DE3789359T2

DE3789359T2 - Modifizierung von Baumwollpflanzen und Zellinien durch Gentechnologie.

Info

Publication number: DE3789359T2
Application number: DE3789359T
Authority: DE
Inventors: Paul F Umbeck
Original assignee: Agracetus Inc
Current assignee: Monsanto Technology LLC
Priority date: 1986-12-03
Filing date: 1987-12-02
Publication date: 1994-10-06
Anticipated expiration: 2007-12-03
Also published as: US5004863A; CN87107233A; EP0270355A2; US5004863B1; US5004863B2; EP0270355B1; IN168950B; US5159135B1; EP0270355A3; BR8706530A; DE3789359D1; ATE102999T1; ES2052582T3; US5159135A

Description

Die vorliegende Erfindung betrifft im allgemeinen die Gentechnologie von Pflanzen und bezieht sich insbesondere auf eine Strategie zur Transformation und Regeneration von Baumwollpflanzen (Gossypium hirsutum L.) unter Anwendung der Agrobakterium-Methode zur gentechnischen Transformation von Pflanzen, um neue, genetisch transformierte Baumwollpflanzen und -pflanzenlinien zu schaffen.
Es ist ein allgemeines Ziel von vielen Forschern, die auf dem Gebiet der Pflanzen-Biotechnologie arbeiten, erfolgreich Pflanzen genetisch zu verändern, die zu den wichtigen Feldfruchtvarietäten gehören. Obgleich die Anwendung der Gentechnologie auf Pflanzen für verschiedene Modellpflanzenspezies erfolgreich demonstriert worden ist, zählen die Modellpflanzenspezies wie Tabak, Karotten und Petunien nicht zu den wirtschaftlich wichtigsten Pflanzenspezies für landwirtschaftliche Zwecke. Demgemäß haben sich viele Forschungsanstrengungen auf die gentechnische Veränderung der landwirtschaftlich wichtigeren Pflanzenspezies gerichtet. Der hier verwendete Begriff "Gentechnologie" dient der Beschreibung der Einführung von fremden, häufig chimären Genen in eine oder mehrere Pflanzenzellen, die zu vollständigen, sexuell kompetenten, lebensfähigen Pflanzen regeneriert werden können, welche selbst-bestäubt oder durch andere Pflanzen derselben Spezies "über Kreuz" bestäubt werden können, damit das in der Keimbahn befindliche Fremdgen in landwirtschaftlich geeignete Pflanzenvarietäten eingeführt oder eingekreuzt werden kann.
Das Gebiet der pflanzlichen Gewebekultur ist über viele Jahre Gegenstand intensiver Forschung gewesen, aber in den letzten 5 bis 10 Jahren sind intensivierte Forschungsanstrengungen auf die Entwicklung regenerierbarer pflanzlicher Gewebekulturverfahren für die bedeutenden landwirtschaftlichen Feldfrüchte wie Mais, Weizen, Reis, Sojabohnen und Baumwolle gerichtet worden.
Frühzeitige Veröffentlichungen über die Gewebekultur von Baumwolle beschäftigten sich hauptsächlich mit der Etablierung der wachsenden Gewebe der Pflanze unter aseptischen Bedingungen in vitro. D.G. Davis et al., In Vitro, 9 : 395-398 (1974); A. Rani und S.S. Bhojwani, Plant Sci. Lett., 7 : 163-169 (1976); und H.J. Price et al., Plant Sci. Lett., 10 : 115-119 (1977). Die in diesen Veröffentlichungen detailliert beschriebenen Methoden lieferten jedoch nicht den notwendigen Rahmen zur Regeneration von Zellen zu vollständigen Pflanzen.
In den späten 70er Jahren wurde über die Entwicklung von somatischen Embryos berichtet, d. h. Embryos, die von nicht-gametischen oder somatischen Geweben der wilden Baumwollspezies G. klotzchianum abgeleitet wurden. H.J. Price und R.H. Smith, Planta, 145 : 305-307 (1979). Unglücklicherweise bestanden jedoch zwei Hauptprobleme, die mit diesem veröffentlichten Verfahren nicht gelöst werden konnten. Zum einen konnten die Forscher selbst nach mehrjähriger weiterer Forschung nicht die Keimung der somatischen Embryos induzieren, d. h. umwandeln, um vollständige Pflanzen zu erhalten (J.J. Finer und R.H. Smith, Plant Cell Rep., 3 : 41-43 (1984). Zum anderen konnte dieselbe Technik bei Verwendung von kultivierter Baumwolle als pflanzliche Gewebequelle nicht erfolgreich wiederholt werden.
Davidonis und Hamilton waren die ersten, die über eine erfolgreiche Regeneration vollständiger Pflanzen aus somatischen Embryos der Baumwolle berichteten. G.H. Davidonis und R.H. Hamilton, Plant Sci. Lett., 32 : 89-93 (1984). Diese Forscher verwendeten unreifes Cotyledongewebe der Kultursorte Coker 310. Das verwendete Grundmedium bestand aus Linsmaier und Skoog (LS)- Salzen, Vitaminen, und den Phytohormonen NAA und Kinetin. E.M. Linsmaier und F. Skoog, Physiol. Plant., 18 : 100-127 (1965). Die bei dieser Veröffentlichung verwendeten Gewebe sind mehrere Jahre kultiviert worden, ohne daß über ähnliche Ergebnisse berichtet wurde, und die zur Wiederholung dieses Verfahrens notwendigen exakten Vorgehensweisen sind immer noch nicht weitläufig bekannt.
Im Verlauf desselben Jahres wurde über die Regeneration von Pflanzen mehrerer unterschiedlicher Kalifornien-Baumwoll-Kultursorten berichtet unter Darlegung einer in ausreichender Weise entwickelten Vorgehensweise, um von den Autoren in vernünftigen Zeiträumen wiederholt werden zu können. T.S. Rangan et al., In Vitro, 20 : 256 (1984). Nach ihrem Verfahren wurden verschiedene Gewebe wie Cotyledone, unreife Embryos und Hypocotylgewebe auf Murashige und Skoog (MS)-Medium (T. Murashige und F. Skoog, Phvsiol. Plant., 15 : 473-497 (1962)) einschließlich der Phytohormone NAA und Kinetin kultiviert. Nach einer Kulturdauer von drei bis vier Monaten entstanden aus diesen Geweben embryogene Kalli und somatische Embryos. Die Embryos wurden nachfolgend auf ein Medium mit niedrigem Salzgehalt, z. B. Beasley und Ting's (BT)- Medium (C.A. Beasley und I.P. Ting, Amer. J. Bot., 60 : 130-139 (1973)) unter Zusatz von Caseinhydrolysat überführt, wodurch einige der Embryos keimten und zu vollständigen Pflanzen auswuchsen. Unter Verwendung der Kultursorte Acala SJ-5 wurden etwa 200 Pflanzen geschaffen. Es wurde eine gewisse Sterilität der Pflanzen beobachtet und lediglich 2% der Pflanzen zeigten eine somaklonale Variation.
