DE69932082T2

DE69932082T2 - Verfahren zur verbesserung der effizienz agrobakterium-vermittelter transformation von pflanzen

Info

Publication number: DE69932082T2
Application number: DE69932082T
Authority: DE
Inventors: Ming Ballwin CHENG; Joyce St. Louis FRY
Original assignee: Monsanto Technology LLC
Current assignee: Monsanto Technology LLC
Priority date: 1998-12-11
Filing date: 1999-12-09
Publication date: 2007-06-21
Anticipated expiration: 2019-12-10
Also published as: CA2353796C; JP2002531132A; ATE331035T1; US7045357B2; AR021628A1; EP1137790B1; ES2267307T3; CA2353796A1; EP1137790A2; US20010054186A1; AU773764B2; PT1137790E; WO2000034491A3; BR9916103A; WO2000034491A2; AU2049200A; DK1137790T3; ZA200104091B; DE69932082D1

Description

Hintergrund der Erfindung
Die vorliegende Erfindung bezieht sich auf das Gebiet der Pflanzenbiotechnologie. Insbesondere betrifft sie Verfahren zum Einbauen genetischer Komponenten in das Genom von einkeimblättrigen oder zweikeimblättrigen Pflanzen. Insbesondere wird hier ein reproduzierbares Verfahren zur genetischen Transformation von Mais, Sojabohne, Reis und Weizen angegeben. Insbesondere wird ein Verfahren zur Transformation von Weizen angegeben.
Das Verfahren umfasst neue Bedingungen während des Cokultivierens von Agrobacterium mit einer regenerierbaren Pflanzenzelle oder einem regenerierbaren Pflanzengewebe. Beispielhafte Verfahren sind ein verbessertes Verfahren unter Verwendung von Agrobacterium-vermittelter Transformation zum Einführen von Nucleinsäuren in verschiedene regenerierbare Gewebe unter Verwendung einer Vielzahl von selektierbaren oder screeningfähigen Markersystemen und mit mehreren verschiedenen Pflanzenspezies. Das Verfahren der vorliegenden Erfindung stellt auch fruchtbare transgene Pflanzen, insbesondere Weizen, bereit. In anderen Aspekten führt das Verfahren der Erfindung zur Herstellung von stabil transformierten und fruchtbaren Pflanzen, Gameten und Nachkommen dieser Pflanzen.
Während der letzten Dekade ist es möglich geworden, Gene aus einem breiten Spektrum von Organismen durch DNA-Rekombinationstechnik auf Kulturpflanzen zu übertragen. Dieser Fortschritt hat für enorme Möglichkeiten gesorgt, die Resistenz von Pflanzen gegenüber Schädlingen, Krankheiten und Herbiziden zu verbessern und Biosynthesevorgänge so zu modifizieren, dass die Qualität von Pflanzenprodukten geändert wird (Knutson et al., 1992; Piorer et al., 1992; Vasil et al., 1992). Die Verfügbarkeit von effizienten Agrobacterium-vermittelten Transformationsverfahren, die für eine Produktion von ökonomisch wichtigen Pflanzen mit hoher Kapazität geeignet sind, ist jedoch beschränkt.
Es gibt viele Verfahren, die für die Transformation von Pflanzen versucht wurden, aber nur wenige Verfahren sind hochgradig effizient. Zu den Verfahren zur DNA-Transformation von Pflanzenzellen gehört die Agrobacterium-vermittelte Pflanzentransformation (siehe zum Beispiel die US-Patente Nr. 5,416,011 und 5,569,834 sowie WO 97/48814). Außerdem wurden Protoplastentransformation, Genübertragung auf Pollen, Injektion in Reproduktionsorgane, Injektion in unreife Embryonen und Partikelbeschuss für die Pflanzentransformation eingesetzt. Trotz der Zahl von Transformationsverfahren, die für spezifische Pflanzensysteme verfügbar sind, wäre es vorteilhaft, über ein Verfahren zur Einführung von Genen in Pflanzen zu verfügen, das auf mehrere verschiedene Kulturpflanzen und eine Vielzahl von regenerierbaren Geweben anwendbar ist.
Mehrere Techniken zur Einführung von DNA in Zellen sind dem Fachmann wohlbekannt und können in Kategorien eingeteilt werden, zu denen die folgenden gehören: (1) chemische Verfahren (Graham und van der Eb, 1973; Zatloukal et al., 1992); (2) physikalische Verfahren, wie Mikroinjektion (Capecchi, 1980), Elektroporation (Wong und Neumann, 1982; Fromm et al., 1985; US-Patent Nr. 5,384,253) und die Genkanone (Johnston und Tang, 1994; Fynan et al., 1993); (3) virale Vektoren (Clapp, 1993; Lu et al., 1993; Eglitis und Anderson, 1988); und (4) Rezeptor-vermittelte Mechanismen (Curie) et al., 1992; Wagner et al., 1992).
Bis vor kurzem umfassten die für einige einkeimblättrige Spezies eingesetzten Verfahren die direkte DNA-Übertragung auf isolierte Protoplasten und die Mikroprojektil-vermittelte DNA-Abgabe (Shimamoto et al., 1989; Fromm et al., 1990). Die Protoplastenverfahren wurden verbreitet bei Reis verwendet, wobei DNA über Liposomen, PEG und Elektroporation an die Protoplasten abgegeben wird. Während in mehreren Laboratorien eine große Zahl von transgenen Pflanzen gewonnen wurde (Shimamoto et al., 1989; Datta et al., 1990), erfor dern die Protoplastenverfahren die Etablierung von langfristigen embryogenen Suspensionskulturen. Einige Regeneranten von Protoplasten sind unfruchtbar und aufgrund der langfristigen Suspensionskultur phänotypisch abnorm (Davey et al., 1991; Rhodes et al., 1988). Das US-Patent Nr. 5,631,152 beschreibt ein schnelles und effizientes Mikroprojektil-Beschussverfahren für die Transformation und Regeneration von Einkeimblättrigen und Zweikeimblättrigen.
In jüngerer Zeit wurden einkeimblättrige Spezies durch Agrobacterium-vermittelte Transformation erfolgreich transformiert. WO 97/48814 offenbart Verfahren zur Herstellung von stabil transformiertem fruchtbarem Weizen. Das Verfahren beschreibt die Gewinnung von transgenen Weizenpflanzen innerhalb einer kurzen Zeitspanne unter Verwendung einer Vielzahl von Explantaten. Die Agrobacterium-vermittelte Transformation liefert eine mögliche Alternative zu Beschussverfahren, und das Verfahren ermöglicht auch eine schnelle molekulare Analyse von transgenen Linien.
Die Transformation von Pflanzenembryonen, die einer Plasmolyse unterzogen wurden, und von Pflanzen durch Vermittlung von Agrobacterium, das interessierende Gene enthält, während der Cokultivierung wurde beschrieben (Zhang et al., 1997; Uze et al., 1997). Die wesentlichen Merkmale für Transformationseffizienz unter Verwendung dieses Systems bleiben jedoch unklar.
Zu den größten Mängeln bei derzeitigen Pflanzentransformationssystemen unter Verwendung von Agrobacterium-vermittelten Verfahren gehören die Produktionseffizienz des Systems und Transformationsschwierigkeiten aufgrund der Genotyp- oder Speziesdiversität und Explantatsbeschränkungen. WO 94/00977 beschreibt ein Verfahren zum Transformieren von Einkeimblättrigen, das auf der Verwendung von frisch kultivierten unreifen Embryonen für die eine einkeimblättrige Pflanze und von kultivierten unreifen Embryonen oder Kallus für eine andere einkeimblättrige Pflanze beruht. In beiden Systemen müssen die Explantate frisch isoliert werden, und das Verfahren ist arbeitsintensiv, genotyp- und explantatsbeschränkt. Weitere Berichte beruhen auf der Verwendung von spezifischen Stämmen oder Vektoren, um eine hocheffiziente Transformation zu erreichen. In einem Bericht muss ein spezifischer binärer Supervektor verwendet werden, um eine hocheffiziente Transformation zu erreichen (Ishida et al., 1996).
Trotz der Zahl von Transformationsverfahren in der Technik wurden nur wenige Verfahren entwickelt, die sowohl auf Einkeimblättrige als auch auf Zweikeimblättrige anwendbar sind. Die vorliegende Erfindung liefert eine Verbesserung eines Agrobacterium-vermittelten Transformationsverfahrens. Das Verfahren ist effizienter bei der Abgabe von Ziel-DNA an die Pflanze, wie durch die höheren Transformatioriseffizienzen bewiesen wird, und ergibt im Vergleich zu herkömmlichen Verfahren einen Vorteil durch Arbeits- und Kostenreduktion.
Kurzbeschreibung der Erfindung
Die vorliegende Erfindung gibt ein Verfahren zur Herstellung einer fruchtbaren transgenen Pflanze an, deren Genom durch die Einführung von einer oder mehreren genetischen Komponenten modifiziert wurde, wobei das Verfahren die folgenden Schritte umfasst:

(a) Einführen einer oder mehrerer genetischer Komponenten in das Genom einer Pflanze durch Cokultivieren einer regenerierbaren Pflanzenzelle oder eines regenerierbaren Pflanzengewebes mit Agrobacterium, das die eine oder mehreren genetischen Komponenten enthält;
(b) Cokultivieren des Agrobacterium und der regenerierbaren Pflanzenzellen oder -gewebe von Schritt (a) in einer Weise, dass eine Reduktion im Gewicht des mit Agrobacterium geimpften Explantats von etwa 20% bis etwa 35% des Gewichts der Pflanzenzelle bzw. des Pflanzengewebes vor der Cokultur gesteuert wird, wobei die Weise der Steuerung der Gewichtsreduktion des mit Agrobacterium geimpften Explantats die Beschränkung oder den Entzug von Wasser aus dem Explantat umfasst;
(c) Identifizieren oder Selektieren einer transformierten Zelllinie; und
(d) Regenerieren einer fruchtbaren transgenen Pflanze aus dieser Zelllinie.

