CN106133140A - 具有增加的葡糖胺含量的棉纤维 - Google Patents

具有增加的葡糖胺含量的棉纤维 Download PDF

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Abstract

提供了分离的核酸分子，该分离的核酸分子包括对来自大肠杆菌的谷氨酰胺:果糖‑6‑磷酸氨基转移酶进行编码的、特别适合于在棉花植物细胞中表达的核苷酸序列。本发明还涉及在其细胞壁中产生增加量的带正电的多糖的植物细胞或植物、具体地是棉花植物细胞或棉花植物。此外提供了增加在棉花细胞的细胞壁中的、具体地在棉纤维中的带正电的多糖的含量的方法和手段。从这类棉花植物获得的纤维具有改变的化学反应性，该改变的化学反应性可以用于将反应性染料或其他纺织品整理试剂附着至这些纤维。

Description

具有增加的葡糖胺含量的棉纤维
发明领域
本发明涉及棉纤维的化学反应性的修饰。具体而言，本发明提供了包括带正电的寡糖例如寡聚N-乙酰葡糖胺或寡聚葡糖胺的棉纤维。由于氨基基团，这些纤维具有修饰的反应性，该修饰的反应性可以用于将其他物质附着至纤维以改变纤维的特征。此类物质可以例如是反应性染料或其他反应物，例如阻燃剂、防水剂、防油剂和防污剂、抗皱剂、软化剂、抗静电剂、荧光增白剂等。
本发明提供了用于增加在棉花植物细胞例如纤维细胞中葡糖胺寡聚物的产生效率的方法和手段。
发明背景
棉纤维是世界范围内唯一最重要的纺织原料。全球每年收获约八千万英亩棉花。按英亩土地面积生产量而言，棉花是美国第五大作物，在2006年至2008年平均种植一千零三十万英亩。世界范围内种植的棉花中大约90％是陆地棉(Gossypium hirsutum L.)，而海岛棉(Gossypium barbadense)占大约8％。
然而，像其他包含天然纤维素的纤维一样，棉纤维不具有合成性纤维的化学多功能性，这是由于纤维素中β-1-4连接的葡萄糖单体的相对惰性性质。这种相对惰性性质例如在棉纤维和织物的染色工艺期间是明显的。
大体上两种类型的染料用于为棉花着色：直接染料和纤维反应性染料，两者均是阴离子型分子。棉花本身在水中产生阴离子电荷，使得在没有特殊处理的情况下，由纤维或织物来摄取染料是相当费力的。直接染料与纤维素聚合物产生相对弱的氢键，形成半永久性附着。与纤维反应性染料相比，直接染料更易于使用并且不太昂贵，但不耐受良好的洗涤。纤维反应性染料是组合了生色团与反应性基团的分子，该反应性基团通过与羟基基团反应与纤维形成强共价键。这些共价键为经染色的纤维提供了良好的抗洗涤抗性。不褪色性可以使用阳离子固定剂来改进。
在使用反应性染料的染色工艺期间，需要大量的电解质来隔离阴离子染料与阴离子纤维电荷。未反应的染料(高达40％)需要通过洗涤步骤来去除，产生大量的还包含上述电解质的废水。
例如通过掺入带正电的化合物如带正电的多糖来提供具有正电荷的纤维素纤维，可以因此改进天然纤维素纤维的可染性，并且改进经修饰的纤维素纤维与带负电的化合物的任何化学反应。这还使得酸性染料的使用成为可能。
若干公开物已经描述了向纤维素纤维中掺入或包覆壳聚糖寡聚物以制备壳聚糖/纤维素共混物、纱线或织物。壳聚糖是带正电的葡糖胺聚合物，它可以通过几丁质的脱乙酰作用(例如通过碱处理)来获得。几丁质本身是1-4连接的N-乙酰葡糖胺(GlcNAc)的聚合物。基于壳聚糖在抑制例如皮肤真菌中的生理学功能，许多功能衣物、织物和纤维采用纤维素-壳聚糖共混纤维、纤维素纤维-壳聚糖缀合物以及用含壳聚糖树脂包覆的织物。
美国专利申请US 2003/0134120描述了用壳聚糖来包覆天然纤维。
刘(Liu)等人(碳水化合物聚合物(Carbohydrate Polymers)44(2003)233-238)描述了一种用于用壳聚糖包覆棉纤维的方法，其是通过在60℃于水中用高碘酸钾氧化棉线并且随后用壳聚糖于水性乙酸中的溶液进行处理。通过用壳聚糖包覆，棉纤维表面变得在生理学和生物学上有活性。由于氨基基团比纤维素单体的羟基基团的化学反应性大，纤维具有更大的进行进一步化学修饰的潜力。此外，棉纤维的光滑表面变得粗糙，表明用于药物吸收和其控制释放的更大的潜力。
WO 2006/136351提供了用于通过将带正电的寡糖或多糖包含到细胞壁中来修饰植物细胞壁(特别是可见于产纤维植物的天然纤维中的细胞壁)的反应性的方法和手段。这可以便利地通过表达嵌合基因来实现，该嵌合基因编码N-乙酰葡糖胺转移酶，具体地为能够靶向于植物细胞中高尔基体膜的N-乙酰葡糖胺转移酶。这些应用之一是增加的可染性。
WO 2011/089021提供了用于修饰植物次生细胞壁(特别是在发现于棉纤维中的棉花细胞壁中的)的反应性的方法和手段。这可以便利地通过在棉花植物中表达对同丝水霉(Saprolegnia monoica)几丁质合酶进行编码的嵌合基因来实现。
WO 2012/048807提供了用以在植物细胞壁中产生带正电的寡糖的可替代方法和手段，其是通过向所述植物细胞中引入与异源高尔基体信号锚定序列融合的结瘤C(NOD C)蛋白。
多糖几丁质是从N-乙酰葡糖胺残基构建的。它合成自UDP-N-乙酰葡糖胺，UDP-N-乙酰葡糖胺是在植物中也有活性的己糖胺生物合成途径的终产物(迈尔(Mayer)等人1968，植物生理学(Plant Physiol.)43，1097-1107)。这个途径的第一个且限速的步骤是谷氨酰胺转化为葡糖胺-6-磷酸，该转化是由谷氨酰胺:果糖-6-磷酸-氨基转移酶(GFAT)催化的。
WO 2007/039314描述了具有透明质酸合酶活性并且另外具有增加的谷氨酰胺:果糖-6-磷酸-氨基转移酶(GFAT)活性的转基因植物。与仅具有透明质酸合酶活性的植物相比，这些植物合成增加量的透明质酸。像几丁质一样，透明质酸合成自UDP-N-乙酰葡糖胺。
