CN103502456A

CN103502456A - 具有增强的产量相关性状的植物和用于制备该植物的方法

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Publication number: CN103502456A
Application number: CN201280020296.2A
Authority: CN
Inventors: V·弗兰卡德; C·勒佐; Y·海茨费尔德; S·范德纳比利; V·米隆诺弗
Original assignee: BASF Plant Science Co GmbH
Current assignee: BASF Plant Science Co GmbH
Priority date: 2011-02-28
Filing date: 2012-02-27
Publication date: 2014-01-08
Also published as: ZA201307173B; US20140033368A1; CA2826859A1; AU2012222999A2; AR094126A1; EP2681325A1; WO2012117330A1; EP3091079A1; EA201391174A1; MX2013009855A; AU2012222999A1; EP2681325A4; DE112012001020T5

Abstract

本发明提供通过调节植物中编码WAK-样多肽、CDKB-RKA多肽或UPA20-样多肽的核酸表达，来增强植物中产量相关性状的方法，以及具有受调节的编码WAK-样多肽、CDKB-RKA多肽或UPA20-样多肽的核酸表达的植物，所述植物相对于对照植物具有增强的产量相关性状。本发明也提供了在实施增强植物中产量相关性状的方法中有用的WAK-样编码核酸、CDKB-RKA编码核酸或UPA20-样编码核酸，和包含该核酸的构建体。

Description

具有增强的产量相关性状的植物和用于制备该植物的方法

背景技术

本发明总体上涉及分子生物学领域并且涉及通过调节植物中编码WAK-样(壁-相关激酶-样)多肽，或UPA20-样多肽的核酸表达，增强植物中产量相关性状的方法。本发明还涉及具有编码WAK-样多肽或UPA20-样多肽的核酸的受调节表达的植物，所述植物相对于对应野生型植物或其他对照植物具有增强的产量相关性状。本发明也提供用于本发明方法中的构建体。

关于CDKB-RKA多肽，本发明总体上涉及分子生物学领域并涉及用于增强植物中多种经济上重要的产量相关性状的方法。更具体地，本发明涉及通过调节植物中编码CDKB-RKA多肽的核酸表达，来增强植物中产量相关性状的方法，其中所述CDKB-RKA多肽是经修饰的CDKB多肽，该CDKB-RKA多肽与全长或未经修饰的CDKB多肽相比，具有经修饰的，优选降低的，更优选缺少催化激酶活性。更具体地，本发明涉及用于增强植物中产量相关性状的方法，其通过在所述植物中引入或表达编码如本文定义的CDKB-RKA多肽的核酸。本发明也涉及具有编码所述CDKB-RKA多肽的核酸受调节的表达的植物，该植物相对于对照植物具有增强的产量相关性状。本发明也提供了在实施本发明方法中有用的包含如本文定义的CDKB-RKA多肽的构建体。

持续增长的世界人口和农业用可耕地供应萎缩刺激了有关增加农业率的研究。常规的作物及园艺学改良手段利用选择性育种技术，以鉴定具有受欢迎特性的植物。然而，此类选择性育种技术具有几个缺陷，即这些技术一般耗费很多劳动并且产生这样的植物，其通常含有异源性遗传组分，其可能不总是导致从亲代植物中传递下去的所希望性状。分子生物学进展已经允许人类改良动物及植物的种质。植物的遗传工程使得可以分离和操作遗传物质(一般以DNA或RNA形式)，并随后将该遗传物质导入至植物中。此类技术具有产生具备多种改良的经济学、农学或园艺学性状的作物或植物的能力。

具有特殊经济意义的性状是增加的产量。产量通常定义为来自作物的经济价值的可测量结果。该结果可以就数量和／或品质方面进行定义。产量直接取决于几个因素，例如器官的数目和大小、植物构造(例如枝的数目)、种子产生、叶衰老等。根发育、养分摄入量、胁迫耐受性和早期生长势(earlyvigor)也可以是决定产量的重要因素。优化前述因素因而可以对增加作物产量有贡献。

种子产量是特别重要的性状，因为许多植物的种子对人和动物营养是重要的。作物如玉蜀黍、稻、小麦、卡诺拉和大豆占超过一半的人类总热量摄入量，无论通过直接消费种子本身或通过消费基于加工的种子而产生的肉产品。作物也是糖、油及工业加工中所用许多类型代谢物的来源。种子含有胚(新苗(shoot)和新根的起源)和胚乳(萌发期间和幼苗(seedling)早期生长期间用于胚生长的养分来源)。种子发育涉及多种基因并且需要代谢物从根、叶和茎转移至正在生长的种子中。胚乳尤其同化糖类、油和蛋白质的代谢前体并且将它们合成为贮藏大分子以灌满籽粒。

许多作物的另一个重要性状是早期生长势。改进早期生长势是现代稻育种计划在温带和热带稻品种上的重要目标。长根在水栽稻中对于合适的土壤固定是重要的。在将稻直接播种至被淹没田地的情况下，以及在植物必须从水中迅速出苗的情况下，较长的苗与生长势相关。在实施条播的情况下，较长的中胚轴和胚芽鞘对于幼苗良好出苗是重要的。将早期生长势人工改造到植物内的能力将在农业中是极其重要的。例如，不良的早期生长势已经限制了基于玉米带种质(Corn Belt germplasm)的玉米(Zea mayesL.)杂种在欧洲大西洋地区的引种。

又一个重要性状是改进的非生物胁迫耐受性。非生物胁迫是世界范围作物损失的主要原因，对于大多数主要作物植物而言降低平均产量超过50％(Wang等人，Planta 218：1-14，2003)。非生物胁迫可以由干旱、盐度、极端温度、化学毒性和氧化胁迫引起。改善植物对非生物胁迫耐受性的能力将在世界范围对农民而言是巨大的经济优势，并且会允许在不利条件期间及在作物栽培否则是不可能的陆地上栽培作物。

作物产量因而可以通过优化前述因素之一而增加。

关于WAK多肽，WAK多肽属于受体样激酶(RLK)超家族，从N-端到C-端具有EGF结构域，跨膜结构域和酪氨酸激酶结构域。它们是膜蛋白，通常靶向质膜。WAK多肽共价结合于细胞壁，且它们将信息从细胞壁传递到细胞。

与拟南芥属(Arabidopsis)中的26WAK和WAK-样相比，张等人(2005)鉴定到稻中有至少125个WAK，。张等人(2005)通过序列分析也鉴定到3个主要类型的WAK和WAK-样多肽：从N-端到C-端具有EGF结构域、跨膜结构域和酪氨酸激酶结构域的典型结构的WAK-RLK；只有激酶结构域、但没有EGF结构域和跨膜结构域的WAK-RLCK；和包含EGF结构域和跨膜结构域、但没有激酶结构域的WAK-RLP。

关于CDKB-RKA多肽，植物的固有生长机制以高度有序的事件顺序存在，总称为“细胞周期”。细胞周期进程是所有多细胞生物生长和发育的基础，并且对于细胞增殖至关重要。细胞周期的主要组件在酵母、哺乳动物和植物中高度保守。细胞周期通常被划分为下列顺序的时期：G0-G1-S-G2-M。DNA复制或合成通常发生在S期(“S’’指DNA合成)，在M期发生染色体的有丝分离(“M”指有丝***)，以及介于其间的间期G1(DNA复制之前，此期间内细胞生长)和G2(DNA复制之后的时期，此期间内细胞为***做准备)。在M期的最后步骤为胞质***之后完成细胞***。已经退出细胞周期并且成为休眠的细胞称为处于G0期。可以刺激这一期间的细胞重返细胞周期处于G1期。在G1、G2和G0中的“G”代表“间期”。细胞周期进程的完成使每个子细胞在细胞***期间接受亲本基因组的完整拷贝。

细胞***由两个主要的细胞周期事件控制，即DNA合成的起始和有丝***的起始。这些关键事件的每一转换是由特定蛋白质复合物(涉及DNA复制和***)所代表的关卡控制。在G1／S边界DNA合成需要的基因的表达由哺乳动物和植物细胞中E2F家族转录因子调节(La Thangue，1994(Curr.Opin.Cell Biol.6(3)，443-450)；Muller等人，2001(Genes Dev.15(3)，267-285)；De Veylder等人，2002(EMBO J.21(6)，1360-1368))。通过E2F/Rb复合体整合信号并激活细胞周期基因的转录从而调节／引发进入细胞周期。由不同的异源二聚体丝氨酸/苏氨酸蛋白激酶的形成和激活驱动细胞周期不同时期之间的转换以及由此的细胞周期进程，通常称上述异源二聚体丝氨酸/苏氨酸蛋白激酶为依赖于细胞周期蛋白的激酶(CDK)。激活这些激酶的先决条件是与特定细胞周期蛋白的物理缔合，激活时机很大程度上依赖于细胞周期蛋白的表达。细胞周期蛋白结合引起所结合的CDK的N-末端叶片(lobe)的构象改变并促使复合体的定位和底物特异性。当与细胞周期蛋白缔合时，单体CDK被激活并由此具有激酶活性。细胞周期蛋白水平在细胞周期中波动而因此代表确定CDK激活时机的主要因子。在细胞周期中含有细胞周期蛋白和CDK的这些复合体的周期性激活介导细胞周期转换(关卡)的时间性调节。调节CDK活性的其他因子包括CDK抑制剂(CKI或ICK、KIP、CIP、INK)、CDK激活激酶(CAK)、CDK磷酸酶(Cdc25)和CDK亚基(CKS)(Mironov等人，1999(Plant Cell11(4)，509-522)；Reed，1996(Progress in Cell Cycle Research2,5-27))。

在植物中，目前已经研究的两种主要类型的CDK被称为A型和B型CDK。A型CDK调节G1-至-S和G2-至-M的转换，而B型CDK似乎仅控制G2-至-M关卡(Hemerly等人，1995(EMBO J.14(16)，3925-3936)；Magyar等人，1997(Plant Cell9(2)，223-235)；Porceddu等人，2001(J.Biol.Chem.276(39)36354-36360))。此外，已报道存在C型CDK和CDK激活激酶(CAK)(Magyar等人，1997(Plant Cell9(2)，223-235)；Umeda等人，1998(Proc Natl Acad Sci USA.95(9)，5021-5026；Joubès等人，2001(Plant Physiol.126(4)，1403-1415))，同样存在D型、E型和F型CDK(Vandepoele等人，2002(Plant Cell14，903-916))。

CDKB基因和CDKB多肽用于增加植物产量的用途已在本领域中公开。例如，美国申请US20070214517公开了多种基因的用途，包括例如CDKB基因用于增加植物产量。另一实例，WO2005／024029描述了改进植物生长特征的方法，其包括在植物中引入和表达编码A或B型依赖于细胞周期蛋白的激酶或其变体的基因。B型CDK核酸或其变体在WO2005／024029中定义为编码B型CDK蛋白的核酸／基因，其具有：(i)在不具有错匹配或在从左到右的位点2和／或4具有错匹配的PPTALRE基序；(ii)催化激酶结构域；和(iii)T-环激活激酶结构域(Magyar等人，1997(Plant Cell9(2)，223-235))。

关于UPA20-样多肽，“UPA”代表“受细菌效应子蛋白AvrBs3上调”。

AvrBs3是由黄单胞菌(Xanthomonas)产生的效应子蛋白。Marois等人(2002，MPMI，第15卷，第7期，第637-646页)报导黄单胞菌III型效应子蛋白AvrBs3调节植物基因表达且诱导细胞在易感宿主植物中过度生长。表达III型效应子蛋白AvrBs3的通用型番茄疮痂病辣椒斑点病菌(Xanthomonas campestris pv.vesicatoria)诱导携带抗性基因Bs3.的胡椒植物中的超敏反应。Marois等人(2002)描述了易感胡椒和番茄植物的感染导致叶肉组织AvrBs3依赖性过度生长。农杆菌(Agrobacterium)介导的AvrBs3基因在烟草和番茄植物中的瞬间表达产生类似表型。显示过度生长的诱导依赖于AvrBs3的重复区、核定位信号和酸性转录激活结构域(ADD)，暗示效应子调节宿主转录组。为寻找受AvrBs3以AAD依赖性方式调节的宿主基因，作者实施了胡椒mRNA群体的cDNA扩增片段长度多态性分析。通过反转录酶聚合酶链反应鉴定到并确认了13个AvrBs3诱导的转录物。序列分析揭示了与生长素诱导基因和扩展蛋白样基因的同源性，生长素诱导基因和扩展蛋白样基因对细胞增大起作用。这些结果显示一些AvrBs3诱导的基因可参与过度生长发育，且黄单胞菌具有操控宿主基因表达的III型效应子。

Kay等人(2007，Science，第318卷，648-651)显示AvrBs3诱导细胞尺寸的主调节物upa20(细胞增大调节物)的表达，其编码包含碱性螺旋-环-螺旋结构域的转录因子。他们进一步报导AvrBs3通过其中央重复区与upa20中的保守元件结合，且通过其活性结构域诱导基因表达。更具体地，为了分离作为AvrBs3直接靶标的upa基因，Kay等人(2007)用表达AvrBs3或在放线菌酮(其阻止真核蛋白质的合成)的存在下携带空载体的黄单胞菌菌株85-10感染易感胡椒植物[cultivar Early Calwonder(ECW)]。作者通过抑制消减杂交鉴定了对应AvrBs3诱导的胡椒基因的cDNA片段，并通过反向Northern分析和反转录聚合酶链反应(RT-PCR)确认。在这些cDNA中，作者检测到一种基因，命名为upa20，其编码碱性螺旋-环-螺旋(bHLH)家族的推定转录因子。Kay等人(2007)描述了upa20具有复杂的基因结构，包含8个外显子和7个内显子，编码具有预测分子量为37.8kD的推定340个氨基酸的bHLH转录因子。据报导通常用作DNA结合和二聚化结构域的bHLH结构域位于从氨基酸167到氨基酸225的区域。农杆菌介导的upa20表达证明Upa20单独诱导本生烟草(N.benthamiana)和其他茄科(solanaceous)植物中的过度生长(Kay等人，2007)。upa20表达的本生烟草组织中，与对照组织中的那些相比，栅栏组织和海绵组织细胞急剧增大。该过度生长反应与暂时表达AvrBs3的组织表型相似，但更快且更强。此外，Upa20的N和C端绿色荧光(GFP)融合蛋白绝对定位于细胞核，此处它们通常集中于不同的细胞灶(Kay等人，2007)。

UPA20-样多肽是碱性／螺旋-环-螺旋(bHLH)蛋白家族的一部分。碱性螺旋-环-螺旋(bHLH)蛋白是一组真核转录因子，其对多种发育途径施加决定性的影响。这些转录因子由介导特异二聚化的高度进化保守bHLH结构域表征。在合适的发育阶段它们促进非活性单体转化为反式激活二聚体。Toledo-Ortiz和Quail(2003，Plant Cell，第15卷，1749-1770)描述了bHLH蛋白是与特定DNA靶位点结合为二聚体的转录因子的超级家族，且已在非植物真核生物中充分表征为多种生物过程中的重要调节组件。Toledo-Ortiz和Quail(2003)实施了拟南芥基因组序列数据库的综合计算分析，定义了bHLH家族的范围和特征。使用一套来自之前定义的共有基序的标准，作者鉴定到147个bHLH蛋白编码基因，使之成为拟南芥中最大的转录因子家族之一。bHLH结构域序列的进化分析允许将这些基因分成21个亚家族。

取决于最终用途，对某些产量性状的改良可能优先于其它的产量性状。例如对于多种应用如饲料或木材生产或生物燃料资源而言，植物营养体部分的增加可能是希望的，而对于应用如面粉、淀粉或油生产而言，种子参数的增加可能是特别希望的。即便在种子参数当中，取决于应用，某些参数可能相对于其它参数是更优先的。多种机制可以对增加种子产量有贡献，无论其形式为增加的种子大小或是增加的种子数目。

现在已经发现，可以通过调节植物中编码WAK-样多肽或UPA20-样多肽的核酸的表达而改善植物中的多种产量相关性状。

关于CDKB-RKA多肽，现在已经发现，可以通过调节植物中编码CDKB-RKA多肽的核酸的表达而改善植物中的多种产量相关性状，其中所述CDKB-RKA是经修饰的CDKB多肽，该CDKB-RKA多肽与全长或未修饰CDKB多肽相比具有修饰的催化激酶活性，优选具有降低的催化激酶活性。

发明详述

1.WAK多肽和UPA20多肽

关于WAK-样多肽，本发明显示，调节植物中编码WAK-样多肽的核酸表达产生了相对于对照植物具有增强的产量相关性状的植物。

关于UPA20-样多肽，本发明显示，调节植物中编码UPA20-样多肽的核酸表达产生了相对于对照植物具有增强的产量相关性状的植物。

根据第一实施方案，本发明提供用于相对于对照植物增强植物中产量相关性状的方法，其包括调节植物中编码WAK-样多肽或UPA20-样多肽的核酸表达，并且任选地选择具有增强的产量相关性状的植物。根据另一个实施方案，本发明提供用于产生相对于对照植物具有增强的产量相关性状的植物的方法，其中所述方法包括以下步骤：调节所述植物中编码如本文所述的WAK-样多肽或UPA20-样多肽的核酸表达，并且任选地选择具有增强的产量相关性状的植物。

