DE69929700T2

DE69929700T2 - Bifunktionelle enzyme zur biopolymerherstellung

Info

Publication number: DE69929700T2
Application number: DE69929700T
Authority: DE
Inventors: P. Oliver Arlington PEOPLES; Lara Bridgewater MADISON; W. Gjalt San Carlos HUISMAN
Original assignee: Metabolix Inc
Current assignee: Yield10 Bioscience Inc
Priority date: 1998-07-30
Filing date: 1999-07-30
Publication date: 2006-08-31
Anticipated expiration: 2019-07-31
Also published as: CA2337099A1; WO2000006747A2; DE69929700D1; EP1100928B1; WO2000006747A3; US20060183209A1; US20080233629A1; AU5250299A; EP1100928A2; US20020173019A1; AU768244B2; CA2337099C; ATE317014T1; MXPA01001049A; JP2002521060A

Description

Hintergrund der Erfindung
Die vorliegende Erfindung betrifft generell das Gebiet gentechnologisch veränderter Bakterien- und Pflanzensysteme zur Erzeugung von Polyhydroxyalkanoaten durch Mikroorganismen und gentechnologisch veränderte Pflanzen, wobei die für die Erzeugung der Polymere essentiellen Enzyme als Fusionsproteine mit verbesserten Eigenschaften für die Polymersynthese exprimiert werden.
Zahlreiche Mikroorganismen besitzen die Fähigkeit zur Akkumulation intrazellulärer Reserven an Poly[(R)-3-hydroxyalkanoat]polymeren oder PHAs. PHAs sind biologisch abbaubare und biokompatible thermoplastische Materialien mit einer Vielzahl industrieller und biomedizinischer Anwendungen (Williams und Peoples, 1996, Chemtech. 26, 38–44). In den vergangenen Jahren haben sich die PHA-Biopolymere aus etwas, was ursprünglich als ein einziges Homopolymer, Poly-3-hydroxybutyrat (PHB) angesehen wurde, zu einer umfangreichen Klasse von Polyestern mit unterschiedlichen Monomerzusammensetzungen und einem weiten Bereich physikalischer Eigenschaften entwickelt. Über 100 verschiedene Monomere wurden in die PHA-Polymere eingearbeitet (Steinbüchel und Valentin, 1995, FEMS Microbiol. Lett. 128, 219–228). Es war hilfreich, die PHAs nach der Länge ihrer Seitenketten und ihren Biosynthesewegen in zwei Gruppen einzuteilen. Diejenigen mit kurzen Seitenketten, wie Polyhydroxybutyrat (PHB), ein Homopolymer aus R-3-Hydroxybuttersäureeinheiten, sind semikristalline, thermoplastische Materialien, während PHAs mit langen Seitenketten stärker elastomer sind.
Die Biosynthese der PHAs mit kurzen Seitenketten, wie PHB und PHBV, verläuft über eine Abfolge von drei enzymkatalysierten Reaktionen, die vom zentralen Metaboliten Acetyl-CoA ausgehen. Im ersten Schritt dieses Wegs werden zwei Acetyl-CoA-Moleküle durch eine 3-Ketoacyl-CoA-Thiolase zu Acetoacetyl-CoA kondensiert. Das Acetoacetyl-CoA wird anschließend durch eine NADPH-abhängige Reduktase zum PHB-Vorläufer 3-Hydroxybutyryl-CoA reduziert. 3-Hydroxybutyryl-CoA wird dann zu PHB polymerisiert, das von den Bakterien in Form „intrazellulärer Einschlusskörper" oder Körnchen abgeschieden wird. Das Molekulargewicht von PHB liegt generell in der Größenordnung von 10⁴–10⁷ Da. Bei einigen Bakterien, wie Chromatium vinosum, ist das Reduktaseenzym in erster Linie mit NADH als Cofaktor aktiv. Die Synthese des PHBV-Copolymers verläuft über den gleichen Weg, wobei der Unterschied darin besteht, dass Acetyl-CoA und Propionyl-CoA durch die β-Ketothiolase in 3-Ketovaleryl-CoA umgewandelt werden. 3-Ketovaleryl-CoA wird dann in 3-Hydroxyvaleryl-CoA umgewandelt, das polymerisiert wird.
PHAs mit langen Seitenketten werden aus Zwischenprodukten der β-Oxidation von Fettsäuren oder der Fettsäurebiosynthese erzeugt. Im Falle der β-Oxidation wird das L-Isomer von β-Hydroxyacyl-CoA durch eine Epimeraseaktivität, die in dem durch die faoAB-Gene codierten Multienzymkomplex vorliegt, in das D-Isomer umgewandelt. Die Biosynthese aus Acetyl-CoA über den Fettsäuresynthaseweg erzeugt das L-Isomer von β-Hydroxyacyl-ACP. Die Umwandlung des ACP in das CoA-Derivat wird durch das Produkt des phaG-Gens katalysiert (Krüger und Steinbüchel 1998, US-Patent 5 750 848).
Enoyl-CoA-Hydratasen wurden mit der PHA-Biosynthese in Mikroben wie Rhodospirillum rubrum und Aeromonas caviae in Verbindung gebracht. Es wird angenommen, dass die Biosynthese von PHB in R. rubrum über ein Acetoacetyl-CoA-Reduktase-Enzym verläuft, das für das L-Isomer von 3-Hydroxybutyryl-CoA spezifisch ist. Die Umwandlung der L- in die D-Form wird dann durch die Wirkung von zwei Enoyl-CoA-Hydrataseaktivitäten katalysiert. Im Falle von PHB-co-HX, wobei X eine C6-C16-Hydroxysäure ist, ein Copolymer, das gewöhnlich durch auf Fettsäuren gezüchtete Zellen erzeugt wird, kann eine Kombination dieser Wege für die Bildung der verschiedenen monomeren Einheiten verantwortlich sein. Tatsächlich identifizierte die Analyse des DNA-Locus, der für das PHA-Synthase-Gen in Aeromonas caviae, das das Copolymer PHB-co-3-hydroxyhexanoat erzeugt, codiert, ein Gen, das für eine D-spezifische Enoyl-CoA-Hydratase codiert, die für die Erzeugung der D-β-Hydroxybutyryl-CoA- und D-β-Hydroxyhexanoyl-CoA-Einheiten verantwortlich ist (Fukui und Doi, 1997, J. Bacteriol. 119, 4821–4830, Fukui et al., 1998, J. Bacteriol. 180, 667–673).
Aus ökonomischen Gründen wäre es wünschenswert, diese Polymere in transgenen Kulturpflanzenspezies zu erzeugen. Verfahren, mit denen das erreicht werden kann, sind bekannt; siehe, zum Beispiel, US-Patent Nr. 5 245 023 und US-Patent Nr. 5 250 430, US-Patent Nr. 5 502 273, US-Patent Nr. 5 534 432, US-Patent Nr. 5 602 321, US-Patent Nr. 5 610 041, US-Patent Nr. 5 650 555, US-Patent Nr. 5 663 063, WO 9100917, WO 9219747, WO 9302187, WO 9302194 und WO 9412014, Poirier et al., 1992, Science 256, 520–523, Williams und Peoples, 1996, Chemtech 26, 38–44. Zur Erreichung dieses Ziels ist es erforderlich, ein Gen, oder, im Falle einer PHA-Synthase mit mehr als einer Untereinheit, Gene, das bzw. die für eine PHA-Synthase aus einem Mikroorganismus codiert bzw. codieren, in Pflanzenzellen zu übertragen und das passende Ausmaß der Erzeugung des PHA-Synthase-Enzyms zu erreichen. Außerdem kann es erforderlich sein, zusätzliche Gene der PHA- Biosynthese bereitzustellen, z.B. ein Ketoacyl-CoA-Thiolase-Gen, ein Acetoacetyl-CoA-Reduktase-Gen, ein 4-Hydroxybutyryl-CoA-Transferase-Gen oder andere Gene, die für Enzyme codieren, die für die Synthese des Substrats für das PHA-Synthase-Enzym erforderlich sind.
In vielen Fällen ist es besonders erwünscht, die Expression in verschiedenen Pflanzengeweben oder -organellen zu steuern. Verfahren zur Steuerung der Expression sind Fachleuten auf diesem Gebiet bekannt (Gasser und Fraley, 1989, Science 244, 1293–1299, Gene Transfer to Plants, 1995, Potrykus, I. und Spangenberg, G., Hrsg., Springer-Verlag, Berlin-Heidelberg-New York, und „Transgenic Plants, A Production System for Industrial and Pharmaceutical Proteins", 1996, Owen, M.R.L. und Pen, J., Hrsg., John Wiley & Sons Ltd., England). Das US-Patent Nr. 5 610 041 beschreibt den Weg der Expression in Plastiden über die bereits früher bekannte Technologie des Anfügens eines Leader-Peptids zur Lenkung des vom Kerngen exprimierten Proteins in die Plastide. Eine neuere Technologie ermöglicht das direkte Einfügen fremder Gene direkt in das Plastidenchromosom über eine Rekombination (Svab et al., 1990, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 87, 8526–8530, McBride et al., 1994, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 91, 7301–7305). Die prokaryotische Natur der Plastiden-RNA und der Proteinsynthesemaschinerie ermöglicht auch die Expression mikrobieller Gene, zum Beispiel der phbC-, phbA- und phbB-Gene von R. eutropha.
Die gentechnologische Manipulation von Bakterien und Pflanzen für die Herstellung von Produkten wie Polymeren, die die koordinierte Expression und Wirkung mehrerer Enzyme, nacheinender auf verschiedene Substrate, erfordern, kann zu niedrigen Ausbeuten oder schlechten Effizienzen oder zu Variationen des oder Abweichungen vom letztendlichen Produkt(s) führen.
Es ist deshalb ein Ziel der vorliegenden Erfindung, Methoden und Materialien für eine verbesserte Erzeugung von Produkten multipler Enzyme, wie Polymeren, und besonders Polyhydroxyalkanoaten, in Bakterien oder Pflanzen bereitzustellen.
Zusammenfassung der Erfindung