WO 2011/089021披露了包括在棉花选择性启动子的控制之下的嵌合几丁质合酶基因和嵌合谷氨酰胺:果糖-6-磷酸-氨基转移酶基因的转基因棉花植物。来自这些转基因棉花植物的纤维具有遍及细胞壁均匀分布的增加量的N-乙酰葡糖胺聚合物。
然而对于改进的用以产生包括增加水平的带正电的多糖(例如寡聚N-乙酰葡糖胺或寡聚葡糖胺)的棉纤维的方法和手段仍存在需要。这些和其他问题如在下文概述、详细实施例、实例、附图和权利要求书中所描述的来解决。
发明概述
本发明示出包括以下项的嵌合基因在植物细胞例如棉花植物细胞中的表达
(a)根据SEQ ID 1的核苷酸序列，或
(b)其变体，该变体与SEQ ID 1的不同之处在于一个或多个核苷酸，其条件是总计它与SEQ ID 1的不同之处在于不超过20个核苷酸，(其编码根据SEQ ID 2的谷氨酰胺:果糖-6-磷酸-氨基转移酶(GFAT)多肽)出乎意料地导致细胞的葡糖胺含量增加。
在第二实施例中，本发明提供了嵌合基因，该嵌合基因包括以下可操作地连接的DNA区域：
(a)植物表达型启动子，例如纤维优先型启动子，
(b)编码GFAT多肽的DNA区域，其中所述GFAT是由根据SEQ ID 1的核苷酸序列或其所述变体编码，以及
(c)任选地在转录终止和多腺苷酸化中涉及的DNA区域。
在另一个实施例中，本发明提供了棉花植物细胞，该棉花植物细胞包括嵌合基因，该嵌合基因包括以下可操作地连接的DNA区域：
(a)植物表达型启动子，例如纤维优先型启动子，
(b)编码GFAT多肽的DNA区域，其中所述GFAT是由根据SEQ ID 1的核苷酸序列或其所述变体编码，以及
(c)任选地在转录终止和多腺苷酸化中涉及的DNA区域。
在一些实施例中，本发明提供了植物细胞，该植物细胞除了所述第一嵌合基因之外还包括第二嵌合基因，该第二嵌合基因包括以下可操作地连接的DNA区域：
(a)植物表达型启动子，例如纤维优先型启动子，
(b)编码几丁质合酶多肽的DNA序列，以及
(c)任选地在转录终止和多腺苷酸化中涉及的DNA区域。
在又另一个实施例中，本发明提供了由如在此描述的植物细胞组成的棉花植物。
本发明还提供了可以获得自如在此描述的植物的纤维，例如棉纤维。另外，提供了由这些纤维制成的纱线或织物。
在本发明的另一个实施例中，提供了一种产生具有带正电的多糖例如寡聚N-乙酰葡糖胺或寡聚葡糖胺的棉纤维的方法，该方法包括以下步骤
i)在棉花植物细胞中表达嵌合基因，该嵌合基因包括根据本发明的GFAT编码核苷酸序列，
ii)从步骤i)的棉花植物细胞再生棉花植物，并且
iii)任选地从所述棉花植物分离纤维。
在本发明的又另一个实施例中，所述的产生具有带正电的多糖的棉纤维的方法包括以下步骤
i)表达第一嵌合基因和第二嵌合基因，该第一嵌合基因包括如在此前描述的GFAT编码核苷酸序列，该第二嵌合基因包括编码几丁质合酶的核苷酸序列，
ii)从步骤i)的棉花植物细胞再生棉花植物，并且
iii)任选地从所述棉花植物分离纤维。
本发明进一步涉及如在此描述的核酸分子用以产生在纤维中具有带正电的多糖的棉花植物的用途。
本发明还涉及如在此描述的核酸分子用以增加棉纤维中带正电的多糖的量的用途。
附图说明
图1：合成的核酸分子的核苷酸序列(SEQ ID 1)，其编码大肠杆菌的根据SEQ ID 2的谷氨酰胺:果糖-6-磷酸氨基转移酶(GFAT)。
图2：大肠杆菌的谷氨酰胺:果糖-6-磷酸氨基转移酶的氨基酸序列(SEQ ID 2)。
发明详述
本发明是基于出乎意料的发现：在植物细胞中，具体地在棉花植物的棉花植物细胞中，对谷氨酰胺:果糖-6-磷酸-氨基转移酶(GFAT)进行编码的根据SEQ ID 1的核苷酸序列的表达导致在植物细胞或此类植物的纤维(例如棉纤维)中，相比于在不包括GFAT蛋白的植物细胞或纤维中或者相比于在表达本领域已知的、并未针对在棉花植物细胞中的表达进行优化的GFAT编码基因的植物细胞中，产生增加量的带正电的多糖，例如寡聚N-乙酰葡糖胺或寡聚葡糖胺。
这个出乎意料的发现还可以通过在植物细胞中，具体地在棉花植物细胞中表达SEQ ID 1的变体来实现，该变体编码根据SEQ ID 2的谷氨酰胺:果糖-6-磷酸-氨基转移酶，其中所述变体与SEQ ID 1的不同之处在于一个或多个核苷酸，其条件是总计它与SEQ ID 1的不同之处在于不超过20个核苷酸。
因此，在第一实施例中，本发明提供了分离的核酸分子，该分离的核酸分子包括
i)根据SEQ ID 1的核苷酸序列，
ii)或其变体，其中一个或多个核苷酸不同于SEQ ID 1的核苷酸序列，其条件是所述变体与SEQ ID 1的不同之处在于不超过20个核苷酸，其编码根据SEQ ID 2的谷氨酰胺:果糖-6-磷酸-氨基转移酶(GFAT)
iii)或i)或ii)的互补序列。
SEQ ID 1编码来自大肠杆菌的谷氨酰胺:果糖-6-磷酸-氨基转移酶。该蛋白质的相应氨基酸序列描述于SEQ ID 2中。这种酶催化果糖-6-磷酸和谷氨酰胺转化为葡糖胺-6-磷酸和作为副产物的谷氨酸盐。这已经描述于WO2007/039314中用于在植物中产生透明质酸。在己糖胺途径期间，葡糖胺-6-磷酸被进一步转化为UDP-N-乙酰葡糖胺，UDP-N-乙酰葡糖胺进而充当用于合成糖胺聚糖(例如透明质酸或几丁质)的起始材料，如果适当的酶存在的话。