用于调节(优选增加)编码WAK-样多肽或UPA20-样多肽的核酸表达的优选方法是在植物中导入并表达编码WAK-样多肽或UPA20-样多肽的核酸。

下文对“本发明方法中有用的蛋白质”的任何称谓意指如本文定义的WAK-样多肽或UPA20-样多肽。下文对“本发明方法中有用的核酸”的任何称谓意指能够编码这种WAK-样多肽或UPA20-样多肽的核酸。待导入植物(并且因此在实施本发明的方法中有用)的核酸是编码现在将加以描述的蛋白质类型的任意核酸，下文也称作“WAK-样核酸”，或“UPA20-样核酸”，或“WAK-样基因”，或“UPA20-样基因”。关于UPA20-样多肽，术语UPA20-样和UPA20本文用作同义词。

如本文定义的“WAK-样多肽”指包含至少EGF结构域和跨膜结构域的任意多肽。EGF结构域可定义为Pattern-Scan PS01187结构域。优选地，根据本发明，WAK-样多肽还包含酪氨酸激酶结构域。

如本文所周的术语“WAK-样”或“WAK-样多肽”还意在包括如本文在“WAK-样多肽”下定义的同源物。

额外地或备选地，WAK-样蛋白的同源物以增加的优选顺序与SEQ IDNO：2或4所代表的氨基酸具有至少25％、26％、27％、28％、29％、30％、31％、32％、33％、34％、35％、36％、37％、38％、39％、40％、41％、42％、43％、44％、45％、46％、47％、48％、49％、50％、51％、52％、53％、54％、55％、56％、57％、58％、59％、60％、61％、62％、63％、64％、65％、66％、67％、68％、69％、70％、71％、72％、73％、74％、75％、76％、77％、78％、79％、80％、81％、82％、83％、84％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％总体序列同一性，条件是该同源蛋白包含至少如上文所概述的EGF结构域和跨膜结构域。使用总体比对算法，如程序GAP(GCGWisconsin Package，Accelrys)中的Needleman Wunsch算法，优选采用默认参数并且优选采用成熟蛋白质的序列(即不考虑分泌信号或转运肽)，确定总体序列同一性。在一个实施方案中，通过在SEQ ID NO：2或4的序列的整个长度范围内比较多肽序列，确定序列同一性水平。

与总体序列同一性相比，仅考虑保守的结构域或基序时，所述序列同一性通常将更高。

“UPA20-样多肽”如本文定义指包含bHLH结构域的任意多肽。在优选的实施方案中，所述UPA20-样基因编码包含碱性螺旋-环-螺旋结构域的转录因子。

螺旋-环-螺旋(HLH)DNA结合结构域由一个封闭的以具有两个交叉连接的左旋四螺旋束组成。HLH结构域指引二聚化，且与碱性区并列以产生识别特定DNA序列的DNA相互作用界面。碱性区／HLH(bHLH)蛋白调节多种生物途径。

在一个实施方案中，所述bHLH结构域包含与SEQ ID NO：544代表的氨基酸序列具有至少50％、且例如至少51％、52％、53％、54％、55％、56％、57％、58％、59％、60％、61％、62％、63％、64％、65％、66％、67％、68％、69％、70％、71％、72％、73％、74％、75％、76％、77％、78％、79％、80％、81％、82％、83％、84％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％总体序列同一性的氨基酸序列。在另一个实施方案中，所述bHLH结构域包含具有SEQ ID NO：544的氨基酸序列。

在一优选实施方案中，本发明提供的方法，其中所述UPA20-样多肽包含一个或多个以下基序：

(i)基序2：YIHVRARRGQATDSHSLAERVRRE[KR]ISERM[KR][LIF]LQ[DL]LVPGC[ND]K[IV]TGKA[LV]ML(SEQ ID NO：538)，

(ii)基序3：DEIINYVQSLQ[RN]QVEFLSMKLA[ST]V[NS]P[RLV]L[DY](SEQ IDNO：539)，

(iii)基序4：[MN][AS][RK]KRK[SA][RA]x[KG][FGS](SEQ ID NO：540)。

在又一优选实施方案中，本发明提供的方法，其中所述UPA20-样多肽包含一个或多个以下基序：

(i)基序5：RVRRE[KR]ISERM[RK][MIV]LQ[ARLS]LVPGCDK[IV]TGKAL[MI]LDEIIN YVQSLQNQVEFLSM(SEQ ID NO：541)，

(ii)基序6：[KRS]KV[HE][EGD]E[PAE]P[KAT]GYIHVRARRGQATDSHSLAE(SEQ ID NO：542)，

(iii)基序7：[KR][LI]AS[LMV][SN]P[VLM][LF]Y[D G]FGMD[LSR](SEQ ID NO：543)。

使用MEME算法(Bailey和Elkan，第二届分子生物学智能***国际会议文集(Proceedings of the Second International Conference on IntelligentSystems for Molecular Biology)，第28-36页，AAAI出版，Menlo Park，California，1994)推导出了基序2至7。在MEME基序内部的每个位置，显示在查询序列集合中以高于0.2的频率存在的残基。方括号内的残基代表备选残基。

更优选地，UPA20-样多肽以增加的优选顺序包含至少2种、至少3种、至少4种、至少5种或全部6种基序。

另外，备选地或额外地，根据本发明的UPA20-样多肽包含保守结构域(或基序)，其与下述保守结构域具有至少50％、51％、52％、53％、54％、55％、56％、57％、58％、59％、60％、61％、62％、63％、64％、65％、66％、67％、68％、69％、70％、71％、72％、73％、74％、75％、76％、77％、78％、79％、80％、81％、82％、83％、84％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％序列同一性或包括下述保守结构域，所述保守结构域选自以下中的任一个：

1.SEQ ID NO：2中的氨基酸186至236(基序8-SEQ ID NO：556)；

2.EQ ID NO：2中的氨基酸174至231(基序9-SEQ ID NO：557)；

3.SEQ ID NO：2中的氨基酸183至230(基序10-SEQ ID NO：558)；

4.SEQ ID NO：2中的氨基酸181至231(基序11-SEQ ID NO：559)；

5.SEQ ID NO：2中的氨基酸176至255(基序12-SEQ ID NO：560)；

和

6.SEQ ID NO：2中的氨基酸176至257(基序13-SEQ ID NO：561)。

在另一实施方案中，根据本发明的UPA20-样多肽包含具有任一种或多种以下结构域的多肽：

-由HMMSmart数据库定义的结构域且具有登陆号SM00353；

-由HMMPanther数据库定义的结构域且具有登陆号如PTHR12565：SF7和／或PTHR12565；

-由HMMPfam数据库定义的结构域且具有登陆号PF00010；

-由Profile Scan数据库定义的结构域且具有登陆号PS50888；

-由Superfamily数据库定义的结构域且具有登陆号SSF47459；和

-由Gene3D数据库定义的结构域且具有登陆号G3DSA：4.10.280.10。

如本文所用的术语“UPA20-样”或“UPA20-样多肽”还意在包括如本文在“UPA20-样多肽”下定义的同源物。

额外地或备选地，UPA20-样蛋白的同源物以增加的优选顺序与SEQID NO：407所代表的氨基酸具有至少25％、26％、27％、28％、29％、30％、31％、32％、33％、34％、35％、36％、37％、38％、39％、40％、41％、42％、43％、44％、45％、46％、47％、48％、49％、50％、51％、52％、53％、54％、55％、56％、57％、58％、59％、60％、61％、62％、63％、64％、65％、66％、67％、68％、69％、70％、71％、72％、73％、74％、75％、76％、77％、78％、79％、80％、81％、82％、83％、84％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％总体序列同一性，条件是该同源蛋白包含任何一个或多个如上文所概述的保守基序。使用总体比对算法，如程序GAP(GCGWisconsin Package，Accelrys)中的Needleman Wunsch算法，优选采用默认参数并且优选采用成熟蛋白质的序列(即不考虑分泌信号或转运肽)，确定总体序列同一性。与总体序列同一性相比，仅考虑保守的结构域或基序时，所述序列同一性通常将更高。优选地，UPA20-样多肽中的基序以增加的优选顺序与SEQ ID NO：133、134、135、136、137、138、151、152、153、154、155和156所代表的基序(基序2至13)中的任何一个或多个基序具有至少70％、71％、72％、73％、74％、75％、76％、77％、78％、79％、80％、81％、82％、83％、84％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％序列同一性。

术语“结构域”、“标签”和“基序”在本文“定义”部分中定义。

此外，WAK-样多肽(至少在它们的天然形式下)一般具有寡聚半乳糖醛酸酐结合活性。用于测量寡聚半乳糖醛酸酐结合活性的工具和技术是本领域熟知的，例如Decreux和Messiaen所述，2005。另外，当根据本发明方法如实施例6和7中所概述那样在稻中表达WAK-样多肽时，产生具有增加的产量相关性状、尤其增加的种子产量和／或根生物量的植物。

在本发明的一个实施方案中，本发明的此核酸序列的功能是将提供WAK-样多肽合成的信息，当本发明的核酸序列在活植物细胞中转录并翻译时，该WAK-样多肽合成增加产量或增强产量相关性状。

关于UPA20-样多肽，当用于构建进化***树时，如图9所示，该多肽序列优选与包含由SEQ ID NO：407代表的氨基酸序列的UPA20-样多肽组聚类，而不与任何其他组聚类。包含由SEQ ID NO：407代表的氨基酸序列的UPA20-样多肽组也被注释为分化支A(也见表A3)。

另外，UPA20-样多肽(至少在其天然形式下)一般具有DNA结合活性。用于测量DNA结合活性的工具和技术是本领域熟知的且因此本文未详述。另外，当根据本发明方法如实施例6和7中所概述那样在稻中表达UPA20-样多肽时，产生相对于对照植物具有增加的产量相关性状、尤其增加的生物量，包括地上部分生物量(面积最大值)和根生物量(根最大值和根厚度最大值)；和增加的种子产量，包括种子总重量、收获指数、饱满种子数、每圆锥花序花数和种子充实率的植物。

关于WAK-样多肽，本发明通过用SEQ ID NO：1所代表的核酸序列转化植物进行说明，其中所述核酸序列编码SEQ ID NO：2的多肽序列；以及通过用SEQ ID NO：3所代表的核酸序列转化植物进行说明，其中所述核酸序列编码SEQ ID NO：4的多肽序列。然而，本发明的实施不限于这些序列；本发明的方法可以有利地使用如本文定义的任何编码WAK-样的核酸或WAK-样多肽实施。

在本文实施例部分的表A1中给出编码WAK-样多肽的核酸的实例。用于实施本发明方法的核酸可选自表A1，条件是这些多肽包含EGF结构域和跨膜结构域。用于实施本发明方法的氨基酸序列可选自表A1，条件是这些多肽包含EGF结构域和跨膜结构域，且这些是由SEQ ID NO：2所代表的WAK-样多肽的直向同源物和旁系同源物的实例序列，术语“直向同源物”和“旁系同源物”如本文中定义。可以通过执行如定义部分中所述的所谓交互性blast检索轻易地鉴定其他直向同源物和旁系同源物；在查询序列是SEQ ID NO：1或SEQ ID NO：2的情况下，第二BLAST(反向BLAST)将针对稻序列。

本发明还提供了迄今未知的WAK-样编码核酸和WAK-样多肽，其用于相对于对照植物在植物中赋予增强的产量相关性状。

根据本发明的又一个实施方案，因而提供分离的核酸分子，其选自：

(i)由任一SEQ ID NO：3、5、7或9代表的核酸；

(ii)由任一SEQ ID NO：3、5、7或9代表的核酸的互补核酸；

(iii)编码WAK-样多肽的核酸，所述WAK-样多肽实例以增加的优选顺序与任一SEQ ID NO：4、6、8或10代表的氨基酸序列具有至少50％、51％、52％、53％、54％、55％、56％、57％、58％、59％、60％、61％、62％、63％、64％、65％、66％、67％、68％、69％、70％、71％、72％、73％、74％、75％、76％、77％、78％、79％、80％、81％、82％、83％、84％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％序列同一性，且额外地包含EGF结构域和跨膜结构域，且还优选相对于对照植物赋予增强的产量相关性状。

(iv)与(i)至(iii)的核酸分子在高严格杂交条件下杂交，并且相对于对照植物赋予增强的产量相关性状的核酸分子。

根据本发明的另一个实施方案，还提供分离的多肽，其选自：

(i)由任一SEQ ID NO：4、6、8或10代表的氨基酸序列；

(ii)氨基酸序列，其以增加的优选顺序与任一SEQ ID NO：4、6、8或10所代表的氨基酸序列具有至少50％、51％、52％、53％、54％、55％、56％、57％、58％、59％、60％、61％、62％、63％、64％、65％、66％、67％、68％、69％、70％、71％、72％、73％、74％、75％、76％、77％、78％、79％、80％、81％、82％、83％、84％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％序列同一性，且额外地包含EGF结构域和跨膜结构域，且还优选相对于对照植物赋予增强的产量相关性状；

(iii)以上(i)或(ii)中给出的任一氨基酸序列的衍生物。

关于UPA20-样多肽，本发明通过用SEQ ID NO：406所代表的核酸序列转化植物进行说明，其中所述核酸序列编码SEQ ID NO：407的多肽序列。然而，本发明的实施不限于这些序列；本发明的方法可以有利地使用如本文定义的任何UPA20-样编码核酸或UPA20-样多肽实施。

在本文实施例部分的表A3中给出编码UPA20-样多肽的核酸的实例。此类核酸用于实施本发明的方法。在实施例部分的表A3中给出的氨基酸序列是由SEQ ID NO：407所代表的UPA20-样多肽的直向同源物和旁系同源物的实例序列，术语“直向同源物”和“旁系同源物”如本文中定义。可以通过执行如定义部分中所述的所谓交互性blast检索轻易地鉴定其他直向同源物和旁系同源物；在查询序列是SEQ ID NO：406或SEQ ID NO：407的情况下，第二BLAST(反向BLAST)将针对杨树(poplar)序列。

本发明还提供了编码迄今未知的UPA20-样编码核酸和UPA20-样多肽，其用于相对于对照植物在植物中赋予增强的产量相关性状。

(i)由任一SEQ ID NO：458、460和496代表的核酸；

(ii)由任一SEQ ID NO：458、460和496代表的核酸的互补核酸；

(iii)编码UPA20-样多肽的核酸，所述UPA20-样多肽以增加的优选顺序与任一SEQ ID NO：459、461和497代表的氨基酸序列具有至少50％、51％、52％、53％、54％、55％、56％、57％、58％、59％、60％、61％、62％、63％、64％、65％、66％、67％、68％、69％、70％、71％、72％、73％、74％、75％、76％、77％、78％、79％、80％、81％、82％、83％、84％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％序列同一性，并且额外地或备选地包含一个或多个基序，所述基序以增加的优选顺序与SEQ ID NO：538、539、540、541、542、543、556、557、558、559、560和561(基序2至13)中所给出的任一个或多个基序具有至少50％、55％、60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％、99％或更高的序列同一性，并且还优选相对于对照植物赋予增强的产量相关性状；

(iv)与(i)至(iii)的核酸分子在高严格杂交条件下杂交，并且优选相对于对照植物赋予增强的产量相关性状的核酸分子。

根据本发明的又一个实施方案，还提供分离的多肽，其选自：

(i)由任一SEQ ID NO：459、461和497代表的氨基酸序列；

(ii)氨基酸序列，其以增加的优选顺序与任一SEQ ID NO：459、461和497代表的氨基酸序列具有至少50％、51％、52％、53％、54％、55％、56％、57％、58％、59％、60％、61％、62％、63％、64％、65％、66％、67％、68％、69％、70％、71％、72％、73％、74％、75％、76％、77％、78％、79％、80％、81％、82％、83％、84％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％序列同一性，并且额外地或备选地包含一个或多个基序，所述基序以增加的优选顺序与SEQ ID NO：538、539、540、541、542、543、556、557、558、559、560和561(基序2至13)中所给出的基序中的任何一个或多个基序具有至少50％、55％、60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％、99％或更高的序列同一性，并且还优选相对于对照植物赋予增强的产量相关性状；

