配列を有するアプロ
チニンを意味し、ところがアプロチニン（３−58）は、
初めの２個のＮ−末端アミノ酸残基を欠くアプロチニン
相同体を意味する。アプロチニン（１−58,42Ser）は、
位置42のArgがSerにより置換されているアプロチニン相
同体を意味し、そしてアプロチニン（３−58,42Ser）
は、初めの２個のＮ−末端アミノ酸残基を欠き、さらに
42位置でのArgがSerにより置換されているアプロチニン
相同体を意味する。
酵母の形質転換法及び本発明の実施に使用され得る形
質転換された酵母株の培養法は、当業界において既知の
方法、たとえば上記に言及されたEP特許出願第0163529A
号及び0189998A号に記載される方法である。
アプロチニン遺伝子のＮ−末端で“三重塩基性”切断
部位により引き起こされる分泌の間、可能性ある複雑さ
を最少にするためには、初めの２個のＮ末端アミノ酸残
基（Arg−Pro）を欠くアプロチニン相同体が生成され
た。
また、Lys（41）−Arg（42）でのアプロチニンの可能
性あるKex2切断を回避し又は最少にするためには、アミ
ノ酸残基Lys（41）及びArg（42）の１つ又は両者が非塩
基性アミノ酸残基により置換されているアプロチニン相
同体が調製され得る。このタイプの好ましいアプロチニ
ン相同体は、Argの代わりに位置42でSerを有する相同体
である。
驚くべき事には、天然のアプロチニンはＮ−末端塩基
性アミノ酸残基を含み、そして二塩基性配列を含む事実
にもかかわらず、酵母はアプロチニン遺伝子の変性を伴
わないで天然のアプロチニンと同一の生成物を発現し、
そして分泌することができることがさらに示された。
本発明の新規アプロチニン相同体は、天然のアプロチ
ニンと同じ、ウシトリプシンに対する特異的阻害効果を
有し、そして従って、天然のアプロチニンのための置換
体として使用され得る。
本発明の化合物の特異的阻害効果は、Erlanger,B.F.,
Kokonski,N.,及びCohen,W.,Arch.Biochem.Biophys.95，
（1961）271により記載されるような分光光度分析によ
りベンゾイル−アルギニン−ｐ−ニトロアニリド（BAPN
A）のトリプシン加水分解の阻止に従って測定された。
本発明のアプロチニン相同体をコードするDNA配列
は、好ましくは、既知の技法を用いてオリゴヌクレオチ
ド合成により製造される。なぜならば、これは酵母発現
のために好ましいことが知られているコドンの選択を可
能にするからである。
次の合成遺伝子が構成された： アプロチニン（３−58）をコードする、 アプロチニン（３−58,42Ser）をコードする、 アプロチニン（１−58）をコードする、 アプロチニン（１−58,42Ser）をコードする、 詳細な記載 例 １ アプロチニン（３−58）生成 アプロチニン（３−58）のための合成遺伝子を、連結
により多くのオリゴヌクレオチドから構成した。
オリゴヌクレオチドを、調節された多孔性ガラス支持
体に基づくホスホラミジット化学を用いて自動DNA合成
機により合成した（Beaucage,S.L.,and Caruthers,M.