WO 2007/039314披露了GFAT核苷酸序列，该核苷酸序列是衍生自编码GFAT的大肠杆菌基因但针对在植物细胞中密码子的使用进行了适配。在本申请中披露为SEQ ID 1的核苷酸序列与在WO 2007/039314中描述的核苷酸序列有约25％的不同。当在WO 2007/039314中披露的序列被总体上针对在植物细胞中的表达进行优化时，包括根据SEQ ID 1的核苷酸序列的嵌合基因的表达导致在棉花细胞中特别好的结果。包括根据SEQ ID 1的植物表达型核苷酸序列或其变体(该变体编码根据SEQ ID 2的来自大肠杆菌的GFAT蛋白，并且与SEQID 1的不同之处在于一个或多个核苷酸，其条件是总计它与SEQ ID 1的不同之处在于不超过20个核苷酸)的棉花细胞，或者由此类棉花植物细胞构成的棉花植物，与表达如在WO2007/039314中披露的核苷酸序列的棉花细胞或由此类棉花细胞构成的植物相比，产生增加量的葡糖胺(参见实验数据)。
如在此使用的，“与SEQ ID 1具有不超过20个核苷酸的差异”意指例如与SEQ ID 1具有20nt、19nt、18nt、17nt、16nt、15nt、14nt、13nt、12nt、11nt、10nt、9nt、8nt、7nt、6nt、5nt、4nt、3nt、2nt或1nt的差异，同时仍编码根据SEQ ID 2的谷氨酰胺:果糖-6-磷酸-氨基转移酶(GFAT)。
核酸可以是单链或双链DNA或RNA。核酸可以化学合成或通过体外或甚至体内的生物表达而产生。可以使用适当受保护的核糖核苷亚磷酰胺和常规的DNA/RNA合成仪来用化学方法合成核酸。与本披露的嵌合基因相关，DNA包括cDNA和基因组DNA。
在本发明的另一个实施例中，提供了嵌合基因，该嵌合基因包括为可操作地连接的DNA区域
(a)植物表达型启动子，例如纤维优先型启动子，
(b)编码GFAT多肽的DNA区域，其中所述GFAT是由如在此上文所述的核苷酸序列编码，以及
(c)任选地在转录终止和多腺苷酸化中涉及的DNA区域。
如在此使用的，术语“植物表达型启动子”意为能够控制(启动)植物细胞中的转录的DNA序列。这包括植物来源的任何启动子，但还有任何非植物来源的能够在植物细胞中引导转录的启动子，即病毒或细菌来源的某些启动子，例如CaMV35S、地三叶草病毒启动子4号或7号(WO 9606932)或T-DNA基因启动子等。
在本发明的一个实施例中，该启动子可以是并非天然地与它可操作地连接的DNA区域相关联的异源启动子。
应清楚的是组成型的植物表达型启动子可以适于本发明。组成型启动子的实例包括来自肌动蛋白基因的启动子(麦克尔罗伊(McElroy)等人(1990)植物细胞(Plant Cell)2:163-171)，CaMV35S启动子(奥德尔(Odell)等人(1985)自然(Nature)313:810-812)，CaMV19S启动子(尼尔森(Nilsson)等人(1997)生理学植物(Physiol.Plant.)100:456-462)，GOS2启动子(德佩特(de Pater)等人(1992)植物杂志(Plant.J.)2(6):837-44)，来自泛素基因的启动子(克里斯坦森(Christensen)等人(1992)植物分子生物学(PlantMol.Biol.)18:675-689)，来自水稻亲环蛋白基因的启动子(巴克霍尔兹(Buchholz)等人(1994)植物分子生物学(Plant.Mol.Biol.)25(5):837-43)，来自玉米H3组蛋白基因的启动子(勒珀蒂(Lepetit)等人(1992)分子基因与遗传学(Mol.Gen.Genet.)231:276-285)或来自肌动蛋白2基因的启动子(安(An)等人(1996)植物杂志(Plant J.)10(1):107-121)。
还应清楚的是可以根据本发明使用诱导型启动子，例如温度诱导型或化学诱导型启动子或者响应于发育线索的启动子。还可以使用组织选择性启动子。
在本发明的优选实施例中，嵌合基因包括纤维优先型或纤维选择性启动子。相对于基因表达而言或相对于启动子而言，术语“纤维优先型”或“纤维选择性”是指出于实践目的，在植物例如棉花植物的纤维细胞中基因的高度特异性表达或由启动子引导的表达。换言之，在不同于纤维细胞的组织中DNA的转录水平低于检测限或者非常低(小于约0,2皮克/微克总RNA)。
相对于根据本发明的DNA的表达而言，术语“纤维优先型”或“纤维细胞优先型”是指这样的表达模式，DNA借此表达模式占优势地表达于纤维细胞或纤维中，但表达可以在植物的其他组织中鉴定到。优选地，在纤维细胞中的表达比在其他组织中高约2至约10倍。
此类启动子(全部通过引用结合在此)包括来自棉花中的纤维特异性ch prom的启动子(如在WO 0210377中所述)，来自棉花中的纤维特异性肌动蛋白基因的启动子(如在WO0210413中所述)，来自棉花中的纤维特异性脂质转移蛋白基因的启动子(如在US 5792933中所述)，来自棉花中的扩张蛋白基因的启动子(WO 9830698)，或者来自棉花中的几丁质酶基因的启动子(US 2003106097)，或者描述于US 6259003或US 6166294中的纤维特异性基因的启动子，或者如披露于US 6096950中的衍生自E6家族的启动子。如描述于WO 08/083969(来自棉花葡聚糖酶基因)、WO 12/093032(来自棉花FS18或SCW-PRP基因)或US2013/0081154(来自棉花FB8样基因)中的纤维选择性启动子也是适合的植物表达型启动子。还适用于本发明的是披露于EP 13172094中的启动子，该启动子包括如在其中描述的SEQ ID No.5的从核苷酸位置4208到核苷酸位置5615的核苷酸序列，或者具有SEQ ID No.5的从核苷酸位置75至1482的核苷酸序列。