Die somatische Embryogenese wurde untersucht unter Verwendung der Coker-Linie 312 und einem mit T25 bezeichneten "Texas race stock". D.C. Robacker und T.W. Zimmermann, In the Ann. Mtg. of the American Society of Agronomy, 25.-30. November, Las Vegas, NV, S. 85 (1984). Das Grundmedium bestand aus MS-Salzen, den Vitaminen Inositol und Thiamin, Sucrose, und den Phytohormonen NAA, 2,4-Dichlorphenoxyessigsäure (2,4-D) und Kinetin. Als ursprüngliche Gewebequelle wurden die Hypocotyle verwendet. Obgleich Embryos gewonnen und auf BT-Medium kultiviert wurden, wurden keine Pflanzen erhalten.
Andere Forscher haben auch über somatische Embryogenese und Pflanzenregeneration berichtet. (N.L. Trolinder und J.R. Goodin, In the Proc. of the Beltwide Cotton Production Research Conferences, 6.-11. Januar 1985, New Orleans, LA, S. 46; und D.H.
Mitten, In the Proc. of the Beltwide Cotton Production Research Conferences, 6.-11. Januar 1985, New Orleans, LA, S. 57-58). Diese Vorgehensweisen wurden nicht detailliert veröffentlicht, aber auf der Grundlage der Darstellungen wurden ausreichend Daten gesammelt, so daß bestimmte Themen zum Vorschein kamen. Ein Forscher erreichte eine somatische Embryogenese unter Verwendung der Kultursorte Coker 310, unreifer Embryos und Hypocotylgewebe auf MS-Medium unter Zusatz der Phytohormone NAA und 2iP (oder Kinetin). Während es klare Anzeichen für die somatische Embryogenese gab, war die Gewinnung vollständiger Pflanzen von diesen Kulturen weniger deutlich. Andere Forscher stellten ein klares und kurzes Protokoll bereit. Sowohl die Wiederholbarkeit als auch die Gewinnung intakter Pflanzen wurde gezeigt. Obgleich sie in der Lage waren, somatische Embryos aus mehreren verschiedenen Linien zu erhalten, gehörten die besten Kultursorten zu den reinrassigen Coker-Linien 5110 und 312 und dem "Texas race stock" T25. Andere Kultursorten waren nicht in der Lage, den Regenerationsprozeß vollständig zu durchlaufen, d. h. sich zu vollständigen Pflanzen umzuformen, oder sie waren nicht in der Lage, reife somatische Embryos zu bilden. Grundsätzlich wurden nach ihrem Protokoll MS-Medium, B5-Vitamine und die Phytohormone 2,4-D und Kinetin verwendet.
Diese Forscher haben sich konzentriert auf die Pflanzenregeneration somatischer, nicht-transformierter Baumwollgewebe, aber Strategien zur gentechnischen Veränderung von Pflanzenlinien beinhalten typischerweise im allgemeinen zwei komplementäre Verfahren. Das erste Verfahren beinhaltet die genetische Transformation von einer oder mehreren Pflanzenzellen eines in spezifischer Weise charakterisierten Typs. Mit Transformation ist gemeint, daß ein fremdes Gen, typischerweise ein chimäres Genkonstrukt, in das Genom der individuellen Pflanzenzellen eingeführt wird, was typischerweise mit Hilfe eines Vektors erfolgt, der die Fähigkeit aufweist, das interessierende Gen in das Genom der kultivierten Pflanzenzellen zu übertragen. Das zweite Verfahren beinhaltet dann die Regeneration der transformierten Pflanzenzellen zu vollständigen, sexuell kompetenten Pflanzen. Weder das Transformation- noch das Regenerationsverfahren muß 100%ig erfolgreich sein, sie müssen aber ein vernünftiges Maß an Verläßlichkeit und Wiederholbarkeit aufweisen, so daß ein vernünftiger prozentualer Anteil der Zellen transformiert und zu vollständigen Pflanzen regeneriert werden kann.
Die beiden Verfahren der Transformation und Regeneration müssen komplementär zueinander sein. Es ist möglich, bestimmte Gewebe- oder Zelltypen zu transformieren, die nicht regeneriert werden können, und es ist ebenfalls möglich, pflanzliche Gewebe einer Reihe von verschiedenen Gewebe- und Zelltypen zu regenerieren, die noch nicht erfolgreich transformiert worden sind, wie von den oben genannten Forschern gezeigt wurde. Die Komplementarität der beiden Verfahren muß derart sein, daß die Gewebe, die erfolgreich durch das Transformationsverfahren genetisch transformiert werden, einen Typ und Charakter aufweisen müssen und ausreichend gesund, kompetent und vital sind, damit sie erfolgreich zu vollständigen Pflanzen regeneriert werden können.
Erfolgreiche Techniken zur Transformation und Regeneration sind im Stande der Technik für andere Pflanzenspezies gezeigt worden. Beispielsweise wurde von Barton et al., "Regeneration of Intact Tobacco Plants Containing Full-Length Copies of Genetically Engineered T-DNA, and Transmission of DNA to R 1 Progeny", Cell, 32 : 1033 (April 1983), über die Transformation und Regeneration von Tabakpflanzen berichtet. Ähnliche Ergebnisse sind mit einigen anderen Pflanzenspezies, jedoch nicht mit Baumwolle erzielt worden.
Die zur Transformation von Zellen dicotyler Pflanzenspezies am häufigsten eingesetzte Methodik beinhaltet die Verwendung des Pflanzenpathogens Agrobacterium tumefaciens. A. tumefaciens beherbergt ein Plasmid, bezeichnet als Tumor-induzierendes oder Ti-Plasmid, welches über die natürliche Fähigkeit verfügt, ein als T-DNA (Transfer-DNA) bezeichnetes eigenes Segment in das Genom infizierter Pflanzenzellen zu übertragen. Der Wildtyp A. tumefaciens nutzt diese Fähigkeit zur genetischen Transformation von infizierten Zellen, damit die Pflanzenzellen einen Tumor entwickeln und ferner eine einer Reihe von als Opine bekannte Verbindungen synthetisieren, die vom infizierenden A. tumefaciens metabolisiert werden kann. Verschiedene Forscher haben gefunden, daß das Agrobacterium nach Entfernung des größten Teils der T-DNA eines von A. tumefaciens beherbergten Ti-Plasmids, und durch Austausch dieser T-DNA durch eine Fremdgen-Konstruktion infizierte Pflanzenzellen mit dem Fremdgen derart transformieren kann, daß die resultierenden Zellen nicht tumorartig sind, wie es solche Pflanzenzellen, die mit dem Wildtyp A. tumefaciens infiziert werden, normalerweise sind. Die Fremdgen- Konstruktion ist dann in den Zellen einer aus den transformierten Zellen regenerierten vollständigen Pflanze eingeschlossen und wird nach dem Mendelschen Verfahren auf einfache Weise vererbt. Die Konstruktion kann folglich wie jede vererbbare Eigenschaft für die Züchtung von Feldfrüchten behandelt werden.