H.,Tetranhedron Letters 22（1981）1859〜1869）。
次の10種のオリゴヌクレオチドを合成した： 第１図に示されるように、５個の二層体Ａ−Ｅを、上
記10種のオリゴヌクレオチドから形成した。
それぞれ20ピコモルの二層体Ａ−Ｅを、90℃で５分間
加熱し、次に室温に75分間にわたって冷却することによ
って５′−リン酸化オリゴヌクレオチドＩ−Ｘの対応す
る対から形成した。それらの５種の二層体を混合し、そ
してT4リガーゼにより処理した。２％アガロースゲル上
での連結混合物の電気泳動の後、合成遺伝子を176bpバ
ンドとして単離した。その得られた合成遺伝子は、第１
図に示される。
その合成遺伝子を、シグナル及びリーダー配列（１−
85）をコードするプラスミドpKFN9からの330bpのEcoR I
−Hga Iフラグメント及びpUC19からのEcoR I−Xba I大
フラグメントに連結した。MFα１リーダー配列のすぐ後
のHga I部位を含むpKFN9の構成法は、EP−特許出願第02
14826号に記載される。
その連結混合物を用いて、アンピシリン耐性のために
選択するコンピテントE.コリ株（r-,m+）を形質転換し
た。32P−Xba I−EcoR Iフラグメント（Maxam,A.and Gi
lbert,W.,Methods Enzymol.65（1980）499〜560）の配
列決定は、その得られたコロニーからのプラスミドがア
プロチニン（３−58）のための正しいDNA配列を含むこ
とを示した。
１つのプラスミドpKNF305を、さらに使用するために
選択した。プラスミドpKFN305の構成法は、第２図に示
される。
pKFN305をEcoR I及びXba Iにより切断し、そしてその
0.5kbのフラグメントを、pMT636からの9.5kbのNco I−X
ba Iフラグメント及びpMT636からの1.4kbのNco I−EcoR
Iフラグメントに連結し、プラスミドpKFN374を得た
（第２図を参照のこと）。プラスミドpMT636を、LEU−
２遺伝子の欠失の後、pMT608から及びpMT479から構成し
た（第３図を参照のこと）。pMT608は、EP−特許出願第
195691号に記載される。pMT479は、EP−特許出願第1635
29号に記載される。pMT479は、スキゾ ポンベ（Schiz
o.pombe）のTPI遺伝子（POT）、S.セレビシアエ（S.cer
evisiae）のトリセフォスフェートイソメラーゼプロモ
ーター及びターミネーター、TPIP及びTPITを含む（Albe
r,T.and Kanasaki,G,J.Mol.Appl.Gen.１（1982）419〜4
34）。プラスミドpKFN374は、次の配列を含む： TPIP−MFα１−シグナル−リーダー（１−85）−アプ
ロチニン（３−58）−TPIT。
MFα１がS.セレビシアエの接合因子α１コード配列で
ある場合（Kurjan,J.and Herskowitz,I.,Cell 30，（19
82）933〜943）、シグナル−リーダー（１−85）は、そ
の配列がMFα１シグナル−リーダー配列の初めの85個の
アミノ酸残基を含み、そしてアプロチニン（３−58）が
初めの２個のアミノ酸残基を欠くアプロチニン誘導体を
コードする合成配列であることを意味する。
S.セレビシアエ株MT663（EZ−7B XE11−36a/α，Δtp
iΔtpi,pep4−3/pep4−３）を、600nmでのO.D.が0.6に
なるまで、YPGaL（１％Bacto酵母抽出物、２％Bactoペ
プトン、２％ガラクトース、１％ラクテート）上で増殖
せめした。
培養物100mlを、遠心分離により収穫し、水10mlによ
り洗浄し、再遠心分離し、そして1.2Mのソルビトール、
25mMのNa2EDTA（pH＝8.0）及び6.7mg/mlのジチオトレイ
トールを含む溶液10ml中に再懸濁した。その懸濁液を、
30℃で15分間インキュベートし、遠心分離し、そして細
胞を、1.2Mのソルビトール、10mMのNa2EDTA、0.1Mのク
エン酸ナトリウム、pH＝5.8及び2mgのNovozym 234を含
む溶液10ml中に再懸濁した。その懸濁液を、30℃で30分
間インキュベートし、細胞を遠心分離により集め、1.2M
のソルビトール10ml及びCAS（1.2Mのソルビトール、10m
MのCaCl2,10mMのトリスHCl（トリス＝トリス（ヒドロキ
シメチル）アミノメタン）pH7.5）により洗浄し、そし
てCAS2ml中に再懸濁した。形質転換のためには、CAS再