(iii)以上(i)或(ii)中给出的任一氨基酸序列的衍生物。

核酸变体也可以用于实施本发明的方法。此类变体的实例包括编码在实施例部分的表A1中所给出的任一个氨基酸序列的同源物和衍生物的核酸，条件是这些多肽包含EGF结构域和跨膜结构域，或此类变体的实例包括在实施例部分的表A3中所给出的任一个氨基酸序列的同源物和衍生物的核酸，术语“同源物”和“衍生物”如本文中定义。在本发明方法中有用的还是这样的核酸，其编码在实施例部分的表A1中或在实施例部分的表A3中给出的任一氨基酸序列的直向同源物或旁系同源物的同源物和衍生物，条件是这些多肽包含EGF结构域和跨膜结构域。在本发明方法中有用的同源物和衍生物与衍生它们的非修饰蛋白质具有基本上相同的生物学活性和功能活性。在实施本发明方法中有用的其他变体是其中优化了密码子选择或其中去除miRNA靶位点的变体。

在实施本发明方法中有用的其他核酸变体包括编码WAK-样多肽或UPA20-样多肽的核酸的部分、与编码WAK-样多肽或UPA20-样多肽的核酸杂交的核酸、编码WAK-样多肽或UPA20-样多肽的核酸的剪接变体、编码WAK-样多肽或UPA20-样多肽的核酸的等位变体，和通过基因改组获得的编码WAK-样多肽或UPA20-样多肽的核酸的变体。术语杂交序列、剪接变体、等位变体和基因改组如本文所述。

编码WAK-样多肽或UPA20-样多肽的核酸不需要是全长核酸，因为本发明方法的实施不依赖于使用全长核酸序列。根据本发明，提供了用于增强植物中产量相关性状的方法，所述方法包括在植物中导入并且表达在实施例部分的表A1或在实施例部分的表A3中给出的任一个核酸序列的一部分，条件是这些多肽包含EGF结构域和跨膜结构域，或编码在实施例部分表A1中或在实施例部分的表A3中给出的任一氨基酸序列的直向同源物、旁系同源物或同源物的核酸的一部分，条件是这些多肽包含EGF结构域和跨膜结构域。

核酸的一部分可以例如通过对所述核酸产生一个或多个缺失而制备。所述部分可以以分离的形式使用或它们可以与其他编码(或非编码)序列融合，例如旨在产生组合有几种活性的蛋白质。与其他编码序列融合时，翻译时产生的所得多肽可以比对该蛋白质部分所预测的多肽更大。

关于WAK-样多肽，在本发明方法中有用的部分编码了如本文定义的WAK-样多肽，并且基本上具有与实施例部分的表A1中给出的氨基酸序列相同的生物学活性，条件是这些多肽包含EGF结构域和跨膜结构域。优选地，该部分是在实施例部分表A1中给出的任一核酸的一部分，或是编码在实施例部分表A1中给出的任一氨基酸序列的直向同源物或旁系同源物的核酸的一部分，条件是这些多肽包含EGF结构域和跨膜结构域。优选地，该部分具有至少50、100、150、200、250、300、350、400、450、500、550、600、650、700、750、800、850、900、950、1000、1050、1100个连续核苷酸长度，所述连续核苷酸属于在实施例部分表A1中给出的任一核酸序列或属于编码在实施例部分表A1中给出的任一氨基酸序列的直向同源物或旁系同源物的核酸，条件是这些核酸编码包含EGF结构域和跨膜结构域的多肽。最优选地，该部分是SEQ ID NO：1的核酸的一部分，条件是这些多肽包含EGF结构域和跨膜结构域。

关于UPA20-样多肽，在本发明方法中有用的部分编码了如本文定义的UPA20-样多肽，并且基本上具有与实施例部分的表A3中给出的氨基酸序列相同的生物学活性。优选地，该部分是在实施例部分表A3中给出的任一核酸的一部分，或是编码在实施例部分表A3中给出的任一氨基酸序列的直向同源物或旁系同源物的核酸的一部分。优选地，该部分具有至少550、600、650、700、750、800、850、900、950、1000、1050、1100、1150、1200、1250、1300、1350、1400、1450、1500、1550、1600、1650、1700、1750个连续核苷酸长度，所述连续核苷酸属于在实施例部分的表A3中给出的任一核酸序列或属于编码在实施例部分的表A3中给出的任一氨基酸序列的直向同源物或旁系同源物的核酸。

优选地，该部分编码具有任一或多种以下特征的氨基酸序列的片段：

-当用于构建进化***树(如图9中所绘制的一个进化***树)时，所述氨基酸序列与包含由SEQ ID NO：407(分化支A)代表的氨基酸序列的多肽组聚类，而不与任何其他组聚类；

-包含如本文定义的bHLH结构域；

-包含如本文提供的任一或多个基序2至13；

-具有DNA结合活性，和

-与SEQ ID NO：407具有至少30％的序列同一性。

最优选地，该部分是SEQ ID NO：406的核酸的一部分。

在本发明方法中有用的另一种核酸变体是能够在降低的严格条件下，优选在严格条件下与如本文定义的编码WAK-样多肽或UPA20-样多肽的核酸或与如本文定义的部分杂交的核酸。

根据本发明，提供了用于增强植物中产量相关性状的方法，其包括在植物中导入并表达能够与实施例部分的表A1中或在实施例部分的表A3中给出的任一种核酸杂交的核酸，条件是这些多肽包含EGF结构域和跨膜结构域，或包括在植物中导入并表达这样的核酸，所述核酸能够与编码在实施例部分的表A1中或在实施例部分的表A3中给出的任意核酸序列的直向同源物、旁系同源物或同源物的核酸杂交，条件是这些多肽包含EGF结构域和跨膜结构域。

关于WAK-样多肽，在本发明方法中有用的杂交序列编码了如本文定义的WAK-样多肽，所述多肽基本上具有与实施例部分的表A1中给出的氨基酸序列相同的生物学活性，条件是这些核酸编码包含EGF结构域和跨膜结构域的多肽。优选地，该杂交序列能够与实施例部分的表A1中给出的任一核酸的互补核酸或与任意这些序列的一部分杂交，所述的一部分如上文中定义，或该杂交序列能够与下述核酸的互补核酸杂交，所述核酸编码在实施例部分的表A1中给出的任一氨基酸序列的直向同源物或旁系同源物，条件是这些核酸编码包含EGF结构域和跨膜结构域的多肽。最优选地，该杂交序列能够与如SEQ ID NO：1所代表的核酸的互补核酸或与其一部分杂交。在一个实施方案中，该杂交条件是如上文定义的中等严格，优选高严格条件。

关于UPA20-样多肽，在本发明方法中有用的杂交序列编码了如本文定义的UPA20-样多肽，所述多肽基本上具有与实施例部分的表A3中给出的氨基酸序列相同的生物学活性。优选地，该杂交序列能够与实施例部分的表A3中给出的任一核酸的互补核酸或与任意这些序列的一部分杂交，所述的一部分如上文中定义，或该杂交序列能够与下述核酸的互补核酸杂交，所述核酸编码在实施例部分的表A3中给出的任一氨基酸序列的直向同源物或旁系同源物。最优选地，该杂交序列能够与如SEQ ID NO：406所代表的核酸的互补核酸或与其一部分杂交。

优选地，该杂交序列编码具有下述氨基酸序列的多肽，所述氨基酸序列具有一个或多个以下特征：

-当构建进化***树(如图9中所绘制的一个进化***树)中使用时，所述氨基酸序列与包含如SEQ ID NO：407(分化支A)所代表的氨基酸序列的多肽组聚类，而不与任何其他组聚类；

-包含如本文定义的bHLH结构域，

-包含如本文中提供的基序2至13中的任一个或多个基序，

-具有DNA结合活性，和

-与SEQ ID NO：407具有至少30％的序列同一性。

在本发明方法中有用的另一种核酸变体是编码如上文定义的WAK-样多肽或UPA20-样多肽的剪接变体，剪接变体如本文中定义。

在另一实施方案中，提供了用于增强植物中产量相关性状的方法，所述方法包括在植物中导入并且表达在实施例部分的表A1中或在实施例部分的表A3中给出的任一个蛋白质的编码核酸的剪接变体，条件是这些多肽包含EGF结构域和跨膜结构域，或编码在实施例部分表A1中或在实施例部分的表A3中给出的任意氨基酸序列的直向同源物、旁系同源物或同源物的核酸的剪接变体，条件是这些多肽包含EGF结构域和跨膜结构域。

关于WAK-样多肽，优选的剪接变体是由SEQ ID NO：1或3所代表的核酸的剪接变体，或是编码SEQ ID NO：2或4的直向同源物或旁系同源物的核酸的剪接变体，条件是这些核酸编码包含EGF结构域和跨膜结构域的多肽。

关于UPA20多肽，优选的剪接变体是由SEQ ID NO：406所代表的核酸的剪接变体，或是编码SEQ ID NO：407的直向同源物或旁系同源物的核酸的剪接变体。优选地，由该剪接变体编码的氨基酸序列具有一个或多个以下特征，

-包含如本文定义的bHLH结构域，

-包含如本文中提供的基序2至13中的任一个或多个基序，

-具有DNA结合活性，和

-与SEQ ID NO：407具有至少30％的序列同一性。

在实施本发明方法中有用的另一种核酸变体是编码如上文所定义的WAK-样多肽或UPA20-样多肽的核酸的等位变体，等位变体如本文中定义。

在又一实施方案中，提供用于增强植物中产量相关性状的方法，所述方法包括在植物中导入并且表达编码实施例部分的表A1中或在实施例部分的表A3中给出的任一蛋白质的核酸的等位变体，条件是这些多肽包含EGF结构域和跨膜结构域，或包括在植物中导入并且表达下述核酸的等位变体，其中所述核酸编码在实施例部分的表A1中或在实施例部分的表A3中给出的任一氨基酸序列的直向同源物、旁系同源物或同源物，条件是这些多肽包含EGF结构域和跨膜结构域。

关于WAK-样多肽，由本发明方法中有用的等位变体编码的多肽基本上具有与SEQ ID NO：2或4的WAK-样多肽和实施例部分的表A1中所述的任一氨基酸序列相同的生物学活性，条件是这些核酸编码包含EGF结构域和跨膜结构域的多肽。等位变体存在于自然界中，并且在本发明的方法中包括使用这些天然的等位基因。优选地，该等位变体是SEQ ID NO：1或3的等位变体或编码SEQ ID NO：2或4的直向同源物或旁系同源物的核酸的等位变体，条件是这些多肽包含EGF结构域和跨膜结构域。

关于UPA20-样多肽，由本发明方法中有用的等位变体编码的多肽基本上具有与SEQ ID NO：407的UPA20-样多肽和实施例部分的表A3中所述的任意氨基酸基本相同的生物学活性。等位变体存在于自然界中，并且在本发明的方法中包括使用这些天然的等位基因。优选地，该等位变体是SEQ ID NO：406的等位变体或编码SEQ ID NO：407的直向同源物或旁系同源物的核酸的等位变体。

优选地，由该等位变体编码的氨基酸序列具有一个或多个以下特征：

-包含如本文定义的bHLH结构域，

-包含如本文中提供的基序2至13中的任一个或多个基序，

-具有DNA结合活性，和

-与SEQ ID NO：407具有至少30％的序列同一性。

基因改组或定向进化也可以用来产生编码如上文定义的WAK-样多肽或UPA20-样多肽的核酸的变体；术语“基因改组”如本文定义。

关于WAK-样多肽，根据本发明，提供了用于增强植物中产量相关性状的方法，所述方法包括在植物中导入并且表达在实施例部分的表A1中给出的任一核酸序列的变体，条件是这些核酸编码包含EGF结构域和跨膜结构域的多肽，或包括在植物中导入并且表达下述核酸的变体，所述的核酸编码在实施例部分的表A1中给出的任一氨基酸序列的直向同源物、旁系同源物或同源物，条件是这些核酸编码包含EGF结构域和跨膜结构域的多肽，其中所述的变体核酸通过基因改组获得。

关于UPA20-样多肽，根据本发明，提供了用于增强植物中产量相关性状的方法，所述方法包括在植物中导入并且表达在实施例部分的表A3中给出的任一核酸序列的变体，或包括在植物中导入并且表达下述核酸的变体，所述的核酸编码在实施例部分的表A3中给出的任一氨基酸序列的直向同源物、旁系同源物或同源物，其中所述的变体核酸通过基因改组获得。

优选地，由基因改组获得的变体核酸编码的氨基酸序列具有一个或多个以下特征：

-包含如本文定义的bHLH结构域，

-包含如本文中提供的基序2至13中的任一个或多个基序，

-具有DNA结合活性，和

-与SEQ ID NO：407具有至少30％的序列同一性。

另外，核酸变体也可以通过位点定向诱变获得。几种方法可用于实现位点定向诱变，最常见方法是基于PCR的方法(Current Protocols inMolecular Biology.Wiley编著)。

因1个或几个氨基酸(如本文定义的置换、***和／或删除)而与SEQ IDNO：2或4的序列不同的WAK-样多肽可以同等地用于增加植物产量的方法中；用于本发明的构建体和植物中，条件是这些多肽包含EGF结构域和跨膜结构域。

编码WAK-样多肽的核酸可以源自任何天然或人工来源。该核酸可以通过人类有意操作，在组成和／或基因组环境方面从其天然形式修改而来。优选地，WAK-样多肽编码核酸来自植物，进一步优选来自单子叶植物，更优选来自禾本科(Poaccae)，最优选地，该核酸来自稻(Oryza sativa)。

在另一实施方案中，本发明扩展至包含在本发明方法中有用的核酸序列的重组染色体DNA，其中所述核酸由重组方法导致出现在染色体DNA中，但不是在其天然基因环境。在又一实施方案中，本发明的重组染色体DNA包含在植物细胞中。

UPA20-样多肽编码核酸可以源自任何天然或人工来源。该核酸可以通过人类有意操作，在组成和／或基因组环境方面从其天然形式修改而来。

在一优选实施方案中，编码UPA20-样多肽的核酸来自植物，优选来自双子叶植物，进一步优选来自茄科，更优选来自毛白杨属(genusPopulus)，最优选地，该核酸来自毛果杨(Populus trichocarpa)。在另一优选实施方案中，UPA20-样多肽编码核酸来自植物，优选来自双子叶植物，又优选来自十字花科，更优选来自拟南芥属，最优选该核酸来自拟南芥。在又一个实施方案中，UPA20-样多肽编码核酸来自植物，优选来自单子叶植物，又优选来自禾本科，更优选来自稻属，最优选该核酸来自稻。

在一个实施方案中，本发明扩展至包含在本发明方法中有用的核酸序列的重组染色体DNA，其中所述核酸由重组方法导致存在于该染色体DNA中，即所述核酸在其天然环境下不位于该染色体DNA中。在又一个实施方案中，本发明的重组染色体DNA包含于植物细胞中。

本发明方法的实施产生了具有增强的产量相关性状的植物。特别地，本发明方法的实施产生了相对于对照植物具有增加的产量、特别是增加的种子产量和／或根生物量的植物。术语“产量”、“种子产量”和“根生物量”在本文的“定义”部分中更详细地描述。

本文对增强的产量相关性状的称谓意指早期生长势和／或植物的一个或多个部分的生物量(重量)的增加，所述的部分可以包括(i)地上部分和优选上可收获部分和／或(ii)地下部分和优选可收获的地下部分。特别地，此类可收获部分是种子，并且本发明方法的实施产生了相对于对照植物的种子产量而言，具有增加的种子产量的植物。

本发明提供了用于相对于对照植物增加植物产量相关性状和产量、尤其种子产量和／或根生物量的方法，所述方法包括调节植物中编码如本文定义的WAK-样多肽的核酸表达。

本发明还提供了用于相对于对照植物增加植物的产量相关性状，优选增加产量产量，更优选增加如本文定义的生物量和／或增加如本文定义的种子产量的方法，所述方法包括调节植物中编码如本文定义的UPA20-样多肽的核酸表达。

根据本发明的优选特征，本发明方法的实施产生了相对于对照植物具有增加的生长速率的植物。因此，根据本发明，提供了用于增加植物生长速率的方法，所述方法包括在植物中调节编码如本文定义的WAK-样多肽或UPA20-样多肽的核酸表达。

相对于可比较条件下培育的对照植物，本发明方法的实施给予在非胁迫条件下或在轻度干旱条件下培育的植物增加的产量相关性状。因此，根据本发明，提供了用于增加非胁迫条件下或在轻度干旱条件下培育的植物中产量相关性状的方法，所述方法包括调节植物中编码WAK-样多肽或UPA20-样多肽的核酸表达。

相对于可比较条件下培育的对照植物，本发明方法的实施给予在干旱条件下培育的植物增加的产量相关性状。因此，根据本发明，提供了用于增加在干旱条件下培育的植物中产量相关性状的方法，所述方法包括调节植物中编码WAK-样多肽或UPA20-样多肽的核酸表达。

相对于可比较条件下生长的对照植物，本发明方法的实施给予在养分缺乏条件下、尤其缺氮条件下培育的植物增加的产量相关性状。因此，根据本发明，提供了用于增加在养分缺乏条件下培育的植物中产量相关性状的方法，所述方法包括调节植物中编码WAK-样多肽或UPA20-样多肽的核酸表达。