Es ist ferner angeregt worden (Gebhart, Genetic Engineering News, April 1985), daß eine Anzahl von Feldfruchtspezies einschließlich Baumwollpflanzen, die Gene für Herbizidresistenz enthalten, unter Anwendung gentechnischer Verfahren herstellbar sein können.
Die Transformation von Baumwollembryos durch Injizieren der nackten DNA in das Ei des Embryos und das Regenerieren der transformierten Embryos ist ebenfalls offenbart worden (Zhou et al., Methods in Enzymology, 1983, Bd. 101, S. 433-481).
Ein Ziel der vorliegenden Erfindung ist demgemäß die gentechnische Bereitstellung vollständiger, intakter Baumwollpflanzen und -linien.
Ein weiteres Ziel der vorliegenden Erfindung betrifft die gentechnische Herstellung vollständiger Baumwollpflanzen unter Anwendung von Transformations-/Regenerationstechniken.
Ein weiteres Ziel der vorliegenden Erfindung liegt in der gentechnischen Herstellung vollständiger Baumwollpflanzen unter Anwendung der Agrobacterium-Methode zur Gentransformation, gefolgt von einer wiederholbaren Regenerationstechnik.
Diese und weitere Ziele werden durch die vorliegende und nachfolgend dargelegte Erfindung erfüllt.
Durch die vorliegende Erfindung wird ein Verfahren bereitgestellt zur Einführung von Genen in Baumwollpflanzen und -pflanzenlinien, das dadurch gekennzeichnet wird, daß es das Exponieren von Hypocotylgewebe unreifer Baumwollpflanzen mit einer transformationskompetenten, nicht-onkogenen Agrobacterium tumefaciens-Kultur umfaßt, deren Zellen ein Ti-Plasmid beherbergen, welches eine T-DNA-Region aufweist, die sowohl ein fremdes chimäres Gen als auch ein Resistenzgen zur Selektion einschließt.
Durch die Erfindung werden ferner Baumwollpflanzen und somatische Embryos, die in ihrem Genom ein chimäres Gen umfassen und durch ein derartiges Verfahren erhältlich sind, und Baumwollsamen bereitgestellt, die in ihrem Genom ein chimäres Gen umfassen und von derartigen Pflanzen gebildet werden.
Mit der Erfindung werden ferner Baumwollsamen, die in der Lage sind, zu Baumwollpflanzen auszukeimen und in ihrem Genom eine chimäre Genkonstruktion einschließlich eines Fremdgens und Promotor- sowie Kontrollsequenzen umfassen, welche in Pflanzenzellen funktionsfähig sind, wobei die chimäre Genkonstruktion in den Zellen der Baumwollpflanze die Expression eines von dem Fremdgen kodierten zellulären Produkts bewirkt, und Baumwollpflanzen bereitgestellt, die aus derartigen Samen auskeimen.
Die vorliegende Erfindung beinhaltet die Transformation von Baumwollzellen in der Gewebekultur und die Regeneration solcher Zellen zu vollständigen, sexuell reifen Baumwollpflanzen. Es ist gefunden worden, daß Gewebe, die von Hypocotylteilen unreifer Baumwollpflanzen stammen, mit einer Kultur von A. tumefaciens inokuliert werden können, ohne die Fähigkeit zur Auslösung der Bildung eines regenerierbaren somatischen Embryos negativ zu beeinflussen. Über die Anwendung selektierbarer Marker ist es möglich, in der Stufe der Gewebekultur ein Screening auf transformierten klonalen Wachstum regenerierbarer Gewebe durchzuführen, um eine vollständige Pflanzenentwicklung zu gewährleisten.
Mit kurzen Worten beinhaltet das Verfahren die Schritte des Inokulierens (oder Infizierens) der Hypocotylstücke unreifer Baumwollpflanzen mit einem A. tumefaciens-Stamm, des Ausplattierens der infizierten Gewebe in einer Gewebekultur, des Entfernens der Bakterien von den infizierten Geweben und des gleichzeitigen Auswählens von Geweben, die gegenüber einem selektierbaren Marker resistent sind, des Amplifizierens der resistenten Gewebe, und des Regenerierens zu vollständigen Pflanzen.
Die vorliegende Erfindung ist damit aufgrund der Einführung ausgewählter Fremdgene in die pflanzliche Keimbahn geeignet zur gentechnischen Herstellung von Baumwollpflanzen- und linien.
Fig. 1 ist eine schematische Darstellung einer Restriktionskarte des pflanzlichen Trägerplasmids pCMC92.
Fig. 2 zeigt eine Restriktionskarte des pflanzlichen Transformationsplasmids pCMC1204.
Das erfindungsgemäße Verfahren zur gentechnischen Herstellung von Baumwollpflanzen und -linien kann, wie oben dargelegt, im weiten Sinne als Kombination zweier verwandter Verfahren angesehen werden. Das erste Verfahren betrifft die genetische Transformation von Baumwollzellen oder -geweben in der Gewebekultur. Das zweite Verfahren betrifft die Regeneration intakter, sexuell reifer Baumwollpflanzen aus genetisch transformierten Zellen. Die beiden Verfahren sind in der Weise wechselseitig voneinander abhängig, daß die Gewebe, die beim Regenerationsverfahren transformiert werden, eine solche Beschaffenheit und Kompetenz aufweisen müssen, daß sie durch das geeignete Regenerationsverfahren regeneriert werden können. Das vorliegende Verfahren beabsichtigt die genetische Transformation von Geweben in Kultur, die von Hypocotylexplantaten abstammen, welche von Baumwollpflanzen 4 bis 6 Tage nach ihrer Keimung entnommen werden. Die aus Hypocotylstücken abgeleiteten transformierten Gewebe können induziert werden, um embryonale Strukturen auszubilden, die hier als somatische Embryos bezeichnet werden und zu vollständigen, relativ normalen und sekuell kompetenten Baumwollpflanzen regeneriert werden können.