懸濁細胞0.1mlを、約１μｇのプラスミドpKFN374と共に
混合し、そして室温で15分間放置した。（20％のポリエ
チレングリコール4000,10mMのCaCl2,10mMのトリスHCl,p
H＝7.5）1mlを添加し、そしてその混合物をさらに30分
間、室温で放置した。その混合物を遠心分離し、そして
ペレットをSOS（1.2Mのソルビトール、33％（v/v）のYP
D、6.7mMのCaCl2、14μg/mlのロイシン）0.1ml中に再懸
濁し、そして30℃で２時間インキュベートした。次に、
その懸濁液を遠心分離し、そしてそのペレットを1.2Mの
ソルビトール0.5ml中に再懸濁した。次に、52℃での上
層寒天（1.2Mのソルビトール＋2.5％の寒天を含む、She
rmanなど.,（Method in Yeast Genetics,Cold Spring H
arbor Laboratory,1981）のSC培地）6mlを添加し、そし
て前記懸濁液を、同じ寒天により固体化された、ソルビ
トール含有培地を含むプレートの上部に注いだ。形質転
換体コロニーを30℃で３日後、収集し、再分離し、そし
て液体培養を開始するために使用した。１つのそのよう
な形質転換体KFN322を、さらに特徴化するために選択し
た。
酵母株KFN322を、YPD培地（１％酵母抽出物、２％ペ
プトン（Difco Laboratoriesから）及び２％グルコー
ス）上で増殖せしめた。その株の培養物10mlを、600nm
でのO.D.が32になるまで30℃で振盪した。遠心分離の
後、その上清液をFPLCイオン交換クロマトグラフィーに
より分析した。その酵母上清液を、0.22μｍのMillex
GVフィルター単位を通して濾過し、そして1mlを、20mM
のBicine（pH8.7）により平衡化されたMonoSカチオン交
換カラム（0.5×5cm）上に適用した。平衡緩衝液による
洗浄の後、カラムを、平衡緩衝液中における線状NaClグ
ラジェント（０−1M）により溶離した。トリプシンイン
ヒビター活性を、分光光度アッセイにより溶離画分で定
量化し、そして280nmでの吸光度の統合により から定量化した。
収率は、約3mg/のアプロチニン（３−58）であっ
た。
アミノ酸分析及びＮ−末端配列決定のために、酵母上
清液（7ml）を、0.1MのNaOHによりpHを8.7に調節し、そ
して濾過した（0.22μｍ）。20mMのBicine（pH8.7）に
より平衡化されたＱ−Sepharoseアニオン交換カラム
（１×4cm）からの溶出液を、MonoSカチオン交換カラム
（0.5×5cm）に適用した。グラジェント溶離されたアプ
ロチニン（３−58）の濃縮を、MonoSでの再クロマトグ
ラフィー処理及び急勾配のNaCl−グラジェントによる溶
離により行なった。集められた画分を、真空遠心分離に
より約100μにさらに濃縮し、そしてRP−HPLCカラム
（Vydac C4,4.6×250mm）に適用した。溶離を、0.1％TF
A中、CH3CNグラジェントにより行なった。集められた画
分を、真空遠心分離により約100μに濃縮し、そして
サンプルを、Ｎ−末端配列決定及びアミノ酸分析のため
に取った。
Ｎ−末端配列決定により、次の配列が見出され： そしてＮ−末端が正しいことが確認された。
アミノ酸分析は、次の第１表に示される。この表か
ら、生成物は、予測されるアミノ酸組成、すなわち少な
いArg及びProを有するように思われる。Ileのわずかに
低い含有量は、Ile（18）−Ile（19）の不完全な加水分
解にたぶん帰する（これは当業界において良く知られて
いる）。また、Pro及びArgは予測されるよりもわずかに
高い。しかしながら、これはまた、アプロチニン自体に
よりも見られる（第１表、第２カラム）。
Erlangerなどの上記方法により比較する場合、アプロ
チニン（３−58）の比活性は、天然のアプロチニンの比
活性と実験誤差内で同一であることが見出された。
例 ２ アプロチニン（３−58,42Ser）の生成 アプロチニン（３−58,42Ser）のための合成遺伝子
を、例１に記載されるようにして構成した。SerとArg
（42）とを置換するために、次のオリゴヌクレオチドVI
I a及びVIII aを、VII及びVIIIの代わりに使用した： 得られた合成遺伝子は、第４表に示される。MFα１シ
グナル−リーダー（１−85）配列に融合されたこの遺伝
子を、pUC19誘導のプラスミドpKFN−306中にクローン化
した（第２図を参照のこと）。
例１の方法に従がうことによって、次の構成体を含む