相对于可比较条件下培育的对照植物，本发明方法的实施给予在盐胁迫条件下培育的植物增加的产量相关性状。因此，根据本发明，提供了用于增加在盐胁迫条件下培育的植物中产量相关性状的方法，所述方法包括调节植物中编码WAK-样多肽或UPA20-样多肽的核酸表达。

关于WAK-样多肽，本发明也提供基因构建体和载体，以促进在植物中导入和／或表达编码WAK-样多肽的核酸。所述基因构建体可以***适于转化至植物或宿主细胞中并且适于在转化细胞中表达目的基因的载体，所述载体可以是市售的。本发明也提供如本文中定义的基因构建体在本发明方法中的用途。

更具体地，本发明提供构建体，其包含：

(a)编码如上文定义的WAK-样多肽的核酸；

(b)能够驱动(a)的核酸序列表达的一个或多个控制序列；和任选地

(c)转录终止序列。

优选地，编码WAK-样多肽的核酸如上文定义。术语“控制序列”和“终止序列”如本文定义。

关于UPA20-样多肽，本发明也提供基因构建体和载体，以促进在植物中导入和／或表达编码UPA20-样多肽的核酸。所述基因构建体可以***适于转化至植物或宿主细胞中并且适于在转化细胞中表达目的基因的载体，所述载体可以是市售的。本发明也提供如本文中定义的基因构建体在本发明方法中的用途。

更具体地，本发明提供构建体，其包含：

(d)编码如上文定义的UPA20-样多肽的核酸；

(e)能够驱动(a)的核酸序列表达的一个或多个控制序列；和任选地

(f)转录终止序列。

优选地，编码UPA20-样多肽的核酸如上文定义。术语“控制序列”和“终止序列”如本文定义。

本发明的基因构建体可以包含于宿主细胞，植物细胞，种子，农产品或植物中。用包含上述任何核酸的基因构建体如载体或表达盒转化植物或宿主细胞。因此，本发明进一步提供用如上文所述的构建体转化的植物或宿主细胞。具体而言，本发明提供用如上文所述的构建体转化的植物，所述植物具有如本文所述的增加的产量性状。

在一实施方案中，本发明基因构建体赋予植物增加的产量或产量相关性状，当其被导入所述植物时，所述植物表达编码包含于基因构建体中的WAK-样多肽或UPA20-样多肽的核酸。在另一实施方案中，本发明基因构建体赋予植物增加的产量或产量相关性状，该植物包含导入该构建体的植物细胞，该植物细胞表达编码包含于基因构建体中的WAK-样多肽或UPA20-样多肽的核酸。

技术人员非常清楚必须在所述基因构建体上存在以便成功转化、选择和增殖含有目的序列的宿主细胞的遗传元件。目的序列与一个或多个控制序列(至少与启动子)有效地连接。

有利地，任意类型的启动子，无论是天然的或合成的，均可以用来驱动该核酸序列表达，不过优选地，该启动子是植物源的。组成型启动子在所述方法中特别有用。优选地，组成型启动子是中等强度的遍在组成型启动子。对于多种启动子类型的定义，见本文的“定义”部分。

组成型启动子优选是中等强度启动子。更优选地，它是源自植物的启动子，例如植物染色体来源的启动子，如GOS2启动子或具有基本上相同强度并且具有基本上相同表达模式的启动子(功能等同的启动子)，更优选地，启动子是来自稻的GOS2启动子。进一步优选地，该组成型启动子由基本上与SEQ ID NO：306，或SEQ ID NO：545相似的核酸序列代表；最优选地，该组成型启动子是如SEQ ID NO：306，或SEQ ID NO：545所代表的组成型启动子。对于组成型启动子的其他实例，见本文的“定义”部分。

关于WAK-样多肽，应当明白本发明的适用性不限于由SEQ ID NO：1或3代表的WAK-样多肽编码核酸，本发明的适用性也不限于WAK-样多肽编码核酸受组成型启动子驱动时的表达。

关于UPA20-样多肽，应当明白本发明的适用性不限于由SEQ ID NO：406代表的UPA20-样多肽编码核酸，本发明的适用性也不限于UPA20-样多肽编码核酸受组成型启动子驱动时的表达。

根据本发明另一实施方案，编码UPA20-样多肽的核酸可与根特异性启动子有效连接。也可用于实施本发明方法的其他根特异性启动子的实例见上文定义部分的表2b。根据本发明又一实施方案，编码UPA20-样多肽的核酸可与种子特异性启动子有效连接。例如，该种子特异性启动子是胚乳／糊粉／胚特异性启动子。胚乳／糊粉／胚特异性启动子的实例在定义部分的表2中给出。

关于WAK-样多肽，任选地，可以在导入植物的构建体中使用一个或多个终止子序列。优选地，该构建体包含这样的表达盒，其包含基本上与SEQ ID NO：306相似的与编码WAK-样多肽的核酸有效连接的GOS2启动子。更优选地，该构建体包含与WAK-样编码序列的3′末端连接的玉米醇溶蛋白终止子(t-玉米醇溶蛋白)。最优选地，该表达盒包含以增加的优选顺序与任意SEQ ID NO：303、304或305所代表的序列(pPRO：：WAK-样：：t-玉米醇溶蛋白序列)具有至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％同一性的序列。另外，编码选择标记的一个或多个序列可以存在于导入植物的构建体上。

关于UPA20-样多肽，任选地，可以在导入植物的构建体中使用一个或多个终止子序列。优选地，该构建体包含这样的表达盒，其包含基本上与SEQ ID NO：545相似的与编码UPA20-样多肽的核酸有效连接的GOS2启动子。更优选地，该构建体包含与UPA20-样编码序列的3′末端连接的玉米醇溶蛋白终止子(t-玉米醇溶蛋白)。最优选地，表达盒包含与由SEQ IDNO：546代表的序列(pGOS2：：UPA20-样：：t-玉米醇溶蛋白序列一表达载体1)以增加的优选顺序具有至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％的序列同一性。另外，编码选择标记的一个或多个序列可以存在于导入植物的构建体上。

另一实施方案中，该构建体包含这样的表达盒，其包含基本上与SEQID NO：545相似的与编码UPA20-样多肽的核酸有效连接的GOS2启动子。更优选地，该构建体包含与UPA20-样编码序列的3′末端连接的玉米醇溶蛋白终止子(t-玉米醇溶蛋白)。最优选地，表达盒包含与由SEQ ID NO：547代表的序列(pGOS2：：UPA20-样：：t-玉米醇溶蛋白序列一表达载体2)以增加的优选顺序具有至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％的序列同一性。另外，编码选择标记的一个或多个序列可以存在于导入植物的构建体上。

根据本发明的优选特征，受调节的表达是增加的表达。本领域中充分记录了用于增加核酸或者基因或基因产物表达的方法并且在定义部分中提供了实例。

如上文提到，用于调节编码WAK-样多肽或UPA20-样多肽的核酸表达的优选方法是通过在植物中导入并表达编码WAK-样多肽或UPA20-样多肽的核酸；然而，使用其他熟知的技术，包括但不限于T-DNA激活标签法、TILLING、同源重组，也可以实现实施本方法的效果，即增强产量相关性状。在定义部分中提供对这些技术的描述。

本发明也提供了用于产生转基因植物的方法，所述转基因植物相对于对照植物具有增强的产量相关性状，所述方法包括在植物中导入并且表达编码如本文所定义的WAK-样多肽或UPA20-样多肽的任意核酸。

更具体地，本发明提供了用于产生转基因植物的方法，所述转基因植物具有增强的产量相关性状、特别是增加的种子产量和／或产量，所述方法包括：

(i)在植物或植物细胞中导入并且表达编码WAK-样多肽或UPA20-样多肽的核酸，或包含编码WAK-样多肽或UPA20-样多肽的核酸的基因构建体；和

(ii)在促进植物生长和发育的条件下培育植物细胞。

(i)的核酸可以是能编码如本文定义的WAK-样多肽或UPA20-样多肽的任意核酸。

在促进植物生长和发育的条件下培育植物细胞可以包括或可以不包括再生和／或生长至成熟。因此，在本发明的一个具体实施方案中，通过本发明方法转化的植物细胞可再生成为转化的植物。在另一个具体实施方案中，通过本发明方法转化的植物细胞不可再生成为转化的植物，即，细胞是使用本领域已知的细胞培养技术不能够再生成植物的细胞。尽管植物细胞通常具有全能性特征，但是一些植物细胞不能用来从所述细胞再生或繁殖出完整植物。在本发明的一个实施方案中，本发明的植物细胞是此类细胞。在另一个实施方案中，本发明的植物细胞是不以自养方式自我维持的植物细胞。

可以将核酸直接导入植物细胞或导入植物自身中(包括导入组织、器官或植物的任何其他部分)。根据本发明的优选特征，核酸优选通过转化导入植物或植物细胞中。术语“转化”在本文的“定义”部分中更详细地描述。

在一个实施方案中，本发明扩展至通过本文所述任意方法产生的任意植物细胞或植物，并扩展至全部植物部分及其繁殖体。

在另一个实施方案中，本发明的植物细胞是不能以自养方式维持自己的植物细胞，此植物细胞不视为代表植物品种。在又一实施方案中，本发明的植物细胞是非植物品种且是非繁殖的。

本发明包括通过本发明方法获得的植物或其部分(包括种子)。植物或植物部分或植物细胞包含了编码如上文定义的WAK-样多肽或UPA20-样多肽的核酸转基因，优选在基因构建体如表达盒中。本发明进一步扩展以包括已经通过前述任意方法产生的原代转化或转染细胞、组织、器官或完整植物的子代，唯一要求是子代展示出与本发明方法中由亲本产生的那些相同的基因型和／或表型特征。

在另一个实施方案中，本发明还扩展至包含如上文所述的本发明表达盒、本发明基因构建体，或编码WAK-样多肽或UPA20-样多肽的核酸，和／或WAK-样多肽或UPA20-样多肽的种子。

本发明也包括含有分离的核酸的宿主细胞，所述分离的核酸编码如上文所定义的WAK-样多肽或UPA20-样多肽。在一个实施方案中，本发明的宿主细胞是植物细胞、酵母、细菌或真菌。对于本发明方法中所用的核酸、构建体、表达盒或载体，宿主植物原则上有利地是能够合成本发明方法中所用多肽的全部植物。在一个具体实施方案中，本发明的植物细胞过量表达本发明的核酸分子。

本发明的方法有利地适用于任意植物，尤其适用于如本文定义的任何植物。在本发明方法中特别有用的植物包括属于植物界超家族、尤其单子叶和双子叶植物的全部植物，包括饲用或饲料豆科植物、观赏植物、粮食作物、树或灌木。根据本发明的一个实施方案，植物是作物植物。作物植物的实例包括但不限于菊苣、胡萝卜、木薯、百脉根、大豆、甜菜、糖料甜菜、向日葵、卡诺拉、苜蓿、油菜、亚麻、棉花、番茄、马铃薯和烟草。根据本发明的另一个实施方案，植物是单子叶植物。单子叶植物的实例包括甘蔗。根据本发明的另一个实施方案，植物是谷类植物。谷类的实例包括稻、玉米、小麦、大麦、粟、黑麦、黑小麦、高粱、二粒小麦、斯卑尔脱小麦、单粒小麦、埃塞俄比亚画眉草(teff)、芦粟(milo)和燕麦。在一个特定实施方案中，在本发明方法中所用的植物选自玉米、小麦、稻、大豆、棉花、油菜(包括卡诺拉)、甘蔗、糖料甜菜和苜蓿。有利地，本发明方法比已知的方法更高效，原因是与可比较方法中使用的对照植物相比，本发明的植物具有增加的产量和／或增加的针对环境胁迫的耐受性。

本发明也扩展至植物的可收获部分，如但不限于种子、叶、果实、花、茎、根、根状茎、块茎和球茎，所述可收获部分包含编码WAK-样多肽或UPA20-样多肽的重组核酸。本发明还涉及源自或产自，优选直接源自或产自这种植物的可收获部分中的产物，如干燥颗粒、粗粉或粉末、油、脂肪和脂肪酸、淀粉或蛋白质。

本发明也包括用于制造产品的方法，其包括a)培育本发明的植物并且b)从或借助本发明的植物或其部分(包括种子)生产所述产品。在又一个实施方案中，所述方法包括步骤a)培育本发明的植物，b)从这些植物中取下如本文所述的可收获部分和c)从或采用本发明的可收获部分生产所述产品。

在一个实施方案中，由本发明的所述方法产生的产品是植物产物，如但不限于食品、饲料、食品补充物、饲料补充物、纤维、化妆品或药物。在另一个实施方案中，所述生产方法用来产生农产品，如但不限于植物提取物、蛋白质、氨基酸、糖类、脂肪、油、聚合物、维生素等。

在又一个实施方案中，本发明的多核苷酸或多肽包含于农产品中。在一个特定实施方案中，本发明的核酸序列和蛋白质序列可以用作产品标志物，例如在通过本发明方法产生农产品的情况下。这种标志物可以用来鉴定已经由有利方法产生的产品，其中所述的有利方法不仅导致该方法的更高效率，还导致改进的产品质量，原因在于该方法中所用的植物材料和可收获部分的品质提高。可以通过本领域已知的多种方法检测此类标志物，例如但不限于基于PCR的用于核酸检测的方法或基于抗体的用于蛋白质检测的方法。

本发明也包括编码如本文中所述的WAK-样多肽或UPA20多肽的核酸的用途；和这些WAK-样多肽或UPA20-样多肽的用途，用于增强植物中任意的前述产量相关性状。例如，编码本文所述的WAK-样多肽或UPA20-样多肽的核酸，或WAK-样多肽或UPA20-样多肽本身可以用于育种计划中，在所述育种计划中鉴定可以遗传地与编码WAK-样多肽或UPA20-样多肽的基因连锁的DNA标志物。这些核酸／基因或WAK-样多肽或UPA20-样多肽自身可以用来定义分子标志物。这种DNA或蛋白质标志物随后可以在本发明方法中用于育种计划中，以选择具有如本文所定义的增强的产量相关性状的植物。另外，编码WAK-样多肽或UPA20-样多肽的核酸／基因的等位变体可以用于标志物辅助的育种计划中。编码WAK-样多肽或UPA20-样多肽的核酸也可以用作探针以遗传地或物理地绘制这些核酸作为其部分的基因并且用作与这些基因连锁的性状的标志物。此类信息可能用于植物育种中旨在开发具有所希望表型的品系。

2.CDKB-RKA多肽

本发明目标是编码如本文定义的CDKB-RKA多肽的核酸序列的用途，用于相对于对照植物增加产量，且优选用于增加种子产量和／或用于增加生物量。本发明基于经修饰形式的B型依赖于细胞周期蛋白的激酶(本文也称为“CDKB-RKA多肽”或“CDKB-RKA多肽”，其与野生型B型依赖于细胞周期蛋白的激酶(CDKB)相比具有降低的激酶活性且优选缺少激酶活性)的用途，且基于编码此类CDKB-RKA多肽的基因的用途。

令人惊讶地，现已发现调节植物中如本文定义的CDKB-RKA多肽的编码核酸的表达，优选通过在所述植物中导入且表达如本文定义的CDKB-RKA多肽的编码核酸产生了相对于对照植物具有增强的产量相关性状的植物，尤其是相对于对照植物增加的产量，且更尤其(i)增加的营养生物量，如增加的叶和／或根生物量，和／或(ii)增加的种子产量。

在具体的实施方案中，如本文定义的CDKB-RKA不包含如WO2005／024029中所述或如实施例1表A2中所给出的全长CDKB多肽或由此全长CDKB多肽组成，且尤其不包含如SEQ ID NO：320所代表的全长CDKB多肽或由此全长CDKB多肽组成。

根据第一个方面，本发明提供相对于对照植物增强产量相关性状的方法，其包括调节编码如本文定义的CDKB-RKA的核酸在植物中的表达。优选的方法用于调节，优选增加编码如本文定义的CDKB-RKA多肽的核酸是通过在植物中导入且表达此类多肽的编码核酸。因此，本文提供了相对于对照植物增加植物产量的方法，其中所述方法包含包括在所述植物中导入且表达如本文定义的CDKB-RKA多肽的编码核酸。

另一方面，本发明提供生产相对于对照植物具有增强的产量相关性状的植物的方法，其中所述方法包括调节编码如本文定义的CDKB-RKA多肽的核酸在所述植物中的表达的步骤，且任选地选择具有增强的产量相关性状的植物。在一优选实施方案中，本发明提供生产相对于对照植物具有增强的产量相关性状的植物的方法，其中所述方法包括在所述植物中引入和表达如本文定义的CDKB-RKA多肽的核酸分子，且任选地选择具有增强的产量相关性状的植物。

下文对“本发明方法中有用的蛋白质”的任何称谓意指如本文定义的CDKB-RKA多肽。下文对“本发明方法中有用的核酸”的任何称谓意指能够编码本文定义的CDKB-RKA多肽的核酸。还应明白术语“CDKB-RKA”，和“CDKB-RKA多肽“和“CDKB-RKA蛋白”本文用作同义词。