Beschreibung der Figuren
1 ist eine Darstellung von pMON15715.
2 ist eine Darstellung von pMON18365.
3 ist eine Darstellung von pMON25457.
Ausführliche Beschreibung der Erfindung
Die vorliegende Erfindung kann mit beliebigen Pflanzenspezies verwendet werden. Sie ist besonders gut für einkeimblättrige Spezies geeignet. Zu den besonders bevorzugten Spezies für die praktische Durchführung der vorliegenden Erfindung gehören Weizen, Mais, Reis und Sojabohne.
Die vorliegende Erfindung gibt ein Verfahren zur Herstellung einer fruchtbaren transgenen Pflanze und ein Verfahren zur Transformation von Pflanzenzellen oder -geweben und zur Regeneration der transformierten Zellen oder Gewebe zu einer differenzierten transformierten Pflanze an. Um ein Transformationsverfahren gemäß der vorliegenden Erfindung einzuleiten, ist es zuerst notwendig, genetische Komponenten auszuwählen, die in die Pflanzenzellen oder -gewebe eingesetzt werden sollen. Die genetischen Komponenten können eine beliebige Nucleinsäure umfassen, die unter Verwendung des Verfahrens gemäß der Erfindung in eine Pflanzenzelle oder ein Pflanzengewebe eingeführt wird. Die genetischen Komponenten können Nichtpflanzen-DNA, Pflanzen-DNA oder synthetische DNA umfassen.
In einer bevorzugten Ausführungsform werden die genetischen Komponenten in eine DNA-Zusammensetzung eingebaut, wie ein rekombinantes doppelsträngiges Plasmid- oder Vektormolekül, das wenigstens einen oder mehrere der folgenden Typen von genetischen Komponenten umfasst:

(a) einen Promotor, der in Pflanzenzellen die Funktion hat, die Produktion einer RNA-Sequenz zu bewirken;
(b) eine Struktur-DNA-Sequenz, die die Produktion einer RNA-Sequenz verursacht, welche ein Produkt codiert, das agronomisch nützlich ist;
(c) eine 3'-untranslatierte DNA-Sequenz, die in Pflanzenzellen die Funktion hat, die Addition von polyadenylierten Nucleotiden an das 3'-Ende der RNA-Sequenz zu bewirken.

Der Vektor kann mehrere genetische Komponenten enthalten, um die Transformation der Pflanzenzelle oder des Pflanzengewebes zu erleichtern und die Expression des bzw. der gewünschten Gene zu regulieren.
In einer bevorzugten Ausführungsform sind die genetischen Komponenten so orientiert, dass eine mRNA exprimiert wird, die in einer Ausführungsform zu einem Protein translatiert werden kann. Die Expression einer strukturellen codierenden Pflanzensequenz (eines Gens, einer cDNA, synthetischen DNA oder anderen DNA), die in doppelsträngiger Form vorliegt, beinhaltet die Transcription von Messenger-RNA (mRNA) ausgehend von einem Strang der DNA durch RNA-Polymerase-Enzym und die anschließende Prozessierung des primären Transcripts der mRNA innerhalb des Zellkerns. Diese Prozessierung beinhaltet einen 3'-untranslatierten Bereich, der polyadenylierte Nucleotide an die 3'-Enden der mRNA addiert.
Mittel zur Herstellung von Plasmiden oder Vektoren, die die gewünschten genetischen Komponenten enthalten, sind in der Technik wohlbekannt. Vektoren, die zum Transformieren von Pflanzen verwendet werden, und Verfahren zur Herstellung dieser Vektoren sind in den US-Patenten Nr. 4,971,908, 4,940,835, 4,769,061 und 4,757,011 beschrieben.
Vektoren bestehen typischerweise aus mehreren genetischen Komponenten, zu denen unter anderem regulatorische Elemente, wie Promotoren, Leadersequen zen, Introns und Terminatorsequenzen gehören. Regulatorische Elemente werden auch als cis- oder trans-regulatorische Elemente bezeichnet, je nach der Nähe des Elements zu den Sequenzen oder Genen, die sie steuern.
Die Transcription von DNA zu mRNA wird durch einen DNA-Bereich reguliert, der gewöhnlich als "Promotor" bezeichnet wird. Der Promotorbereich enthält eine Sequenz von Basen, die der RNA-Polymerase signalisiert, sich mit der DNA zu assoziieren und die Transcription zu mRNA einzuleiten, wobei einer der DNA-Stränge als Matrize verwendet wird, um einen entsprechenden komplementären RNA-Strang herzustellen.
In der Literatur wurden mehrere Promotoren beschrieben, die in Pflanzenzellen aktiv sind. Zu diesen Promotoren gehören unter anderem die Promotoren der Nopalin-Synthase (NOS) und der Octopin-Synthase (OCS), die auf tumorinduzierenden Plasmiden von Agrobacterium tumefaciens vorhanden sind, die Caulimovirus-Promotoren, wie der 19S- und der 35S-Promotor des Blumenkohl-Mosaikvirus (CaMV) und der 35S-Promotor des Figwort-Mosaic-Virus (FMV), der verstärkte CaMV35S-Promotor (e35S) und der lichtinduzierbare Promotor von der kleinen Untereinheit der Ribulosebisphosphat-Carboxylase (ssRUBISCO, ein sehr häufiges Pflanzen-Polypeptid). Alle diese Promotoren werden verwendet, um verschiedene Typen von DNA-Konstrukten zu schaffen, die in Pflanzen exprimiert wurden. Siehe zum Beispiel die PCT-Veröffentlichung WO 84/02913.
Promotorhybride können ebenfalls- aufgebaut werden, um die Transcriptionsaktivität zu verstärken (US-Patent Nr. 5,106,739) oder um gewünschte Transcriptionsaktivität, Induzierbarkeit und Gewebe- oder Entwicklungsspezifität miteinander zu kombinieren. Promotoren, die in Pflanzen funktionieren, sind Promotoren, die induzierbar, viral, synthetisch, konstitutiv, wie es beschrieben ist (Poszkowski et al., 1989; Odell et al., 1985), und zeitlich reguliert, räumlich reguliert und raumzeitlich reguliert sind (Chau et al., 1989). Andere Promotoren, die gewebeverstärkt, gewebespezifisch oder entwicklungsreguliert sind, sind ebenfalls in der Technik bekannt und gelten als möglicherweise für die praktische Durchführung dieser Erfindung geeignet.
Promotoren können von einer Vielzahl von Quellen, wie Pflanzen und Pflanzen-DNA-Viren, erhalten werden und umfassen den CaMV35S- und den FMV35S-Promotor sowie Promotoren, die aus Pflanzengenen, wie ssRUBISCO-Genen, isoliert wurden. Wie unten beschrieben ist, sollte der besondere ausgewählte Promotor vorzugsweise in der Lage sein, eine ausreichende Expression zu bewirken, die zur Produktion einer wirksamen Menge des interessierenden Genprodukts führt.
Die in den DNA-Konstrukten (d.h. chimären/rekombinanten Pflanzengenen) der vorliegenden Erfindung verwendeten Promotoren können gegebenenfalls modifiziert werden, um ihre Regulierungseigenschaften zu beeinflussen. Promotoren können mittels Ligierung mit Operatorbereichen oder statistischer oder gezielter Mutagenese gewonnen werden. Weiterhin können die Promotoren so verändert werden, dass sie mehrere "Enhancer-Sequenzen" enthalten, die die Verstärkung der Genexpression unterstützen. Beispiele für solche Enhancer-Sequenzen wurden von Kay et al. (1987) beschrieben.
Die durch ein DNA-Konstrukt der vorliegenden Erfindung produzierte mRNA kann auch eine 5'-untranslatierte Leadersequenz enthalten. Diese Sequenz kann von dem Promotor abgeleitet sein, der ausgewählt wurde, um das Gen zu exprimieren, und kann spezifisch so modifiziert sein, dass die Translation der mRNA verstärkt wird. Die 5'-untranslatierten Bereiche können auch von viralen RNAs, von geeigneten eukaryontischen Genen oder von einer synthetischen Gensequenz erhalten werden. Solche "Enhancer"-Sequenzen können wünschenswert sein, um die Translationseffizienz der resultierenden mRNA zu erhöhen oder zu verändern. Die vorliegende Erfindung ist nicht auf Konstrukte beschränkt, bei denen der untranslatierte Bereich von der 5'-untranslatierten Sequenz, die die Promotorsequenz begleitet, abgeleitet ist, sondern die untranslatierte Leadersequenz kann auch von nicht verwandten Promotoren oder Genen abgeleitet sein (siehe zum Beispiel US-Patent 5,362,865). Andere genetische Komponenten, die dazu dienen, die Expression zu verstärken oder die Transcription oder Translation eines Gens zu beeinflussen, werden ebenfalls als genetische Komponenten ins Auge gefasst.
Der 3'-untranslatierte Bereich der chimärischen Konstrukte sollte einen Transcriptionsterminator oder ein Element mit einer äquivalenten Funktion sowie ein Polyadenylierungssignal enthalten, das in Pflanzen die Funktion hat, die Addition von polyadenylierten Nucleotiden an das 3'-Ende der RNA zu bewirken. Beispiele für geeignete 3'-Bereiche sind (1) die 3'-transcribierten, untranslatierten Bereiche, die das Polyadenylierungssignal von tumorinduzierenden (Ti) Agrobacterium-Plasmidgenen, wie des Gens von Nopalin-Synthase (NOS), enthalten, und (2) Pflanzengene, wie die Soja-Speicherprotein-Gene und die kleine Untereinheit des Gens der Ribulose-1,5-bisphosphat-Carboxylase (ssRUBISCO). Ein Beispiel für einen bevorzugten 3'-Bereich ist der 3'-Bereich vom ssRUBISCO-E9-Gen der Erbse (Europäische Patentanmeldung 385,962).
Typischerweise dienen DNA-Sequenzen, die sich einige hundert Basenpaare stromabwärts der Polyadenylierungsstelle befinden, zum Terminieren der Transcription. Die DNA-Sequenzen werden hier als Transcriptionsterminationsbereiche bezeichnet. Die Bereiche sind für eine effiziente Polyadenylierung der transcribierten Messenger-RNA (mRNA) erforderlich und sind als 3'-untranslatierte Bereiche bekannt. RNA-Polymerase transcribiert eine codierende DNA-Sequenz über eine Stelle hinweg, an der die Polyadenylierung erfolgt.
In einer bevorzugten Ausführungsform enthält der Vektor ein selektierbares, screeningfähiges oder bewertbares Marker-Gen. Diese genetischen Komponenten werden hier auch als funktionelle genetische Komponenten bezeichnet, da sie ein Produkt, das eine Funktion bei der Identifizierung einer transformierten Pflanze erfüllt, oder ein Produkt mit gewünschtem Nutzen produzieren. Die DNA, die als Selektionsvorrichtung dient, hat in einem regenerierbaren Pflanzengewebe die Funktion, eine Verbindung zu produzieren, die dem Pflanzengewebe eine Resistenz gegen eine ansonsten toxische Verbindung verleiht. Zu den interessierenden Genen zur Verwendung als selektierbarer, screeningfähiger oder bewertbarer Marker gehören unter anderem β-Glucuronidase (GUS), grünes fluoreszentes Protein (GFP), Luciferase (LUX), Antibiotikum- oder Herbizid-Toleranz-Gene. Beispiele für Transposons und assoziierte Antibiotikum-Resistenz-Gene sind die Transposons Tns (bla), Tn5 (nptII), Tn7 (dhfr), Penicilline, Kanamycin (und Neomycin, G418, Bleomycin), Methotrexat (und Trimethoprim), Chloramphenicol und Tetracyclin.
Merkmale, die für selektierbare Marker in Pflanzen nützlich sind, wurden in einem Bericht über die Verwendung von Mikroorganismen skizziert (Advisory Committee on Novel Foods and Processes, Juli 1994). Dazu gehören:

i) eine strenge Selektion mit einer minimalen Zahl von untransformierten Geweben;
ii) eine große Zahl von unabhängigen Transformationsereignissen ohne wesentliche Störung der Regeneration;
iii) Anwendung auf eine große Zahl von Spezies; und
iv) Verfügbarkeit eines Assays, um die Gewebe in Bezug auf die Anwesenheit des Markers zu bewerten.

Wie erwähnt, genügen mehrere Antibiotika-Resistenz-Marker diesen Kriterien, einschließlich solcher für Resistenz gegen Kanamycin (nptII), Hygromycin B (aphIV) und Gentamicin (aac3 und aacC4).
In der Technik sind mehrere selektierbare Markergene bekannt. Zu den besonders bevorzugten selektierbaren Markergenen zur Verwendung in der vorliegenden Erfindung gehören Gene, die Resistenz gegen Verbindungen, wie Antibiotika, zum Beispiel Kanamycin (Dekeyser et al., 1989), und Herbizide, zum Beispiel Glyphosat (Della-Cioppa et al., 1987), verleihen. Weitere Selektionsvorrichtungen können ebenfalls implementiert sein.
Die vorliegende Erfindung kann mit jedem geeigneten Pflanzentransformationsplasmid oder -vektor verwendet werden, das bzw. der einen selektierbaren oder screeningfähigen Marker sowie assoziierte regulatorische Elemente, wie sie oben beschrieben sind, zusammen mit einer oder mehreren Nucleinsäuren, die in ausreichender Weise exprimiert werden, so dass sie eine besondere wün schenswerte Eigenschaft verleihen, enthält. Beispiele für geeignete interessierende Strukturgene, die von der vorliegenden Erfindung ins Auge gefasst werden, sind unter anderem Gene für Insekten- oder Schädlingstoleranz, Herbizidtoleranz, Gene für Qualitätsverbesserungen, wie Ertrag, Nährwertsteigerungen, Umwelt- oder Belastungstoleranz oder irgendwelche wünschenswerten Veränderungen der Pflanzenphysiologie, des Wachstums, der Entwicklung, der Morphologie oder des bzw. der Pflanzenprodukte.
Alternativ dazu können die DNA-codierenden Sequenzen diese Phänotypen beeinflussen, indem sie ein nichttranslatierbares RNA-Molekül codieren, das die gezielte Hemmung der Expression eines endogenen Gens bewirkt, zum Beispiel über Antisense- oder Cosuppressions-vermittelte Mechanismen (siehe zum Beispiel Bird et al., 1991). Die RNA könnte auch ein katalytisches RNA-Molekül (d.h. ein Ribozym) sein, das so gestaltet ist, dass es ein gewünschtes endogenes mRNA-Produkt spaltet (siehe zum Beispiel Gibson und Shillitoe, 1997). Somit ist jedes Gen, das ein Protein oder mRNA produziert, das bzw. die eine interessierende Änderung des Phänotyps oder der Morphologie exprimiert, für die praktische Durchführung der vorliegenden Erfindung geeignet.
Beispielhafte Nucleinsäuren, die durch die Verfahren der vorliegenden Erfindung eingeführt werden können, sind zum Beispiel DNA-Sequenzen oder Gene von einer anderen Spezies oder auch Gene oder Sequenzen, die aus derselben Spezies stammen oder dort vorhanden sind, aber durch gentechnische Verfahren und nicht durch klassische Reproduktions- oder Zuchttechniken in Empfängerzellen eingebaut werden. Der Ausdruck "exogen" soll sich auch auf Gene, die normalerweise nicht in der Zelle, die transformiert wird, vorhanden sind, oder auf Gene, die nicht in der Form, Struktur usw., wie man sie in dem transformierenden DNA-Segment findet, vorhanden sind, oder auf Gene, die normalerweise vorhanden sind, für die jedoch eine andere Expression wünschenswert ist, beziehen. Der Ausdruck "exogenes" Gen oder "exogene" DNA soll sich auf irgendein Gen oder DNA-Segment beziehen, das in eine Empfängerzelle eingeführt wird, unabhängig davon, ob ein ähnliches Gen vielleicht schon in einer solchen Zelle vorhanden ist. Zu dem DNA-Typ, der in der exogenen DNA vorhanden ist, kann DNA, die bereits in der Pflanzenzelle vorhanden ist, DNA von einer anderen Pflanze, DNA von einem anderen Organismus oder extern erzeugte DNA, wie eine DNA-Sequenz, die eine Antisense-Message eines Gens enthält, oder eine DNA-Sequenz, die eine synthetische oder modifizierte Version eines Gens codiert, gehören.
Im Lichte dieser Offenbarung werden dem Fachmann zahlreiche andere mögliche selektierbare oder screeningfähige Marker-Gene, regulatorische Elemente und andere interessierende Sequenzen einfallen. Daher soll die obige Diskussion beispielhaft und nicht umfassend sein.
Nach der Konstruktion des Pflanzentransformationsvektors oder -konstrukts wird das Nucleinsäuremolekül, das in vitro als DNA-Zusammensetzung hergestellt wird, in einen geeigneten Wirt, wie E. coli, eingeführt und durch Paarung in einen anderen geeigneten Wirt, wie Agrobacterium, eingeführt oder direkt durch Transformation in kompetentes Agrobacterium eingeführt. Diese Techniken sind dem Fachmann wohlbekannt und wurden für mehrere Pflanzensysteme einschließlich Sojabohne, Baumwolle und Weizen beschrieben (siehe zum Beispiel US-Patente Nr. 5,569,834 und 5,159,135 sowie WO 97/48814).
Die vorliegende Erfindung umfasst die Verwendung von Bakterienstämmen zur Einführung von einer oder mehreren genetischen Komponenten in Pflanzen. Der Fachmann wird die Eignung von Agrobacterium-vermittelten Transformationsverfahren erkennen. Zu den bevorzugten Stämmen gehören unter anderem der Agrobacterium-tumefaciens-Stamm C58, ein Nopalin-Stamm, der verwendet wird, um die Übertragung von DNA in eine Pflanzenzelle zu vermitteln, Octopin-Stämme, wie LBAQ4404, oder Agropin-Stämme, z.B. EHA101, EHA105 oder EHA109. Die Verwendung dieser Stämme für die Pflanzentransformation wurde beschrieben, und die Verfahren sind dem Fachmann geläufig.
Die vorliegende Erfindung kann mit jeder regenerierbaren Zelle oder jedem regenerierbaren Gewebe verwendet werden. Der Fachmann erkennt, dass sich "regenerierbares Pflanzengewebe" allgemein auf Gewebe bezieht, aus dem nach der Insertion von exogener DNA und geeigneten Kulturbedingungen eine differenzierte Pflanze entstehen kann. Solches Gewebe kann unter anderem Kallusgewebe, Hypokotylgewebe, Keimblätter, Wurzeln und Blätter umfassen. Zum Beispiel können regenerierbare Gewebe Kalli oder Embryoide von Staubbeuteln (Zhou und Konzak, 1989), Mikrosporen (Ziauddin et al., 1992), Blütenständen (Barcelo et al., 1994) und Blattgeweben (Conger et al., 1987) umfassen. Bei Weizen können zum Beispiel unreife Embryonen aus Weizenährchen isoliert werden. Andere Gewebe gelten ebenfalls als möglicherweise für die praktische Durchführung der vorliegenden Erfindung geeignet.
In einer Ausführungsform der vorliegenden Erfindung wird embryogenes Kallusgewebe als Ausgangsexplantatsmaterial verwendet. Embryogene Kalli werden aus unreifen Embryonen produziert. Diese Kalli können produziert werden, indem man unreife Embryonen isoliert und aus einem Nährmedium kultiviert, das Kohlenhydrate und Pflanzenwachstumsregulatoren enthält.
Embryogenes Kallus- oder anderes Zielgewebe für die Transformation einer bestimmten Kulturpflanze kann nach mehreren, dem Fachmann bekannten Verfahren isoliert werden. Zum Beispiel beschreibt WO 97/48814 die Isolierung von unreifen Weizenembryonen und von embryogenem Weizenkallus. Die Isolierung von unreifen Weizenembryonen wird auch von Weeks et al. (1993) und Vasil et al. (1993) beschrieben.
Ähnlich können auch unreife Maisembryonen auf einem geeigneten Kulturmedium vorkultiviert und für die Impfung mit Agrobacterium verwendet werden. Bei Sojabohnen können zum Beispiel Suspensionszellkulturen aus Blattgewebe entwickelt und vor der Impfung mit Agrobacterium längere Zeit aufrechterhalten werden. Hypokotylabschnitte werden ebenfalls als Explantate für Sojabohne ins Auge gefasst und können aus gekeimten Sämlingen hergestellt werden, wie dem Fachmann bekannt ist.
Eine weitere Ausführungsform der vorliegenden Erfindung besteht darin, vorkultivierte Zellen oder Gewebe als Ausgangsmaterial zu verwenden. Der hier verwendete Ausdruck "vorkultiviert" bedeutet das Kultivieren der Zellen oder Gewebe in einem geeigneten Medium, das das Wachstum von Pflanzengewebe ermöglicht, vor der Impfung mit Agrobacterium. Die Vorkultur der regenerierbaren Zellen oder des regenerierbaren Gewebes vor der Impfung mit Agrobacterium kann längere Zeit erfolgen, zum Beispiel sieben Tage oder länger. Besonders bevorzugt beträgt die Vorkulturzeit sechs Tage oder weniger. Ganz besonders bevorzugt ist die Vorkulturzeit eine kürzere Zeitspanne, wie etwa eine Stunde bis vier Tage. Am meisten bevorzugt beträgt die Vorkulturzeit etwa einen bis drei Tage. Beispiele für geeignete Medien für die Vorkultur sind unter anderem Medien auf MS-Basis (Murashige und Skoog, 1962) oder Medien auf N6-Basis (Chu et al., 1978), die mit zusätzlichen Nährstoffen und/oder Pflanzenwachstumsregulatoren einschließlich unter anderem Pichloram und 2,4-D ergänzt sind (siehe Tabelle 2). Der Fachmann ist mit der Vielzahl von Gewebekulturmedien vertraut, die bei geeigneter Ergänzung das Wachstum und die Entwicklung von Pflanzengewebe ermöglichen. Diese Gewebekulturmedien können entweder als kommerzielles Präparat erworben oder vom Fachmann bedarfsgerecht hergestellt und modifiziert werden. Beispiele für solche Medien sind unter anderem Gamborg-Medien (Gamborg et al., 1968), McCown-Holzpflanzenmedien (McCown und Lloyd, 1981), Medien nach Nitsch und Nitsch (Nitsch und Nitsch, 1969) und Medien nach Schenk und Hildebrandt (Schenk und Hildebrandt, 1972), die entsprechend ergänzt sind. Der Fachmann ist sich darüber im Klaren, dass Medien und Medienergänzungen, wie Nährstoffe und Wachstumsregulatoren, zur Verwendung bei der Transformation und Regeneration gewöhnlich für die bestimmte interessierende Zielkulturpflanze optimiert sind.
Sobald das regenerierte Pflanzengewebe isoliert ist, besteht der nächste Schritt des Verfahrens darin, die genetischen Komponenten in das Pflanzengewebe einzuführen. Dieser Vorgang wird hier auch als "Transformation" bezeichnet. Die Pflanzenzellen werden transformiert, und jede unabhängig transformierte Pflanzenzelle wird selektiert. Die unabhängigen Transformanten werden als Pflanzenzelllinien bezeichnet. Mehrere Verfahren wurden beschrieben und können verwendet werden, um genetische Komponenten in regenerierbares Pflanzengewebe einzusetzen.
Verfahren zum Transformieren von Zweikeimblättrigen, primär durch Verwendung von Agrobacterium tumefaciens, und die Gewinnung von transgenen Pflanzen wurden für mehrere Kulturpflanzen veröffentlicht, einschließlich Baumwolle (US-Patent Nr. 5,004,863, US-Patent Nr. 5,159,135, US-Patent Nr. 5,518,908, WO 97/43430), Sojabohne (US-Patent Nr. 5,569,834, US-Patent Nr. 5,416,011, McCabe et al., 1988, Christou et al., 1988), Brassica (US-Patent Nr. 5,463,174) und Erdnuss (Cheng et al., 1996; De Kathen und Jacobsen, 1990).
Die Transformation von Einkeimblättrigen mit Hilfe von Elektroporation, Teilchenbeschuss und Agrobacterium wurde ebenfalls beschrieben. Transformation und Pflanzenregeneration wurden erreicht bei Spargel (Bytebier et al., 1987), Gerste (Wan und Lemaux, 1994), Mais (Rhodes et al., 1988; Ishida et al., 1996; Gordon-Kamm et al., 1990, Fromm et al., 1990, Koziel et al., 1993, Armstrong et al., 1995), Hafer (Somers et al., 1992), Reis (Toriyama et al., 1988, Zhang und Wu, 1988; Zhang et al., 1988; Battraw und Hall, 1992, Christou et al., 1991, Park et al., 1996), Zuckerrohr (Bower und Birch, 1992), Rohrschwinge) (Wang et al., 1992) und Weizen (Vasil et al., 1992, Weeks et al., 1993).