Zur Optimierung des Fluxes oder Flusses von Kohlenstoffzwischenprodukten des normalen Zellmetabolismus in PHAs ist es wünschenswert, die Expression der Enzyme des PHA-Biosynthesewegs zu optimieren. Genfusionen sind genetische Konstrukte, bei denen zwei offene Leserahmen zu einem fusioniert wurden. Die transkriptionellen und translationellen Sequenzen stromaufwärts des ersten offenen Leserahmens steuern die Synthese eines einzigen Proteins mit einer Primärstruktur, die die beiden ursprünglichen offenen Leserahmen umfasst. Somit codieren Genfusionen für hybride Proteine, und in einigen Fällen für bifunktionelle hybride Enzyme. Die einzelnen Gene werden, zum Beispiel mittels PCR, so isoliert, dass die resultierenden DNA-Fragmente den vollständigen codierenden Bereich oder Teile des interessierenden codierenden Bereichs enthalten. Das DNA-Fragment, das für die aminoterminale Domäne des hybriden Proteins codiert, kann eine Stelle für die Initiation der Translation und eine Sequenz für die Steuerung der Transkription enthalten. Das Stopcodon in dem Gen, das für die aminoterminale Domäne codiert, muss aus diesem DNA-Fragment entfernt werden. Das Stopcodon in dem Gen, das für die carboxyterminale Domäne codiert, muss im DNA-Fragment erhalten bleiben. Es können DNA-Sequenzen, die durch Restriktionsenzyme erkannt werden, zum Zwecke der DNA-Klonierung in das neue Gen eingeführt werden. Linker können angefügt werden, um die zwei Domänen des hybriden Proteins räumlich zu trennen.
Im Falle von Enzymen, die aufeinanderfolgende Reaktionen eines Wegs katalysieren, führt die Fusion von zwei Genen dazu, dass zwei Enzymaktivitäten in enge Nachbarschaft zueinander gebracht werden. Wenn das Produkt der ersten Reaktion ein Substrat für die zweite ist kann diese neue Konfiguration aktiver Zentren zu einem schnelleren Transfer des Produkts der ersten Reaktion zum zweiten aktiven Zentrum führen, was mit einem Potenzial zur Erhöhung des Fluxes durch den Weg verbunden ist. Die relative Konfiguration der zwei katalytischen Domänen im Hybrid kann durch die Bereitstellung einer Linkersequenz zwischen ihnen verändert werden. Dieser Linker kann aus beliebigen der zwanzig natürlichen Aminosäuren zusammengesetzt sein und kann unterschiedliche Länge haben. Die Variation der Länge und der Zusammensetzung sind wichtige Parameter für die Veränderung der relativen Konfiguration der einzelnen Domänen des Hybrids und seiner Enzymaktivitäten.
Diese Technologie ermöglicht die direkte Inkorporation einer Reihe von Genen, die für einen aus mehreren Enzymen bestehenden Weg codieren, in ein Bakterium oder eine Pflanze oder Pflanzenorganelle, zum Beispiel in das Plastidengenom. In einige Fällen kann es nützlich sein, die 5'-untranslatierten Bereiche von Plastidengenen umzukonstruieren, die für die Stabilität der mRNA und die Translation wichtig sind (Hauser et al., 1996, J. Biol. Chem. 271, 1486–1497), sekundäre Strukturelemente zu entfernen oder Elemente von hoch exprimierten Plastidengenen anzufügen, um die Expression des von einem Operon codierten Transgens zu maximieren.
Beispiele demonstrieren die Expression aktiver Polypeptide, die für mehrere Enzymaktivitäten codieren. Bei ihnen handelt es sich um homotetramere Enzyme, die Cofaktoren benötigen und für die Synthese des Polymers zusammenwirken, und von denen bisher nicht gezeigt wurde, dass sie als Fusionsproteine exprimiert werden können.
Kurze Beschreibung der Zeichnungen
1A–1H sind schematische Darstellungen von Genfusionen, die für Proteine aus mehreren Enzymen codieren: pTrcAB, das die beta-Ketothiolase (phbA) und die Acyl-CoA- Reduktase (phbB) einschließt (1A); pTrcBA, das die phbB und die phbA einschließt (1B); pTrcCP, das die PHA-Synthase (phaC) und Phasin (phaP) einschließt (1C); pTrcPC, das phaP und die phaC einschließt (1D); pTrcCG, das die phaC und beta-Hydroxyacyl-ACP:: Coenzym-A-Transferase (phbG) einschließt (1E); pTrcGC, das die phbG und die phaC einschließt (1F); pTrcCJ, das die phaC und Enoyl-CoA-Hydratasen (phaJ) einschließt (1G); und pTrcJC, das die phaJ und die phaC einschließt (1H).
2 ist eine schematische Darstellung der Konstruktion von pTrcAB11, das die phbA und die phbB auf einem einzigen Polypeptid mit sowohl Thiolase- als auch Reduktase-Aktivität einschließt.
Detaillierte Beschreibung der Erfindung
I. Genfusionen
Zur Optimierung des Fluxes oder Flusses von Kohlenstoffzwischenprodukten des normalen Zellmetabolismus in PHAs ist es wünschenswert, die Expression der Enzyme des PHA-Biosynthesewegs zu optimieren. Genfusionen sind genetische Konstrukte, bei denen zwei offene Leserahmen zu einem fusioniert wurden. Die transkriptionellen und translationellen Sequenzen stromaufwärts des ersten offenen Leserahmens steuern die Synthese eines einzigen Proteins mit einer Primärstruktur, die die beiden ursprünglichen offenen Leserahmen umfasst. Somit codieren Genfusionen für hybride Proteine, und in einigen Fällen für bifunktionelle hybride Enzyme. Hybride Proteine wurden entwickelt für Anwendungen wie die Proteinreinigung (Bülow, L., Eur. J. Biochem. (1987) 163, 443–448, Bülow, L, Biochem. Soc. Symp. (1990) 57, 123–133, Bülow, L., Tibtech. (1991) 9, 226–231), biochemische Analysen (Ljungcrantz et al., FEBS Lett. (1990) 275, 91–94, Ljungcrantz et al., Biochemistry (1989) 28, 8786–8792, Bülow, L., Biochem. Soc. Symp. (1990) 57, 123–133, Bülow, L., Tibtech. (1991) 9, 226–231) und das Metabolic Engineering (US-Patent 5 420 027, Carlsson, Biotech. Lett. (1992) 14, 439–444, Bülow, L., Biochem. Soc. Symp. (1990) 57, 123–133, Bülow, L., Tibtech. (1991) 9, 226–231, Fisher, Proc. Natl. Acad. Sci. USA (1992) 89, 10817–10821).
Die einzelnen Gene werden, zum Beispiel mittels PCR, so isoliert, dass die resultierenden DNA-Fragmente den vollständigen codierenden Bereich oder Teile des interessierenden codierenden Bereichs enthalten. Das DNA-Fragment, das für die aminoterminale Domäne des hybriden Proteins codiert, kann eine Stelle für die Initiation der Translation und eine Sequenz für die Steuerung der Transkription enthalten. Das Stopcodon in dem Gen, das für die aminoterminale Domäne codiert, muss aus diesem DNA-Fragment entfernt werden. Das Stopcodon in dem Gen, das für die carboxyterminale Domäne codiert, muss im DNA-Fragment erhalten bleiben. Es können DNA-Sequenzen, die durch Restriktionsenzyme erkannt werden, zum Zwecke der DNA-Klonierung in das neue Gen eingeführt werden. Linker können angefügt werden, um die zwei Domänen des hybriden Proteins räumlich zu trennen.
Im Falle von Enzymen, die aufeinanderfolgende Reaktionen eines Wegs katalysieren, führt die Fusion von zwei Genen dazu, dass zwei Enzymaktivitäten in enge Nachbarschaft zueinander gebracht werden. Wenn das Produkt der ersten Reaktion ein Substrat für die zweite ist, kann diese neue Konfiguration aktiver Zentren zu einem schnelleren Transfer des Produkts der ersten Reaktion zum zweiten aktiven Zentrum führen, was mit einem Potenzial zur Erhöhung des Fluxes durch den Weg verbunden ist. Die relative Konfiguration der zwei katalytischen Domänen im Hybrid kann durch die Bereitstellung einer Linkersequenz zwischen ihnen verändert werden. Dieser Linker kann aus beliebigen der zwanzig natürlichen Aminosäuren zusammengesetzt sein und unterschiedliche Länge haben. Die Variation der Länge und der Zusammensetzung sind wichtige Parameter für die Veränderung der relativen Konfiguration der einzelnen Domänen des Hybrids und seiner Enzymaktivitäten.
Es gibt Verfahren zur Verbesserung der Einsetzbarkeit von Fusionsenzymen für die PHA-Biosynthese über den Einsatz von Techniken einer molekularen Evolution oder eines „Gen-Shuffling" (Stemmer, M.P.C. 1994, Nature 370, 389–391, Stemmer, M.P.C. 1994, Proc. Natl. Acad. Sci. 1994, 91, 10747–10751). Zu den für das Funktionieren dieses Ansatzes notwendigen Anforderungen gehören die Mutagenesetechniken, die gewöhnlich auf einer PCR basieren, und eine Screening-Technik zur Identifizierung der Enzymmutanten mit den gewünschten verbesserten Eigenschaften.
A. Gene
Zu geeigneten Genen gehören die PHB- und PHA-Synthasen, β-Ketothiolasen, Acyl-CoA-Reduktasen, Phasine, Enoyl-CoA-Hydratasen und β-Hydroxyacyl-ACP::Coenzym-A-Transferasen. Beispiele für Fusionen, die konstruiert werden können, werden in den 1A–1H veranschaulicht.