如在此描述的嵌合基因任选地包括在转录终止和多腺苷酸化中涉及的DNA区域。在植物中有功能的在转录终止和多腺苷酸化中涉及的多种DNA区域是本领域中已知的，并且本领域技术人员应知晓可以适合于进行在此描述的方法的终止子和多腺苷酸化序列。多腺苷酸化区域可以衍生自天然基因、多种其他植物基因、T-DNA基因或甚至植物病毒基因组。待添加的3’端序列可以衍生自例如胭脂氨酸合酶或章鱼碱合酶基因，或可替代地衍生自其他植物基因，或衍生自任何其他真核生物基因。
在本发明的具体实施例中，提供了包括嵌合基因的棉花植物细胞，该嵌合基因包括为可操作地连接的DNA区域
(a)植物表达型启动子，例如纤维优先型启动子，
(b)编码GFAT多肽的DNA区域，其中所述GFAT是由如在此所述的核苷酸序列编码，以及
(c)任选地在转录终止和多腺苷酸化中涉及的DNA区域。
可以通过本领域中熟知的方法将该嵌合基因引入植物细胞中。与本申请有关的“引入”涉及通过人工手段将遗传信息置于植物细胞或植物中。这可以通过本领域已知的用于将RNA或DNA引入植物细胞、组织、原生质体或完整植物中的任何方法来实现。
术语“引入”可以指代通过转化将外源DNA分子引入到植物细胞中，任选地随后从经转化的植物细胞再生植物。该术语还可以指代通过以下方式引入重组DNA分子：使包括重组DNA分子的转基因植物和另一植物进行杂交，并且选择已经遗传了重组DNA分子或转基因的后代植物。提供的又另一种可替代的意义指代通过例如原生质体融合的技术引入重组DNA分子，任选地随后从经融合的原生质体再生植物。
应清楚的是使用的转化方法与本发明具有较小相关性。现在植物的转化是常规技术。有利地，若干转化方法中的任一种都可以用于将感兴趣的核酸/基因引入适合的祖先细胞中。转化方法包括使用脂质体，电穿孔，增加游离DNA摄取的化学品，直接将DNA注射到植物中，粒子枪轰击，使用病毒或花粉进行转化，以及显微喷射。方法可以选自针对原生质体的钙/聚乙二醇法(克伦(Krens)等人(1982)自然(Nature)296:72-74；内格罗蒂(Negrutiu)等人(1987)植物分子生物学(Plant.Mol.Biol.)8:363-373)；原生质体的电穿孔(希利托(Shillito)等人(1985)生物/技术(Bio/Technol.)3:1099-1102)；显微注射进植物材料中(克洛斯威(Crossway)等人(1986)分子基因与遗传学(Mol.Gen.Genet.)202:179-185)；DNA或RNA包覆的粒子轰击(克莱因(Klein)等人(1987)自然(Nature)327:70)，用(非整合性)病毒感染等。
用于转化棉花植物的方法也是本领域中熟知的。例如在美国专利5.004.863或美国专利6.483.013中已经描述了棉花的土壤杆菌介导的转化，并且通过粒子轰击的棉花转化报道于例如WO 92/15675中。其他适合的棉花转化方法披露于例如WO 00071733和US5.159.135中，这些披露通过引用如同完全阐述的结合在此。
根据本发明的重组DNA分子可以按稳定方式或以瞬时方式使用本领域中熟知的方法引入植物中。嵌合基因可以引入植物中，或可以在植物细胞内部产生，如例如在EP1339859中所述的。
在又另一个实施例中，本发明提供了如在此上文描述的棉花植物细胞，其中所述棉花植物细胞另外地包括第二嵌合基因，该第二嵌合基因包括以下可操作地连接的DNA区域：
(a)植物表达型启动子，例如纤维优先型启动子，
(b)编码几丁质合酶多肽的DNA序列，以及
(c)任选地在转录终止和多腺苷酸化中涉及的DNA区域。
关于由术语“植物表达型启动子”意指的若干实施例和说明在上文给出，并且同样适用于包括编码几丁质合酶的DNA区域的第二嵌合基因。对于上文给出的关于在转录终止和多腺苷酸化中涉及的DNA区域的说明以及还有用以提供具有嵌合基因的植物细胞的方法和手段同样如此。
可以将第一嵌合基因和第二嵌合基因单独地以任何顺序或同时引入植物细胞中。可以将它们引入在相同的载体或分开的载体上。
几丁质合酶可以是具有几丁质合酶(EC 2.4.1.16)的酶活性(即将UDP-N-乙酰基-D-葡糖胺转化为几丁质和UDP)的任何蛋白。几丁质合酶催化反应：UDP-N-乙酰基-α-D-葡糖胺+(1,4-(N-乙酰基-β-D-葡糖胺基))(n)<＝>UDP+(1,4-(N-乙酰基-β-D-葡糖胺基))(n+1)。适用于本发明的是衍生自任何生物的任何几丁质合酶。适合的几丁质合酶的实例是例如来自同丝水霉的几丁质合酶(WO 2011/089021)，或者如描述于WO 2006/136351中或WO2012/048807中的NOD C类型的几丁质合酶。
在本发明的具体实施例中，如前所述的在所述棉花植物细胞中的几丁质合酶是NOD C类型的N-乙酰葡糖胺转移酶。如果所述几丁质合酶多肽包括高尔基体定位信号，则实现特别好的结果。
虽然已经用包括除了GFAT活性之外的几丁质合酶活性的植物细胞实现了好的结果，如通过在本发明中描述的手段获得的GFAT活性还可以有益地与导致从GFAT产物葡糖胺-6-磷酸或从UDP-N-乙酰葡糖胺产生糖胺聚糖的任何酶活性组合。如在引言中所描述的，在植物中葡糖胺-6-磷酸被进一步经由己糖胺途径转化为UDP-N-乙酰葡糖胺。一种这样的将UDP-N-乙酰葡糖胺转化为不同于几丁质的糖胺聚糖的酶活性是透明质酸合酶的酶活性。因此还可以使用透明质酸合酶来代替几丁质合酶。
在另一个具体实施例中，本发明提供了一种基本上由包括在此前述的嵌合基因的植物细胞组成的植物。该嵌合基因可以是包含GFAT编码区的第一嵌合基因，或如前所述的第一和第二嵌合基因。在具体实施例中，该植物是棉花植物。
如在此使用的“棉花”或“棉花植物”可以是有用于培育棉花的任何品种。最常用的棉花品种是海岛棉、陆地棉(G.hirsutum)、亚洲棉(G.arboreum)和草棉(G.herbaceum)。另外的品种包括阿非利加棉(G.africanum)和雷蒙德氏棉(G.raimondii)。还包括的是来自前述任一物种与其他物种杂交或这类物种之间杂交的后代。