In der vorliegenden Erfindung wird Agrobacterium-vermittelte Transformation verwendet. Ein Vorteil der vorliegenden Erfindung besteht darin, dass bei den Experimenten in dieser Erfindung gewöhnliche binäre Vektoren verwendet werden können. In allen getesteten Pflanzensystemen wurde eine Transformation erreicht. Die Tatsache, dass ein binärer Supervektor möglicherweise nicht notwendig ist, bringt zusätzlichen Nutzen, da sich gezeigt hat, dass binäre Supervektoren in einem anderen beschriebenen Maissystem wesentlich sind, um eine hohe Transformation zu erreichen (Ishida et al., 1996).
Regenerierbares Gewebe wird mit Agrobacterium geimpft, und das geimpfte Explantat wurde so behandelt, dass das Gewicht des Explantats während der Cokulturzeit reduziert wurde. Die Behandlung von regenerierbaren Zellen oder Geweben nach der Impfung mit Agrobacterium umfasst jedes Verfahren, das das Gewicht des geimpften Explantats reduziert und den DNA-Übertragungsvorgang erleichtert.
In einer besonders bevorzugten Ausführungsform der Erfindung werden Bedingungen beschränkter oder reduzierter Feuchtigkeit verwendet, um das Gewicht des Explantats nach der Impfung mit Agrobacterium zu reduzieren. Mögliche Verfahren, um das Gewicht des Explantats während der Cokultur zu reduzieren, könnten unter anderem folgende umfassen: das Einschränken der exogenen Feuchtigkeit, die auf das Explantat einwirkt, während der Cokultur; das Reduzieren des Gewichts des Explantats durch Anlegen eines Vakuums während der Cokultur; das Erhöhen des osmotischen Potentials der Medien, zum Beispiel durch Verwendung von Mannit, Sorbit, Raffinose oder Polyethylenglycol oder Kombinationen davon; das Trocknen des Explantats an der Luft, um das Gewicht des Explantats durch Verdunstung oder angewendete Luft zu reduzieren; oder chemische Mittel zum Extrahieren von Feuchtigkeit aus dem Explantat während der Cokultur, indem man das Explantat zum Beispiel in eine austrocknende Umgebung bringt. Beispiele für geeignete Trocknungsmittel sind Calciumoxid oder Schwefelsäure.
Ein bevorzugtes Verfahren zum Reduzieren des Gewichts des mit Agrobacterium geimpften Explantats besteht darin, die Feuchtigkeitszufuhr zu dem Explantat während der Cokultur zu beschränken. Der hier verwendete Ausdruck "Cokultur" bedeutet die Zeit von dem Zeitpunkt, wenn das Explantat mit der Agrobacterium-Kultur geimpft wird, bis zu dem Zeitpunkt, in dem das Wachstum von Agrobacterium durch die Zugabe von Verbindungen oder durch Verfahren, die das Wachstum von Agrobacterium hemmen, unterdrückt wird. Das mit Agrobacterium geimpfte Explantat wird in ein Gewebekulturgefäß, wie eine Petri-Schale, gegeben, das keine Medien enthält, die ein Geliermittel enthalten. In einer Ausführungsform wird das Explantat auf ein geeignetes Blotting-Material gelegt, einschließlich unter anderem Filterpapier, das in die Petri-Schale gelegt wird.
Der Agrobacterium-Stamm, der das interessierende Plasmid oder den interessierenden Vektor beherbergt, wird auf einem geeigneten Kulturmedium kultiviert, wie Luria-Burtani-Medium (LB), das mit selektiven Antibiotika für den Stamm und den Vektor ergänzt ist. Der Fachmann ist mit Verfahren zum Wachsenlassen und geeigneten Kulturbedingungen für Agrobacterium sowie den anschließenden Impfverfahren vertraut. Die Dichte der für die Impfung verwendeten Agrobacterium-Kultur und das Verhältnis von Agrobacterium-Zellen zu Explantat können von einem System zum nächsten variieren, und daher wird eine Optimierung dieser Parameter für jedes Transformationsverfahren erwartet. Typischerweise wird eine Agrobacterium-Kultur ausgehend von einer Ausstrichplatte oder Glycerin-Stammlösung für die Impfung verwendet und über Nacht gezüchtet, und die Bakterienzellen werden gewaschen und in einem für die Impfung des Explantats geeigneten Kulturmedium resuspendiert. Zu den geeigneten Impfmedien für die vorliegende Erfindung gehören unter anderem 1/10-MS-Salze in CM4C-Medien (Tabelle 2) oder ein modifiziertes CM4C-Kulturmedium mit einer reduzierten Salzkonzentration. In einigen Fällen kann auch ein Tensid, einschließlich unter anderem Silwet (L77) (Wites, Hudson, Ohio) oder Pluronic F68 (Sigma, St. Louis, MO), in einer niedrigen Konzentration zu dem Impfmedium gegeben werden. Die Explantate werden mit der gewaschenen und resuspendierten Agrobacterium-Zellsuspension inkubiert. Die Impfung wird im Allgemeinen bei einer Temperatur von etwa 20 °C bis 28 °C, vorzugsweise etwa 23 °C bis 28 °C, während etwa 1 Minute bis etwa 3 Stunden durchgeführt.
Die Menge der hinzugefügten Flüssigkeit, die während der Cokulturzeit mit dem Explantat inkubiert wird, variiert je nach der Größe des Kulturgefäßes, der Größe/dem Gewicht der Ausgangsexplantate und der Zahl der Explantate pro Schale. Die Menge der hinzugefügten Flüssigkeit kann für eine Kulturschale von 60 ×20 mm im Bereich von 0 μl bis 1000 μl, vorzugsweise 0 μl bis 500 μl, liegen. Die Cokulturzeit kann im Bereich von etwa einer Stunde bis etwa einer Woche, vorzugsweise etwa einem Tag bis vier Tagen, besonders bevorzugt etwa einem Tag bis drei Tagen, liegen. Nach der Cokulturzeit wird das Gewicht des mit Agrobacterium geimpften Explantats um nicht mehr als etwa 50% reduziert. Besonders bevorzugt wird das Gewicht des mit Agrobacterium geimpften Explantats um bis zu etwa 40% reduziert. Ganz besonders bevorzugt wird das Gewicht des mit Agrobacterium geimpften Explantats um bis zu etwa 30% reduziert.
Nach der Cokulturzeit werden die mit Agrobacterium geimpften Explantate auf einem geeigneten Medium kultiviert, das ein Mittel enthält, um das Wachstum von Agrobacterium zu hemmen. Die mit Agrobacterium geimpften Explantate werden im Allgemeinen einen bis vierzehn Tage lang, vorzugsweise zwei bis sieben Tage lang, auf einem solchen Medium kultiviert. Der Fachmann kennt die geeigneten Komponenten des Mediums, um das Wachstum von Agrobacterium zu hemmen. Zu diesen Medienkomponenten gehören unter anderem Antibiotika, wie Carbenicillin oder Cefotaxim.
Nach dem Kulturschritt zur Hemmung des Wachstums von Agrobacterium, und vorzugsweise bevor die Explantate auf Selektionsmedien gebracht werden, werden sie auf Effizienz der DNA-Abgabe analysiert, und zwar mit einem vorläufigen Assay, der die Anwesenheit eines auf dem Transformationsvektor enthaltenen Gens nachweist, einschließlich unter anderem eines screeningfähigen Markergens, wie des Gens, das für β-Glucuronidase (GUS) codiert. Die Gesamtzahl der blauen Flecken (die eine GUS-Expression anzeigen) für eine ausgewählte Zahl von Explantaten wird als positive Korrelation der DNA-Übertragungseffizienz verwendet. Sowohl das optimale Ausmaß der Gewichtsreduktion während der Cokultur als auch die Transformationseffizienz werden vorläufig vorhergesagt und anschließend durch die mit hoher Effizienz erfolgende Produktion stabiler Transformanten bestätigt.
In der bevorzugten Ausführungsform werden die Explantate nach der Inkubation auf nichtselektiven Medien, die die Antibiotika enthalten, um das Wachstum von Agrobacterium ohne Selektionsmarker zu hemmen, auf selektiven Wachstumsmedien kultiviert, einschließlich unter anderem eines kallusinduzierenden Mediums, das ein Selektionsmittel enthält. Zu den typischen Selektionsmitteln gehören unter anderem Antibiotika, wie Geneticin (G418), Paromomycin, oder andere Chemikalien, wie Glyphosat. Die Kulturen werden anschließend auf ein Regenerationsmedium übertragen, das für die Produktion von transformierten Pflänzchen geeignet ist. Der Fachmann kennt die zahlreichen Arten von Medien und Übertragungsanforderungen, die für jedes Pflanzensystem für Pflanzentransformation und -regeneration implementiert und optimiert werden können.
Folglich können solche Medien und Kulturbedingungen, die in der vorliegenden Erfindung offenbart sind, mit nährwertäquivalenten Komponenten oder ähnlichen Verfahren für die Selektion und Regeneration modifiziert oder substituiert werden und immer noch in den Umfang der vorliegenden Erfindung fallen.
Die produzierten Transformanten werden anschließend analysiert, um die Anwesenheit oder Abwesenheit einer bestimmten interessierenden Nucleinsäure, die auf dem Transformationsvektor enthalten ist, zu bestimmen. Die molekularen Analysen können unter anderem Analysen durch Southern-Blots (Southern, 1975) oder PCR (Polymerase-Kettenreaktion) umfassen. Diese und weitere wohlbekannte Verfahren können durchgeführt werden, um die Stabilität der mit den offenbarten Verfahren hergestellten transformierten Pflanzen zu bestätigen. Diese Verfahren sind dem Fachmann wohlbekannt und wurden beschrieben (siehe zum Beispiel Sambrook et al., 1989).
Der Fachmann wird die vielen Vorteile der von der vorliegenden Erfindung vorgesehenen Verfahren und Zusammensetzungen würdigen. Die folgenden Beispiele sind mit aufgeführt, um die bevorzugten Ausführungsformen der Erfindung aufzuzeigen. Der Fachmann sollte sich darüber im Klaren sein, dass die in den Beispielen offenbarten Techniken Techniken darstellen, von denen die Erfinder herausgefunden haben, dass sie bei der praktischen Durchführung der Erfindung gut funktionieren, und die daher als bevorzugte Methoden für ihre praktische Durchführung gelten können.
Beispiele
Beispiel 1. Konstruktion des Plasmidvektors
Plasmidvektoren wurden unter Verwendung von Standardtechniken der Molekularbiologie konstruiert, die dem Fachmann bekannt sind. Mehrere Vektoren für die Agrobacterium-vermittelte Pflanzentransformation wurden beschrieben (Klee und Rogers, 1989). Kurz gesagt, die hier beschriebenen Pflanzentransformationsvektoren umfassen eine oder mehrere Nucleinsäuresequenzen einschließlich unter anderem einer oder mehrerer T-DNA-Border-Sequenzen, um die Übertragung von Nucleinsäuremolekülen in das Pflanzengenom zu fördern, Replikationselementen, eines selektierbaren Markers und eines oder mehrerer interessierender Gene. pMON25457 (3) enthält auch ein Intron des Mais-Hitzeschockproteins (hsp70), das sich stromaufwärts des bzw. der codierenden Bereiche befindet. pMON15715 (1) und pMON18365 (2) enthalten ein Intron von Solanum tuberosum (ST-LS1*INT). Die grundlegenden Merkmale der in den Beispielen verwendeten Vektoren sind in Tabelle 1 zusammengefasst und sind wie folgt aufgeführt: Promotor/codierende Sequenz/3'-untranslatierter Bereich.
Die Abkürzungen in der Tabelle werden wie folgt beschrieben: FMV ist der Promotor aus dem Figwort-Mosaic-Virus (US-Patent Nr. 5,378,619); der e35S-Promotor ist eine Modifikation des 35S-Promotors, der von der 35S-RNA des Blumenkohl-Mosaikvirus (CaMV) abgeleitet ist und der eine Verdoppelung des Bereichs von –90 bis –300 enthält; der nos-Promotor stammt von Agrobacterium tumefaciens pTiT37. Das GUS-Gen ist die β-Glucuronidase-codierende Sequenz von E. coli; das nptII-Gen codiert für Neomycin-Phosphotransferase; der nos-3'-Bereich enthält eine stromabwärts liegende untranslatierte Sequenz sowie das Poly-A-Signal für das NOS-Gen von Agrobacterium tumefaciens pTiT37. Mehrere Glyphosattoleranz-Konstrukte wurden ebenfalls getestet, wobei das CP4-Gen als interessierendes Gen zusammen mit assoziierten regulatorischen Elementen verwendet wurde. Tabelle 1. Plasmidvektoren