Für die β-Ketothiolase codierende Gene wurden isoliert aus Alcaligenes latus [(MBX unveröffentlicht, Choi et al., Appl. Environ. Microbiol. 64 (12), 4897–4903 (1998)], Ralstonia eutropha [Peoples, O.P. und Sinskey, A.J., J. Biol. Chem. 264, 15298–15303 (1989), Slater et al., 1998, J. Bacteriol. 180, 1979–1987], Acinetobacter sp. [Schembri et al., J. Bacteriol., Chromatium vinosum [Liebergesell, M. und Steinbüchel, A., Eur. J. Biochem. 209 (1), 135–150 (1992)], Pseudomonas acidophila (Umeda et al., Appl. Biochem. Biotech. 70–72, 341–352 (1998)], Pseudomonas denitrificans [Yabutani et al., FEMS Microbiol. Lett. 133 (1–2), 85–90 (1995)], Rhizobium meliloti [Tombolini et al., Microbiology 141, 2553–2559 (1995)], Thiocystis violacea [Liebergesell et al., Appl. Microbiol. Biotechnol. 38 (4), 493–501 (1993)] und Zoogloea ramigera [Peoples et al., J. Biol. Chem. 262 (1), 97–102 (1987)].
Für die Reduktase codierende Gene wurden isoliert aus Alcaligenes latus (Choi of al., Appl. Environ. Microbiol. 64 (12), 4897–4903 (1998)], R. eutropha (Peoples, O.P. und Sinskey, A.J., J. Biol. Chem. 264 (26), 15298–15303 (1989), Acinetobacter sp. (Schembri et al., J. Bacteriol.), C. vinosum [Liebergesell, M. und Steinbüchel, A., Eur. J. Biochem. 209 (1), 135–150 (1992)], Pseudomonas acidophila (Umeda et al., Appl. Biochem. Biotech. 70–72, 341–352 (1998)], P. denitrificans (Yabutani et al., FEMS Microbiol. Lett. 133 (1–2), 85–90 (1995)], R. meliloti [Tombolini et al., Microbiology 141 (Teil 10), 2553–2559 (1995)] und Z. ramigera [Peoples, O.P. und Sinskey, A.J., 1989, Molecular Microbiology 1, 349–357).
Für die PHA-Synthase codierende Gene wurden isoliert aus Aeromonas caviae [Fukui, T. und Doi, Y., J. Bacteriol. 179 (15), 4821–4830 (1997)], Alcaligenes latus (Choi et al., Appl. Environ. Microbiol. 64 (12), 4897–4903 (1998)], R. eutropha [Peoples, O.P. und Sinskey, A.J., J. Biol. Chem. 264 (26), 15298–15303 (1989), Lee et al., Acinetobacter (Schembri et al., J. Bacteriol.), C. vinosum [Liebergesell, M. und Steinbüchel, A., Eur. J. Biochem. 209 (1), 135–150 (1992)], Methylobacterium extorquens (Valentin und Steinbüchel, Appl. Microbiol. Biotechnol. 39 (3), 309–317 (1993)], Nocardia corallina (GenBank Acc. No. AFO19964), Nocardia salmonicolor, Pseudomonas acidophila (Umeda et al., T. Appl. Biochem. Biotech. 70–72, 341–352 (1998)], P. denitrificans [Ueda et al., J. Bacteriol. 178 (3), 774–779 (1996)], Pseudomonas aeruginosa (Timm und Steinbüchel, Eur. J. Biochem. 209 (1), 15–30 (1992)]. Pseudomonas oleovorans [Huisman et al., J. Biol. Chem. 266 (4), 2191–2198 (1991)], Rhizobium etli (Cevallos et al., J. Bacteriol. 178 (6), 1646–1654 (1996)], R. meliloti [Tombolini et al., Microbiology 141 (Teil 10), 2553–2559 (1995)], Rhodococcus ruber [Pieper, U. und Steinbüchel, A., FEMS Microbiol. Lett. 96 (1), 73–80 (1992)], Rhodospirillum rubrum [Hustede et al., FEMS Microbiol. Lett. 93, 285–290 (1992)], Rhodobactersphaeroides (Steinbüchel et al., FEMS Microbiol. Rev. 9 (2–4), 217–230 (1992), Hustede et al., Biotechnol. Lett. 15, 709–714 (1993)], Synechocystis sp. [Kaneko, T., DNA Res. 3 (3), 109–136 (1996)], T. violaceae [Liebergesell et al., Appl. Microbiol. Biotechnol. 38 (4), 493–501 (1993)] und Z. ramigera (GenBank Acc. No. U66242).
Es können auch andere Gene verwendet werden, die nicht mit der PHA-Bildung in Zusammenhang gebracht worden sind, die aber eine signifikante Homologie zu den phb-Genen und/oder den entsprechenden Genprodukten zeigen. Gene, die für Thiolase- und Reduktaseähnliche Enzyme codieren, wurden in vielen verschiedenen Bakterien, die kein PHB bilden, identifiziert. E. coli (U29581, D90851, D90777), Haemophilus influenzae (U32761), Pseudomonas fragi (D10390), Pseudomonas aeruginosa (U88653), Clostridium acetobutylicum (U08465), Mycobacterium leprae (000014), Mycobacterium tuberculosis (Z73902), Helicobacter pylori (AE000582), Thermoanaerobacterium thermosaccharolyticum (Z92974), Archaeoglobus fulgidus (AE001021), Fusobacterium nucleatum (037723), Acinetobacter calcoaceticus (L05770), Bacillus subtilis (D84432, Z99120, 029084) und Synechocystis sp. (D90910) codieren alle für eine oder mehrere Thiolase(n) auf ihrem Chromosom. Eukaryotische Organismen, wie Saccharomyces cerevisiae (L20428), Schizosaccharomyces pombe (D89184), Candida tropicalis (D13470), Caenorhabditis elegans (U41105), der Mensch (S70154), die Ratte (D13921), die Maus (M35797), der Rettich (X78116), der Kürbis (D70895) und die Gurke (X67696) exprimieren ebenfalls Proteine mit signifikanter Homologie zur 3-Ketothiolase aus R. eutropha.
Gene mit signifikanter Homologie zu dem für die Acetoacetyl-CoA-Reduktase codierenden phbB-Gen wurden aus mehreren Organismen isoliert, Azospirillum brasiliense (X64772, X52913) und Rhizobium sp. (U53327, Y00604), E. coli (D90745), Vibrio harveyi (U39441), H. influenzae (U32701), B. subtilis (U59433), P. aeruginosa (U91631), Synechocystis sp. (D90907), H. pylori (AE000570), Arabidopsis thaliana (X64464), Cuphea lanceolata (X64566) und Mycobacterium smegmatis (066800).
Es wurden verschiedene Proteine, die an PHA-Körnchen binden, identifiziert, und ihre Gene wurden kloniert (Steinbüchel et al., 1995, Can. J. Microbiol. (Supplement 1) 41, 94–105). Die derzeitige Hypothese besagt, dass diese Proteine eine ähnliche Rolle wie die Oleosin-Ölspeicherproteine (Huang, A.H.C., 1992, Annu. Rev. Plant Physiol. Plant Mol. Biol. 43, 177–200) in Ölsamen spielen, und sie wurden Phasine genannt. Zum Beispiel ist das Protein GA24 ein Protein von 24 Kilodalton, das in PHA-bildenden Zellen von Alcaligenes eutrophus vorkommt (Wieczorek et al., J. Bacteriol. 1995, 177, 2425–2435). Das für GA24 codierende Gen, phaP, wurde über die Komplementierung von PHA-leaky Mutanten des Bakteriums isoliert. Wieczorek et al. beobachteten in ihren Untersuchungen von GA24, dass das Protein PHA-Körnchen in PHA-erzeugenden Zellen von A. eutrophus überzog, und dass Zellen, die kein GA24 aufwiesen, sehr große Körnchen bildeten, während Wildtypzellen viel kleinere Körnchen besaßen (Wieczorek et al., J. Bacteriol. 1995, 177, 2425–2435). Basierend auf dieser Beobachtung schlugen die Autoren vor, dass GA24 eines von mehreren derartigen Proteinen ist, die als Phasine bezeichnet werden und für die Steuerung der Größe der PHA-Körnchen verantwortlich sind. Eine immunologische Analyse anderer PHA-Körnchen mehrerer verschiedener Bakterien zeigte die Konservierung dieses Proteins (Wieczorek et al., 1996, FEMS Microbiology Letters 135, 23–30), und die Autoren zogen die Schlussfolgerung, dass Homologe des GA24 weit verbreitet sind und ihre Gene leicht isoliert werden können. Ein Phasin von 13 kDa wurde in Acinetobacter sp. identifiziert (Schembri et al., 1995, FEMS Micro. Lett. 133, 277–283).
B. Transformationsvektoren
Zu DNA-Konstrukten gehören Transformationsvektoren, die imstande sind, Transgene in Pflanzen einzuführen. Es stehen viele Transformationsvektoren für Pflanzen zur Verfügung; siehe „Gene Transfer to Plants" (1995), Potrykus, I. und Spangenberg, G., Hrsg., Springer-Verlag Berlin-Heidelberg-New York, „Transgenic Plants, A Production System for Industrial and Pharmaceutical Proteins" (1996), Owen, M.R.L. und Pen, J., Hrsg., John Wiley & Sons Ltd., England, und „Methods in Plant Molecular Biology – a laboratory course manual" (1995), Maliga, P., Klessig, D.F., Cashmore, A.R., Gruissem, W. und Varner, J.E., Hrsg., Cold Spring Laboratory Press, New York.
C. Regulatorische Sequenzen
Im Allgemeinen umfassen Transformationsvektoren für Pflanzen eine oder mehrere interessierende codierende Sequenzen) unter der transkriptionellen Kontrolle von 5'- und 3'-regulatorischen Sequenzen, zu denen ein Promotor, ein Signal für die Termination der Transkription und/oder die Polyadenylierung und ein selektierbares oder screenbares Markergen gehören. Zu den üblichen Anforderungen an 5'-regulatorische Sequenzen gehören ein Promotor, eine Stelle für die Initiation der Transkription und ein Signal für die Prozessierung der mRNA. Zu 3'-regulatorischen Sequenzen gehören ein Signal für die Termination der Transkription und/oder ein Polyadenylierungssignal. Es können weitere Signale für die RNA-Prozessierung und Ribozymsequenzen gentechnologisch in das Konstrukt für die Expression von zwei oder mehreren Polypeptiden von einem einzigen Transkript eingeführt werden (US-Patent Nr. 5 519 164). Dieser Ansatz hat den Vorteil, mehrere Transgene in nur einem Locus zu lokalisieren, was für die spätere Pflanzenzüchtung vorteilhaft ist. Ein weiterer Ansatz besteht darin, einen Vektor für die spezifische Transformation des Plastidenchromosoms der Pflanze über eine homologe Rekombination einzusetzen (US-Patent Nr. 5 545 818), und in diesem Falle ist es möglich, die prokaryotische Natur des Plastidengenoms auszunützen und mehrere Transgene als ein Operon einzufügen.