Die erfindungsgemäße Transformationstechnik macht von der Verwendung des Ti-Plasmids von A. tumefaciens Gebrauch. Bei der Verwendung einer A. tumefaciens-Kultur als Transformationsvehikel ist es besonders vorteilhaft, als Vektorträger einen nichtonkogenen Stamm von Agrobacterium zu verwenden, damit eine normale, nicht-onkogene Differenzierung der transformierten Gewebe möglich ist. Es wird aus praktischen Erwägungen hinsichtlich der Herstellung des tatsächlichen genetischen Vektors zur Übertragung in die pflanzlichen Zellen ferner bevorzugt, daß das Agrobacterium ein binäres Ti-Plasmidsystem beherbergt. Bei einem solchen binären System trägt das Agrobacterium ein erstes Ti- Plasmid mit einer Virulenzregion und ein zweites, chimäres Plasmid, das die Borderregionen der T-DNA-Region eines Wildtyp-Ti- Plasmids enthält, die eine chimäre Genkonstruktion einschließlich eines interessierenden Fremdgens umgeben. Binäre Ti-Plasmid-Systeme haben sich bei der Transformation von Pflanzenzellen als wirksam erwiesen. De Framond, Biotechnology, 1 : 262-269 (1983); Hoekema et al., Nature, 303 : 179 (1983). Ein derartiges binäres System wird bevorzugt, da das kleinere, die T-DNA-Border enthaltende Plasmid auf äußerst einfache Weise in einem alternativen Wirt wie E. coli hergestellt und manipuliert und anschließend auf Agrobacterium übertragen werden kann. Die chimäre, das interessierende Fremdgen einschließende Konstruktion muß nach erfolgter Einführung in Baumwollzellen zusätzlich zu einem heterologen Gen, welches für ein gewünschtes Produkt kodiert, einen Promotor, der in Baumwollzellen die Transkription des interessierenden Gens bewirkt, und eine Polyadenylierungssequenz oder Transkriptionskontrollsequenz enthalten, die von Baumwollzellen ebenfalls erkannt werden, um effektiv zu sein. Promotoren, von denen bekannt ist, daß sie in Baumwollzellen wirksam sind, schließen den Nopalin-Synthase-Promotor, isoliert von der T-DNA von Agrobacterium, und den 35s-Promotor des Cauliflower Mosaikvirus ein. Es wird ferner bevorzugt, daß das binäre Plasmid, welches das interessierende Fremdgen trägt, ferner ein oder mehrere selektierbare Markergene enthält, damit die transformierten Zellen in der Kultur von nicht-transformierten Zellen selektiert werden können. Bevorzugte Markergene schließen Antibiotika-Resistenzgene ein, so daß zur Abtrennung und Auswahl von transformierten Zellen unter nicht-transformierten Zellen das geeignete Antibiotikum eingesetzt werden kann.
Das zur Einführung in die Baumwollgewebe ausgewählte heterologe Gen kann jedes zur Erzielung eines geeigneten Ergebnisses ausgewählte Fremdgen sein, sofern es in Baumwollpflanzen exprimiert wird. Beispielsweise würde die Expression des kristallinen Proteintoxins von Bacillus thuringiensis in den Zellen von Baumwollpflanzen diese Zellen im Falle der Aufnahme von Insekten der Gattung Lepidoptera toxisch machen, wodurch den Pflanzen eine geeignete Resistenz gegenüber Schädlingen verliehen werden würde. Die Expression eines viralen Hüllproteins in den Zellen einer Baumwollpflanze würde zu einer Resistenz der Pflanze gegenüber einer Infektion durch dieses Virus führen. Die Transkription minussträngiger RNAs in Zellen einer Baumwollpflanze kann geeignet sein zur Hemmung unerwünschter endogener Gene oder zur Etablierung von Resistenzen gegenüber Krankheiten. Der durchschnittliche Fachmann wird erkennen, daß die hier dargelegte Expression eines Fremdproteins in einer Baumwollpflanze mit jedem anderen interessierenden Fremdgen leicht wiederholt werden kann.
Um ein erfindungsgemäßes Transformationsverfahren zu beginnen, ist es zunächst notwendig, die interessierenden Fremdgene zu konstruieren und sorgfältig in einen transformationskompetenten, aber nicht-onkogenen Stamm von Agrobacterium tumefaciens einzuführen. Die Einzelheiten hinsichtlich der Konstruktion der Vektoren, die derartige interessierende Fremdgene enthalten, sind dem Durchschnittsfachmann auf dem Gebiet der Gentechnologie bekannt und weichen nicht von solchen Verfahren ab, deren Effektivität zuvor bei Tabak, Petunien und anderen Modellpflanzen- Spezies demonstriert worden ist. Das Fremdgen sollte offensichtlich ausgewählt werden, um einen gewünschten Effekt in den Zellen einer Baumwollpflanze zu erzielen. Dieser Effekt kann die Wachstumsförderung, die Krankheitsresistenz, die Veränderung der pflanzlichen Morphologie oder der Qualität des Pflanzenprodukts (d. h. Lint) oder irgend eine andere Veränderung betreffen, die mittels genetischer Manipulation erreicht werden kann. Die chimäre Genkonstruktion kann die Expression eines oder mehrerer exogener Proteine kodieren, oder sie kann die Transkription von minussträngigen RNAs bewirken, um entweder einen Krankheitsverlauf oder eine unerwünschte, endogene pflanzliche Funktion zu kontrollieren oder zu hemmen.
Um das Transformations- und Regenerationsverfahren für Baumwollpflanzen zu initiieren, ist es notwendig, zunächst die Oberfläche von Baumwollsamen zu sterilisieren, um eine nachteilige Kontamination der resultierenden Kultur zu vermeiden. Anschließend läßt man die Samen auf einem geeigneten Keimmedium, das ein Fungizid enthält, auskeimen.
4 bis 6 Tage nach dem Auskeimen wird der Hypocotylbereich der unreifen Pflanze entfernt und in kleine Segmente mit einer durchschnittlichen Größe von 0,5 cm unterteilt. Anschließend überführt und beläßt man die Hypocotylexplantate zur Stabilisierung und Beibehaltung ihrer Lebensfähigkeit auf ein flüssiges oder auf Agar basierendes Kulturmedium für Pflanzengewebe.
Sobald sich die Hypocotylsegmente stabilisiert haben, können sie mit einer Suspensionskultur von transformationskompetenten, nicht-onkogenen Agrobacterium-Zellen inokuliert werden. Man läßt den Vorgang der Inokulation 3 bis 5 Tage bei Raumtemperatur, d. h. 24ºC, voranschreiten.