Plasmid Genetische Elemente

pMON15715 pFMV-GUS-E93'/pnos-nptII-nos3'

pMON18365 pe35S-nptII-nos3'Ipe35S-GUS-nos3'

pMON25457 pE35S-GUS-nos3'fpe35S-nptII-nos3"
Beispiel 2. Transformation unter Verwendung von vorkultivierten unreifen Embryonen (PCIEs) von Weizen
1. Explantatherstellung
Unreife Embryonen von Weizen (Triticum aestivum L.) der Sorte Bobwhite wurden 13–15 Tage nach der Bestäubung aus der unreifen Kornfrucht (Weizenährchen) isoliert und 1–6 Tage lang auf CM4C kultiviert (Tabelle 2). Die Embryonen ohne embryogenen Kallus wurden für die Impfung mit Agrobacterium ausgewählt. Tabelle 2. Ergänzende Komponenten in Grundmedien¹

¹ Alle Medien enthalten Grundsalze (MS-Grundsalze) und -vitamine (MS-Vitamine) von Murashige und Skoog (1962). Der pH-Wert in jedem Medium wurde auf 5,8 eingestellt.
² Sterilfiltriert und nach dem Autoklavieren zu dem Medium gegeben.
³ PHYTAGEL (P) (PHYTAGEL ist ein eingetragenes Warenzeichen der Sigma Chemical Co., St. Louis, MO) oder GELRITE (G) (GELRITE ist von Schweizerhall, Inc., South Plainfield, NJ, erhältlich) (GELRITE ist ein eingetragenes Warenzeichen der Monsanto Company, St. Louis, MO).