Es sind viele pflanzliche Promotoren bekannt, die entweder zu einer konstitutiven oder durch Umwelteinflüsse oder entwicklungsabhängig regulierten Expression des interessierenden Gens führen. Pflanzliche Promotoren können so ausgewählt werden, dass sie die Expression des Transgens in unterschiedlichen Pflanzengeweben oder Organellen steuern, wie es von Gasser und Fraley, 1989, Science 244, 1293–1299, beschrieben wurde. Das 5'-Ende des Transgens kann gentechnologisch so verändert werden, dass es Sequenzen einschließt, die für Peptide codieren, die eine Lokalisierung in Plastiden oder anderen subzellulären Organellen bewirken und im Leseraster mit dem Transgen verknüpft sind. Zu geeigneten konstitutiven pflanzlichen Promotoren gehören der 35S-Promotor des Blumenkohl-Mosaikvirus (CaMV) und verbesserte CaMV Promotoren (Odell et al., 1985, Nature 313, 810), der Actin-Promotor (McElroy et al., 1990, Plant Cell 2, 163–171), der Adhl-Promotor (Fromm et al., 1990, Bio/Technology 8, 833–839, Kyozuka et al., 1991, Mol. Gen. Genet. 228, 40–48), Ubiquitin- Promotoren, der Promotor des Figwort-Mosaikvirus, der Mannopinsynthase-Promotor, der Nopalinsynthase-Promotor und der Octopinsynthase-Promotor. Zu nützlichen regulierbaren Promotorsystemen gehören der nitratinduzierbare Spinat-Promotor, Hitzeschock-Promotoren, Promotoren der kleinen Untereinheit der Ribulosebiphosphatcarboxylase und chemisch induzierbare Promotoren (US-Patent Nr. 5 364 780 und US-Patent Nr. 5 364 780).
Es kann vorzuziehen sein, das Transgen nur in den sich entwickelnden Samen zu exprimieren. Zu Promotoren, die für diesen Zweck geeignet sind, gehören der Promotor des Napin-Gens (US-Patent Nr. 5 420 034, US-Patent Nr. 5 608 152), der Acetyl-CoA-Carboxylase-Promotor (US-Patent Nr. 5 420 034, US-Patent Nr. 5 608 152), der 2S-Albumin-Promotor, der Promotor des Samenspeicherproteins, der Phaseolin-Promotor (Slightom et al., 1983, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 80, 1897–1901), der Oleosin-Promotor (Plant et al., 1994, Plant Mol. Biol. 25, 193–205, Rowley et al., 1997, Biochim. Biophys. Acta. 1345, 1–4, US-Patent Nr. 5 650 554, PCT WO 93/20216), der Zein-Promotor, der Glutelin-Promotor, der Stärkesynthase-Promotor und der Promotor des stärkeverzweigenden Enzyms.
Es sind in der Literatur mehrere nützliche pflanzliche Vektoren beschrieben worden, die viele der oben beschrieben Merkmale aufweisen. Besonders nützlich unter diesen sind die von Ishida et al. (1996, Nature Biotechnology 14, 745–750) beschriebenen „superbinären" Vektoren und die sehr große Gruppe von Vektoren, die von Cambia, Canberra, Australien bezogen werden können (und beschrieben wurden von Roberts et al., „A comprehensive set of modular vectors for advanced manipulations and efficient transformation of plants", präsentiert auf dem Rockefeller Foundation Meeting of the International Program on Rice Biotechnology, 15.–18. September 1997, Malacca, Malaysia).
II. Verfahren zur Transformation von Pflanzen und deren Selektion
Vorzugsweise wird mehr als ein Genprodukt in der Pflanze exprimiert. Es können dazu mehrere Methoden eingesetzt werden, zu denen die folgenden gehören: das Einführen der codierenden DNAs in einem einzigen Transformationsereignis, wobei sich alle erforderlichen DNAs auf einem einzigen Vektor befinden; in einem Cotransformationsereignis, wobei sich alle erforderlichen DNAs auf separaten Vektoren befinden, aber gleichzeitig in die Pflanzenzellen eingeführt werden; das Einführen der codierenden DNAs über voneinander unabhängige Transformationsereignisse nacheinander in die Pflanzenzellen, d.h. die Transformation transgener Pflanzenzellen, die eine oder mehrere der codieren DNAs exprimieren, mit weiteren DNA-Konstrukten; die Transformation eines jeden der benötigten DNA-Konstrukte über separate Transformationsereignisse, wodurch transgene Pflanzen erhalten werden, die die einzelnen Proteine exprimieren, und der Einsatz herkömmlicher Methoden der Pflanzenzüchtung zur Einarbeitung des vollständigen Wegs in eine einzige Pflanze.
Die Transformation geeigneter Agrarplanzen-Wirte unter Verwendung dieser Vektoren kann mittels mehrerer Methoden und mit verschiedenen Pflanzengeweben erreicht werden. Zu geeigneten Pflanzen gehören die Brassica-Familie einschließlich von napus, rappa, sp. carinata and juncea, Mais, Soja, Baumwolle, Sonnenblume, Palme, Kokosnuss, Saflor, Erdnuss, Senfarten, einschließlich von Sinapis alba, und Flachs. Zu geeigneten Geweben für eine Transformation unter Einsatz dieser Vektoren gehören Protoplasten, Zellen, Kallusgewebe, Blattscheiben, Pollen, Meristeme etc. Zu geeigneten Transformationsverfahren gehören die Agrobacterium-vermittelte Transformation, die Biolistik, eine Mikroinjektion, eine Elektroporation, eine Polyethylenglycol-vermittelte Protoplastentransformation, eine Liposomen-vermittelte Transformation, eine Silikonfaser-vermittelte Transformation (US-Patent Nr. 5 464 765) etc. (Gene Transfer to Plants (1995), Potrykus, I. und Spangenberg, G., Hrsg., Springer-Verlag Berlin-Heidelberg-New York, „Transgenic Plants, A Production System for Industrial and Pharmaceutical Proteins" (1996), Owen, M.R.L. und Pen, J., Hrsg., John Wiley & Sons Ltd., England, und „Methods in Plant Molecular Biology – a laboratory course manual" (1995), Maliga, P., Klessig, D.F., Cashmore, A. R., Gruissem, W. und Varner, J.E., Hrsg., Cold Spring Laboratory Press, New York).
Transformationverfahren für die jeweiligen Ackerpflanzen wurden etabliert (Gene Transfer to Plants (1995), Potrykus, I. und Spangenberg, G., Hrsg., Springer-Verlag Berlin-Heidelberg-New York, „Transgenic Plants, A Production System for Industrial and Pharmaceutical Proteins" (1996), Owen, M.R.L. und Pen, J., Hrsg., John Wiley & Sons Ltd., England, und „Methods in Plant Molecular Biology – a laboratory course manual" (1995), Maliga, P., Klessig, D.F., Cashmore, A. R., Gruissem, W. und Varner, J.E., Hrsg., Cold Spring Laboratory Press, New York).
Brassica napus kann transformiert werden, wie es zum Beispiel im US-Patent Nr. 5 188 958 und im US-Patent Nr. 5 463 174 beschrieben wurde. Andere Brassica-Arten, wie rappa, carinata und juncea, sowie Sinapis alba können transformiert werden, wie es von Moloney et al. beschrieben wurde (1989, Plant Cell Reports 8, 238–242). Soja kann mittels mehrerer berichteter Verfahren transformiert werden; siehe US-Patent Nr. 5 015 580, US-Patent Nr. 5 015 944, US-Patent Nr. 5 024 944, US-Patent Nr. 5 322 783, US-Patent Nr. 5 416 011 und US-Patent Nr. 5 169 770. Mehrere Transformationsverfahren wurden für die Erzeugung transgener Maispflanzen berichtet, einschließlich einer Pollentransformation (US-Patent Nr. 5 629 183), einer Silikonfaser-vermittelten Transformation (US-Patent Nr. 5 464 765), einer Elektroporation von Protoplasten (US-Patent Nr. 5 231 019, US-Patent Nr. 5 472 869, US-Patent Nr. 5 384 253), einer Gene Gun (US-Patent Nr. 5 538 877, US-Patent Nr. 5 538 880) und einer Agrobacterium-vermittelten Transformation ( EP 0 604 662 A1 ; WO 94/00977). Das Agrobacterium-vermittelte Verfahren wird besonders bevorzugt, da einzelne Integrationsereignisse der Transgenkonstrukte unter Einsatz dieses Verfahrens leichter erhalten werden, was die sich anschließende Pflanzenzüchtung stark erleichtert. Baumwolle kann über einen Partikelbeschuss transformiert werden (US-Patent Nr. 5 004 863, US-Patent Nr. 5 159 135). Die Sonnenblume kann unter Einsatz einer Kombination aus einem Partikelbeschuss und einer Infektion mit Agrobacterium transformiert werden ( EP 0 486 233 A2 , US-Patent Nr. 5 030 572). Flachs kann entweder über ein Partikelbeschuss oder eine Agrobacterium-vermittelte Transformation transformiert werden. Zu Recombinase-Technologien, die für die Durchführung der vorliegenden Erfindung nützlich sind, gehören die cre/lox, FLP/FRT- und Gin-Systeme. Verfahren, durch die diese Technologien für den hier beschriebenen Zweck eingesetzt werden können, werden zum Beispiel beschrieben im US-Patent Nr. 5 527 695, bei Dale und Ow, 1991, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 88, 10558–10562, Sauer, 1993, Methods in Enzymology 225, 890–900 und Medberry et al., 1995, Nucleic Acids Res. 23, 485–490. US 5 723 764 beschreibt ein Verfahren zur Steuerung der Expression von Pflanzengenen unter Einsatz von cre/lox.