用于本文的术语“CDKB-RKA”包含经修饰形式的B型依赖于细胞周期蛋白的激酶(CDKB)，其中所述经修饰的形式与野生型B型CDKB相比具有至少降低的激酶活性。优选所述CDKB-RKA缺少激酶活性。CDKB-RKA多肽在本领域是公知的且已描述例如Van Leene等人，2010，Mol Syst Biol6,397；Francis2007New Phytol174(2)：261-78；Doonan&Kitsios2009Mol Biotechnol42(1)：14-29。CDKB多肽的实例也在实施例1、表A2中显示。

更尤其，用于本文的术语“CDKB-RKA”包含突变的B型依赖于细胞周期蛋白的激酶(CDKB)，该突变体与野生型蛋白质相比具有至少降低的激酶活性，且优选缺少激酶活性。在一实例中，用于本文的术语“CDKB-RKA”包含在激酶结构域中突变的B型依赖于细胞周期蛋白的激酶(CDKB)。用于本文的术语“降低的催化激酶活性”指与野生型多肽相比具有降低的催化激酶活性的多肽。用于本文的术语“缺少的催化激酶活性”指与野生型多肽相比没有或没有可检测到的催化激酶活性的多肽。术语“催化激酶活性”和“激酶活性”本文用作同义词。用于检测和确定催化激酶活性的工具和技术使本领域公知的。催化激酶活性例如可通过激酶测定法确定，例如本说明书实施例4所述的。

本发明上下文中术语“突变的”意指一种或多种非沉默突变，即与对应未经修饰的多肽相比修饰多肽的氨基酸序列的突变。此突变的非限制性实例例如可包括：***；删除；氨基酸置换；由在DNA核酸序列中***或删除大量核苷酸引起的移码突变，其不由3点突变均匀分割；无义突变在已转录的mRNA中产生例如预成熟停止密码子或无义密码子，且可能产生截短的蛋白产品；错义突变或同义突变，是一类点突变，其中改变单核苷酸以引起不同氨基酸置换等。用于诱导突变例如***、置换、截短、删除等的技术是本领域公知的，且因此未在本文描述。

用于本文的术语“CDKB-RKA”也包含CDKB的截短形式，其中该截短优选位于激酶结构域。用于本文的术语“CDKB-RKA”也包含CDKB多肽的截短形式，其中没有活性激酶出现。其实例是由拟南芥序列SEQ IDNO：318代表，其是SEQ ID NO：320的截短形式。优选地，用于本发明方法的CDKB-RKA多肽是在该多肽的C端一半处有删除的CDKB多肽的截短形式，其降低，优选基本灭活该多肽的激酶活性。更优选地，用于本发明方法的CDKB-RKA多肽是在该多肽的C端一半处有删除的CDKB多肽的截短形式，其包含该CDKB多肽或其部分的基本上完整的激酶结构域，或由该CDKB多肽或其部分的基本上完整的激酶结构域组成。

在一优选的实施方案中，如本文提供的CDKB-RKA多肽包含由不具有错配或在从左到右的2位和／或4位具有错配的PPTALRE基序代表的细胞周期蛋白结合结构域。如本文提供的CDKB-RKA多肽优选包含由SEQID NO：403，更优选由SEQ ID NO：404代表的细胞周期蛋白结合结构域。换言之，本发明涉及能够结合细胞周期蛋白且因此具有细胞周期蛋白结合活性的CDKB-RKA多肽的编码核酸的用途。图3中可见不具有错配或在从左到右的2位和／或4位具有错配的PPTALRE基序，其是具有代表性数量的B型CDK多肽。

额外地或备选地，本发明涉及CDKB-RKA多肽的编码核酸序列的用途，其：

(i)具有细胞周期蛋白结合活性，和

(ii)具有如本文定义的降低的激酶活性和／或缺少激酶活性。

在另一实施方案中，本发明涉及CDKB-RKA多肽的编码核酸序列的用途，其：

(i)具有由不具有错配或在从左到右的2位和／或4位具有错配的PPTALRE基序代表的，且优选由SEQ ID NO：403，且更优选由SEQ ID NO：404代表的细胞周期蛋白结合结构域，和

(ii)具有突变或截短激酶结构域或缺少激酶结构域。

在又一实施方案中，本发明涉及CDKB-RKA多肽的编码核酸序列的用途，其：

(ii)具有突变或截短激酶结构域或缺少激酶结构域，和

(iii)与SEQ ID NO：318具有至少约30-40％，优选至少约41-50％，更优选至少约51-60％、61-70％、71-80％、81-85％、86-90％、91-95％、96-99％或超过99％总体序列同一性。

在另一实施方案中，本文提供的CDKB-RKA多肽包含蛋白激酶抑制结构域。在一优选的实施方案中，所述蛋白激酶抑制结构域具有蛋白激酶抑制功能，且其能够被激酶(如Wee1激酶)磷酸化，以抑制催化激酶活性。

在又一实施方案中，本文提供的CDKB-RKA多肽缺少T环激活激酶结构域(如Magyar等人1997；plant cell9(2)223-235定义的)。

编码如本文定义的CDKB-RKA多肽的核酸可衍生自本文实施例部分的表A2中给出的任一CDKB核酸序列。衍生自本文实施例部分的表A2中给出的核酸序列的核酸在本发明方法中有用。实施例部分的表A2中给出的核酸序列是由SEQ ID NO：320代表的CDKB-RKA多肽的直向同源物或旁系同源物，术语“直向同源物”和“旁系同源物”如本文中定义。可以通过执行如定义部分中所述的所谓交互性blast检索轻易地鉴定其他直向同源物和旁系同源物；在查询序列是SEQ ID NO：319或SEQ ID NO：320的情况下，第二BLAST(反向BLAST)将针对拟南芥序列。此外，在另一实施方案中，编码如本文定义的CDKB多肽的核酸序列还可衍生自表A2中给出的任意多肽的直向同源物或旁系同源物。可衍生出编码如本文定义的CDKB-RKA多肽的核酸序列的编码CDKB多肽的核酸的其他实例也被公开例如在WO2005／024029或US20070214517，其并入本文作为参考。

在优选的实施例中，用于本发明方法的CDKB-RKA多肽是表A2中代表的，且优选SEQ ID NO：320代表的任意CDKB多肽的经修饰的形式，如突变的形式和／或截短的形式。

在另一优选的实施例中，用于本发明方法的CDKB-RKA多肽是表A2中代表的，且优选SEQ ID NO：320代表的任意CDKB多肽的截短的形式，在所述多肽得C端一半处具有删除，其降低，优选基本灭活该多肽的激酶活性。

在又一优选的实施例中，用于本发明方法的CDKB-RKA多肽是具有表A2中代表的，且优选SEQ ID NO：320代表的任意CDKB多肽的截短的形式，其删除包括任意所述多肽的部分或基本全部激酶结构域。例如，用于本发明方法的CDKB-RKA多肽是具有SEQ ID NO：320代表的CDKB多肽的截短的形式，其删除所述多肽的基本全部激酶结构域，例如由SEQ ID NO：4(IPR008271)上氨基酸位置140至152所代表的，或只删除其一部分的，其中所述部分可包含1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11或12个氨基酸。

在尤其优选的实施例中，用于本发明方法的CDKB-RKA多肽与SEQID NO：318代表的氨基酸序列或其同源物、直向同源物或旁系同源物对应。

如本文定义的术语“同源物”指氨基酸序列，其以增加的优选顺序与SEQ ID NO：318具有至少30％、31％、32％、33％、34％、35％、36％、37％、38％、39％、40％、41％、42％、43％、44％、45％、46％、47％、48％、49％、50％、51％、52％、53％、54％、55％、56％、57％、58％、59％、60％、61％、62％、63％、64％、65％、66％、67％、68％、69％、70％、71％、72％、73％、74％、75％、76％、77％、78％、79％、80％、81％、82％、83％、84％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％总体序列同一性，且例如与SEQ ID NO：318具有至少约30-40％，优选至少约41-50％，更优选至少约51-60％、61-70％、71-80％、81-85％、86-90％、91-95％、96-99％或超过99％总体序列同一性，条件是该氨基酸序列具有

(i)如上文定义的降低的激酶活性，优选缺少激酶活性，和

(ii)任选地，具有由不具有错配或在从左到右的2位和／或4位具有错配的PPTALRE基序代表的，且优选由SEQ ID NO：403，且更优选由SEQID NO：404代表的细胞周期蛋白结合结构域。

使用总体比对算法，如程序GAP(GCG Wisconsin Package，Accelrys)中的Needleman Wunsch算法，优选采用默认参数并且优选采用成熟蛋白质的序列(即不考虑分泌信号或转运肽)，确定总体序列同一性。在一个实施方案中，通过在SEQ ID NO：318的序列的整个长度范围内比较多肽序列，确定序列同一性水平。

在本发明的一个实施方案中，当本发明的核酸序列在活的植物细胞中转录并翻译时，本发明的此核酸序列的功能将赋予增加产量或产量相关性状的信息用于具有降低，且优选缺少催化激酶活性CDKB-RKA多肽的合成。

编码如本文定义的CDKB-RKA多肽的核酸可以源自任何天然或人工来源。该核酸可以通过人类有意操作，在组成和／或基因组环境方面从其天然形式修改而来。优选地，编码CDKB-RKA多肽的核酸来自植物，进一步优选来自双子叶植物，更优选来十字花科科(Brassicaceae)，最优选地，该核酸来自拟南芥。

另外，当根据本发明方法如实施例8和9中所概述那样在稻中表达CDKB-RKA多肽时，产生具有增加的产量相关性状，尤其增加地上生物量、根生物量，和包括总种子重和种子数的种子产量的任一项或更多项。

本发明通过用SEQ ID NO：317所代表的核酸序列转化植物进行说明，其中所述核酸序列编码SEQ ID NO：318的多肽序列。然而，本发明的实施不限于这些序列；本发明的方法可以有利地使用如本文定义的任何CDKB-RKA编码核酸或CDKB-RKA多肽或其变体实施。

核酸变体也可以用于实施本发明的方法。此类核酸变体的实例包括编码在实施例部分的表A2中所给出的任一个氨基酸序列或SEQ ID NO：318的同源物和衍生物的核酸，术语“同源物”和“衍生物”如本文中定义，条件是所述同源物和衍生物具有降低的，且优选缺少催化激酶活性。在本发明方法中有用的还是这样的核酸，其编码在实施例部分的表A2中给出的任一氨基酸序列或SEQ ID NO：318的直向同源物或旁系同源物的同源物和衍生物，条件是所述直向同源物或旁系同源物的同源物和衍生物如本文定义的具有降低的，且优选缺少催化激酶活性。在实施本发明方法中有用的其他变体是其中优化了密码子选择或其中去除miRNA靶位点的变体。

在实施本发明方法中有用的其他核酸变体包括编码CDKB-RKA多肽的核酸的部分、与编码CDKB-RKA多肽的核酸杂交的核酸、编码CDKB-RKA多肽的核酸的剪接变体、编码CDKB-RKA多肽的核酸的等位变体和通过基因改组获得的编码CDKB-RKA多肽的核酸的变体。术语杂交序列、剪接变体、等位变体和基因改组如本文所述。根据本发明的这些其他核酸变体共同特征在于它们编码具有降低的催化激酶活性，且优选缺少催化激酶活性的多肽。

根据本发明，提供了用于增强植物中产量相关性状的方法，所述方法包括在植物中导入并且表达在实施例部分的表A2给出的任一个核酸序列或SEQ ID NO：317的一部分，或编码在实施例部分表A2中给出的任一氨基酸序列或SEQ ID NO：317的直向同源物、旁系同源物或同源物的核酸的一部分。

在本发明方法中有用的部分编码了如本文定义的CDKB-RKA多肽。优选地，该部分是在实施例部分表A2中给出的任一核酸或SEQ ID NO：317的一部分，或是编码在实施例部分表A2中给出的任一氨基酸序列或SEQ ID NO：318的直向同源物或旁系同源物的核酸的一部分。优选地，该部分具有至少50、60、70、80、90、100、110、120、150、200、250、300、350、400、450、500、550、600、650、700个连续核苷酸长度，所述连续核苷酸属于在实施例部分表A2中给出的任一核酸序列或SEQ ID NO：317，或属于编码在实施例部分表A2中给出的任一氨基酸序列或SEQ IDNO：317的直向同源物或旁系同源物的核酸。优选地，该部分编码氨基酸序列的片段，其具有降低的激酶活性，且优选缺少激酶活性，且其(i)包含细胞周期蛋白结合结构域和／或(ii)与SEQ ID NO：318具有至少约30-40％，优选至少约41-50％，更优选至少约51-60％、61-70％、71-80％、81-85％、86-90％、91-95％、96-99％或超过99％总体序列同一性。

在本发明方法中有用的另一种核酸变体是能够在降低的严格条件下，优选在严格条件下与如本文定义的编码CDKB-RKA多肽的核酸或与如本文定义的部分杂交的核酸。

根据本发明，提供了用于增强植物中产量相关性状的方法，其包括在植物中导入并表达能够与实施例部分的表A2中给出的任一种核酸或SEQ ID NO：317如本文定义的部分杂交的核酸，或包含在植物中导入并表达这样的核酸，所述核酸能够与编码在实施例部分的表A2中给出的任意核酸序列或SEQ ID NO：317或如本文定义的部分的直向同源物、旁系同源物或同源物的核酸杂交。

在本发明方法中有用的杂交序列编码了如本文定义的CDKB-RKA多肽。优选地，该杂交序列能够与实施例部分的表A2中给出的任一核酸的互补核酸或与SEQ ID NO：317或与任意这些序列的一部分杂交，所述的一部分如上文中定义，或该杂交序列能够与下述核酸的互补核酸杂交，所述核酸编码在实施例部分的表A2中给出的任一氨基酸序列或SEQ ID NO：317的直向同源物或旁系同源物。

最优选地，该杂交序列能够与如SEQ ID NO：317所代表的核酸的互补核酸或与其一部分杂交。在一个实施方案中，该杂交条件是如上文定义的中等严格，优选高严格条件。

优选地，该杂交序列编码具有氨基酸序列的多肽，该氨基酸序列具有降低的激酶活性，且优选缺少激酶活性，且其(i)包含细胞周期蛋白结合结构域和／或(ii)与SEQ ID NO：318具有至少约30-40％，优选至少约41-50％，更优选至少约51-60％、61-70％、71-80％、81-85％、86-90％、91-95％、96-99％或超过99％总体序列同一性。

在本发明方法中有用的另一种核酸变体是编码如上文定义的CDKB-RKA多肽的剪接变体，剪接变体如本文中定义。

根据本发明，提供了用于增强植物中产量相关性状的方法，所述方法包含在植物中导入并且表达在实施例部分的表A2中给出的任一个核酸序列或SEQ ID NO：317的剪接变体，或编码在实施例部分表A2中给出的任一氨基酸序列或SEQ ID NO：317的直向同源物、旁系同源物或同源物的核酸的剪接变体。

优选地，剪接变体是SEQ ID NO：317代表的核酸的剪接变体，或编码SEQ ID NO：318的直向同源物、旁系同源物的核酸的剪接变体。优选地，该剪接变体编码的氨基酸序列具有降低的激酶活性，且优选缺少激酶活性，且其(i)包含细胞周期蛋白结合结构域和／或(ii)与SEQ ID NO：318具有至少约30-40％，优选至少约41-50％，更优选至少约51-60％、61-70％、71-80％、81-85％、86-90％、91-95％、96-99％或超过99％总体序列同一性。

在实施本发明方法中有用的另一种核酸变体是编码如上文所定义的CDKB-RKA多肽的核酸的等位变体，等位变体如本文中定义。

根据本发明，提供用于增强植物中产量相关性状的方法，所述方法包括在植物中导入并且表达在实施例部分的表A2中给出的任一核酸或SEQID NO：317的等位变体，或包括在植物中导入并且表达下述核酸的等位变体，其中所述核酸编码在实施例部分的表A2中给出的任一氨基酸序列或SEQ ID NO：317的直向同源物、旁系同源物或同源物。

等位变体存在于自然界中，并且在本发明的方法中包括使用这些天然的等位基因。优选地，该等位变体是SEQ ID NO：317的等位变体或编码SEQ ID NO：318的直向同源物或旁系同源物的核酸的等位变体。优选地，该等位变体编码的氨基酸序列具有降低的激酶活性，且优选缺少激酶活性，且其(i)包含细胞周期蛋白结合结构域和／或(ii)与SEQ ID NO：318具有至少约30-40％，优选至少约41-50％，更优选至少约51-60％、61-70％、71-80％、81-85％、86-90％、91-95％、96-99％或超过99％总体序列同一性。