棉花植物细胞可以是基本上包含对定义棉花植物必要的遗传信息的任何细胞，其中除在此披露的嵌合基因之外，该细胞可以由一个或多个其他转基因补充。细胞可以衍生自形成棉花植物的不同器官和/或组织，包括但不限于果实、种子、胚、繁殖组织、分生组织区、愈伤组织、叶、根、苗、花、维管组织、配子体、孢子体、花粉和小孢子。
尽管根据本发明的某些植物细胞可以能够再生成完整植物，但在一些实施例中，所述植物细胞不能进一步发育或再生成完整植物。在本发明的一个实施例中，纤维细胞就是这样。成熟纤维细胞是死细胞。
本发明还针对包括根据本发明的一种或多种重组构建体的产纤维植物。虽然编码GFAT蛋白的核苷酸序列已经针对在棉花植物中的表达进行了优化，但认为编码区也可以有益地用于其他产纤维植物中，例如***、黄麻、亚麻和木本植物，包括但不限于松属物种(Pinus spp.)、杨属物种(Populus spp.)、云杉属物种(Picea spp.)、桉属物种(Eucalyptus spp.)等。该植物细胞可以衍生自任何产毛状体植物。
根据本发明的植物可以用于常规的育种方案中，以产生更多的具有相同特征的植物，或者以在相同或相关植物物种的其他品种中或在杂交植物中引入根据本发明的嵌合基因。从经转化的植物获得的种子包含作为稳定基因组***物的本发明的嵌合基因，并且也被本发明所涵盖。
如在此使用的术语“植物”涵盖完整植物、植物的祖先和后代以及植物部分，这些植物部分包括种子、芽、茎、叶、根(包括块茎)、花、纤维和组织和器官，其中上述每一者都包括感兴趣的基因/核酸。术语“植物”还涵盖植物细胞、悬浮培养物、愈伤组织、胚、分生组织区、配子体、孢子体、花粉以及小孢子，再者其中前述每一者都包括感兴趣基因/核酸。
在具体实施例中，本发明提供了可获得自根据本发明的棉花植物的棉纤维。
根据本发明的棉纤维可以与天然存在的棉纤维(即从并不包括根据本发明的核酸序列的等基因系获得的棉纤维)通过增加含量的带正电的多糖例如寡聚N-乙酰葡糖胺或寡聚葡糖胺来相区分。可以直接检测GlcNAc聚合物或寡聚葡糖胺。可替代地，在棉纤维中带正电的多糖可以通过在用三氟乙酸(TFA)处理以水解多糖之后测量葡糖胺含量来检测。根据本发明的棉纤维还可以通过其增加的氮含量来区分。由于在葡糖胺聚合物内的含氮基团的反应性，根据本发明的棉纤维表征为，与从并不包括如在此所述的编码GFAT多肽的核酸区域的棉花植物获得的纤维相比，具有改变的化学反应性。根据本发明的纤维具有提高的经由含氮基团而与染料或其他适合的化学品反应的能力。
根据本发明的棉纤维表征为增加含量的带正电的多糖，例如寡聚N-乙酰葡糖胺或寡聚葡糖胺。“增加的含量”意指存在于植物细胞或纤维中的带正电的多糖的量比在并不包括GFAT蛋白的植物细胞或纤维中的量要高，或者与表达本领域中已知的、并未针对在棉花植物细胞中的表达进行优化的GFAT编码基因的植物细胞或纤维相比而言要高。在一个实施例中，葡糖胺(GlcN)的含量是来自不表达人工引入的基因构建体的植物的细胞或纤维的葡糖胺含量的至少两倍。观察到这种背景水平是总纤维重量的大约0,010％至0,015％GlcN。优选地，根据本发明的纤维包含总纤维重量的超过0,03％GlcN。更优选地，根据本发明的纤维的GlcN含量是总纤维重量的超过0,06％，甚至更优选超过0,08％，最优选超过0,10％GlcN。在另一个实施例中，根据本发明的植物细胞或棉纤维的GlcN含量是来自不表达人工引入的基因构建体的植物的细胞或纤维的GlcN含量的至少四倍。在本发明的特别适合的实施例中，植物细胞或纤维具有的GlcN含量是来自不表达人工引入的基因构建体的植物的细胞或纤维的GlcN含量的至少五倍，优选至少七倍，并且最优选十倍。
“纤维”被植物学地定义为长的窄的尖端细的细胞，其在成熟时是无活力的且中空的、具有大部分由纤维素和通常的木质素组成的硬的厚的细胞壁。在双子叶茎(亚麻、黄麻、***、苎麻)的韧皮部(内部树皮)中发现软纤维或韧皮纤维。在单子叶植物(剑麻、马尼拉麻、菠萝)的叶维管束中发现硬纤维或叶纤维。表面纤维由种子(棉花)、叶或果实(椰子纤维)的表面长成。
如在此使用的“棉纤维”是指种子毛状体，更确切地为在开花期或正好在开花期之前从胚珠的外珠被的表皮开始的产纤维植物(例如棉花)的单个细胞。棉纤维的形态发育已经被文献良好地记录(巴士拉(Basra)和马利克(Malik)，1984，国际细胞学评论(Int Revof Cytology)89:65-113；格雷夫斯(Graves)和斯图尔特(Stewart)，1988，实验植物学杂志(J.Exp.Bot.)39(1):59-69；拉姆齐(Ramsey)和柏林(Berlin)，1976，美国植物学杂志(American Journal of Botany)63(6):868-876；鲁安(Ruan)和舒瑞(Chourey)，1998，植物生理学(Plant Physiology)118:399–406；鲁安(Ruan)等人2000，澳大利亚植物生理学杂志(Aust.J.Plant Physiol.)27:795–800；斯图尔特(Stewart)，1975，美国植物学杂志(Am.J.Bot.)62，723-730)。
因此本发明的另一个实施例是植物细胞壁，例如来自棉花细胞的细胞壁，这些细胞壁与来自未经修饰的植物细胞或来自不表达如在此所述的GFAT编码核苷酸序列的植物细胞的细胞壁相比，包括增加水平的带正电的多糖，例如寡聚N-乙酰葡糖胺或寡聚葡糖胺。
本发明还涉及由根据本发明的纤维制成的纱线以及由这些纱线制成的织物。