Zu selektierbaren Markergenen gehören das Neomycinphosphotransferase-Gen, nptII (US-Patent Nr. 5 034 322, US-Patent Nr. 5 530 196), das Hygromycinresistenz-Gen (US-Patent Nr. 5 668 298) und das bar-Gen, das für die Resistenz gegen Phosphinothricin codiert (US-Patent Nr. 5 276 268). EP 0 530 129 A1 beschreibt ein positives Selektionssystem, das es den transformierten Pflanzen ermöglicht, die nicht-transformierten Linien zu überwachsen, indem sie ein Transgen exprimieren, das für ein Enzym codiert, das ein inaktive, dem Wachstumsmedium zugesetzte Verbindung aktiviert. Zu nützlichen screenbaren Markergenen gehören das Gen der β-Glucuronidase (Jefferson et al., 1987, EMBO J. 6, 3901–3907, US-Patent Nr. 5 268 463) und das Gen des nativen oder modifizierten grünfluoreszierenden Proteins (Cubitt et al., 1995, Trends Biochem Sci. 20, 448–455, Pang et al., 1996, Plant Physiol. 112, 893–900). Einige dieser Marker haben den weiteren Vorteil, dass sie ein Merkmal wie eine Herbizidresistenz in die interessierende Pflanze einführen, wodurch auf der Einsatzseite ein zusätzlicher ackerbaulicher Nutzen bereitgestellt wird.
Nach der Transformation mittels einer beliebigen der oben beschriebenen Methoden können die folgenden Verfahren eingesetzt werden, um eine transformierte Pflanze zu erhalten, die das erfindungsgemäße Transgen exprimiert: wähle die Pflanzenzellen aus, die auf einem selektiven Medium transformiert worden sind; vermehre die Pflanzenzellen, die transformiert worden sind, um differenzierte Pflanzen zu erzeugen; und selektiere transformierte Pflanzen, die das Transgen so exprimieren, dass die Menge des gewünschten Polypeptids im gewünschten Gewebe und der gewünschten Lokalisation in der Zelle erhalten wird.
Die Beispiele demonstrieren die Synthese neuer gentechnologisch konstruierter Enzyme für die effiziente Erzeugung von Polyhydroxyalkanoat-Biopolymeren in transgenen Organismen. Bei einem Beispiel wurden die durch das phbA- und das phbB-Gen codierten Thiolase- und Reduktase-Aktivitäten über die Konstruktion einer Genfusion in einem einzigen Enzym kombiniert. Der Einsatz eines derartigen hybriden Enzyms und seines entsprechenden Gens ist vorteilhaft: das Kombinieren von zwei Enzymaktivitäten in einer einzigen transkriptionellen Einheit reduziert die Zahl der Gene, die in transgenen Organismen exprimiert werden müssen, und die enge Nachbarschaft von zwei Enzymaktivitäten, die aufeinanderfolgende Schritte in einem Metabolismusweg katalysieren, auf dem Fusionsenzym ermöglicht den direkten Transfer des Reaktionsprodukts von der ersten katalytischen Domäne zur zweiten Domäne. Diese Genfusionen können in transgenen Systemen aus Mikroorganismen oder Kulturpflanzen zur PHA-Erzeugung eingesetzt werden. Die Fusionen können im Cytosol oder in subzellulären Organellen höherer Pflanzen exprimiert werden, wie in den Samen einer Ölpflanze (Brassica, Sonnenblume, Soja, Mais, Saflor, Flachs, Palme oder Kokosnuss), in stärkeakkumulierenden Pflanzen (Kartoffel, Tapioka, Maniok), in Faserpflanzen (Baumwolle, Hanf) oder dem grünen Gewebe von Tabak, Luzerne, Rutenhirse oder anderen Futterpflanzen.
Beispiele
Die vorliegende Erfindung wird durch die Bezugnahme auf die folgenden Beispiele besser verstanden werden, in denen die folgenden generellen Methoden und Materialien eingesetzt werden:
Die Manipulationen der DNA wurden mit Plasmid-DNA und chromosomaler DNA durchgeführt, die mit dem Qiagen-Kit für die Plasmidpräparation oder dem Qiagen-Kit für die Präparation chromosomaler DNA entsprechend den Empfehlungen des Herstellers gereinigt wurden. Die DNA wurde mit Restriktionsenzymen entsprechend den Empfehlungen des Herstellers (New England Biolabs, Beverly, Massachusetts) verdaut. Die DNA-Fragmente wurden aus 0,7%igen Agarose-Tris/Acetat/EDTA-Gelen mittels eins Qiagen-Kits isoliert. Oligonucleotide wurden von Biosynthesis oder Genesys bezogen. Die DNA-Sequenzen wurden durch automatisches Sequenzieren mit Hilfe einer Sequenzierapparatur ABI 373A von Perkin-Elmer bestimmt. Die DNA wurde über die Polymerase-Kettenreaktion in einem Volumen von 50 Mikrolitern mit Hilfe eines PCR-Mix von Gibco-BRL (Gaithersburg, Maryland) und einer Ericomp-Apparatur zur DNA-Amplifizierung amplifiziert.
Die E.-coli-Stämme ließ man in Luria-Bertani-Medium oder in 2xYT-Medium (Sambrook et al., 1992, in Molecular Cloning, a laboratory manual, 2. Auflage, Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, New York) bei 37°C, 30°C oder 16°C wachsen.
Das akkumulierte PHB wurde mittels einer gaschromatographischen (GC) Analyse untersucht, die mit der lyophilisierten Zellmasse durchgeführt wurde. Ungefähr 20 mg der lyophilisierten Zellmasse wurden einer gleichzeitigen dreistündigen Extraktion und Butanolyse bei 110°C in 2 mL einer Mischung unterzogen, die (in Volumeneinheiten) 90% 1-Butanol und 10% konzentrierte Salzsäure enthielt, wobei 2 mg/mL Benzoesäure als interner Standard zugesetzt wurden. Die wasserlöslichen Bestandteile der resultierenden Mischung wurden durch Extraktion mit 3 mL Wasser entfernt. Die organische Phase (1 μL in einem Splitverhältnis von 1:50 und einer Gesamtfließgeschwindigkeit von 2 mL/min) wurde auf einem HP-5890-GC mit FID-Detektor (Hewlett-Packard Co., Palo Alto, Kalifornien) unter Verwendung einer SPB-1-Kapillar-GC-Säule aus verschmolzenem Siliciumdioxid (30 m, Innendurchmesser 0,32 mm, Film von 0,25 μm; Supelco; Bellefonte, Pennsylvania) mit dem folgenden Temperaturprofil analysiert: 80°C, 2 min; mit 10°C pro min auf 250°C; 250°C, 2 min. Butylbenzoat wurde als interner Standard eingesetzt. Die Molekulargewichte der isolierten Polymere wurden mittels GPC unter Verwendung einer Styragel-HT6E-Säule von Waters (Millipore Corp., Waters Chromatography Division, Milford, Massachusetts), die mit Polystyrolproben enger Polydispersität kalibriert worden war, bestimmt. Die Proben wurden in einer Konzentration von 1 mg/mL in Chloroform gelöst, Proben von 50 μL wurden injiziert und mit 1 mL/min eluiert. Der Nachweis erfolgte mittels eines Differenzialrefraktometers.
Die Proteinproben wurden durch Inkubation in einem Bad mit siedendem Wasser (3 Minuten) in Gegenwart von 2-Mercaptoethanol und Natriumdodecylsulfat denaturiert und anschließend auf 10%igen, 15%igen oder 10–20%igen Natriumdodecylsulfat-Polyacrylamid-Gelen (SDS-PAGE) aufgetrennt. Nach dem Transfer der Proteine auf Nitrocellulosemembranen auf einem Träger (Gibco-BRL, Gaithersburg, Maryland) wurden die 3-Ketoacyl-CoA-Thiolase, die Acetoacetyl-CoA-Reduktase und die PHB-Polymerase mittels polyklonaler Antikörper, die in Kaninchen gegen diese Enzyme gewonnen wurden, und Meerrettichperoxidase-markierter sekundärer Antikörper, gefolgt von einem Chemilumineszenznachweis (USB/Amersham), detektiert.
Die Aktivitäten der β-Ketothiolase und der NADP-spezifischen Acetoacetyl-CoA-Reduktase wurden wie von Nishimura et al. (1978, Arch. Microbiol. 116, 21–24) bzw. Saito et al. (1977, Arch. Microbiol. 114, 211–217) beschrieben gemessen. Die Aktivität der Acetoacetyl-CoA-Thiolase wird als Abbau eines Mg²⁺-Acetoacetyl-CoA-Komplexes über das Verfolgen der Abnahme der Extinktion bei 304 nm nach Zugabe von zellfreiem Extrakt mittels eines Spektralphotometers von Hewlett-Packard gemessen. Die Aktivität der Acetoacetyl-CoA-Reduktase wird über das Verfolgen der Umwandlung von NADPH in NADP bei 340 nm mittels eines Spektralphotometers von Hewlett-Packard gemessen.
Beispiel 1: Konstruktion eines Thiolase-Reduktase-Fusionsproteins (Thredase)
Das Plasmid pTrcAB11 wurde mittels der folgenden Techniken im Wesentlichen so konstruiert, wie es in der 2 veranschaulicht ist. Das phbA-Gen aus A. eutrophus wurde aus dem Plasmid pAeT413, einem Derivat des Plasmids pAeT41 (Peoples, O.P. und Sinskey, A.J., 1989, J. Biol. Chem. 264, 15298–15303), durch Thermal Cycling (30 Zyklen von 40 s bei 94°C, 40 s bei 65°C und 2 min bei 72°C, gefolgt von einem abschließenden Verlängerungsschritt bei 72°C für 7 min) mit den folgenden Primern amplifiziert. Die DNA-Sequenz und die Aminosäuresequenz von phbA aus A. eutrophus sind in SEQ ID NO: 1 und SEQ ID NO: 2 gezeigt.