基因改组或定向进化也可以用来产生编码如上文定义的CDKB-RKA多肽的核酸的变体；术语“基因改组”如本文定义。

根据本发明，提供了用于增强植物中产量相关性状的方法，所述方法包括在植物中导入并且表达在实施例部分的表A2中给出的任一核酸序列或SEQ ID NO：317的变体，或包括在植物中导入并且表达下述核酸的变体，所述的核酸编码在实施例部分的表A2中给出的任一氨基酸序列或SEQ ID NO：317的直向同源物、旁系同源物或同源物，所述的变体核酸通过基因改组获得。

优选地，由基因改组获得的变体核酸编码的氨基酸序列具有降低的激酶活性，且优选缺少激酶活性，且其(i)包含细胞周期蛋白结合结构域和／或(ii)与SEQ ID NO：318具有至少约30-40％，优选至少约41-50％，更优选至少约51-60％、61-70％、71-80％、81-85％、86-90％、91-95％、96-99％或超过99％总体序列同一性。

另外，核酸变体也可以通过位点定向诱变获得。几种方法可用于实现位点定向诱变，最常见方法是基于PCR的方法(Current Protocols inMolecular Biology.Wiley编著)。因1个或几个氨基酸(如本文定义的置换、***和／或删除)而与SEQ ID NO：318的序列不同的CDKB-RKA多肽可以同等地用于本发明的方法和构建体和植物中增加植物的产量。

本发明方法的实施产生了具有增强的产量相关性状的植物。特别地，本发明方法的实施产生了相对于对照植物具有增加的产量、特别是增加的种子产量。术语“产量”和“种子产量”在本文的“定义”部分中更详细地描述。在另一实施方案中，本发明方法的实施产生了相对于对照植物具有增加的产量，特别是增加的营养生物量，如增加的叶和／或根生物量。术语“营养生物量”在本文的“定义”部分中更详细地描述。

本发明提供了用于相对于对照植物增加植物产量相关性状、且尤其产量、且更尤其种子产量和生物量、尤其增加的营养生物量，如增加的叶和／或根生物量的方法，所述方法包括调节植物中编码如本文定义的CDKB-RKA多肽的核酸表达。

根据本发明的优选特征，本发明方法的实施产生了相对于对照植物具有增加的生长速率的植物。因此，根据本发明，提供了用于增加植物生长速率的方法，所述方法包括在植物中调节编码如本文定义的CDKB-RKA多肽的核酸表达。

相对于可比较条件下培育的对照植物，本发明方法的实施给予在非胁迫条件下或在轻度干旱条件下培育的植物增加的产量。因此，根据本发明，提供了用于增加非胁迫条件下或在轻度干旱条件下培育的植物中产量的方法，所述方法包括调节植物中编码如本文定义的CDKB-RKA多肽的核酸表达。

相对于可比较条件下培育的对照植物，本发明方法的实施给予在干旱条件下培育的植物增加的产量。因此，根据本发明，提供了用于增加在干旱条件下培育的植物中产量的方法，所述方法包括调节植物中编码如本文定义的CDKB-RKA多肽的核酸表达。

相对于可比较条件下生长的对照植物，本发明方法的实施给予在养分缺乏条件下、尤其缺氮条件下培育的植物增加的产量。因此，根据本发明，提供了用于增加在养分缺乏条件下培育的植物中产量的方法，所述方法包括调节植物中编码如本文定义的CDKB-RKA多肽的核酸表达。

相对于可比较条件下培育的对照植物，本发明方法的实施给予在盐胁迫条件下培育的植物增加的产量。因此，根据本发明，提供了用于增加在盐胁迫条件下培育的植物中产量的方法，所述方法包括调节植物中编码如本文定义的CDKB-RKA多肽的核酸表达。

本发明也提供基因构建体和载体以促进在植物中导入和／或表达编码如本文定义的CDKB-RKA多肽的核酸。所述基因构建体可以***适于转化至植物中并且适于在转化细胞中表达目的基因的载体，所述载体可以是市售的。本发明也提供如本文中定义的基因构建体在本发明方法中的用途。

更具体地，本发明提供构建体，其包含：

(a)编码如上文定义的CDKB-RKA多肽的核酸；

(c)转录终止序列。

优选地，编码CDKB-RKA多肽的核酸如上文定义。术语“控制序列”和“终止序列”如本文定义。

本发明的基因构建体可以包含于宿主细胞，植物细胞，种子，农产品或植物中。本发明进一步提供用如上文所述的构建体转化的植物。具体而言，本发明提供用如上文所述的构建体转化的植物，所述植物具有如本文所述的增加的产量性状。

用基因构建体如包含任意上述核酸的载体或表达盒转化植物。本领域技术人员非常清楚必须在所述基因构建体上存在以便成功转化、选择和增殖含有目的序列的宿主细胞的遗传元件。目的序列与一个或多个控制序列(至少与启动子)有效地连接。

在一实施方案中，本发明基因构建体当其被导入所述植物细胞时且表达编码存在于基因构建体中的CDKB-RKA多肽的核酸时，赋予活着的植物细胞增加的产量或产量相关性状，。

应该明白本发明的适用性不限于SEQ ID NO：317代表的核酸编码的CDKB-RKA多肽。

有利地，任意类型的启动子，无论是天然的或合成的，均可以用来驱动该核酸序列表达，不过优选地，该启动子是植物源的。组成型启动子在所述方法中特别有用。优选地，组成型启动子是中等强度启动子。在另一实施方案中，所述组成型启动子是中等强度的遍在组成型启动子。对于多种启动子类型的定义，见本文的“定义”部分。

任选地，可以在导入植物的构建体中使用一个或多个终止子序列。优选地，该构建体包含这样的表达盒，其包含中等强度的遍在组成型启动子，与如本文定义的编码CDKB-RKA多肽的核酸有效连接。另外，编码选择标记的一个或多个序列可以存在于导入植物的构建体上。

如上文提到，用于调节编码如本文定义的CDKB-RKA多肽的核酸表达的优选方法是通过在植物中导入并表达编码CDKB-RKA多肽的核酸；然而，使用其他熟知的技术，包括但不限于T-DNA激活标签法、TILLING、同源重组，也可以实现实施本方法的效果，即增强产量相关性状。在定义部分中提供对这些技术的描述。

本发明也提供了用于产生转基因植物的方法，所述转基因植物相对于对照植物具有增强的产量相关性状，所述方法包括在植物中导入并且表达编码如本文所定义的CDKB-RKA多肽的任意核酸。

更具体地，本发明提供了用于产生转基因植物的方法，所述转基因植物具有增强的产量相关性状、尤其是增加的产量、更尤其增加的种子产量和／或增加的生物量如营养生物量，所述方法包括：

(i)在植物或植物细胞中导入并且表达如本文定义的CDKB-RKA多肽编码核酸或包含如本文定义的CDKB-RKA多肽编码核酸的基因构建体；和

(ii)在促进植物生长和发育的条件下培育植物细胞。

在促进植物生长和发育的条件下培育植物细胞可以包括或可以不包括再生和／或生长至成熟。

(i)的核酸可以是能编码如本文定义的CDKB-RKA多肽的任意核酸。

可以将核酸直接导入植物细胞或导入植物自身中(包括导入组织、器官或植物的任何其他部分)。根据本发明的优选特征，核酸优选通过转化导入植物中。术语“转化”在本文的“定义”部分中更详细地描述。

在一个实施方案中，本发明扩展至通过本文所述任意方法产生的任意植物细胞或植物，并扩展至全部植物部分及其繁殖体。本发明包括通过本发明方法获得的植物或其部分(包括种子)。植物或植物部分或植物细胞包含了编码如上文定义的CDKB-RKA多肽的核酸转基因，优选在基因构建体如表达盒中。本发明进一步扩展以包括已经通过前述任意方法产生的原代转化或转染细胞、组织、器官或完整植物的子代，唯一要求是子代展示出与本发明方法中由亲本产生的那些相同的基因型和／或表型特征。

在另一个实施方案中，本发明还扩展至包含本发明表达盒、本发明基因构建体，或编码如上文所述的CDKB-RKA的核酸，和／或该核酸编码的CDKB-RKA的种子。

在一具体实施方案中，本发明的植物细胞是非繁殖细胞，即，细胞是使用本领域已知的细胞培养技术不能够再生成植物的细胞。尽管植物细胞通常具有全能性特征，但是一些植物细胞不能用来从所述细胞再生或繁殖出完整植物。在本发明的一个实施方案中，本发明的植物细胞是此类细胞。

在另一个实施方案中，本发明的植物细胞是不以自养方式自我维持的植物细胞。此植物细胞不视为代表植物品种。在又一实施方案中，本发明的植物细胞是非植物品种且是非繁殖的。

本发明也包括含有分离的核酸的宿主细胞，所述分离的核酸编码如上文所定义的CDKB-RKA多肽。在一个实施方案中，本发明的宿主细胞是植物细胞、酵母、细菌或真菌。对于本发明方法中所用的核酸或载体，表达盒、构建体或载体，宿主植物原则上有利地是能够合成本发明方法中所用多肽的全部植物。在一个具体实施方案中，本发明的植物细胞过量表达本发明的核酸分子。

本发明也包括用于产品生产的方法，其包括a)种植本发明的植物和b)从或通过本发明植物或这些植物的部分包括种子生产所述产品。在又一实施方案中，该方法包含步骤a)种植本发明的植物，b)从该植物移出如上定义的可收获部分，和c)从或用本发明可收获部分生产所述产品。

有利地，本发明方法比已知的方法更高效，原因是与可比较方法中使用的对照植物相比，本发明的植物具有增加的产量和／或增加的针对环境胁迫的耐受性。在一个实施方案中，由本发明的所述方法产生的产品是植物产物，如但不限于食品、饲料、食品补充物、饲料补充物、纤维、化妆品或药物。在另一个实施方案中，本发明方法用来产生农产品，如但不限于植物提取物、蛋白质、氨基酸、糖类、脂肪、油、聚合物、维生素等。

在又一个实施方案中，本发明的多核苷酸序列或多肽序列包含于农产品中。在一个特定实施方案中，本发明的核酸序列和蛋白质序列可以用作产品标志物，例如在通过本发明方法产生农产品的情况下。这种标志物可以用来鉴定已经由有利方法产生的产品，其中所述的有利方法不仅导致该方法的更高效率，还导致改进的产品质量，原因在于该方法中所用的植物材料和可收获部分的品质提高。可以通过本领域已知的多种方法检测此类标志物，例如但不限于基于PCR的用于核酸检测的方法或基于抗体的用于蛋白质检测的方法。

本发明的方法有利地适用于任意植物，尤其适用于如本文定义的任何植物。在本发明方法中特别有用的植物包括属于植物界超家族、尤其单子叶和双子叶植物的全部植物，包括饲用或饲料豆科植物、观赏植物、粮食作物、树或灌木。根据本发明的一个实施方案，植物是作物植物。作物植物的实例包括但不限于菊苣、胡萝卜、木薯、百脉根、大豆、甜菜、糖料甜菜、向日葵、卡诺拉、苜蓿、油菜、亚麻、棉花、番茄、马铃薯和烟草。根据本发明的另一个实施方案，植物是单子叶植物。单子叶植物的实例包括甘蔗。根据本发明的另一个实施方案，植物是谷类植物。谷类的实例包括稻、玉米、小麦、大麦、粟、黑麦、黑小麦、高粱、二粒小麦、斯卑尔脱小麦、单粒小麦、埃塞俄比亚画眉草、芦粟和燕麦。在一个特定实施方案中，在本发明方法中所用的植物选自玉米、小麦、稻、大豆、棉花、油菜(包括卡诺拉)、甘蔗、糖料甜菜和苜蓿。

本发明也扩展至植物的可收获部分，如但不限于种子、叶、果实、花、茎、根、根状茎、块茎和球茎，所述可收获部分包含编码CDKB-RKA多肽的重组核酸。本发明还涉及源自或产自，优选直接源自或产自这种植物的可收获部分中的产物，如干燥颗粒、粗粉或粉末、油、脂肪和脂肪酸、淀粉或蛋白质。

本发明也包括编码如本文中所述的CDKB-RKA多肽的核酸的用途，和这些CDKB-RKA多肽的用途，用于增强植物中任意的前述产量相关性状。例如，编码本文所述的CDKB-RKA多肽的核酸，或CDKB-RKA多肽本身可以用于育种计划中，在所述育种计划中鉴定可以遗传地与编码CDKB-RKA多肽的基因连锁的DNA标志物。这些核酸／基因或CDKB-RKA多肽自身可以用来定义分子标志物。这种DNA或蛋白质标志物随后可以在本发明方法中用于育种计划中以选择具有如上文所定义的增强的产量相关性状的植物。另外，编码CDKB-RKA多肽的核酸／基因的等位变体可以用于标志物辅助的育种计划中。编码CDKB-RKA多肽的核酸也可以用作探针以遗传地或物理地绘制这些核酸作为其部分的基因并且用作与这些基因连锁的性状的标志物。此类信息可能用于植物育种中旨在开发具有所希望表型的品系。

实施方案

1.WAK-样多肽

本发明还由以下一种或多种实施方案所表征：

1.用于相对于对照植物增强植物中产量相关性状的方法，所述方法包括调节植物中编码WAK-样多肽的核酸的表达，其中所述的WAK-样多肽包含EGF结构域和跨膜结构域。

2.根据实施方案1的方法，其中所述受调节的表达通过在植物中导入并且表达编码所述WAK-样多肽的所述核酸实现。

3.根据实施方案1或2的方法，其中所述增强的产量相关性状相对于对照植物包括增强的产量，且优选相对于对照植物包括增加的生物量和／或增加的种子产量。

4.根据实施方案1至3中任一实施方案的方法，其中所述增强的产量相关性状在非胁迫条件下获得。

5.根据实施方案1至3中任一实施方案的方法，其中所述增强的产量相关性状在干旱胁迫或缺氮条件下获得。

6.根据实施方案1至5中任一实施方案的方法，其中所述编码WAK-样多肽的核酸是植物来源的，优选来自单子叶植物，还优选来自禾本科，更优选来自稻属，最优选来自稻。

7.根据实施方案1至6中任一实施方案的方法，其中所述编码WAK-样多肽的核酸编码表A1中所列的任一种多肽，或是这种核酸的一部分，或是能与这种核酸杂交的核酸，条件是这些多肽包含EGF结构域和跨膜结构域。

8.根据实施方案1至7中任一实施方案的方法，其中所述核酸序列编码表A1中给出的任一多肽的直向同源物或旁系同源物，条件是这些多肽包含EGF结构域和跨膜结构域。

9.根据实施方案1至8中任一实施方案的方法，其中所述核酸编码由SEQ ID NO：2或4代表的多肽。

10.根据实施方案1至9中任一实施方案的方法，其中所述的核酸与组成型启动子，优选与中等强度组成型启动子，优选与植物启动子，更优选与GOS2启动子，最优选与来自稻的GOS2启动子有效连接。

11.通过根据实施方案1至10中任一实施方案的方法获得的植物、其植物部分，包括种子或植物细胞，其中所述植物、植物部分或植物细胞包含编码如实施方案1、4-9中任一实施方案所定义的WAK-样多肽的重组核酸。

12.构建体，其包含：

(i)编码如实施方案1、4-9中任一实施方案所定义的WAK-样多肽的核酸；

(ii)能够驱动(i)的核酸序列表达的一个或多个控制序列；和任选地

(iii)转录终止序列。

13.根据实施方案12的构建体，其中所述控制序列之一是组成型启动子，优选是中等强度组成型植物启动子，优选是植物启动子，更优选是GOS2启动子，最优选是来自稻的GOS2启动子。

14.根据实施方案12或13的构建体在制备植物的方法中的用途，所述植物具有增强的产量相关性状，优选相对于对照植物具有增加的产量，和更优选相对于对照植物具有增加的种子产量和／或增加的生物量。

15.用根据实施方案12或13的构建体转化的植物、植物部分或植物细胞。

16.用于产生转基因植物的方法，所述转基因植物相对于对照植物具有增强的产量相关性状，优选相对于对照植物具有增加的产量，并且更优选相对于对照植物具有增加的种子产量和／或增加的生物量，所述方法包括：

(i)在植物细胞或植物中导入并且表达编码如实施方案1、4-9中任一者所定义的WAK-样多肽的核酸；和

(ii)在促进植物生长和发育的条件下培育所述植物细胞或植物。

17.转基因植物，其因编码如实施方案1、4-9中任一实施方案所定义的WAK-样多肽的核酸的受调节表达而相对于对照植物具有增强的产量相关性状，优选相对于对照植物具有增加的产量，并且更优选具有增加的种子产量和／或增加的生物量，或源自所述转基因植物的转基因植物细胞。

18.根据实施方案11、15或17的转基因植物或源自其的转基因植物细胞，其中所述植物是作物植物，如甜菜、糖料甜菜或苜蓿，或单子叶植物如甘蔗；或谷类，如稻、玉米、小麦、大麦、粟、黑麦、黑小麦、高粱、二粒小麦、斯卑尔脱小麦、单粒小麦、埃塞俄比亚画眉草、芦粟或燕麦。