2. Agrobacterium-Kultur und Impfung
Für alle Experimente wurde ein unschädlich gemachter (disarmed) Agrobacterium-Stamm C58 (ABI), der einen binären Vektor beherbergt, verwendet. Kulturen von Agrobacterium wurden aus Glycerin-Stammlösungen oder aus einer frisch hergestellten Ausstrichplatte angesetzt und über Nacht bei 26 °C bis 28 °C unter Schütteln (ungefähr 150 U/min) bis zur Mitte der logarithmischen Phase (etwa OD₆₆₀ = 1–1,5) in flüssigem LB-Medium, pH 7,0 (Miller, 1972), das 50 mg/l Kanamycin, 50 mg/l Streptomycin und Spectinomycin sowie 25 mg/l Chloramphenicol mit 200 μM Acetosyringon (AS) enthielt, kultiviert. Die Agrobacterium-Zellen wurden im Impfmedium resuspendiert, und die Dichte wurde auf ein OD₆₆₀ von 1 eingestellt. Die in CM4C-Medium kultivierten unreifen Embryonen wurden in sterile Petri-Schalen (16 × 20 mm) oder Näpfe einer 6-Napf-Zellkulturplatte (Costar Corporation, Cambridge, MA) übertragen, die 10 ml Impfmedium pro Petri-Schale oder 5 ml pro Zellkulturhaufenplatte enthielten. Eine gleiche Menge der Agrobacterium-Zellsuspension wurde hinzugefügt, so dass die Endkonzentration der Agrobacterium-Zellen einer OD₆₀₀ von 0,5 entsprach. In den meisten Experimenten wurde Pluronic F68 bis zu einer Endkonzentration von 0,01% zu dem Impfgemisch gegeben. Das Verhältnis zwischen dem Agrobacterium und den unreifen Embryonen (IEs) betrug etwa 10 ml : 20–200 IEs. Die Bedingungen für die Impfung waren Temperaturen von etwa 23 °C bis 26 °C mit einer Dauer von etwa 5–60 Minuten.
3. Cokultur
Nach der Impfzeit wurden die restlichen Agrobacterium-Zellen aus den Explantaten entfernt, wobei man die Vakuumversorgungsleitung verwendete. Ein Stück steriles Filterpapier Whatman Nr. 1 (das zur Größe der Petri-Schale passte) wurde ohne zusätzliches flüssiges oder mit Agar versetztes Medium in jede Petri-Schale von 60 × 15 oder 60 × 20 mm gelegt. In die Mitte des Filterpapiers wurden 200 μl steriles Wasser gegeben. Nach 2–3 Minuten wurden die geimpften unreifen Embryonen in die Schalen gegeben. Gewöhnlich werden 20–50 Explantate als Haufen (etwa 1 cm groß und 60–80 mg/Haufen) gruppiert, wobei sich 4–5 Haufen in jeder Schale befanden. Die Schalen wurden sofort mit Parafilm abgedeckt und dann 2–3 Tage lang im Dunkeln bei 24 °C bis 26 °C cokultiviert.
4. Wirkung von Feuchtigkeit während der Cokultur auf die DNA-Abgabe, das Wachstum von Agrobacterium und das Gewicht der Explantate
Die Effizienz der DNA-Abgabe wurde nach einer Selektionsverzögerung von 2–3 Tagen anhand der transienten GUS-Expression gemessen. Die Wirkung der Feuchtigkeit während der Cokultur auf die DNA-Abgabe wurde mit Hilfe der vorkultivierten Explantate getestet. Wie in Tabelle 3 gezeigt ist, wurde das Gewicht der Explantate um etwa 20–35% reduziert, wenn 300 μl oder weniger Wasser zu den Cokulturschalen gegeben wurde. Es wurde auch eine signifikant höhere transiente GUS-Expression beobachtet. Wenn 400 μl oder mehr Wasser hinzugefügt wurde, wurde das Gewicht der Explantate erhöht, und es wurden weniger GUS-Flecken auf den Explantaten beobachtet. Die transiente GUS-Expression wurde signifikant reduziert, wenn eine kurze Impfzeit (5–30 Minuten) in Kombination mit 500 μl oder mehr Wasser in den Cokulturschalen verwendet wurde. Wenn 300 μl oder weniger Wasser für die Cokultur verwendet wurde, waren die blauen Flecken, die eine GUS-Expression anzeigen, gleichmäßig auf der Oberfläche des Schildchengewebes aller unreifen Embryonen verteilt, insbesondere in dem Bereich, der eine aktive Zellteilung zeigt. Dagegen zeigten nur 30–50% der unreifen Embryonen eine GUS-Expression, wenn während der Cokultur 500 μl oder mehr Wasser hinzugefügt wurde. Tabelle 3. Wirkung von Feuchtigkeit während der Cokultur auf das Wachstum von Agrobacterium, das Gewicht der geimpften PCIEs und die DNA-Abgabe¹

¹ pMON18365 wurde verwendet.
² Jede Schale (Behandlung) enthielt 100 PCIEs.
³ 95 geimpfte PCIEs nach 3 Tagen Cokultur mit Agrobacterium wurden 5 min lang mit 10 ml H₂O gespült, das mit 0,01% L77 ergänzt war, und dann wurden 100 μl entnommen und auf 10 ml H₂O verdünnt. 1 μl von Behandlung 400 und 500 (H₂O/Schale) und 10 μl von den übrigen Behandlungen wurden auf LB plus geeigneten Wirkstoffen ausgestrichen, und die Schalen wurden 3 Tage lang bei 28 °C inkubiert. Die individuellen Kolonien wurden gezählt, und die Zahl wurde auf der Basis von 10 μl verdünnter Lösung eingestellt.
⁴ Fünf Explantate wurden mit einem GUS-Assay analysiert, und die blauen Flecken wurden gezählt.

5. Selektion und Regeneration
Nach 2–3 Tagen auf dem Verzögerungsmedium wurden die unreifen Embryonen auf CM4C übertragen, das mit 25 mg/l G418 und 500 mg/l Carbenicillin ergänzt war. Nach 2–3 Wochen wurden die Embryonen in kleinere Stücke (ca. 2 mm) zerbrochen und für eine Subkultur auf das erste Regenerationsmedium MMS.2C (Tabelle 2) mit 25 mg/l G418 und 250 mg/l Carbenicillin übertragen. Nach der Übertragung auf das Regenerationsmedium wurde jedes Stück Kallus weiter in mehrere kleine Stücke (ca. 2 mm) unterteilt. Zwei Wochen nach der Übertragung wurden junge Schösslinge und lebensfähiges Kallusgewebe auf ein zweites Regenerationsmedium MMSOC (Tabelle 2) mit denselben Konzentrationen an G418 und Carbenicillin übertragen. Größere Stücke von Geweben wurden in kleinere Stücke aufgeteilt, wie es oben beschrieben ist. Pflänzchen, die sich später als echte Transformanten erwiesen, wuchsen auf diesem Medium kräftig und bildeten starke Wurzelsysteme. Die Pflanzen mit starken Wurzelhaaren, mit mehr als zehn kurzen und starken Wurzeln oder sekundären Wurzeln, wurden für weiteres Wachstum und Selektion auf Sundae-Becher (Sweetheart Cup Company, Chicago, IL) übertragen, die das zweite Regenerationsmedium enthielten. Zu diesem Zeitpunkt wurden von einigen der Pflänzchen Blattproben für den histochemischen GUS-Assay genommen. Während der Wachstumszeit in den Sundae-Bechern starben die meisten Nichttransformanten ab oder zeigten Anzeichen einer Empfindlichkeit gegenüber G418. Die Pflanzen, die hochgradig resistent gegen G418 waren und kräftig mit starken Wurzelsystemen wuchsen, wurden auf Erde übertragen, bevor sie bis zum oberen Rand der Sundae-Becher wuchsen. Alle Pflanzen, die von demselben Embryo abstammten, wurden als Geschwister angesehen, die auf dasselbe Ereignis zurückgehen.
6. Transformationseffizienz
Die regenerierten Pflanzen zeigten keine sichtbaren Abnormitäten und waren fruchtbar. Alle Pflanzen wurden mit einem histochemischen GUS-Assay getestet. Viele transgene Ereignisse wurden produziert. Auf insgesamt 1519 Explantate aus 12 getrennten Experimenten wurden 99 transgene Ereignisse produziert, mit einer mittleren Transformationseffizienz von 6,5%. Der Wertebereich der Transformationseffizienz betrug 1,4% bis 19% für die verschiedenen getesteten Parameter, zu denen die Dauer der Impfzeit und die für die Impfung verwendete Agrobacterium-Dichte gehörten.
7. Nachweis und Analyse der transgenen Pflanzen
Die Pflanzen wurden in einer Wachstumskammer mit kontrollierten Umweltbedingungen mit einer sechzehnstündigen Lichtzeit mit 800 molm^–2s^–1, die durch High-Intensity-Discharge(HID)-Sylvania-Leuchten (GTE Products Corp., Manchester, NH) bereitgestellt wurde, wachsen gelassen. Die Tag/Nacht-Temperaturen betrugen 18/16 °C. Es dauerte etwa 2,5 bis 3 Monate von der Impfung bis zur Übertragung der meisten Pflanzen auf Erde, und es wurden keine sichtbaren Abnormitäten beobachtet. Jede Pflanze wurde nach einer oder mehreren der folgenden Verfahren untersucht:

1) Histochemischer kolorimetrischer GUS-Assay (Jefferson, 1987) unter Verwendung von verschiedenen Teilen der Pflanzen.
2) Blattbleichungsassay, wie er bei Cheng et al. (1997) beschrieben ist.
3) Eine Southern-Hybridisierungsanalyse (Southern, 1975) wird ebenfalls durchgeführt. Genomische DNA wird aus Blattgewebe von Testpflanzen isoliert, wobei man dem Fachmann bekannte Standardverfahren verwendet (siehe zum Beispiel das bei Roger und Bendich, 1985, beschriebene Verfahren). Sobald die DNA isoliert ist, können Southern-Analysen durchgeführt werden, wobei man Vorschriften und Verfahren verwendet, die dem Fachmann bekannt sind.

Beispiel 3. Transformation von embryogenem Kallus von Weizen unter Verwendung von NptII-Selektion
1. Explantatherstellung
In der gesamten Studie wurde ein Sommerweizen Triticum aestivum der Sorte Bobwhite verwendet. Die Vorratspflanzen wurden in einer Wachstumskammer mit kontrollierten Umweltbedingungen unter denselben Wachstumsbedingungen, wie sie oben beschrieben sind, wachsen gelassen. Unreife Kornfrüchte (Ährchen) wurden 13–15 Tage nach der Blüte von den Pflanzen abgesammelt. Unreife Embryonen (IEs) wurden aseptisch seziert und 10–30 Tage lang bei 23–25 °C im Dunkeln auf CM4- oder CM4C-Kallusinduktionsmedium (Tabelle 2) kultiviert.
2. Agrobacterium-Kultur
Die Vorschrift für die Kultur und Ernte von Agrobacterium war dieselbe, wie sie in Beispiel 2 beschrieben ist, und es wurde pMON18365 verwendet.
3. Impfung
Die unreifen Embryonen, die 10–30 Tage lang im Kallusinduktionsmedium (CM4 oder CM4C) kultiviert wurden, wurden in eine Agrobacterium-Zellsuspension in Petri-Schalen (25 × 100 mm) übertragen. Das Verhältnis zwischen Agrobacterium und embryogenem Kallusgewebe (EC) betrug etwa 30 ml Agrobacterium 30 EC. Ein Tensid, Silwet (L77) (Witco Corporation, Hudson, OH) oder Pluronic F68 (Sigma, St. Louis, MO), wurde in einer Konzentration von 0,01–0,02% zu dem Impfmedium gegeben. Die Impfung wurde 2–3 Stunden lang im Dunkeln bei 23 °C bis 25 °C durchgeführt.
4. Cokultivierung
Nach der Impfung wurden die zusätzlichen Agrobacterium in der flüssigen Kultur von den Explantaten entfernt, wobei man die Vakuumversorgungsleitung verwendete. Ein Stück steriles Filterpapier Whatman Nr. 1 wurde in jede Petri-Schale von 60 × 20 mm gelegt. In die Mitte des Filterpapiers wurden 50 μl Impfmedium oder steriles Wasser gegeben. Nach ein bis zwei Minuten wurden die geimpften embryogenen Kalli (die von jedem unreifen Embryo abgeleitet waren, der 10–30 Tage lang kultiviert wurde) an den Rand des flüssigen Mediums oder Wassers gelegt. Gewöhnlich wurden etwa 10–12 Explantate in einem Kreis auf das Filterpapier jeder Schale gelegt. Die Schalen wurden mit Parafilm abgedeckt, und die Cokultivierung wurde 3 Tage lang im Dunkeln bei 24 °C bis 25 °C fortschreiten gelassen.
5. Effizienz der DNA-Abgabe
Die Effizienz der DNA-Abgabe wurde nach einer Selektionsverzögerung von 2–3 Tagen anhand der transienten GUS-Expression gemessen. Bei allen Experimenten, bei denen die Feuchtigkeitszufuhr zu dem mit Agrobacterium geimpften Explantat eingeschränkt war, wurde ein höheres Niveau der GUS-Expression beobachtet. Wie in Tabelle 4 gezeigt ist, wurde eine signifikant höhere transiente GUS-Expression beobachtet, wenn 200 μl oder weniger flüssiges Medium zu den Cokulturschalen gegeben wurde. Wenn 400 μl oder mehr Wasser hinzugefügt wurde, waren weniger als 40 GUS-Flecken auf den Explantaten sichtbar. Tabelle 4. Wirkung der Feuchtigkeit während der Cokultur auf die DNA-Abgabe bei Verwendung von 14 Tage lang kultivierten unreifen Embryonen¹