A1FKpn (GGGGTACCAGGAGGTTTTTATGACTGACGTTGTCATCGTATCC) (SEQ ID NO: 3)
A1F-Bam (CGCGGATCCTTTGCGCTCGACTGCCAGCGCCACGCCC) (SEQ ID NO: 4)

B1L-Bam (CGCGGATCCATGACTCAGCGCATTGCGTATGTGACC) (SEQ ID NO: 7)
B1L-Xba (GCTCTAGATCAGCCCATATGCAGGCCGCCGTTGAGCG) (SEQ ID NO: 8)

B1L-Bam enthält ein Initiationscodon ATG neben der BamH1-Stelle, aber keine Signale für die Initiation der Translation; B1L-Xba enthält das Stopcodon TGA für die Translation. Das amplifizierte phbA-Gen wurde dann mit Kpn1 und BamH1 verdaut, und das amplifizierte phbB-Gen wurde mit BamH1 und XbaI verdaut. Nach dem Verdau wurde das phbA-Gen in pTrcN kloniert, das zur Erzeugung von pTrcAF mit Kpn1 und BamH1 verdaut worden war, und das phbB-Gen wurde zur Erzeugung von pTrcBL in das BamH1/XbaI-verdaute pTrcN kloniert.
Nach der Bestätigung der DNA-Sequenz des Inserts wurde phbB als BamH1/XbaI-Fragment aus pTrcBL in BamH1/XbaI-verdautes pTrcAF kloniert, was zum Plasmid pTrcAB11 führte. Das resultierende hybride Gen codiert für eine Thiolase-Glycin-Serin-Reduktase-Fusion. Die DNA-Sequenz und die Aminosäuresequenz der AB11-Fusion sind in SEQ ID NO: 9 und SEQ ID NO: 10 gezeigt.
Das Einfügen der BamH1-Stelle zwischen phbA and phbB führt zu einem Glycin-Serin-Linker, der das Thiolase- und das Reduktase-Enzym verbindet, und der anschließend zur Veränderung der Länge und/oder der Sequenz der Linkerregion modifiziert werden konnte. Verschiedene derartige Derivate von pTrcAB11 wurden wie folgt konstruiert: pTrcAB11 wurde mit BamH1 verdaut, und das linearisierte Fragment wurde gereinigt und mit der alkalischen Phosphatase aus der Garnele dephosphoryliert.
Es wurden Oligonucleotide für die Insertion der folgenden DNA-Fragmente in die BamH1-Stelle konstruiert. Die durch sie codierte Aminosäuresequenz wird angegeben:

L5A 5' GATCTACCG 3' (SEQ ID NO: 11)
L5B 3' ATGGCCTAG 5' (SEQ ID NO: 12)
G S T G S (SEQ ID NO: 13)