Zum Ende der Inokulationsdauer ist es notwendig, zunächst den Überschuß an Agrobacterium abzuspülen. Anschließend können die verbleibenden behandelten Gewebe auf ein zweites Agarmedium überführt werden, das zusätzlich ein oder mehrere Antibiotika enthält, die für Agrobacterium, nicht aber für Hypocotylgewebe toxisch sind, und zwar in einer Konzentration, die ausreicht, um jedes in der Kultur verbliebenes Agrobacterium abzutöten. Zur Verwendung in einem derartigen Medium geeignete Antibiotika schließen Carbenicillin und Cefotaxim ein. Anschließend läßt man den Geweben eine Zeitdauer von einem bis 10 Tagen, um sich von der Transformation zu erholen, bevor sie wieder in Kultur genommen werden.
Die Gewebe werden nun auf einem Gewebekulturmedium kultiviert, welches zusätzlich zu seinen normalen Bestandteilen ein Selektionsmittel enthält, wobei das Selektionsmittel für nicht-transformierte Baumwollzellen toxisch ist, nicht aber für transformierte Baumwollzellen, die eine genetische Resistenz für das Selektionsmittel aufweisen und diese Resistenz exprimieren. Ein geeignetes Gewebekulturmedium ist das MS-Medium, dem die Phytohormone 2,4-Dichlorphenoxyessigsäure (2,4-D), 6-Furfurylaminopurin und ein Geliermittel zugegeben werden. Geeignete Selektionsmarker schließen sowohl Antibiotika als auch Herbizide ein. Geeignete antibiotische Eigenschaften, die als dominante selektierbare Marker dienen können, schließen das Aminoglykosid- Phosphotransferase-3'-II (APH-(3')-II)-Gen, auch als Neomycin- Phosphotransferase-II-Gen (NPTII) bezeichnet, das für eine Resistenz gegenüber dem Antibiotikum Kanamycin kodiert, und das APH- (3')-IV-Gen ein, das für eine Resistenz gegenüber Hygromycin B kodiert. Kanamycin, G418 und Hygromycin B sind Aminoglykoside, die das Wachstum nicht-transformierter Baumwollzellen unterbinden, aber diese Antibiotika werden durch das geeignete Enzym im Falle der Expression in den transformierten Zellen phosphoryliert. Ein weiteres geeignetes Antibiotika-Selektionsmittel ist Chloramphenicol, das durch das von dem CAT (Chloramphenicol-Acetyltransferase)-Gen gebildete Enzym acetyliert und damit zu einer nicht-toxischen Substanz umgewandelt wird. Der Einsatz von Medien mit Antibiotika-Dosierungen erlauben es lediglich transformierten Zellen, weiterhin zu wachsen und zu überleben. Demgemäß läßt man die transformierten Zellen oder Kalli auf dem Selektivmedium wachsen. Die überlebenden transformierten Gewebe werden auf ein zweites Medium überführt, um somatische Embryogenese zu induzieren. Das überlebende transformierte Gewebe wird daher weiter somatische Embryos ausbilden, die anschließend durch das erfindungsgemäße Regenerationsverfahren oder durch jedes andere alternative Vorgehen zur Regeneration einer Pflanze, bei dem somatische Baumwollembryos als Ausgangsmaterial verwendet werden, regeneriert werden.
Die Auswahl sollte aufgrund des langsamen Wachstums von sogar transformierten Geweben auf dem Antibiotikamedium für einen längeren Zeitraum, d. h. 3-4 Monate vorgenommen werden. Alle 4 bis 6 Wochen werden Subkulturen erstellt, um Nährstoffe und Antibiotika wieder aufzufüllen. Bei der Selektion und Amplifikation von transformierten Zellen werden individuell abgeleitete Zellinien identifizierbar und können entfernt und separat amplifiziert werden.
Das erfindungsgemäße Regenerationsverfahren beginnt mit den aus dem Transformationsverfahren resultierenden Geweben. Diese Gewebe sind mutmaßlich transformierte Kalli, die bei Kultivierung auf geeignetem Embryo-induzierenden Medium somatische Embryos bilden können. Ein Verfahren zur Regeneration dieser somatischen Embryos zu vollständigen Pflanzen wird hier offenbart, aber es ist davon auszugehen, daß andere Techniken ebenfalls möglich sind, sobald transformierte Embryogengewebe gebildet sind.
Das von den Anmeldern angewendete Regenerationsverfahren beginnt daher mit den Geweben, die aus dem Transformationsverfahren resultieren. Die Baumwoll-Gewebekalli, die aus Hypocotylsegmenten von Baumwollpflanzen gebildet und mutmaßlich transformiert sind, werden direkt auf ein Medium überführt, das der Induktion von somatischen Embryos dient. Zu diesem Zeitpunkt sollte das Antibiotika-Selektionsmittel aus dem Kulturmedium entfernt werden, wobei das Medium jedoch ansonsten konstant bleiben kann. Diese auf dem Induktionsmedium für somatische Embryos kultivierten Kalli bilden kleine embryonale Strukturen aus, die als somatische Embryos bezeichnet worden sind. Es kann zwei bis drei Monate dauern, bis sich die somatischen Embryos ausbilden und reifen. Aus einem einzelnen Kallus in einer Agar-Formulierung eines Induktionsmediums für somatische Embryos werden sich ungefähr 5 bis 20 somatische Embryos bilden. Viele der auf diese Weise hergestellten somatischen Embryos werden in Übereinstimmung mit den hier beschriebenen Techniken zu vollständigen Pflanzen regenerierbar sein.
Wenn die sich entwickelnden somatischen Embryos groß genug sind, d. h. eine Länge von 4 mm oder mehr aufweisen, und wenn sie über eine gute embryonale Entwicklung verfügen, d. h. gewöhnlich ein Cotyledon und eine Radikula aufweisen, können sie in große Teströhrchen überführt und auf feinem Vermiculit kultiviert werden. Der Vermiculit ist gesättigt mit Stewart und Hsu (SH)-Medium (Planta, 137 : 113 (1977)) unter Zusatz der Phytohormone Indolessigsäure, 6-Furfurylaminopurin und Gibberellinsäure. Schließlich entwickeln sich kleine Pflänzchen mit zwei bis drei Blättern.
Nach Etablierung des Wachstums von Pflänzchen, d. h. der zwei- bis dreiblättrigen Stufe, können die Pflanzen in Pflanzentöpfe mit Vermiculiterde überführt werden. Sie können je nach Anforderung gewässert und gedüngt werden. Es kann ebenfalls erforderlich sein, sie vor der Überführung in das Gewächshaus abzuhärten. Die Pflänzchen können umgetopft werden, wenn sie 4 bis 6 Blätter tragen, wonach sie bis zur Reife kultiviert werden.
Die folgenden Beispiele dienen der Veranschaulichung des erfindungsgemäßen Verfahrens, ohne dieses zu beschränken.