在另一个实施例中，本发明提供了一种产生具有带正电的多糖例如寡聚N-乙酰葡糖胺或寡聚葡糖胺的棉纤维的方法，该方法包括以下步骤
i)在棉花植物细胞中表达嵌合基因，该嵌合基因包括如上所述的GFAT编码区，
ii)从步骤i)的棉花植物细胞再生棉花植物，并且
iii)任选地从所述棉花植物分离纤维。
在具体实施例中，提供了一种产生具有带正电的多糖例如寡聚N-乙酰葡糖胺或寡聚葡糖胺的棉纤维的方法，该方法包括i)在棉花植物细胞中表达第一嵌合基因和第二嵌合基因，该第一嵌合基因包括根据本发明的GFAT编码区，该第二嵌合基因包括几丁质合酶编码区，ii)从所述棉花植物细胞再生棉花植物，并且iii)任选地从所述棉花植物分离纤维。可以如上所述地将所述第一和第二嵌合基因同时或分开地以任何顺序引入植物细胞中。
在另一个实施例中，提供了一种产生具有增加含量的带正电的多糖例如寡聚N-乙酰葡糖胺或寡聚葡糖胺的棉纤维的方法，该方法包括以下步骤：i)在棉花植物细胞中表达所述第一嵌合基因或表达所述第一和第二嵌合基因，ii)从所述棉花植物再生棉花植物，并且iii)任选地从所述棉花植物分离纤维。术语“增加的含量”应按如上所述的来理解。
另外，提供了一种用于产生纤维具有改变的化学反应性的棉纤维的方法，该方法包括以下步骤：i)在棉花植物细胞中表达包括根据本发明的GFAT编码区的嵌合基因，ii)从所述棉花植物细胞再生棉花植物，并且iii)任选地从所述棉花植物分离纤维。
在又另一个实施例中，提供了一种用于产生纤维具有改变的化学反应性的棉纤维的方法，该方法包括以下步骤：i)在棉花植物中表达第一嵌合基因和第二嵌合基因，该第一嵌合基因包括如上所述的GFAT编码区，该第二嵌合基因包括几丁质合酶编码区，ii)从所述棉花植物细胞再生棉花植物，并且iii)任选地从所述棉花植物分离纤维。
根据本发明的核酸分子可以用于产生在纤维中具有带正电的多糖例如寡聚N-乙酰葡糖胺或寡聚葡糖胺的棉花植物。具体而言，它可以用于增加纤维中带正电的多糖例如寡聚N-乙酰葡糖胺或寡聚葡糖胺的量。它还可以用于产生具有改变的化学反应性的棉纤维。这可能允许对纤维进行便利的、容易的和/或有效的进一步整理。获得自根据本发明的棉花植物的纤维可以例如用反应性染料染色，这些反应性染料经由与多糖中葡糖胺残基的氨基基团的共价键结合至纤维。可替代地，其他物质可以经由化学反应附着至葡糖胺残基的氨基基团。物质也可以经由与多糖的含N基团的静电键合或离子键合而附着至根据本发明的纤维。其他物质与棉纤维的附着可以有益于将特殊特性转移到纤维上。此类整理可以是但不限于染色、附着阻燃剂、防水剂、防油剂和防污剂、抗皱剂、软化剂、抗静电剂、荧光增白剂或任何其他纺织品整理剂。
如在此使用的，“包括”应解释为指定所陈述的特征、整体、步骤或部件的存在，但不排除存在或增加一个或多个特征、整体、步骤、部件或其组。因此，例如包括核苷酸或氨基酸的序列的核酸或蛋白可以包括比引用的序列更多的核苷酸或氨基酸，即可以被包含在更大的核酸或蛋白中。包括功能上或结构上定义的DNA区域的嵌合基因可以包括另外的DNA区域等。
以下非限制性实例描述了具有增加含量的带正电的多糖例如寡聚N-乙酰葡糖胺或寡聚葡糖胺的棉纤维的产生。
除非在实例中另外指出，所有的重组技术是根据如在“萨姆布鲁克(Sambrook)J和拉塞尔(Russell)DW(编写)(2001)分子克隆：实验室手册(Molecular Cloning:ALaboratory Manual)，第3版，冷泉港实验室出版社(Cold Spring Harbor LaboratoryPress)，纽约(New York)”和在“奥苏贝尔(Ausubel)FA、布伦特(Brent)R、金斯顿(Kingston)RE、摩尔(Moore)DD、塞德曼(Seidman)JG、史密斯(Smith)JA和斯特鲁尔(Struhl)K(编写)(2006)当前分子生物学方案(Current Protocols in MolecularBiology)约翰威立父子公司(John Wiley&Sons)，纽约”中描述的标准方案来进行的。
标准材料和参考描述于“克罗伊(Croy)RDD(编写)(1993)植物分子生物学LabFax(Plant Molecular Biology LabFax)，BIOS科学出版有限公司(BIOS ScientificPublishers Ltd.)，牛津和布莱克韦尔科学出版物(Oxford and Blackwell ScientificPublications)，牛津(Oxford)”以及“布朗(Brown)TA(1998)分子生物学LabFax(MolecularBiology LabFax)，第2版，学术出版社(Academic Press)，圣地亚哥(San Diego)”中。聚合酶链式反应(PCR)的标准材料与方法可以发现于“麦弗逊森(McPherson)MJ和莫勒SG(2000)PCR(基础)，BIOS科学出版有限公司，牛津”和“PCR扩增手册(PCR ApplicationsManual)，第3版(2006)，德国罗氏诊断有限公司(Roche Diagnostics GmbH)，曼海姆(Mannheim)或www.roche-applied-science.com”中。
序列说明
遍及本申请参考呈现于序列表中的以下序列，该序列表名称为“BCS14-2002_ST25”，其为42kB(大小如Microsoft中所测量)，含有4个序列SEQ ID NO:1到SEQID NO:4，一并经由电子提交方式提交并且通过引用结合在此：
SEQ ID 1：对具有来自大肠杆菌的谷氨酰胺:果糖-6-磷酸-氨基转移酶(GFAT)活性的蛋白质进行编码的合成核苷酸序列。该序列针对在棉花植物细胞中的表达进行了优化。示出的核苷酸序列编码具有SEQ ID 2的氨基酸序列的多肽。