プラスミドpKFN375を得た： TPIP−MFα１−シグナル−リーダー（１−85）−アプ
ロチニン（３−58,42Ser）−TPIT。
ここでアプロチニン（３−58,42Ser）は、初めの２個
のアミノ酸残基を欠き、そして位置42でArgの代わりにS
erを含むアプロチニン誘導体をコードする合成遺伝子で
ある。
酵母株MT663を、上記のようにしてプラスミドpKFN375
により形質転換し、そしてその形質転換された株KFN324
の培養は、約12mg/のアプロチニン（３−58,42Ser）
を付与した。
上記のようにして行なわれたＮ−末端配列決定は、次
のＮ−末端配列を確認した： これは正しい配列であった。
このアミノ酸分析は、第１表に示され、そして予測さ
れるアミノ酸組成、すなわち少ないPro及びArg及び多い
Serを確認する（また、例１における言及も参照のこ
と）。
Erlangerなどの上記方法と比較する場合、アプロチニ
ン（３−58,42Ser）の比活性は、天然のアプロチニンの
比活性と実験誤差内で同一であることが見出された。
例 ３ アプロチニン（１−58）の生成 第５図に示される合成二層体を、MFα１シグナル及び
リーダー配列をコードするプラスミドpKFN9からの330bp
のEcoR I−Hga Iフラグメント及びpKFN305からの144bp
のAra II−Xba Iフラグメント及びpUC19からの大きなEc
oR I−Xba Iフラグメントに連結した。
この連結混合物を用いて、アンピシリン耐性のために
選択するコンピテントE.コリ株を形質転換した。32Pに
よりラベルされたXba I−EcoR Iフラグメントの配列決
定は、得られたコロニーからのプラスミドがアプロチニ
ン（１−58）のための正しいDNA配列を含むことを示し
た。
１つのプラスミドpKFN414を、さらに使用するために
選択した。プラスミドpKFN414の構成法は、第５図に示
されている。
例１の方法に従うことによって、次の構成体を含む酵
母プラスミドpKFN418を得た： TPIP−MFα１−シグナル−リーダー（１−85）−アプ
ロチニン（１−58）−TPIT。
酵母株MT633を、上記のようにしてプラスミドpKFN418
により形質転換した。その形質転換されたKFN385株の培
養は、約１〜13mg/のアプロチニン（１−58）を付与
した。
Erlangerなどの上記方法により比較する場合、この例
に従って生成されるアプロチニン（１−58）の比活性
は、天然のアプロチニンの比活性と実験誤差内で同一で
あることが見出された。
例 ４ アプロチニン（１−58,42Ser）の生成 アプロチニン（１−58,42Ser）のための遺伝子を含む
プラスミドpKFN416を、例３に記載のようにしてpKFN306
から構成した。例１の方法に従うことによって、次の構
成体を含む酵母プラスミドpKFN420を得た： TPIP−MFα１−シグナル−リーダー（１−85）−アプ
ロチニン（１−58,42Ser）−TPIT。
酵母株MT663を、上記のようにしてプラスミドpKFN420
により形質転換した。この形質転換された株KFN387の培
養は、約１〜13mg/のアプロチニン（１−58,42Ser）
を付与した。
Erlangerなどの上記方法により比較される場合、アプ
ロチニン（１−58,42Ser）の比活性は、天然のアプロチ
ニンの比活性と実験誤差内で同一であることが見出され
た。
───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (51)Int.Cl.6 識別記号 ＦＩ (Ｃ１２Ｎ 1/19 Ｃ１２Ｒ 1:865） (Ｃ１２Ｐ 21/02 Ｃ１２Ｒ 1:865） (56)参考文献 特開 昭61−1389（ＪＰ，Ａ) ＥＭＢＯ Ｊ．５（12） （1986） Ｐ．3219−3225 (58)調査した分野(Int.Cl.6，ＤＢ名) C12N 15/15 C12N 15/81 C12P 21/02 C12N 1/19 C07K 14/81 C12N 9/99 ＷＰＩ（ＤＩＡＬＯＧ) ＢＩＯＳＩＳ（ＤＩＡＬＯＧ)

Claims (11)

    (57)【特許請求の範囲】
  1. 【請求項１】酵母においてアプロチニン又はその相同体
    を製造する方法であって、アプロチニン又はその相同体
    をコードする遺伝子及び好適な栄養培地中でそのアプロ
    チニン又はその相同体の発現を許容するDNA配列を含む
    複製可能な発現ベクターを含む酵母株を培養し、そして
    その発現されたアプロチニン又はその相同体を回収する