Die Oligonucleotide L5A und L5B (500 pmol) wurden mittels der T4-Polynucleotidkinase phosphoryliert und hybridisiert (133 pmol eines jeden Primers) und in das linearisierte pTrcAB11 ligiert. Die Ligationsmischung wurde in E. coli MBX240 elektroporiert, und Plasmide mit dem zwischen dem Thiolase- und dem Reduktase-Gen eingefügten Linker wurden über einen Verdau mit dem Restriktionsenzym BsaWI identifiziert.
Die Nützlichkeit der Fusionskonstrukte wurde über ihr Transformieren in E. coli MBX240 und das Überprüfen der Integrität der Fusion auf der Polypeptidebene durch Immunblotting, auf der Proteinebene durch Enzymtests und hinsichtlich der Erzeugung von PHB untersucht. MBX240 wurde aus E.-coli-XL1-blue über die Integration des phaC-Gens von A. eutrophus gewonnen (Peoples, O.P. und Sinskey, A.J., 1989, J. Biol. Chem. 264, 15298–15303). Ein alternativer Ansatz zur Gewinnung des Stammes mit der Integration wäre gewesen, die PHB-Synthase durch eine kompatibles Plasmid zu exprimieren.
Rekombinante Stämme, die das passende Fusionsplasmid enthielten, ließ man über Nacht in 2xYT/1% Glucose/100 μg/ml Ampicillin bei 30°C wachsen. Die gewachsene Kultur wurde 1:100 mit 50 mL frischem 2xYT/1% Glucose/100 μg/ml Ampicillin verdünnt und bei 30°C inkubier. Es wurden zwei identische Kulturen angeimpft, von denen die eine mit IPTG induziert wurde und die andere nicht. Sobald die Kultur einen OD₆₀₀-Wert von 0,6 erreichte, wurden Proben mit einer Endkonzentration von 1 mM IPTG induziert. Die Zellen wurden 24 Stunden nach der Induktion durch Aufteilen in zwei Proben von 50 mL und 10-minütige Zentrifugation bei 3000 × g geerntet. Proben mit ganzen Zellen wurden für die Analyse des PHB-Gehalts aufgehoben. Die zweite Gruppe von Pellets wurde in 0,75 mL Lysierpuffer (50 mM Tris, 1 mM EDTA, 20% Glycerol, pH 8,2) resuspendiert und sonifiziert (50% Ausgangsleistung, 2 min bei 50%). Der rohe Extrakt wurde dann zentrifugiert (10 min, 3000 × g, 4°C), und der Überstand und das Pellet wurden auf 10%igen SDS-PAGE-Gelen aufgetrennt und über eine Coomassie-Färbung und mittels Immunblotting analysiert. Immunblots wurden mit einem Kaninchen-Antikörper gegen die A.-eutrophus-Thiolase und einem Kaninchen-Antikörper gegen die A.-eutrophus-Reduktase analysiert. Beide Antikörper reagierten mit einem Protein von Mr = 62 kDa, das im Kontrollstamm, MBX240 mit lediglich dem Vektor pTrcN, nicht vorkam. Es wurde keine Kreuzreaktivität des Anti-Thiolase-Antikörpers mit einem Polypeptid von Mr = 42 kDa oder des Reduktase-Antikörpers mit einem Polypeptid von Mr = 26 kDa beobachtet. Das lösliche Protein wurde dann auf Thiolase- und Reduktase-Aktivität untersucht.
Die Ergebnisse dieser Analysen sind in der Tabelle 1 für pTrcAB11 und fünf Derivate mit modifizierten Linkern gezeigt. Tabelle 1: Aktivitäten der Fusionsenzyme

^a in pTrcN eingefügtes Konstrukt, L5-n bezeichnet eine Fusion von AB11 mit einem aus der L5-Oligonucleotidgruppe gewonnenen Linker;
^b die Kultur wurde bei OD₆₀₀ 24 Stunden mit 1 mM IPTG induziert (+) oder nicht induziert (–);
^c Thiolase- und Reduktase-Aktivität in U/mg roher Proteinextrakt;
^d akkumuliertes PHB als prozentualer Anteil des Trockengewichts der Zellen

Die in der Tabelle 1 gezeigten Ergebnisse machen deutlich, dass diese Thiolase-Reduktase-Fusionen beide Enzymaktivitäten besitzen und zur Bildung hoher PHB-Gehalte führen.
Die durch pTrcAB11 codierte Fusion wurde partiell gereinigt. Eine Kultur von E.-coli-Zellen des Stammes MBX240 (XL1-Blue::phbC150) [pTrcAB11], die bei 16°C 33 Stunden gewachsen war (5,5 g), wurde in 11 mL Lysierpuffer (50 mM Tris, 1 mM EDTA, 0,05% (Gew./Vol.) Hecameg, 20% Glycerol, pH 8,0) resuspendiert und sonifiziert (Leistungsabgabe 50%, 2 min bei 50%). Der rohe Extrakt wurde dann zentrifugiert (10 min, 3000 × g, 4°C), und der Überstand wurde auf eine voräquilibrierte Toyopearl-DEAE-650S-Säule (Rohm & Haas, Pennsylvania) (16,5 × 3,0 cm) in 50 mM NaCl aufgetragen. Das nicht gebundene Protein wurde mit 50 mM NaCl (300 mL) von der Säule gewaschen, und danach wurde das gebundene Protein mit einem NaCl-Gradienten von 50–500 mM (400 mL Gesamtvolumen) eluiert. Fraktionen, die sowohl Thiolase- als auch Reduktase-Aktivität (eluiert bei 250 mM NaCl) enthielten, wurden gepoolt und auf einer 50 000-MW-Spinsäule (Amicon) konzentriert/entsalzt. Die aktive Proteinprobe wurde weiter über eine BLUE-SEPHAROSE^TM-CL6B-Säule (Pharmacia Biotech AB, Schweden) (10,5 cm × 2,6 cm) unter Verwendung des gleichen Puffers wie für die DEAE-Säule, aber mit anderen NaCl-Konzentrationen, gereinigt. Das nicht gebundene Protein wurde mit 250 mM NaCl (200 mL) von der Säule gewaschen, und das verbliebene Protein wurde in zwei Schritten mit 750 mM NaCl und 2 M NaCl eluiert. Zwei Drittel der Thiolase- und Reduktase-Aktivitäten wurden im Schritt mit 750 mM NaCl gewonnen, und der Rest eluierte im Schritt mit 2 M NaCl. Die Fraktionen, die sowohl Thiolase- als auch Reduktase-Aktivität enthielten, wurden wieder gepoolt und über eine 50 000-MW-Spinsäule konzentriert/entsalzt. Die Präparation des Fusionsproteins wurde mittels SDS-PAGE analysiert, und die Proteine wurden entweder durch Färben mit Coomassie-Blue oder durch Western-Blot-Analyse unter Einsatz von Antikörpern gegen die β-Ketothiolase und die Acetoacetyl-CoA-Reduktase nachgewiesen. Fraktionen, die sowohl β-Ketothiolase- als auch Acetoacetyl-CoA-Reduktase-Aktivität enthielten, führten zu nur einer Proteinbande mit einem apparenten Molekulargewicht von 60 kDa, die mit beiden Antikörpern reagierte, was bestätigte, dass beide Enzymaktivitäten auf nur einer Polypeptidkette vorhanden waren, die durch ein einziges Gen codiert wurde.
Beispiel 2: Konstruktion eines Reduktase-Thiolase-Fusionsproteins
Es wurde ein hybrides Gen, das ein Reduktase-Glycin-Serin-Thiolase-Enzym exprimiert, aus PCR-Produkten, die das Reduktase- und das Thiolase-Gen enthielten konstruiert. Die folgenden Primer

B1F-Kpn (GGGGTACCAGGAGGTTTTTATGACTCAGCGCATTGCGTATGTGACC) (SEQ ID NO: 14)
B1F-BamH1 (CGCGGATCCGCCCATATGCAGGCCGCCGTTGAGCG) (SEQ ID NO: 15)
A1L-BamH1 (CGCGGATCCATGACTGACGTTGTCATCGTATCC) (SEQ ID NO: 16)
A1L-XbaI (GCTCTAGATTATTTGCGCTCGACTGCCAGCGCCACGCCC) (SEQ ID NO: 17)

Das amplifizierte phbB-Gen wurde mit Kpn1 und BamH1 verdaut und dann zur Erzeugung von pTrcBF in die KpnI-BamH1-Stelle von pTrcN kloniert. Das amplifizierte phbA-Gen wurde mit BamH1 und XbaI verdaut und in die BamH1-XbaI-Stelle von pTrcN kloniert, wodurch das Plasmid pTreAL erhalten wurde. Das phbB-Gen von pTrcBF wurde mit BamH1-Kpn1 verdaut, und das Fragment wurde in die BamH1-Kpn1-Stelle von pTrcAL eingefügt, wodurch das Plasmid pTrcBA erhalten wurde, was letztlich zu einem Fusionsgen führte, das für Reduktase-Glycin-Serin-Thiolase in einem Polypeptid codierte. Die DNA-Sequenz und die Aminosäuresequenz der B1A1-Fusion sind in SEQ ID NO: 18 und SEQ ID NO: 19 gezeigt.
Beispiel 3: Konstruktion von PHA-Synthase-ACP::CoA-Transferase-Fusionen
Das phaC1-Gen, das für die PHA-Synthase 1 von P. oleovorans codiert (Huisman et al., 1991, J. Biol. Chem. 266, 2191–2198) (C3), kann über die Polymerase-Kettenreaktion mittels der folgenden Primer amplifiziert werden. Die DNA-Sequenz und die Aminosäuresequenz des phbC1-Gens von P. oleovorans sind in SEQ ID NO: 20 und SEQ ID NO: 21 gezeigt.