BEISPIEL 1

Transformation eines Kallus

Dieses Beispiel dient der Veranschaulichung der Transformation von Baumwollgewebe in Kultur unter Verwendung virulenter und avirulenter Stämme von A. tumefaciens, die Plasmide beherbergen, die für die Markerenzyme Neomycin-Phosphotransferase II (NPTII) (auch bekannt als APH-3'-II) und/oder Chloramphenicol-Acetyltransferase (CAT) kodieren. Die Kallusgewebe wurden über eine Zeitdauer von mehreren Monaten auf einem Selektionsmedium amplifiziert. Gewebeproben wurden entnommen und hinsichtlich der Expression der Enzyme analysiert, und die verbleibenden Gewebe wurden zur DNA-Analyse verwendet. Die Einzelheiten des Beispiels sind wie folgt:
Die Samen von kultivierter Baumwolle (Gossypium hirsutum L.) der Coker-Linien 310, 312, 5110 Deltapine 61, und Stoneville 213 wurden mit 3%igem Natriumhypochlorit 20 Minuten lang oberflächensterilisiert. Die Samen wurden anschließend dreimal mit sterilem destillierten Wasser plus Cefotaxim (500 mg/l) abgespült. Man ließ die Samen in SH-Medium enthaltend das Fungizid Benomyl (50 mg/l) keimen. 4 bis 6 Tage nach der Keimung wurden Hypocotylexplantate entfernt, in Stücke von jeweils 0,5 cm geschnitten und auf ein Agar (0,8%) und Wasser enthaltendes Trägermedium überführt.
Die Hypocotylstücke wurden anschließend mit einer verdünnten (1 : 10) Übernachtkultur von A. tumefaciens inokuliert. Die Suspensionskultur von A. tumefaciens enthielt ungefähr 108 Bakterien pro Milliliter.
Der verwendete besondere A. tumefaciens-Stamm beherbergte ein binäres Ti-Plasmid-System enthaltend ein Ti-Plasmid, das die sog. Virulenzregion trägt und ein zweites Ti-Plasmid, das die T- DNA-Borderregionen eines virulenten Ti-Plasmids (pCMC91, pCMC92 oder pCMC1204) und ferner ein Antibiotika-Resistenzgen (NPTII) enthält. Ein Plasmid (pCMC1204) trug ferner ein Fremdgen (CAT) zwischen den T-DNA-Borderbereichen. Die Infektion der unreifen embryonalen Gewebe mit A. tumefaciens ließ man für 3 bis 5 Tage bei Raumtemperatur erfolgen.
Nach Inkubation bei Raumtemperatur und Belichtung wurden die Gewebe auf Murashige und Skoog-Salze mit B5-Vitaminen (Gamborg et al., Exp. Cell Res., 50 : 151-158 (1968)) unter Zusatz von Antibiotika, den Phytohormonen 2,4-D (0,1 mg/l) und 6-Furfurylaminopurin (0,1 mg/l), und dem Geliermittel Gelrite (1,6 g/l) (Gelrite ist ein eingetragenes Warenzeichen von Kelco Company, San Diego, Kalifornien) plus Magnesiumchlorid (750 mg/l) überführt. Die zur Abtötung der Bakterien verwendeten Antibiotika waren Cefotaxim (50-100 mg/l) und Carbenicillin (400-500 mg/l). Kanamycinsulfat (5-50 mg/l) wurde in das Medium eingeschlossen und als Selektionsmittel eingesetzt. Alle 4 bis 6 Wochen wurden Subkulturen angelegt, um verbrauchte Nährstoffe und Antibiotika aufzufüllen.
Nach 3 bis 4 Monaten wurden individuell abgeleitete Zellinien markiert und auf einem Selektionsmedium zur Gewebeamplifikation gehalten. Die Gewebe wurden bei 30ºC mit einer 16-stündigen Photoperiode (50-100 uM/m²/s) inkubiert.
NPTII-Assays wurden durchgeführt unter Verwendung von rohen Zellextrakten, hergestellt aus Kalli oder Pflanzengeweben, die zuvor in einer Pufferlösung (30 mM NaCl, 15 mM NH&sub2;Cl, 3 mM MgCl, 5,5 mM Na EDTA, 2,3 mM Tris, 0,2 mM Dithiothreitol (DTT), 105 mM Sucrose bei einem pH-Wert von 7) inkubiert worden waren. Im Anschluß an dreimaliges Einfrieren und Auftauen in Flüssigstickstoff wurden die Gewebe in einem Puffer vermahlen, der 37 mM Na EDTA, 126 mM NaCl, 83 mM NH&sub2;Cl, 7,7 mM Tris und 15 mM DTT enthielt. Um vor einem Proteaseabbau von NPTII zu schützen, wurden dem Puffer 2,5 mM Phenylmethylsulfonylfluorid und 0,6 mg/ml Leupeptin, 1,05 mg/ml Sojabohnen-Trypsin-Inhibitor und 5,0 mg/ml bovines Serumalbumin zugegeben. 40 ul des Extraktionspuffers wurden pro 100 mg (Frischgewicht) Kallus oder Pflanzengewebe verwendet. Im Anschluß an eine Zentrifugation wurden die Überstände gesammelt. Eine elektrophoretische Analyse der NPTII- Aktivität erfolgte nach J. Paszknowski et al., EMBO J., 3 : 2717- 2722 (1984), und B. Reiss et al., Gene, 30 : 211-218 (1984).
Die Pflanzengewebe wurden extrahiert nach dem Verfahren von Herrera-Estrella et al., Nature, 303 : 209-213 (1983). Die extrahierten Pflanzengewebe wurden einem CAT-Assay nach C.M. Gorman et al., Molec. Cell. Biol., 2 : 1044-1051 (1982), zugeführt.
In Tabelle 1 sind die zahlreichen untersuchten Vektoren, die Anzahl erhaltener transformierter Linien und die Ergebnisse ihrer NPTII-Tests aufgeführt. Die Tabelle 2 veranschaulicht Daten, die für Proben von zwei der Vektoren gesammelt wurden. Tabelle 1 In Baumwolle untersuchte Vektorkonstruktionen Vektor Anzahl der erhaltenen transformierten Linien Anzahl der auf NPTII getesteten Linien Anzahl der Linien mit (+)-Analysen
Die Konstruktion A6 trägt kein Kanamycin-Resistenzgen und wird daher das NPTII-Protein nicht bilden. A6 ist ein virulenter Agrobacterium-Stamm. LBA4404 ist ein nicht-virulenter Stamm. Die Plasmide pCMC91 und pCMC92 tragen das NPTII-Gen alleine zwischen den T-DNA-Bordersegmenten. Das Plasmid pCMC1204 trägt das NPTII- und CAT-Gen als Tandem. Tabelle 2 NPTII-Aktivität in transformierten Baumwollkalli Vektor/Probe cpm/20 ul Rohextrakt ng Enzym/20 ul * Kontrollen: Stoneville 231 Coker 310 Deltapine 61 Vektor
Die Nanogramm-Werte wurden ausgehend von Zerfällen berechnet, die von einer bekannten Menge des NPTII-Enzyms auf demselben Gel erhalten wurden. "L" bedeutet weniger als.
Die Ergebnisse zeigen die Expression mindestens eines Enzyms (NPTII) und/oder in den meisten Fällen die Expression beider Enzyme (NPTII und CAT), wenn sie gemeinsam in dasselbe Plasmid in Geweben von Baumwollkalli in Kultur eingeschlossen worden sind.