19.根据实施方案18的植物的可收获部分，其中所述可收获部分优选是苗生物量和／或种子。

20.产品，其来自根据实施方案18的植物和／或来自根据实施方案19的植物的可收获部分。

21.编码如实施方案1、4-9中任一实施方案所定义的WAK-样多肽的核酸的用途，用于相对于对照植物增强植物中的产量相关性状，优选用于增加产量，且更优选用于相对于对照植物增加植物中的种子产量和／或增加生物量。

22.生产产品的方法，其包括培育根据实施方案11、14、15、17或18的植物的步骤，和从或由以下生产所述产品：

(i)所述植物；或

(ii)所述植物的部分，包括种子。

23.根据实施方案12或13构建体，其包含在植物细胞中。

24.重组染色体DNA，其包含根据实施方案12或13的构建体。

2.CDKB-RKA多肽

本发明还由以下一种或多种实施方案所表征：

1.用于相对于对照植物增加植物中产量的方法，所述方法包括在所述植物中导入和表达编码CDKB-RKA多肽的核酸分子，其中所述CDKB-RKA多肽是经修饰的CDKB多肽，且其中所述CDKB-RKA多肽与所述CDKB多肽相比具有降低的催化激酶活性。

2.根据实施方案1的方法，其中所述CDKB-RKA多肽缺少催化激酶活性。

3.根据实施方案1或2的方法，其中所述CDKB-RKA多肽是突变的CDKB多肽。

4.根据实施方案1、2或3实施方案的方法，其中所述CDKB-RKA多肽是包含突变的激酶结构域的CDKB多肽。

5.根据实施方案1至4中任一项实施方案的方法，其中所述CDKB-RKA多肽是截短的CDKB多肽。

6.根据实施方案1至5中任一项实施方案的方法，其中所述CDKB-RKA多肽是截短的CDKB多肽，其在所述多肽的C端一半处包含删除，其降低所述CDKB的激酶活性，且优选基本上灭活所述CDKB的激酶活性。

7.根据实施方案1至6中任一项实施方案的方法，其中所述CDKB-RKA多肽是截短的CDKB多肽，其包含所述CDKB多肽的激酶结构域的删除。

8.根据实施方案1至6中任一项实施方案的方法，其中所述CDKB-RKA多肽是截短的CDKB多肽，其包含所述CDKB多肽的激酶结构域的一部分的删除，其中所述部分优选包含至少1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11或12个氨基酸。

9.根据实施方案1至8中任一项实施方案的方法，其中所述CDKB多肽的所述激酶结构域由来自SEQ ID NO：320的氨基酸140至氨基酸152所代表的保守结构域代表。

10.根据实施方案1至9中任一项实施方案的方法，其中所述CDKB多肽具有细胞周期蛋白结合活性。

11.根据实施方案1至10中任一项实施方案的方法，其中所述CDKB-RKA多肽包含细胞周期蛋白结合结构域，优选由不具有错配或在从左到右的2位和／或4位具有错配的PPTALRE基序代表的细胞周期蛋白结合结构域，且更优选由SEQ ID NO：403且更优选由SEQ ID NO：404代表的细胞周期蛋白结合结构域。

12.根据实施方案1至11中任一项实施方案的方法，其中所述CDKB-RKA多肽包含蛋白激酶抑制结构域。

13.根据实施方案1至12中任一项实施方案的方法，其中所述CDKB-RKA多肽缺少T环激活激酶结构域。

14.根据实施方案1至13中任一实施方案的方法，其中所述编码CDKB-RKA的核酸选自以下中的任一个：

-核酸，其衍生自编码表A2所列出的任一多肽的核酸；

-核酸，其衍生自表A2所列出的任意多肽的直向同源物或旁系同源物；

-核酸的部分，其编码表A2中给出的任一多肽或表A2中给出的任意多肽的直向同源物或旁系同源物；

-核酸，其能与编码表A2中给出的任一多肽或表A2中给出的任意多肽的直向同源物或旁系同源物的核酸杂交。

15.根据实施方案1至14中任一实施方案的方法，其中所述核酸编码由SEQ ID NO：318代表的多肽或其同源物、直向同源物或旁系同源物，或所述核酸的部分，或能与所述核酸杂交的核酸。

16.根据实施方案1至15中任一实施方案的方法，其中所述核酸编码的所述CDKB多肽是植物来源，优选来自双子叶植物，进一步优选来自十字花科，更优选来自拟南芥属，最优选来自拟南芥。

17.根据实施方案1至16中任一实施方案的方法，其中所述核酸编码多肽，其与SEQ ID NO：318具有至少约30-40％，优选至少约41-50％，更优选至少约51-60％、61-70％、71-80％、81-85％、86-90％、91-95％、96-99％或超过99％总体序列同一性，且优选与SEQ ID NO：318相对应。

18.根据实施方案1至17中任一项实施方案的方法，其中所述相对于对照植物增加的产量包含(i)增加的种子产量和／或(ii)增加的营养生物量，例如增加的叶生物量和／或增加的根生物量。

19.根据实施方案1至18中任一实施方案的方法，其中所述增强的产量相关性状在非胁迫条件下获得。

20.根据实施方案1至19中任一实施方案的方法，其中所述核酸与组成型启动子，优选与组成型植物启动子，更优选与中等强度组成型植物启动子有效连接。

21.根据实施方案1至20中任一实施方案的方法获得的转基因植物，转基因植物部分、包括种子，或转基因植物细胞，其中所述植物、植物部分或植物细胞包含编码如实施方案1和17中任一项实施方案中定义的CDKB-RKA多肽的重组核酸。

22.构建体，其包含：

(i)编码如实施方案1至17中任一项实施方案所定义的CDKB-RKA多肽的核酸；

(iii)转录终止序列。

23.根据实施方案22的构建体，其中所述控制序列之一是组成型启动子，优选是组成型植物启动子，更优选是中等强度组成型植物启动子。

24.根据实施方案22或23的构建体在制备植物的方法中的用途，所述植物具有增强的产量相关性状，优选相对于对照植物具有增加的产量，和更优选相对于对照植物具有增加的种子产量和／或增加的生物量。

25.用根据实施方案22或23的构建体转化的转基因植物、转基因植物部分或转基因植物细胞。

26.用于产生转基因植物的方法，所述转基因植物相对于对照植物具有增强的产量相关性状，优选相对于对照植物具有增加的产量，并且更优选相对于对照植物具有增加的种子产量和／或增加的生物量，所述方法包括：

(i)在植物细胞或植物中导入并且表达编码如实施方案1至17中任一项实施方案所定义的CDKB-RKA多肽的核酸；和

27.转基因植物，其因编码如实施方案1至17中任一项实施方案所定义的CDKB-RKA多肽的核酸导入和表达而相对于对照植物具有增强的产量相关性状，优选相对于对照植物具有增加的产量，并且更优选具有增加的种子产量和／或增加的生物量，或源自所述转基因植物的转基因植物细胞。

28.根据实施方案21、25或27的转基因植物或源自其的转基因植物细胞，其中所述植物是作物植物，如甜菜、糖料甜菜或苜蓿，或单子叶植物如甘蔗；或谷类，如稻、玉米、小麦、大麦、粟、黑麦、黑小麦、高粱、二粒小麦、斯卑尔脱小麦、单粒小麦、埃塞俄比亚画眉草、芦粟或燕麦。

29.根据实施方案21、25、27或28中任一项实施方案的植物的可收获部分，其中所述可收获部分优选是种子。

30.产品，其来自根据实施方案29的植物和／或来自根据实施方案21、25、27或28中任一项实施方案的植物的可收获部分。

31.编码如实施方案1至17中任一项实施方案所定义的CDKB-RKA多肽的核酸的用途，用于相对于对照植物增强植物中的产量相关性状，优选用于增加产量，且更优选用于相对于对照植物增加植物中的种子产量和／或增加生物量。

32.生产产品的方法，其包括培育根据实施方案21、25、27或28中任一项实施方案的植物的步骤，和从或由以下生产所述产品：

(i)所述植物；或

(ii)所述植物的部分，包括种子。

33.根据实施方案22或23构建体，其包含在植物细胞中。

34.重组染色体DNA，其包含根据实施方案22或23的构建体。

35.编码如实施方案1至17中任一项实施方案所定义的CDKB-RKA多肽的核酸的用途，作为分子标记用于相对于对照植物选择植物中增强的产量相关性状，优选用于相对于对照植物选择增加的产量，且更优选用于相对于对照植物选择植物中增加的种子产量和／或用于相对于对照植物选择增加的生物量。

在其他实施方案中，本发明还由以下I至XV实施方案中一种或多种实施方案所表征：

I.用于相对于对照植物增加植物中产量的方法，所述方法包括在所述植物中导入和表达编码CDKB-RKA多肽的核酸分子，其中所述CDKB-RKA多肽是经修饰的CDKB多肽。

II.根据实施方案I的方法，其中所述CDKB-RKA多肽缺少催化激酶活性。

III.根据实施方案I或II的方法，其中所述CDKB-RKA多肽是突变的和／或截短CDKB多肽。

IV.根据实施方案I至III实施方案的方法，其中所述CDKB-RKA多肽是截短的CDKB多肽，其在所述多肽的C端一半处包含删除，其降低所述CDKB的激酶活性，且优选基本上灭活所述CDKB的激酶活性。

V.根据实施方案I至IV中任一项实施方案的方法，其中所述CDKB-RKA多肽是截短的CDKB多肽，其包含所述CDKB多肽的激酶结构域或其部分的删除。

VI.根据实施方案I至V中任一项实施方案的方法，其中所述CDKB-RKA多肽包含由不具有错配或在从左到右的2位和／或4位具有错配的PPTALRE基序代表的细胞周期蛋白结合结构域，优选由SEQ ID NO：403且更优选由SEQ ID NO：404代表的细胞周期蛋白结合结构域。

VII.根据实施方案I至VII中任一实施方案的方法，其中所述核酸编码由SEQ ID NO：318代表的多肽或其同源物、直向同源物或旁系同源物，或所述核酸的部分，或能与所述核酸杂交的核酸。

VIII.根据实施方案I至VII中任一项实施方案的方法，其中所述相对于对照植物增加的产量包含(i)增加的种子产量和／或(ii)增加的营养生物量，例如增加的叶生物量和／或增加的根生物量。

IX.根据实施方案I至VIII中任一实施方案的方法，其中所述核酸与组成型启动子，优选与组成型植物启动子，更优选与中等强度组成型植物启动子有效连接。

X.根据实施方案I至IX中任一实施方案的方法获得的转基因植物，转基因植物部分、包括种子或转基因植物细胞，其中所述植物、植物部分或植物细胞包含编码如实施方案I和VII中任一项实施方案中定义的CDKB-RKA多肽的重组核酸。

XI.构建体，其包含：

(i)编码如实施方案I至VII中任一项实施方案所定义的CDKB-RKA多肽的核酸；

(ii)能够驱动(i)的核酸序列表达的一个或多个控制序列；其中所述调控序列之一是组成型启动子，优选组成型植物启动子，更优选中等强度组成型植物启动子和任选地

(iii)转录终止序列。

XII.根据实施方案XI的构建体转化的植物、植物部分或植物细胞。

XIII.用于产生转基因植物的方法，所述转基因植物相对于对照植物具有增强的产量相关性状，优选相对于对照植物具有增加的种子产量和／或增加的生物量如增加的营养生物量，所述方法包括：

(i)在植物细胞或植物中导入且表达编码如实施方案I至VII中任一项实施方案所定义的CDKB-RKA多肽的核酸；和

XIV.转基因植物或源自所述转基因植物的转基因植物细胞，其因编码如实施方案I至VII中任一项实施方案所定义的CDKB-RKA多肽的核酸导入和表达而相对于对照植物具有增加的产量，优选具有增加的种子产量和／或增加的生物量。

XV.编码如实施方案I至VII中任一项实施方案所定义的CDKB-RKA多肽的核酸的用途，用于相对于对照植物增强植物中产量相关性状，优选用于相对于对照植物增加产量，且更优选用于相对于对照植物增加种子产量和／或用于增加生物量，和／或根据实施方案XI中的构建体的用途，用于制备具有增强的产量相关性状，优选相对于对照植物增加的产量，且更优选增加的种子产量和／或相对于对照植物增加的生物量的方法。

3.UPA20-样多肽

本发明还由以下一种或多种实施方案所表征：

1.用于相对于对照植物增加植物中产量的方法，所述方法包括在所述植物中调节编码UPA20-样多肽的核酸分子，其中所述UPA20-样多肽包含bHLH结构域，且优选包含选自以下的一个或多个结构域：SM00353、PTHR12565：SF7、PTHR12565、PF00010、PS50888、SSF47459和G3DSA：4.10.280.10。

2.根据实施方案1的方法，其中所述受调节的表达通过在植物中导入并且表达编码所述UPA20-样多肽的所述核酸实现。

3.根据实施方案1或2的方法，其中所述增强的产量相关性状包含相对于对照植物增加的产量，且优选包含相对于对照植物增加的种子产量和增加的生物量。

4.根据实施方案1至3中任一实施方案的方法，其中所述增加的种子产量包含增加的总种子重、增加的种子数量、增加的每圆锥花序花数、增加的千粒重和增加的充实率中的任意一种或多种。

5.根据实施方案1至4中任一实施方案的方法，其中所述增强的产量相关性状在非胁迫条件下获得。

6.根据实施方案1至4中任一实施方案的方法，其中所述增强的产量相关性状在干旱胁迫、盐胁迫或缺氮条件下获得。

7.根据实施方案1至6中任一实施方案的方法，其中所述bHLH结构域包含与SEQ ID NO：544代表的氨基酸具有至少50％总体序列同一性的氨基酸序列。

8.根据实施方案1至7中任一项实施方案的方法，其中所述UPA20-样多肽包含一个或多个以下基序：

(ii)基序3：DEIINYVQSLQ[RN]QVEFLSMKLA[ST]V[NS]P[RLV]L[DY](SEQ IDNO：539)，

(iii)基序4：[MN][AS][RK]KRK[SA][RA]x[KG][FGS](SEQ ID NO：540)。

9.根据实施方案1至8中任一项实施方案的方法，其中所述UPA20-样多肽还包含一个或多个以下基序：

(iii)基序7：[KR][LI]AS[LMV][SN]P[VLM][LF]Y[DG]FGMD[LSR](SEQ ID NO：543)。

10.根据实施方案1至9中任一项实施方案的方法，其中所述UPA20-样多肽包含保守结构域(或基序)，其与下述保守结构域具有至少50％序列同一性，该保守结构域选自：

(i)SEQ ID NO：2中的氨基酸186至236(基序8-SEQ ID NO：556)；

(ii)SEQ ID NO：2中的氨基酸174至231(基序9-SEQ ID NO：557)；

(iii)SEQ ID NO：2中的氨基酸183至230(基序10-SEQ ID NO：558)；

(iv)SEQ ID NO：2中的氨基酸181至231(基序11-SEQ ID NO：559)；

(v)SEQ ID NO：2中的氨基酸176至255(基序12-SEQ ID NO：560)；和

(vi)SEQ ID NO：2中的氨基酸176至257(基序13-SEQ ID NO：561)。

11.根据实施方案1至10中任一实施方案的方法，其中所述编码UPA20-样多肽的核酸是植物来源，优选来自双子叶植物，进一步优选来自茄科，更优选来自毛白杨属，最优选地，该核酸来自毛果杨。

12.根据实施方案1至11中任一实施方案的方法，其中所述编码UPA20-样多肽的核酸编码表A3所列出的任一多肽或此核酸的一部分，或能与此核酸杂交的核酸。

13.根据实施方案1至12中任一实施方案的方法，其中所述核酸序列编码表A3中给出的任意多肽的直向同源物或旁系同源物。

14.根据实施方案1至13中任一实施方案的方法，其中所述核酸编码由SEQ ID NO：407代表的多肽或其同源物。

15.根据实施方案1至14中任一实施方案的方法，其中所述的核酸与组成型启动子，优选与中等强度组成型启动子，优选与植物启动子，更优选与GOS2启动子，最优选与来自稻的GOS2启动子有效连接。

16.根据实施方案1至15中任一实施方案的方法获得的植物、其植物部分，包括种子或植物细胞，其中所述植物、植物部分或植物细胞包含编码如实施方案1和7至14中任一实施方案所定义的UPA20-样多肽的重组核酸。

17.根据实施方案16的植物或源自其的植物细胞，其中所述植物是作物植物，如甜菜、糖料甜菜或苜蓿，或单子叶植物如甘蔗；或谷类，如稻、玉米、小麦、大麦、粟、黑麦、黑小麦、高粱、二粒小麦、斯卑尔脱小麦、黑麦草、单粒小麦、埃塞俄比亚画眉草、芦粟或燕麦。