    ことを含み、そのアプロチニン又はその相同体が、成熟
    かつ活性形で分泌され、かつ、以下の式： Ｘ−アプロチニン（３−40）−Yn−Zm−アプロチニン
    （43−58）｛式中、Ｘは、Arg−Pro,Pro又は水素であ
    り、アプロチニン（３−40）は、生来のアプロチニン内
    のアミノ酸残基３〜40番のアミノ酸配列であり、Ｙは、
    Lys又は非塩基性アミノ酸残基であり、Ｚは、Arg又は非
    塩基性アミノ酸残基であり、ｎとｍは、各々０又は１で
    ありそしてアプロチニン（43−58）は、生来のアプロチ
    ニン内のアミノ酸残基43〜58番のアミノ酸配列であ
    る。｝をもつことを特徴とする方法。
  2. 【請求項２】前記遺伝子が、以下の配列： に記載される、生来のアプロチニンのアミノ酸３−58番
    をコードする、請求項１に記載の方法。
  3. 【請求項３】前記遺伝子が、以下の配列： に記載される、生来のアプロチニンのアミノ酸３−58番
    をコードするが、その生来のアプロチニンの42位におけ
    るArgが、Serで置換されている、請求項１に記載の方
    法。
  4. 【請求項４】前記遺伝子が、以下の配列： に記載される、生来のアプロチニンをコードする、請求
    項１に記載の方法。
  5. 【請求項５】前記遺伝子が、以下の配列： に記載される、生来のアプロチニンの42位におけるArg
    がSerで置換されているアプロチニン相同体をコードす
    る、請求項１に記載の方法。
  6. 【請求項６】酵母内で複製でき、そしてアプロチニン又
    はその相同体をコードする遺伝子及びそのアプロチニン
    又はその相同体の発現を許容するDNA配列を含むベクタ
    ーであって、そのアプロチニン又はその相同体が、酵母
    から成熟かつ活性形で分泌され、かつ、以下の式： Ｘ−アプロチニン（３−40）−Yn−Zm−アプロチニン
    （43−58）｛式中、Ｘは、Arg−Pro,Pro又は水素であ
    り、アプロチニン（３−40）は、生来のアプロチニン内
    のアミノ酸残基３〜40番のアミノ酸配列であり、Ｙは、
    Lys又は非塩基性アミノ酸残基であり、Ｚは、Arg又は非
    塩基性アミノ酸残基であり、ｎとｍは、各々０又は１で
    ありそしてアプロチニン（43−58）は、生来のアプロチ
    ニン内のアミノ酸残基43〜58番のアミノ酸配列であ
    る。｝をもつことを特徴とするベクター。
  7. 【請求項７】前記遺伝子が、以下の配列： に記載される、生来のアプロチニンのアミノ酸３−58番
    をコードする、請求項６に記載のベクター。
  8. 【請求項８】前記遺伝子が、以下の配列： に記載される、生来のアプロチニンのアミノ酸３−58番
    をコードするが、その生来のアプロチニンの42位におけ
    るArgが、Serで置換されている、請求項６に記載のベク
    ター。
  9. 【請求項９】前記遺伝子が、以下の配列： に記載される、生来のアプロチニンをコードする、請求
    項６に記載のベクター。
  10. 【請求項１０】前記遺伝子が、以下の配列： に記載される、生来のアプロチニンの42位におけるArg
    がSerで置換されているアプロチニン相同体をコードす
    る、請求項６に記載のベクター。
  11. 【請求項１１】酵母内で複製可能であり、かつ、アプロ
    チニン又はその相同体をコードする遺伝子及びそのアプ
    ロチニン又はその相同体の発現を許容するDNA配列を含
    むベクターにより形質転換された酵母株であって、その
    アプロチニン又はその相同体が、成熟かつ活性形で分泌
    され、かつ、以下の式： Ｘ−アプロチニン（３−40）−Yn−Zm−アプロチニン
    （43−58）｛式中、Ｘは、Arg−Pro,Pro又は水素であ
    り、アプロチニン（３−40）は、生来のアプロチニン内
    のアミノ酸残基３〜40番のアミノ酸配列であり、Ｙは、
    Lys又は非塩基性アミノ酸残基であり、Ｚは、Arg又は非
    塩基性アミノ酸残基であり、ｎとｍは、各々０又は１で
    ありそしてアプロチニン（43−58）は、生来のアプロチ
    ニン内のアミノ酸残基43〜58番のアミノ酸配列であ
    る。｝をもつことを特徴とする酵母株。
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