BEISPIEL 2

Transformation und Regeneration

In diesem Beispiel wurden Baumwollgewebe transformiert unter Verwendung eines avirulenten Stammes von A. tumefaciens (LBA4404), der ein Plasmid (pCMC1204) trägt, welcher sowohl für das Markerenzym NPTII als auch für CAT kodiert. Im Laufe der nächsten Monate wurden die Kallusgewebe auf Selektionsmedium amplifiziert. Die Gewebeproben wurden entnommen und hinsichtlich der Expression der Enzyme analysiert. Die verbleibenden Kallusgewebe wurden zur Regeneration von Pflanzen verwendet. Die Einzelheiten des Beispiels werden nachfolgend dargelegt.
Das Plasmid pCMC1204 wurde hergestellt aus Komponenten eines bipartiten Vektorsystems, ähnlich dem zuvor im Stand der Technik beschriebenen. De Framond et al., Biotechnology, 1 : 262-269 (1983), Bevan, Nuc. Acids Res., 12 : 8711-8721 (1984). Es wurde eine Expressionskassette für das CAT-Gen hergestellt, indem das Hind III/Sau 3A1 CAT-kodierende Fragment aus pSV2CAT (Gorman et al., Mol. Cell. Biol., 2 : 1044-1051 (1982)) mit den Hind III- und Bam H1-Stellen von pCMC66 ligiert wurde. Das Plasmid pCMC66 ist ein Expressionsplasmid, das die Promotor- und Polyadenylierungsregionen des Nopalin-Synthase nos-Gens von pTiT37 von Agrobacterium enthält. Das resultierende CAT-Expressionsplasmid, bezeichnet mit pCMC1201, wurde linearisiert mit Sal I, das das Plasmid einmal unmittelbar stromabwärts der Polyadenylierungsregion schneidet, und es wurde in die einmalige Sal 1-Stelle des Trägerplasmids pCMC92 insertiert. Das Trägerplasmid pCMC92 ist ein Replikon für einen weiten Wirtsbereich und trägt die T-DNA- Borderregionen von Agrobacterium und ein chimäres NPTII-Gen. Das chimäre NPTII-Gen wird gebildet von der Nopalin-Synthase-Promotor- und der Polyadenylierungssequenz von pTiT37, d. h. denselben Kontrollsequenzen wie in pCMC66, und der für NPTII kodierenden Region aus Ti5. Das Produkt der Ligation wurde mit pCMC1204 bezeichnet. Das Plasmid pCMC1204 wurde von E. coli in den A. tumefaciens-Stamm LBA4404 in Form eines triparentalen Matings mit einem Helferstamm von E. coli mobilisiert, der pRK2013 trägt. Transkonjuganten wurden ausgewählt auf Platten, die Streptomycin, Sulfadiozon und Carbenicillin mit 100 ug/ml enthielten. Einzelkolonien wurden gepickt zur Amplifikation für die Inokulation pflanzlicher Gewebe.
Die Konstruktion und Verwendung beider Plasmide pCMC66 und pCMC92 wird in der veröffentlichten Patentanmeldung WO85/04899 von Barton und Gelfand detaillierter beschrieben. Das Plasmid pCMC92 ist bei der ATCC unter der Hinterlegungsnummer 53093 hinterlegt und enthält nicht nur das chimäre NPTII-Gen und die T-DNA-Border, sondern auch die Nopalinsynthasepromotor- und Polyadenylierungssequenzen, die von dem Plasmid entfernt werden und für jede gewünschte heterologe Kodierungssequenz verwendet werden können.
Hypocotylstücke wurden mit verdünnten (1 : 10) Übernachtkulturen von A. tumefaciens inokuliert. Nach einer dreitägigen Inkubation bei Raumtemperatur (23ºC-27ºC) und Belichtung wurden die Gewebe auf MS-Salze mit B5-Vitaminen unter Zusatz von Antibiotika, den Phytohormonen 2,4-D (0,1 mg/l) und 6-Furfurylaminopurin (0,1 mg/l) und dem Geliermittel Gelrite (1,6 g/l) plus Magnesiumchlorid (750 mg/l) überführt. Die zur Abtötung der Bakterien verwendeten Antibiotika waren Cefotaxim (50-100 mg/l) und Carbenicillin (400-500 mg/l). Kanamycinsulfat (5-50 mg/l) wurde in das Medium eingeschlossen und als Selektionsmittel verwendet. Alle 4 bis 6 Wochen wurden Subkulturen erstellt, um verbrauchte Nährstoffe und Antibiotika aufzufüllen. Nach 3 bis 4 Monaten wurden individuell abgeleitete Zellinien markiert und zur Gewebeamplifikation auf dem Selektionsmedium gehalten. Die Gewebe wurden bei 30ºC für eine 16-stündige Photoperiode (50- 100 uM/m²/s) inkubiert.
Nach der Amplifikation wurden die Antibiotika nicht mehr eingesetzt, und die transformierten Gewebe wurden auf demselben Medium gehalten. Nach weiteren 2 bis 3 Monaten ergaben die embryogenen Kalli somatische Embryos. Sobald die Embryos groß genug waren, d. h. eine Länge von 4 mm und mehr aufwiesen, und eine gute embryonale Entwicklung mit vorhandenem Cotyledon und Radikula zeigten, wurden sie in große Teströhrchen überführt, die "feinen" Vermiculit enthielten. Der Vermiculit war gesättigt mit SH-Medium unter Zusatz der Phytohormone Indolessigsäure, 6-Furfurylaminopurin und Gibberellinsäure, alle mit 0,1 mg/l. Die Embryos wurden für eine 16-stündige Photoperiode bei 30ºC inkubiert. Nach der Keimung, d. h. im 2- bis 3-Blätter-Stadium, wurden die Pflänzchen in Töpfe überführt, die mit Vermiculit gefüllt waren, und sie wurden nach Bedarf gewässert und gedüngt. Die Pflänzchen wurden für etwa eine Woche in ein Becherglas eingeschlossen, um die Blätter abzuhärten. Sobald das Wachstum der in den Töpfen befindlichen Pflänzchen etabliert war (4- bis 6-Blätter-Stadium), wurden sie in das Gewächshaus überführt. Adaptierte Pflanzen wurden in eine handelsübliche Erdmischung Metromix 360 (Metromix ist ein eingetragenes Warenzeichen von W.R. Grace & Co.) umgetopft und bis zur Reife gehalten.
Die NPTII-Assays erfolgten nach den Darlegungen in Beispiel 1. Die Assays zeigten eine NPTII-Aktivität in dem Blattgewebe von verschiedenen der regenerierten Baumwollpflanzen. Einige Pflanzen, die aus einem Kallus gewachsen waren, der sich hinsichtlich der NPTII-Aktivität als positiv erwies, erwiesen sich jedoch als negativ.
Um die Anwesenheit des Plasmids in den transformierten Pflanzen zu bestätigen, erfolgte eine Southern Blot-Analyse. Die Southern Blot-Analyse wurde mit den Restriktionsenzymen Ava I und Hind III durchgeführt, korrespondierend mit der NPTII-Kodierungsregion. Die pflanzliche DNA in extrahierter und verdauter Form wurde mit einer radioaktiv markierten, minussträngigen NPTII-Sequenz hybridisiert. Eine Hybridisierungsbande zeigte die Anwesenheit des erwarteten Fragments in den Pflanzengeweben in einer Kopiezahl von mindestens 1.
Das Plasmid pCMC1204 wurde bei der American Type Culture Collection, 12301 Parklawn Drive, Rockville, MD, USA, am 3. Dezember 1986 unter der ATCC-Hinterlegungsnummer 67275 hinterlegt.
Die genannte Hinterlegung erfolgte gemäß eines Vertrages zwischen der ATCC und der Cetus Corp., einem Partner der Anmelderin. Der Vertrag mit der ATCC gewährleistet eine permanente Verfügbarkeit der Nachkommen dieser Zellinien für die Öffentlichkeit mit der Herausgabe des US-Patents, in dem die Hinterlegung beschrieben und-identifiziert ist, oder mit der Veröffentlichung oder Offenlegung einer amerikanischen Patentanmeldung oder einer ggf. vorher veröffentlichten oder offengelegten Patentanmeldung eines anderen Staates, und er gewährleistet die Verfügbarkeit der Nachkommen dieser Zellinien für eine Person, die von der amerikanischen Patent- und Warenzeichenbehörde gemäß 35 USC Kapitel 122 und den entsprechenden Ausführungsregeln (einschließlich 37 CFR Kapitel 1.14 unter besonderer Bezugnahme auf 8869.G638) dazu ermächtigt wird. Die Anmelderin der vorliegenden Anmeldung hat zugesichert, daß die hinterlegten Zelllinien im Falle des Absterbens oder des Verlustes oder der Zerstörung unter den geeigneten Kulturbedingungen unverzüglich nach Mitteilung durch eine lebensfähige Kultur derselben Zellinie ersetzt wird.
Eine Ausführungsform eines Verfahrens zur Einführung von Genen in Baumwollpflanzen und -pflanzenlinien umfaßt die folgenden Schritte in der angegebenen Reihenfolge:
a) Oberflächensterilisierung von Baumwollsamen,
b) Keimenlassen der Baumwollsamen unter Bildung unreifer Baumwollpflanzen, wobei die unreifen Baumwollpflanzen Hypocotylgewebe einschließen,
c) Exposition des Hypocotylgewebes mit einer transformationskompetenten, nicht-onkogenen Agrobacterium tumefaciens-Kultur, deren Zellen ein Ti-Plasmid beherbergen, welches eine T-DNA-Region aufweist, die sowohl ein fremdes chimäres Gen als auch ein Resistenzgen zur Selektion einschließt,
d) Kultivierung des Hypocotylgewebes auf einem Medium, das mindestens ein für Agrobacterium tumefaciens, nicht aber für Baumwollzellen toxisches Antibiotikum enthält,
e) Kultivierung des Gewebes der Stufe d) in Gegenwart eines Selektionsmittels, gegenüber welchem das Resistenzgen eine Resistenz kodiert, um mit der T-DNA-Region transformierte Pflanzenzellen zu selektieren,
f) Induktion einer somatischen Embryobildung in dem exponierten Gewebe in Kultur, und
g) Regeneration der somatischen Embryos zu vollständigen Baumwollpflanzen.