¹ pMON18365 wurde verwendet.
² In diesem Experiment wurden zehn Explantate getestet.

6. Selektion und Regeneration von Pflanzen
Nach 2–5 Tagen auf dem CM4C-Medium (Tabelle 2) wurden die mit Agrobacterium geimpften embryogenen Kalli auf CM4 oder CM4C (Tabelle 2) übertragen, das 25 mg/l G418 und 500 mg/l Carbenicillin enthielt. Jeder embryogene Kallus wurde in 5 oder 6 Stücke aufgetrennt, und jedes Stück wurde als einzelnes Explantat behandelt. Die embryogenen Kalli wurden 2–3 Wochen lang für die Kallusinduktion kultiviert, bevor sie auf die ersten Regenerationsmedien übertragen wurden, und die anschließenden Kulturverfahren sind so, wie es in Beispiel 2 umrissen ist.
7. Nachweis und Analyse der transgenen Pflanzen
Die T₁-Pflanzen wurden so analysiert, wie es in Beispiel 2 beschrieben ist.
8. Transformationseffizienz
Die Zahl der transgenen Ereignisse in jedem Experiment wurde bestimmt, nachdem die Pflanzen getestet wurden, wie es beschrieben ist. Aus 10 getrennten Experimenten wurden 53 positive transgene Ereignisse aus ursprünglich insgesamt 515 Explantaten erhalten. Die Transformationseffizienz lag im Bereich von 3,6% bis 37,7%, mit einem Mittelwert von 10%. Zu den Behandlungsparametern gehörten die Art des Tensids und die Konzentration und Menge des Wassers in der Schale während der Cokulturzeit.
9. Analyse der Nachkommen der transgenen Pflanzen
Die Segregation der GUS- und NPTII-Gene bei den T₁-Nachkommen wurde entweder mit einem histochemischen GUS-Assay am Blattgewebe oder mit einem Paromomycin-Sprühtest an den T₁-Sämlingen analysiert. Die von jeder T₀-Pflanze geernteten T₁-Samen wurden in Töpfe von 5,1 cm (2'') gepflanzt und unter denselben Bedingungen wachsen gelassen wie die zuvor beschriebenen Vorratspflanzen. Pflanzen im Dreiblattstadium wurden mit 2% (w/v) Paromomycin besprüht, das 0,2% Tween^® 20 enthielt (beides erhältlich von Sigma Chemical Co., St. Louis, MO). Eine Woche später wurden die Pflanzen in Bezug auf die Paromomycin-Empfindlichkeit bewertet. Die Pflanzen mit einem funktionierenden NPTII-Gen wurden nicht gebleicht, während Pflanzen ohne ein funktionierendes NPTII-Gen gebleichte Flecken aufwiesen. Dann wurden die Daten mit einem Chi-Quadrat-Test analysiert, um die Zahl der funktionellen GUS- oder NPTII-Genloci zu bestimmen (Tabelle 5). Wenn das Verhältnis von resistenten zu empfindlichen Pflanzen zum Beispiel 3:1 beträgt, ist bei diesem transgenen Ereignis ein einziger funktioneller nptII-Genlocus vorhanden. Wenn das Verhältnis größer als 3:1 ist, ist mehr als ein funktionelles Ereignis vorhanden. Tabelle 5. Segregation der NPTII- und GUS-Gene bei den T₁-Nachkommen von transgenem Weizen¹

¹ Alle Linien sind vom Konstrukt pMON18365 abgeleitet

Beispiel 4. Transformation von Weizen unter Verwendung von Glyphosat-Selektion
1. Explantatherstellung
Die Verfahren für das Wachsenlassen von Vorratspflanzen, die Isolierung von unreifen Embryonen und die Induktionskultur waren dieselben, wie es in Beispiel 2 beschrieben ist. Die Explantate waren entweder 3–6 Tage lang vorkultivierte unreife Embryonen (PCIE) ohne embryogenes Kallusgewebe oder 10–30 Tage lang kultiviertes embryogenes Kallusgewebe.
2. Agrobacterium-Herstellung, Impfung, Cokultur und T-DNA-Abgabe
Die Vorschriften waren dieselben, wie es in den Beispielen 2 und 3 beschrieben ist.
3. Selektion und Regeneration von Pflanzen
Nach einer dreitägigen Cokultur wurden mit Agrobacterium infizierte PCIE und embryogene Kalli auf CM4C-Medium (Tabelle 2), das mit 500 mg/l Carbenicillin ergänzt war, übertragen und etwa sieben Tage lang kultiviert. Die PCIE-Explantate bildeten auf diesem Medium embryogene Kalli. Dann wurden die Explantate auf CM4C-Selektionsmedium mit 2 mM Glyphosat und 500 mg/l Carbenicillin übertragen und eine Woche lang im Dunkeln gehalten. Alle Kalli wurden auf MMS0.2C (Tabelle 2) übertragen, das mit 0,1 mM Glyphosat und 250 mg/l Carbenicillin ergänzt war, und weitere zwei Wochen lang einer Selektion mit Lichtbedingungen von etwa 80 μmol/m²/s (80 μE) unterzogen. Am Ende dieser Kulturzeit bildeten sich grüne Flecken oder Schösslinge. Alle embryogenen Kalli wurden auf das zweite Regenerationsmedium MMSOC (Tabelle 2) übertragen, das mit 500 mg/l Carbenicillin und 0,02 mM Glyphosat ergänzt war. Aromatische Aminosäuren einschließlich L-Tryptophan und L-Phenylalanin (10^–7 mM/Aminosäure) wurden zu diesem Medium gegeben, um die Selektion zu erleichtern. Diese Gewebe wurden alle zwei Wochen auf frische Medien übertragen. Zu jedem Zeitpunkt während der Kulturzeit konnten Pflänzchen mit länglichen Meristemen und Wurzeln aus embryogenem Kallusgewebe regeneriert werden. Sobald das Wurzelsystem etabliert war, wurden die Pflanzen auf Erde übertragen und anschließend getestet. Alle Pflanzen, die von demselben PCIE oder Kallus abstammten, wurden als Geschwister angesehen, die auf dasselbe Ereignis zurückgehen.
4. Bestätigung der transgenen Natur der Pflanzen
Transgene Pflanzen überlebten die Glyphosat-Selektion und wurden in der Wachstumskammer unter denselben Umweltbedingungen wachsen gelassen, wie sie in Beispiel 2 beschrieben sind. Transgene Pflanzen wurden gewöhnlich entweder durch Glyphosat-Selektion (alle Pflanzen, die die Glyphosat-Selektion überlebten, wurden als Transformanten angesehen) oder durch Southern-Hybridisierung (Southern, 1975) untersucht.
5. Transformationseffizienz
Glyphosattolerante transgene Pflanzen wurden ebenfalls unter Verwendung des Agrobacterium-Transformationsverfahrens der vorliegenden Erfindung hergestellt. Sowohl 10–14 Tage altes Kallusgewebe als auch 3–6 Tage lang vorkultivierte unreife Embryonen wurden als Explantate verwendet. Alle mutmaßlichen transgenen Pflanzen wurden durch die beschriebenen Assayverfahren als positiv bestätigt. Die mittlere Transformationseffizienz aus 12 Experimenten betrug 4,6% (insgesamt 2844 Explantate führten zu 131 transgenen Ereignissen). Der Wertebereich der Transformationseffizienz war 3,3% bis 6,7%.
6. Analyse der Nachkommen der transgenen Pflanzen
Die Segregation von CP4- und GUS-Genen in der T₁-Generation wurde entweder mit einem histochemischen GUS-Assay am Blattgewebe und Wurzelgewebe oder mit einem Roundup^®-Sprühtest mit 64–128 ounces/acre im Drei- bis Sechsblattstadium getestet. Die Daten wurden mit einem Chi-Quadrat-Test analysiert, um die Zahl der funktionellen CP4- und GUS-Genloci zu bestimmen. 21 Linien wurden analysiert (17 CP4, 4 GUS). Von den CP4-Linien wiesen die Nachkommen von 11 Linien ein Segregationsverhältnis von 3:1 (resistent:empfindlich) auf, 5 Linien wiesen ein Verhältnis von 15:1 auf, und 1 Linie wies ein Verhältnis von 1:1 auf. Von den GUS-Linien wiesen die Nachkommen von 4 Linien ein Verhältnis von 3:1 (positiv:negativ) auf, 2 Linien wiesen ein Verhältnis von 1:1 auf, und 1 Linie wies ein Verhältnis von 15:1 auf. Insgesamt wurden über 500 Nachkommen analysiert.
Beispiel 5. Transformation von embryogenen Kalli von Mais
1. Explantatherstellung
Unreife Embryonen von Mais (Zea mays L.), Dreifachkreuzung (Pa91 × H99) × A188 und die Inzuchtlinie H99 (1 bis 1,5 mm Länge) wurden 14 Tage lang bei 27 °C im Dunkeln in Medium D (Duncan et al., 1985) kultiviert, das mit 1,5 mg/l 2,4-D ergänzt war (Medium D-1,5D).
2. Agrobacterium-Herstellung, Impfung und Cokultur
Für die Maistransformation wurde der unschädlich gemachte (disarmed) Agrobacterium-Stamm EHA101 (Hood et al., 1986), der den Vektor pMON25457 beherbergt, verwendet. Kulturen von Agrobacterium wurden angesetzt, gezüchtet und geerntet, wie es in Beispiel 2 beschrieben ist; die Zellen wurden jedoch mit anderen Antibiotika (100 mg/l Gentamicin und Kanamycin) selektiert. Die Zelldichte wurde für die Impfung auf eine OD₆₆₀ von 0,5 bis 1,0 eingestellt. Embryogene Kalli (14 Tage, vorkultiviert) wurden 3 Stunden lang bei 23 °C bis 25 °C im Dunkeln mit der Agrobacterium-Zellsuspension getränkt. Gewöhnlich wurde 0,01% Silwet (L77) in dem Impfungsgemisch mitverwendet. Nach der Impfung wurden Agrobacterium-Zellen aus den Impfschalen entnommen, wie es beschrieben ist, und die Explantate wurden cokultiviert, wie es in den Beispielen 2 und 3 beschrieben ist. Gewöhnlich wurden 50–300 μl Wasser zu jeder Cokulturschale gegeben. Behandlungen mit 500 μl oder mehr Wasser, das zu den Cokulturschalen gegeben wird, wurden als Kontrollen verwendet.
3. Regeneration von Pflanzen und Identifizierung der transgenen Pflanzen
Nach 3 Tagen auf dem Verzögerungsmedium (Medium D-1,5D mit 500 mg/l Carbenicillin) wurden die mit Agrobacterium infizierten vorkultivierten unreifen Embryonen oder embryogenen Kalli auf das modifizierte Medium D, wie es beschrieben ist, mit 500 ml/g Carbenicillin, das für eine schrittweise erfolgende Selektion mit Paromomycin ergänzt war, übertragen. Die Explantate wurden eine Woche lang mit 25 mg/l Paromomycin selektiert, dann auseinandergebrochen und in Abständen von zwei oder drei Wochen für eine Subkultur auf Medium mit Paromomycin in Konzentrationen von 50 mg/l, 100 mg/l und 200 mg/l übertragen. Die lebensfähigen Gewebe wurden auf BA-Pulsmedium übertragen, das aus Medium D bestand, das mit 0,5 mg/l Benzyladenin (BA) ergänzt war. Nach 5 Tagen wurden die embryogenen Kalli auf BS-Basismedium für die Pflanzenregeneration übertragen. Transgene Pflanzen wurden durch einen histochemischen GUS-Assay identifiziert. Tabelle 6 zeigt die Wirkungen von Feuchtigkeitsmangel während der Cokultur auf die GUS-Expression. Tabelle 6. DNA-Abgabe und Transformationseffizienz