C3 up I 5' g-GAATTC-aggaggtttt-ATGAGTAACAAGAACAACGATGAGC 3' (SEQ ID NO: 22)
C3 up II 5' CG-GGATCC-acgctcgtgaacgtaggtgccc 3' (SEQ ID NO: 23)
C3 dw I 5' CG-GGATCC-AGTAACAAGAACAACGATGAGC 3' (SEQ ID NO: 24)
C3 dw II 5' GC-TCTAGA-AGCTT-TCAACGCTCGTGAACGTAGGTGCCC 3' (SEQ ID NO: 25)

Das phaG-Gen, das für die Acyl-ACP::CoA-Transferase von P. putida codiert (G3), kann über die Polymerase-Kettenreaktion mittels der folgenden Primer amplifiziert werden. Die DNA-Sequenz und die Aminosäuresequenz des phaG-Gens von P. putida sind in SEQ ID NO: 26 und SEQ ID NO: 27 gezeigt.

G3 dw I 5' CG-GGATCC-AGGCCAGAAATCGCTGTACTTG 3' (SEQ ID NO: 28)
G3 dw II 5' GC-TCTAGA-AGCTT-TCAGATGGCAAATGCATGCTGCCCC 3' (SEQ ID NO: 29)
G3 up I 5' G-GAATTC-AGGAGGTTTT-ATGAGGCCAGAAATCGCTGTACTTG 3' (SEQ ID NO: 30)
G3 up II 5' CG-GGATCC-GATGGCAAATGCATGCTGCCCC 3' (SEQ ID NO: 31)

Beispiel 4: Konstruktion von PHA-Synthase-Hydratase-Fusionen
Das phaG-Gen, das für eine PHB-Synthasefusion von Z. ramigera (C5) codiert, wurde über die Polymerase-Kettenreaktion mittels der folgenden Primer amplifiziert. Die DNA-Sequenz und die Aminosäuresequenz des phbC-Gens von Z. ramigera sind in SEQ ID NO: 36 und SEQ ID NO: 37 gezeigt.

C5 up I 5' G-GAGCTC-AGGAGGTTTT-ATGAGTAACAAGAACAACGATGAGC 3' (SEQ ID NO: 38)
C5 up II 5' CG-GGATCC-GCCCTTGGCTTTGACGTAACGG 3' (SEQ ID NO: 39)
C5 dw I 5' CG-GGATCC-AGTAACAAGAACAACGATGAGC 3' (SEQ ID NO: 40)
C5 dw II 5' GC-TCTAGA-AGCTT-TCAGCCCTTGGCTTTGACGTAACGG 3' (SEQ ID NO: 41)

Das phaJ-Gen, das für die (R)-spezifische Enoyl-CoA-Transferase von A. caviae (J12) codiert, kann über die Polymerase-Kettenreaktion mittels der folgenden Primer amplifiziert werden. Die DNA-Sequenz und die Aminosäuresequenz des phbJ-Gens von A. caviae sind in SEQ ID NO: 42 und SEQ ID NO: 43 gezeigt.

J12 dw I 5- CG-GGATCC-AGCGCACAATCCCTGGAAGTAG 3' (SEQ ID NO: 44)
J12 dw II 5' GC-TCTAGA-AGCTT-TTAAGGCAGCTTGACCACGGCTTCC 3' (SEQ ID NO: 45)
J12 up I 5' AG-GAGCTC-AGGAGGTTTT-ATGAGCGCACAATCCCTGGAAGTAG 3' (SEQ ID NO: 46)
J12 up II 5' CG-GGATCC-AGGCAGCTTGACCACGGCTTCC 3' (SEQ ID NO: 47)

Beispiel 5: Konstruktion von Thiolase-Reduktase Fusionen mit breitem Substratbereich
Das bktB-Gen, das für die Thiolase II von R. eutropha codiert (Slater et al., J. Bacteriol. (1998) 180, 1979–1987) (A1-II), kann über die Polymerase-Kettenreaktion mittels der folgenden Primer amplifiziert werden. Die DNA-Sequenz und die Aminosäuresequenz des bktB-Gens von R. eutropha sind in SEQ ID NO: 52 und SEQ ID NO: 53 gezeigt.

A1-II up I 5' G-GAATTC-AGGAGGTTTT-ATGACGCGTGAAGTGGTAGTGGTAAG 3' (SEQ ID NO: 54)
A1-II up II 5' CG-GGATCC-GATACGCTCGAAGATGGCGGC 3' (SEQ ID NO: 55)
A1-II dw I 5' CG-GGATCC-ACGCGTGAAGTGGTAGTGGTAAG 3' (SEQ ID NO: 56)
A1-II dw II 5' GC-TCTAGA-AGCTT-TCAGATACGCTCGAAGATGGCGGC 3' (SEQ ID NO: 57)

Das phaB-Gen, das für die Acyl-CoA-Reduktase von R. eutropha (B1) codiert, wird über die Polymerase-Kettenreaktion mittels der im Beispiel 1 beschriebenen Primer amplifiziert. Fusionen von A1-II und B1 werden anschließend durch das Klonieren entweder der PCR-Produkte A1-II up und B1 dw oder der PCR-Produkte B1 up und A1-II dw als EcoR1-BamH1- und BamH1-HindIII-Fragmente in pTrcN erzeugt. Die resultierenden Plasmide codieren entweder für ein Thiolase-Reduktase- (A1-IIB1) oder ein Reduktase-Thiolase-Fusionsenzym (B1A1-II)). Die DNA-Sequenz und die Aminosäuresequenz von A1-IIB1 sind in SEQ ID NO: 58 und SEQ ID NO: 59 gezeigt, und die DNA-Sequenz und die Aminosäuresequenz des B1A1-II-Gens sind in SEQ ID NO: 60 und SEQ ID NO: 61 gezeigt.
Modifikationen und Variationen der vorliegenden Erfindung werden für Fachleute auf diesem Gebiet im Hinblick auf die obige detaillierte Beschreibung offensichtlich sein.
SEQUENZPROTOKOLL

Claims

Bifunktionelles Fusionsprotein mit einer Formel, die aus der Gruppe ausgewählt ist, die aus E1-L_n-E2 und E2-L_n-E1 besteht, wobei E1 und E2 aufeinanderfolgende Reaktionen in einem Biosyntheseweg für Polyhydroxyalkanoate katalysieren und beide aus der Gruppe ausgewählt sind, die besteht aus β-Ketothiolasen, Acyl-CoA-Reduktasen, Polyhydroxyalkanoat-synthasen, Polyhydroxybutyratsynthasen, Phasinen, Enoyl-CoA-Hydratasen und Beta-Hydroxyacyl-ACP::Coenzym-A-Transferase, wobei der Linker L_n ein Peptid aus n Aminosäuren ist, die E1 mit E2 oder E2 mit E1 verknüpfen, und wobei das bifunktionelle Fusionsprotein die Enzymaktivitäten von E1 und E2 besitzt.
Fusionsprotein nach Anspruch 1, wobei E1 und E2 aus der Gruppe ausgewählt sind, die besteht aus β-Ketothiolase (phbA) und Acyl-CoA-Reduktase (phbB), phbB und phbA, PHA-Synthase (phaC) und Phasin (phaP), phaP und phaC, phaC und Beta-Hydroxyacyl-ACP::Coenzym-A-Transferase (phbG), phbG und phaC, phaC und Enoyl-CoA-Hydratasen (phaJ) sowie phaJ und phaC.
Fusionsprotein nach Anspruch 1, wobei n im Linker zwischen null und 50 Aminosäuren liegt.
Fusionsprotein nach Anspruch 1, wobei der Linker Glycin-Serin ist.
Fusionsprotein nach Anspruch 1, exprimiert in einer Pflanze.
Fusionsprotein nach Anspruch 1, exprimiert in einem Bakterium.
Polynucleotid, das für ein bifunktionelles Fusionsprotein, wie es durch einen beliebigen der Ansprüche 1 bis 4 definiert ist, codiert.
Polynucleotid nach Anspruch 7, das einen Promotor für die Expression in Pflanzen umfasst.
Polynucleotid nach Anspruch 8, das einen für die Expression in einem Gewebe, einer Plastide oder einem anderen Organ spezifischen Promotor umfasst.
Polynucleotid nach Anspruch 8, das einen regulierbaren Promotor umfasst.
Pflanze, die ein Polynucleotid gemäß einem beliebigen der Ansprüche 7–10 umfasst.
Pflanze, die ein bifunktionelles Fusionsprotein gemäß einem beliebigen der Ansprüche 1 bis 4 exprimiert.
Bakterium, das ein Polynucleotid gemäß einem beliebigen der Ansprüche 7–10 umfasst.
Bakterium, das ein bifunktionelles Fusionsprotein gemäß einem beliebigen der Ansprüche 1 bis 4 exprimiert.