Claims

1. Verfahren zur Einführung von Genen in Baumwollpflanzen und - pflanzenlinien, dadurch gekennzeichnet, daß es das Exponieren von Hypocotylgewebe unreifer Baumwollpflanzen mit einer transformationskompetenten, nicht-onkogenen Agrobacterium tumefaciens-Kultur umfaßt, deren Zellen ein Ti-Plasmid beherbergen, welches eine T-DNA-Region aufweist, die sowohl ein fremdes chimäres Gen als auch ein Resistenzgen zur Selektion einschließt.

2. Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß es ferner das Kultivieren des exponierten Gewebes in Gegenwart eines Selektionsmittels, für das das Resistenzgen eine Resistenz kodiert, um mit der T-DNA-Region transformierte Pflanzenzellen zu selektieren, das Induzieren einer somatischen Embryobildung in dem exponierten Kulturgewebe, und das Regenerieren der somatischen Embryos zu vollständigen Baumwollpflanzen umfaßt.

3. Verfahren nach Anspruch 1 oder 2, dadurch gekennzeichnet, daß dem Schritt des Exponierens eine Sterilisation der Oberfläche der Baumwollsamen, gefolgt von der Keimung der Baumwollsamen zur Bildung der unreifen Baumwollpflanzen vorhergeht.

4. Verfahren nach einem der vorhergehenden Ansprüche, dadurch gekennzeichnet, daß das Hypocotylgewebe Stücke von Hypocotylexplantaten umfaßt, die den unreifen Baumwollpflanzen entnommen werden.

5. Verfahren nach einem der vorhergehenden Ansprüche, dadurch gekennzeichnet, daß die Kultur von Agrobacterium tumefaciens ein binäres Ti-Plasmidsystem beherbergt, in welchem die Eigenschaft zur Virulenz von einem Plasmid getragen wird, das von dem die T-DNA-Region tragenden Plasmid verschieden ist.

6. Verfahren nach Anspruch 5, dadurch gekennzeichnet, daß die T-DNA-Region lediglich die rechten und linken Bordersequenzen der T-DNA aus der T-DNA eines Ti-Wildtyp-Plasmids einschließt.

7. Verfahren nach einem der Ansprüche 2 bis 6, dadurch gekennzeichnet, daß das Selektionsmittel ein Antibiotikum ist und das Resistenzgen für Antibiotika-Resistenz kodiert.

8. Verfahren nach Anspruch 7, dadurch gekennzeichnet, daß das Antibiotika-Resistenzgen das NPTII-Gen ist und das Antibiotikum aus der Gruppe bestehend aus Kanamycin und G418 ausgewählt wird.

9. Verfahren nach Anspruch 7, dadurch gekennzeichnet, daß das Antibiotika-Resistenzgen das CAT-Gen und das Antibiotikum Chloramphenicol sind.

10. Verfahren nach Anspruch 7, dadurch gekennzeichnet, daß zwei Antibiotika und zwei Antibiotika-Resistenzgene verwendet werden, wobei die Antibiotika vorzugsweise aus der Gruppe bestehend aus Hygromycin B, Chloramphenicol und einem von Kanamycin und G418 ausgewählt werden.

11. Verfahren nach einem der vorhergehenden Ansprüche, dadurch gekennzeichnet, daß es nach dem Schritt des Exponierens des Gewebes mit Agrobacterium tumefaciens ferner einen Schritt des Kultivierens des Gewebes auf einem Medium einschließt, welches mindestens ein für Agrobacterium tumefaciens, nicht aber für Baumwollzellen toxisches Antibiotikum enthält.

12. Verfahren nach einem der Ansprüche 2 bis 11, dadurch gekennzeichnet, daß der Schritt des Induzierens einer Embryobildung das Kultivieren des Pflanzengewebes auf einem Kulturmedium einschließt, welches mindestens ein Auxin oder Cytokinin enthält.

13. Baumwollpflanzen, dadurch gekennzeichnet, daß sie in ihrem Genom ein chimäres Gen umfassen und durch ein Verfahren gemäß einem der vorhergehenden Ansprüche erhältlich sind.

14. Somatische Baumwollembryos, dadurch gekennzeichnet, daß sie in ihrem Genom ein chimäres Gen umfassen und durch ein Verfahren gemäß einem der Ansprüche 1 bis 12 erhältlich sind.

15. Baumwollsamen, dadurch gekennzeichnet, daß sie in ihrem Genom ein chimäres Gen umfassen und von Pflanzen gemäß Anspruch 13 erhältlich sind.

16. Baumwollsamen, die in der Lage sind, zu Baumwollpflanzen auszukeimen und in ihrem Genom eine chimäre Genkonstruktion einschließlich eines Fremdgens und Promotor- sowie Kontrollsequenzen umfassen, welche in Pflanzenzellen funktionsfähig sind, wobei die chimäre Genkonstruktion in den Zellen der Baumwollpflanze die Expression eines von dem Fremdgen kodierten zellulären Produkts bewirkt.

17. Baumwollsamen nach Anspruch 16, dadurch gekennzeichnet, daß das zelluläre Produkt ein exogenes Protein oder eine RNA ist, wodurch eine somatische Veränderung der Baumwollpflanze herbeigeführt wird.

18. Baumwollsamen nach Anspruch 16, dadurch gekennzeichnet, daß das Fremdgen für die Bildung eines negativen RNA-Stranges kodiert, welcher die Etablierung einer somatischen Veränderung in der aus dem Samen kultivierten Baumwollpflanze bewirkt.

19. Baumwollsamen nach einem der Ansprüche 16 bis 18, dadurch gekennzeichnet, daß die Promotorsequenz die des Nopalinsynthasepromotors von Agrobacterium tumefaciens oder die des 35s-Promotors des Cauliflower mosaic virus ist.

20. Baumwollpflanzen, dadurch gekennzeichnet, daß sie durch Keimung aus Samen gemäß einem der Ansprüche 16 bis 19 hervorgegangen sind.