SEQ ID 2：具有来自大肠杆菌的谷氨酰胺:果糖-6-磷酸-氨基转移酶(GFAT)活性的多肽的氨基酸序列。示出的氨基酸序列可以衍生自SEQ ID 1。
SEQ ID 3：pTDBI 252的T-DNA。它包括根据SEQ ID 1的、在纤维选择性SCW-PRP启动子的控制下编码来自大肠杆菌的GFAT多肽的核苷酸序列，在纤维选择性SCW-PRP启动子的控制下编码NOD C几丁质合酶的DNA区域，以及作为选择性标记的epsps基因。
SEQ ID 4：pTDBI 250的T-DNA。它包括根据SEQ ID 1的、在纤维选择性Fb8样-1启动子的控制下编码来自大肠杆菌的GFAT多肽的核苷酸序列，在纤维选择性Fb8样-1启动子的控制下编码NOD C几丁质合酶的DNA区域，以及作为选择性标记的epsps基因。
实例
实例1：构建编码谷氨酰胺:果糖-6-磷酸-氨基转移酶(GFAT)蛋白的嵌合基因以用于在 棉花植物中表达
由恩特力传有限公司(Entelechon GmbH)合成具有根据SEQ ID 1的核酸序列的DNA分子。核苷酸序列被设计为i)编码根据SEQ ID 2的多肽，并且ii)优化核苷酸序列以便在棉花植物细胞中表达。出于此目的，考虑了多种因素例如密码子使用、mRNA二级结构、AT含量、隐蔽剪接位点或限制性位点。
如在SEQ ID 1中披露的所得核苷酸序列与公开的编码来自大肠杆菌的GFAT蛋白的、被针对在植物中的密码子使用适配的核苷酸序列(WO2007/039314)具有75％一致性(1830个中有1390个匹配碱基)。
使用标准的重组DNA技术，构建了以下嵌合GFAT基因：嵌合的谷氨酰胺-6-磷酸-氨基转移酶基因，该嵌合基因包括以下可操作地连接的DNA区域：
i.根据从SEQ ID 3的核苷酸位置61至1499的序列的纤维选择性SCW-PRP启动子区域，
ii.对来自拟南芥的DNA木糖基转移酶的、充当高尔基体定位信号肽的35个N-末端氨基酸进行编码的DNA片段，
iii.对与前述DNA片段一起克隆于框架中的茎瘤固氮根瘤菌(Azorhizobiumcaulinodan)NOD C进行编码的DNA片段，
iv.花椰菜花叶病毒的35S转录物的3′非翻译序列，
v.根据从SEQ ID 3的核苷酸位置61至1499的序列的纤维选择性SCW-PRP启动子区域，
vi.具有根据SEQ ID 1的核苷酸序列的DNA区域，该核苷酸序列编码根据SEQ ID 2的来自大肠杆菌的谷氨酰胺:果糖-6-磷酸-氨基转移酶，
vii.拟南芥的组蛋白H4基因的3′非翻译序列。
将这个嵌合基因连同来自玉蜀黍(玉米)的嵌合的双突变5-烯醇-丙酮酸莽草酸-3-磷酸合酶(epsps)基因(该基因提供对N-(膦酰甲基)羟苯基甘氨酸的抗性，为选择性标记)一起引入到T-DNA载体的T-DNA边界之间。所得T-DNA载体命名为pTDBI 252。此载体的T-DNA序列提供于SEQ ID 3中。此载体的T-DNA的基因元件呈现于表1中。
构建包含以下可操作地连接的DNA区域的另一嵌合GFAT基因：
i.根据从SEQ ID 4的核苷酸位置60至1495的序列的纤维选择性Fb8样-1启动子区域，
ii.对来自拟南芥的DNA木糖基转移酶的、充当高尔基体定位肽的35个N-末端氨基酸进行编码的DNA片段，
iii.对与前述DNA片段一起克隆于框架中的茎瘤固氮根瘤菌NOD C进行编码的DNA片段，
iv.花椰菜花叶病毒的35S转录物的3′非翻译序列，
v.根据从SEQ ID 4的核苷酸位置60至1495的序列的纤维选择性Fb8样-1启动子区域，
vi.具有根据SEQ ID 1的核苷酸序列的DNA区域，该核苷酸序列编码根据SEQ ID 2的来自大肠杆菌的谷氨酰胺:果糖-6-磷酸-氨基转移酶，
vii.拟南芥的组蛋白H4基因的3′非翻译序列。
将这个嵌合基因连同作为选择性标记的嵌合epsps基因一起引入到T-DNA载体的T-DNA边界之间。所得T-DNA载体命名为pTDBI 250。此载体的T-DNA序列提供于SEQ ID 4中。T-DNA的基因元件呈现于表2中。
表1：pTDBI 252的T-DNA的元件
表2：pTDBI 250的元件
使用包含以下可操作地连接的DNA区域的嵌合基因作为对照：
i.根据从SEQ ID 3的核苷酸位置61至1499的序列的纤维选择性SCW-PRP启动子区域，
ii.对来自拟南芥的DNA木糖基转移酶的35个N-末端氨基酸进行编码的DNA片段，
iii.对与前述DNA片段一起克隆于框架中的茎瘤固氮根瘤菌NOD C进行编码的DNA片段，
iv.花椰菜花叶病毒的35S转录物的3′非翻译序列，
v.根据从SEQ ID 3的核苷酸位置61至1499的序列的纤维选择性SCW-PRP启动子区域，
vi.对来自大肠杆菌的谷氨酰胺:果糖-6-磷酸氨基转移酶进行编码的DNA区域，其针对在植物中的密码子使用进行了优化，如在WO 2007/039314中在其中的SEQ ID 10下所述的，
vii.拟南芥的组蛋白H4基因的3′非翻译序列。
将这个嵌合基因连同作为选择性标记的嵌合epsps基因一起引入到T-DNA载体的T-DNA边界之间。所得T-DNA载体命名为pTGK 110。此载体除了GFAT编码序列外与pTDBI252是相同的。
实例2：产生表达谷氨酰胺:果糖-6-磷酸氨基转移酶的转基因棉花植物
将T-DNA载体引入包含辅助Ti质粒的根癌土壤杆菌菌株中，并且用于棉花转化中，基本上如在WO 00/71733中描述的。将T0植物如在实例3中所述的进行进一步分析。
实例3：棉纤维的葡糖胺含量的确定