¹ Behandlung 1–3, 5–7 unter Verwendung des Genotyps (Pa91 × H99) × A188; Behandlung 4 und 8 unter Verwendung des Genotyps H99
² Unreife Embryonen von (Pa91 × H99) × A188, vor der Impfung 14 Tage lang auf verschiedenen Medien kultiviert. Embryogene Kalli von H99 wurden vor der Impfung über 2 Monate lang auf Medium D-1,5D angesetzt und gehalten.
³ Petri-Schalen von 60 × 20 mm wurden für die Cokultur verwendet; ein Stück Filterpapier in der Mitte der Schale.
⁴ Erdnuss-P-Medium bestand aus MS-Basismedium plus Vitaminen, das mit 3 mg/l Picloram ergänzt und mit GELRITE verfestigt ist.

Beispiel 6. Transformation von Zellen in Suspension und vorkultivierte Hypokotyl-Explantate von Sojabohne
1. Explantatherstellung
Eine Suspensionszellkultur wurde aus Kallus angesetzt, der auf MS-Basismedium, das mit 1 mg/l 2,4-D und 0,1 mg/l Benzyladenin (BA) ergänzt war, aus Blattgewebe von Soja Sorte A3237 induziert worden war. Die Suspensionszellen wurden vor der Impfung zwei Monate lang auf diesem Medium gehalten. Die Zellen wurden aus der flüssigen Kultur geerntet und mit Agrobacterium geimpft. Hypokotyl-Abschnitte wurden aus fünf Tage alten gekeimten Sämlingen von Sorte A3237 hergestellt. Die Hypokotylen wurden in Abschnitte von etwa 0,5 cm geschnitten. Die Explantate wurden vor der Impfung 5 Tage lang auf verschiedenen Medien vorkultiviert.
2. Agrobacterium-Herstellung, Impfung und Cokultur
Für alle Experimente mit Sojabohnen wurde der unschädlich gemachte (disarmed) Agrobacterium-Stamm ABI, der den binären Vektor pMON15715 beherbergt, verwendet. Kulturen von Agrobacterium wurden angesetzt, gezüchtet und geerntet, wie es zuvor beschrieben wurde. Die Zelldichte wurde für die Impfung auf eine OD₆₆₀ von 0,1 bis 1,0 eingestellt. Die Explantate wurden 15 bis 30 Minuten lang mit der Agrobacterium-Lösung getränkt, und die infizierten Explantate wurden in Petri-Schalen (100 × 20 mm, 100 × 15 mm oder 60 × 20 mm) cokultiviert, wobei sich ein Stück Filterpapier in der Petri-Schale befand. Während der Cokulturzeit wurde Wasser oder flüssiges Medium ausgeschlossen, um die Wirkung von Feuchtigkeit zu testen, und Kontrollen wurden angesetzt, bei denen man während der Cokultur 500 μl oder 1000 μl Wasser oder flüssiges Medium verwendete. Die Cokultur wurde 3 Tage lang im Dunkeln bei 23 °C bis 25 °C durchgeführt.
3. Effizienz der DNA-Abgabe
Nach 2 Tagen Selektionsverzögerung auf einem modifizierten MS-Medium (als Erdnuss-P bezeichnet) mit 500 mg/l Carbenicillin wurden die Explantate mit einem GUS-Assay analysiert. Bei Verwendung der Suspensionszellen zeigte sich im Vergleich zu den Kontrollen eine signifikant höhere transiente GUS-Expression (ca. 50fach) bei der Behandlung mit eingeschränkter Feuchtigkeit. Eine positive Wirkung der Einschränkung der Feuchtigkeitszufuhr zu den mit Agrobacterium geimpften Explantaten auf die DNA-Abgabe wurde bei den Hypokotyl-Explantaten ebenfalls beobachtet. Die Wirkung war unter verschiedenen Vorkulturmediumbedingungen, wie sie in Tabelle 7 gezeigt sind, stärker ausgeprägt. Tabelle 7. Wirkung der Feuchtigkeit und der Vorkulturmedien auf die DNA-Abgabe an Soja-Hypokotyl-Explantate¹

¹ kein Wasser während der Cokultur.
² Erdnuss-P = Medium auf MS-Basis plus Vitamine plus 3 mg/l Picloram.
³ Erdnuss-TDZ-Medium bestand aus MS-Basissalzen plus Vitaminen, ergänzt mit 2 mg/l TDZ (TDZ = Thidiazuran, Sigma, St. Louis, MO).

Literatur

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Claims

Verfahren zur Herstellung einer fruchtbaren transgenen Pflanze, das die folgenden Schritte umfasst: (a) Einführen einer oder mehrerer genetischer Komponenten in das Genom einer Pflanze durch Cokultivieren einer regenerierbaren Pflanzenzelle oder eines regenerierbaren Pflanzengewebes mit Agrobacterium, das die eine oder mehreren genetischen Komponenten enthält; (b) Cokultivieren des Agrobacterium und der regenerierbaren Pflanzenzellen oder -gewebe von Schritt (a) in einer Weise, dass eine Reduktion im Gewicht des mit Agrobacterium geimpften Explantats von 20% bis 35% des Gewichts der Pflanzenzelle bzw. des Pflanzengewebes vor der Cokultur gesteuert wird, wobei die Weise der Steuerung der Gewichtsreduktion des mit Agrobacterium geimpften Explantats die Beschränkung oder den Entzug von Wasser aus dem Explantat umfasst; (c) Identifizieren oder Selektieren einer transformierten Zelllinie; und (d) Regenerieren einer fruchtbaren transgenen Pflanze aus dieser Zelllinie.
Verfahren gemäß Anspruch 1, wobei die regenerierbare Zelle oder das regenerierbare Gewebe vor Schritt (a) vorkultiviert wird.
Verfahren gemäß Anspruch 1, wobei das Gewicht des mit Agrobacterium geimpften Explantats um 20% bis 23% reduziert wird.
Verfahren gemäß Anspruch 1, wobei die Zeit der Beschränkung oder des Entzugs von Wasser nach der Impfung mit Agrobacterium länger als eine Stunde dauert.
Verfahren gemäß Anspruch 1, wobei die Zeit der Beschränkung oder des Entzugs von Wasser nach der Impfung mit Agrobacterium eine Stunde bis etwa 6 Tage dauert.
Verfahren gemäß Anspruch 1, wobei die Zeit der Beschränkung oder des Entzugs von Wasser nach der Impfung mit Agrobacterium etwa einen Tag bis etwa 4 Tage, vorzugsweise einen Tag bis 3 Tage, dauert.
Verfahren gemäß Anspruch 1, wobei die transgene Pflanze eine Einkeimblättrige oder Zweikeimblättrige Pflanze ist.
Verfahren gemäß Anspruch 7, wobei es sich bei der Einkeimblättrigen Pflanze um Weizen, Mais oder Reis handelt.
Verfahren gemäß Anspruch 7, wobei es sich bei der Zweikeimblättrigen Pflanze um Sojabohne handelt.