将来自转基因棉花T0植物的纤维进行分离，用三氟乙酸(TFA)进行处理以水解葡糖胺聚合物，并且通过HPLC针对葡糖胺含量进行分析。遵循标准方案进行所有步骤。
未经转化的品系的纤维包含约0,01％的GlcN。从表达根据本发明的GFAT基因(在SCW-PRP启动子的控制下)的不同T0植物(用pTDBI 252转化)测量的棉纤维的葡糖胺含量的结果描绘于表3中。
表3：来自单独的T0植物的棉纤维的GlcN含量
值代表总纤维重量的％GlcN；*：被认为是背景
给出的数目代表总纤维重量的％GlcN。低于0,015的值被认为是背景。表3还示出在来自单独的T0棉花植物的纤维中发现的GlcN含量，所述单独的T0棉花植物用对照载体pTGK 110转化，该对照载体包括针对在植物中的密码子使用进行优化的并且在本领域中已知的GFAT编码DNA区域。
表4示出从在SCW-PRP启动子控制下或在Fb8样-1启动子控制下表达根据本发明的GFAT基因的T0植物衍生的棉纤维的平均和最大GlcN含量(以总纤维重量的％测量)。作为对照，给出表达WO 2007/039314中所述的植物优化型GFAT基因的植物的值。在SCW-PRP启动子控制下表达根据SEQ ID 1的GFAT基因序列的纤维的均值GlcN含量是背景水平的约四倍(0,061％对比0,015％)，并且是表达公开于WO 2007/039314中的植物优化型GFAT基因序列的对照植物的几乎两倍(0,061％对比0,039％)。在SCW-PRP启动子控制下表达根据本发明的GFAT基因的T0植物中测量的最大GlcN含量是来自不表达人工引入的基因构建体的植物的纤维的背景水平的几乎10倍(0,132％对比0,015％)。此外，它是表达WO 2007/039314中公开的植物优化型GFAT基因序列的对照植物的几乎两倍(0,132％对比0,071％)。同样，与不表达人工引入的基因构建体的植物相比，在Fb8样-1启动子控制下表达根据SEQ ID 1的GFAT基因的植物在纤维的GlcN含量方面具有超过10倍的最大增加(0,178％对比0,015％)，并且在纤维的GlcN含量方面具有均值为2倍的增加(0,039％对比0,015％)。
表4：来自在不同纤维选择性启动子的控制下表达根据SEQ ID 1的GFAT基因的T0棉花植物的纤维的均值和平均GlcN含量
值代表总纤维重量的％GlcN
实例4：具有增加的反应性的棉纤维
包括可操作地连接到纤维特异性启动子上的嵌合GFA基因和嵌合NOD C基因的转基因棉花植物(如实例1所概述)是如实例2中所述来产生的。将成熟棉纤维从这些植物收获，并且可以用阴离子染料例如刚果红进行染色，或可以与麦胚凝集素(WGA)偶联的亚历克萨荧光染料(Alexa fluor)555反应。WGA特异性地结合至植物细胞中的N-乙酰葡糖胺上，并且因此可以用作N-乙酰葡糖胺的检测试剂。另外，所得成熟棉纤维可以用包括棉花反应性染料(例如，活性红120、丽华实蓝(Levafix Blue)CA)、酸性染料(酸性橙7、酸性蓝281)和毛料反应性染料(例如，活性红116、丽雅伦琥珀色(Realan Amber)EHF)的商业染料进行染色。

Claims (14)

1.一种分离的核酸分子，包括
i)根据SEQ ID 1的核苷酸序列，
ii)或其变体，其中一个或多个核苷酸不同于根据SEQ ID 1的核苷酸序列，其条件是所述变体与SEQ ID 1的不同之处在于不超过20个核苷酸，
它们编码根据SEQ ID 2的谷氨酰胺:果糖-6-磷酸-氨基转移酶(GFAT)
iii)或i)或ii)的互补序列。
2.一种嵌合基因，包括以下可操作地连接的DNA区域：
a)植物表达型启动子，例如纤维优先型启动子，
b)编码GFAT多肽的DNA区域，其中所述GFAT是由根据权利要求1所述的核苷酸序列编码以及
c)任选地在转录终止和多腺苷酸化中涉及的DNA区域。
3.根据权利要求2所述的嵌合基因，其中所述启动子是纤维选择性启动子。
4.一种棉花植物细胞，包括根据权利要求2或3所述的嵌合基因。
5.根据权利要求4所述的棉花植物细胞，其中所述棉花植物细胞另外地包括第二嵌合基因，该第二嵌合基因包括以下可操作地连接的DNA区域：
a)植物表达型启动子，例如纤维优先型启动子，
b)编码几丁质合酶多肽的DNA序列以及
c)任选地在转录终止和多腺苷酸化中涉及的DNA区域。
6.根据权利要求5所述的棉花植物细胞，其中所述几丁质合酶是Nod C类型的N-乙酰葡糖胺转移酶。
7.根据权利要求6所述的棉花植物细胞，其中所述几丁质合酶多肽包括高尔基体定位信号。
8.一种基本上由根据权利要求4至7中任一项所述的植物细胞组成的棉花植物。
9.能从根据权利要求8所述的棉花植物获得的纤维。
10.一种由根据权利要求9所述的纤维制成的纱线或织物。
11.一种用于产生具有带正电的多糖例如寡聚N-乙酰葡糖胺或寡聚葡糖胺的棉纤维的方法，该方法包括以下步骤
i)在棉花植物细胞中表达根据权利要求2或3所述的嵌合基因，
ii)从步骤i)的棉花植物细胞再生棉花植物并且
iii)任选地从所述棉花植物分离纤维。
12.根据权利要求11所述的方法，其中在棉花植物细胞中表达嵌合基因的所述步骤i)另外包括在所述棉花植物细胞中表达第二嵌合基因，该第二嵌合基因包括
a)植物表达型启动子，例如纤维优先型启动子，
b)编码几丁质合酶多肽的DNA序列以及
c)任选地在转录终止和多腺苷酸化中涉及的DNA区域。
13.根据权利要求1所述的核酸分子用以产生在纤维中具有带正电的多糖的棉花植物的用途。
14.根据权利要求1所述的核酸分子用以增加棉纤维中带正电的多糖的量的用途。
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