18.构建体，其包含：

(i)编码如实施方案1和7至14中任一项实施方案所定义的UPA20-样多肽的核酸；

(iii)转录终止序列。

19.根据实施方案18的构建体，其中所述控制序列之一是组成型启动子，优选中等强度组成型启动子，优选植物启动子，更优选GOS2启动子，最优选来自稻的GOS2启动子。

20.根据实施方案18或19的构建体在制备植物的方法中的用途，所述植物具有增强的产量相关性状，优选相对于对照植物具有增加的产量，和更优选相对于对照植物具有增加的种子产量和／或增加的生物量。

21.用根据实施方案18或19的构建体转化的植物、植物部分或植物细胞。

22.根据实施方案21的植物或源自其的植物细胞，其中所述植物是作物植物，如甜菜、糖料甜菜或苜蓿，或单子叶植物如甘蔗；或谷类，如稻、玉米、小麦、大麦、粟、黑麦、黑小麦、高粱、二粒小麦、斯卑尔脱小麦、黑麦草、单粒小麦、埃塞俄比亚画眉草、芦粟或燕麦。

23.用于产生转基因植物的方法，所述转基因植物相对于对照植物具有增强的产量相关性状，优选相对于对照植物具有增加的产量，并且更优选相对于对照植物具有增加的种子产量和／或增加的生物量，所述方法包括：

(i)在植物细胞或植物中导入并且表达编码如实施方案1和7至14中任一项实施方案所定义的UPA20-样多肽的核酸；和

24.转基因植物或源自所述转基因植物的转基因植物细胞，其因编码如实施方案1和7至14中任一项实施方案所定义的UPA20-样多肽的核酸的受调节表达而相对于对照植物具有增强的产量相关性状，优选相对于对照植物具有增加的产量、并且更优选具有增加的种子产量。

25.根据实施方案24的转基因植物或源自其的转基因植物细胞，其中所述植物是作物植物，如甜菜、糖料甜菜或苜蓿，或单子叶植物如甘蔗；或谷类，如稻、玉米、小麦、大麦、粟、黑麦、黑小麦、高粱、二粒小麦、斯卑尔脱小麦、黑麦草、单粒小麦、埃塞俄比亚画眉草、芦粟或燕麦。

26.根据实施方案16-17、21-22和24-25中任一项实施方案的植物的可收获部分，其中所述可收获部分优选是苗生物量和／或种子。

27.产品，其来自根据实施方案16-17、21-22和24-25中任一项实施方案的植物和／或来自根据实施方案26的植物的可收获部分。

28.分离的核酸分子，其选自：

(i)由任一SEQ ID NO：458、460和496代表的核酸；

(ii)由任一SEQ ID NO：458、460和496代表的核酸的互补核酸；

29.分离的多肽，其选自：

(i)由任一SEQ ID NO：459、461和497代表的氨基酸序列；

(iii)以上(i)或(ii)中给出的任一氨基酸序列的衍生物。

30.编码如实施方案1和7至14和28中任一项实施方案所定义的UPA20-样多肽的核酸的用途，用于相对于对照植物增强植物中的产量相关性状，优选用于增加产量，且更优选相对于对照植物用于增加植物中的种子产量。

31.如实施方案28中所定义的并且编码UPA20-样多肽的核酸的用途，用于相对于对照植物增强植物中产量相关性状，优选用于增加产量，且更优选用于相对于对照植物增加植物种子产量。

32.编码如实施方案1和7至14和29中任一项实施方案所定义的UPA20-样多肽的核酸作为分子标志物的用途。

33.如实施方案28中所定义并且编码如实施方案1和7至14和29中任一项实施方案所定义的UPA20-样多肽的核酸作为分子标志物的用途。

更尤其，本发明还由以下1至12实施方案中一种或多种实施方案所表征：

1.用于生产相对于对照植物具有增强的种子产量的转基因植物的方法，其包含步骤：

(i)在植物细胞或植物中导入并且表达编码UPA20-样多肽的核酸，其中所述核酸与组成型植物启动子有效连接，且其中所述UPA20-样多肽包含由SEQ ID NO：407所代表的多肽或与SEQ ID NO：407至少具有80％的总体序列同一性的同源物；和

其中所述增加的种子产量包含至少两个选自以下的参数：增加的总种子重、增加的种子数量、增加的每圆锥花序花数和增加的充实率。

2.根据实施方案1的方法，其中所述的核酸与GOS2启动子有效连接。

3.根据实施方案1或2的方法，其中所述GOS2启动子是来自稻的GOS2启动子。

4.根据实施方案1至3中任一项实施方案的方法，其中所述增加的种子产量包含至少三个选自以下的参数：增加的总种子重、增加的种子数量、增加的每圆锥花序花数和增加的充实率。

5.根据实施方案1至4中任一项实施方案的方法，其中所述增加的种子产量包含所有选自以下的参数的增加：增加的总种子重、增加的种子数量、增加的每圆锥花序花数和增加的充实率。

6.根据实施方案1至5中任一项实施方案的方法，其中与对照植物的各个所述参数相比，所述种子产量的增加在所述植物中包含至少5％的增加。

7.根据实施方案1至6中任一项实施方案的方法，其中与对照植物相比，所述种子产量的增加还包含所述植物的增加的千粒重。

8.根据实施方案1至7中任一项实施方案的方法，其中所述增强的产量在非胁迫条件下获得。

9.根据实施方案1至8中任一实施方案的方法，其中所述植物是单子叶植物。

10.根据实施方案9的方法，其中所述植物是玉蜀黍。

11.转基因植物或源自所述转基因植物的转基因植物细胞，其因在所述植物中导入且表达编码如实施方案1所定义的UPA20-样多肽的核酸而相对于对照植物具有如实施方案4至7中任一项实施方案定义的增强的种子产量。

12.编码如实施方案1所定义的UPA20-样多肽的核酸的用途，用于相对于对照植物，增强转基因植物中如实施方案4至7中任一项实施方案所定义的种子产量。

定义

以下定义将在本申请中自始至终使用。本申请中的章节标题和节标题目的仅在于方便和参考目的并且不应当以任何方式影响本申请的含义或解释。通常向本申请范围内所用的技术术语和表述给予在植物生物学、分子生物学、生物信息学和植物育种的相关领域中常适用于它们的含义。以下全部术语定义均适用于本申请的完整内容。与某属性或值相联系的情况下，术语“基本上”、“约”、“大约”等还分别具体地确切限定该属性或确切限定该值。在给定数值或范围的情况下，术语“约”特别涉及处于给予的所述值或范围的20％以内、10％以内或5％以内的值或范围。如本文所用，术语“包含”也包括术语“由……组成”。

肽/蛋白质

除非本文中另外提到，术语“肽”、“寡肽”、“多肽”和“蛋白质”在本文中可互换使用并且指由肽键连接在一起的处于任意长度的聚合形式下的氨基酸。

多核苷酶／核酸／核酸序列／核苷酸序列

术语“多核苷酸”、“核酸序列”、“核苷酸序列”、“核酸”、“核酸分子”在本文中可互换地使用并且指任意长度的聚合非分支形式的核苷酸：核糖核苷酸或脱氧核糖核苷酸，或这二者的组合。

同源物

蛋白质的“同源物”包括这样的肽、寡肽、多肽、蛋白质和酶，它们相对于所讨论的未修饰蛋白具有氨基酸置换、缺失和／或***并且与作为所述肽、寡肽、多肽、蛋白质和酶来源的未修饰蛋白具有相似的生物学活性和功能活性。

直向同源物和旁系同源物是两种不同形式的同源物并且包括用来描述基因祖先关系的进化概念。旁系同源物是相同物种内起源于先祖基因复制的基因；而直向同源物是来自不同生物的起源于物种形成的基因，并且也源自共同的祖先基因。

缺失指从蛋白质中移除一个或多个氨基酸。

“***”指一个或多个氨基酸残基在蛋白质中预定位点内的导入。***可以包含单个或多个氨基酸的氨基端融合和／或羧基端融合以及序列内***。通常，在氨基酸序列内部的***会比氨基端融合或羧基端融合更小，约1-10个残基级别。氨基端或羧基端融合蛋白或融合肽的实例包括如酵母双杂交***中所用的转录激活物的结合结构域或激活结构域、噬菌体外壳蛋白、(组氨酸)-6-标签、谷胱甘肽S-转移酶-标签、蛋白A、麦芽糖结合蛋白、二氢叶酸还原酶、Tag·100表位、c-myc表位、

-表位、lacZ、CMP(钙调蛋白结合肽)、HA表位、蛋白C表位和VSV表位。

“置换”指将蛋白质的氨基酸以具有相似特性(如相似疏水性、亲水性、抗原性、形成或破坏α-螺旋结构或β-折叠结构的倾向)的其它氨基酸替换。氨基酸置换一般是单个残基的，不过可以是簇集性的，这取决于置于多肽上的功能性约束条件，并且可以为1到10个氨基酸变动。氨基酸置换优选是保守性氨基酸置换。保守性置换表是本领域熟知的(见例如Creighton(1984)Proteins.W.H.Freeman and Company(编著)和下表1)。

表1：保守性氨基酸置换的实例

残基	保守性置换	残基	保守性置换
				Ala	Ser	Leu	Ile；Val
Arg	Lys	Lys	Arg；Gln
				Asn	Gln；His	Met	Leu；Ile
Asp	Glu	Phe	Met；Leu；Tyr
				Gln	Asn	Ser	Thr；Gly
Cys	Ser	Thr	Ser；Val
				Glu	Asp	Trp	Tyr
GIV	Pro	Tyr	Trp；Phe
				His	Asn；Gln	Val	Ile；Leu
Ile	Leu、Val

氨基酸置换、缺失和／或***可以使用本领域已知的肽合成技术如固相肽合成法等或通过重组DNA操作而容易地进行。用于操作DNA序列以产生蛋白质的置换、***或缺失变体的方法是本领域熟知的。例如，用于在DNA中的预定位点处产生置换突变的技术是本领域技术人员熟知的并且包括M13诱变法、T7-Gen体外诱变法(USB，Cleveland，OH)、QuickChange位点定向诱变法(Stratagene，San Diego，CA)、PCR介导的位点定向诱变或其他位点定向诱变法(见Current Protocols in Molecular Biology，JohnWiley&Sons，N.Y.(1989和年度更新))。

衍生物

“衍生物”包括这样的肽、寡肽、多肽，其中与天然存在形式的蛋白质(如目的蛋白)的氨基酸序列相比，它们包含以非天然存在的氨基酸残基对氨基酸的置换或者非天然存在的氨基酸残基的添加。蛋白质的“衍生物”也包含这样的肽、寡肽、多肽，其中与所述多肽的天然存在形式的氨基酸序列相比，它们包含天然存在的改变(糖基化、酰化、异戊二烯化、磷酸化、肉豆蔻酰化、硫酸盐化等)的氨基酸残基或非天然改变的氨基酸残基。与衍生物所来源的氨基酸序列相比，该衍生物可以也包含与所述氨基酸序列共价或非共价结合的一个或多个非氨基酸置换或添加(例如报道分子或其它配体)，如为促进检测该衍生物而结合的报道分子，和与天然存在的蛋白质的氨基酸序列相对比的非天然存在的氨基酸残基。此外，“衍生物”也包括天然存在形式蛋白质与标签肽如FLAG、HIS6或硫氧还蛋白(对于标签肽的综述，见Terpe，Appl.Microbiol.Biotechnol.60，523-533，2003)的融合物。

结构域、基序／共有序列／标签

术语“结构域”指沿进化相关蛋白质的序列比对结果而在特定位置处保守的一组氨基酸。尽管在其他位置处的氨基酸可以在同源物之间不同，然而在特定位置处高度保守的氨基酸指示在蛋白质结构、稳定性或功能方面可能是必需的氨基酸。结构域因通过在蛋白质同源物家族的比对序列中的高保守程度而被鉴定，它们可以用作鉴定物以确定任意的所讨论多肽是否属于先前已鉴定的多肽家族。

术语“基序”或“共有序列”或“标签”指在进化相关蛋白质的序列中的短保守区。基序往往是结构域的高度保守部分，不过也可以仅包括该结构域的部分，或可以位于保守结构域之外(若该基序的全部氨基酸位于定义的结构域之外)。

存在用于鉴定结构域的专业数据库，例如，SMART(Schultz等人，(1998)Proc.Natl.Acad.Sci.USA95，5857-5864；Letunic等人，(2002)Nucleic Acids Res30，242-244)、InterPro(Mulder等，(2003)Nucl.Acids.Res.31，315-318)、Prosite(Bucher和Bairoch(1994)，A generalized profilesyntax for biomolecular sequences motifs and its function in automaticsequence interpretation(用于生物分子序列基序的概括特征结构及其在自动化序列解读中的功能)(引自)ISMB-94；第二届分子生物学智能***国际会议文集(Proceedings2nd International Conference on Intelligent Systemsfor Molecular Biology).Altman R.，Brutlag D.，Karp P.，Lathrop R.，SearlsD.编著，第53-61页，AAAI出版，Menlo Park；Hulo等，Nucl.Acids.Res.32：D134-D137，(2004))或Pfam(Bateman等，Nucleic Acids Research30(1)：276-280(2002))。一组用于计算机芯片上分析蛋白质序列的工具是在ExPASY蛋白质组服务器上可获得的(瑞士生物信息研究所(Gasteiger等人，ExPASy：The proteomics server for in-depth protein knowledge andanalysis(用于深入认识和分析蛋白质的蛋白质组服务器)，Nucleic AcidsRes.31：3784-3788(2003))。也可以使用常规技术如通过序列比对鉴定结构域或基序。

用于比对序列以比较的方法是本领域熟知的，此类方法包括GAP、BESTFIT、BLAST、FASTA和TFASTA。GAP使用Needleman和Wunsch算法((1970)J Mol Biol48：443-453)以找到使匹配数最大化并使空位数最小化的两个序列的总体(即，覆盖完整序列的)比对结果。BLAST算法(Altschul等人，(1990)J Mol Biol215：403-10)计算序列同一性百分数并且开展两个序列之间相似性的统计学分析。用于开展BLAST分析的软件是通过国家生物技术信息中心(NCBI)可公开获得的。同源物可以使用例如ClustalW多重序列比对算法(版本1.83)，以默认配对比对参数和百分数评分方法轻易地鉴定。也可以使用MatGAT软件包中的可用方法之一确定相似性和同一性的总体百分数(Campanella等，BMC Bioinformatics.2003年7月10日；4：29.MatGAT：an application that generates similarity／identitymatrices using protein or DNA sequences(MatGAT：使用蛋白质序列或DNA序列产生相似性／同一性矩阵的一种应用)。如对本领域技术人员显而易见，可以进行少许手工编辑以优化保守基序之间的比对。此外，作为使用全长序列鉴定同源物的替代，也可以使用特定的结构域。使用上文提及的程序，使用默认参数，可以确定在完整核酸或氨基酸序列范围或所选结构域或保守基序范围内的序列同一性值。对于局部比对，Smith-Waterman算法是特别有用的(Smith TF，Waterman MS(1981)J.Mol.Biol147(1)；195-7)。

交互式BIAST

通常，这包括第一BLAST，其中所述的第一BLAST包括将查询序列(例如使用实施例部分的表A中列出的任意序列)针对任意序列数据库，如可公开获得的NCBI数据库进行BLAST。从核苷酸序列开始时，一般使用BLASTN或TBLASTX(使用标准默认值)，并且从蛋白质序列开始时，使用BLASTP或TBLASTN(使用标准默认值)。可以任选地筛选BLAST结果。筛选结果或非筛选结果的全长序列随后针对来自衍生查询序列的生物中的序列进行反向BLAST搜索(第二BLAST)。随后比较第一BLAST和第二BLAST的结果。如果来自第一blast的高阶位命中是来自与衍生该查询序列的物种相同的物种，则鉴定到旁系同源物，随后的反向BLAST理想地产生最高命中当中的所述查询序列；若在第一BLAST中的高阶位命中不是来自与衍生该查询序列的物种相同的物种，则鉴定到直向同源物，并且当反向BLAST时，优选产生属于最高命中的所述查询序列。

高阶位命中是具有低E-值的那些命中。E-值越低，评分越显著(或换句话说，偶然发现该命中的几率越低)。E-值的计算是本领域熟知的。除了E-值外，比较结果也由同一性百分数评定。同一性百分数指所比较的两个核酸(或多肽)序列之间在特定长度范围内的相同核苷酸(或氨基酸)的数目。在大型家族的情况下，可以使用ClustalW，随后使用邻接树法，以帮助观察相关基因的聚类并鉴定直向同源物和旁系同源物。

杂交

如本文中所定义的术语“杂交”是其中基本上同源的互补核苷酸序列相互复性的过程。杂交过程可以完全在溶液中进行，即两种互补性核酸均处于溶液中。杂交过程也可以在互补性核酸之一固定到基质如磁珠、琼脂糖凝胶(Sepharose)珠或任何其他树脂的情况下发生。杂交过程也可以在互补性核酸之一固定至固相支持体如硝酸纤维素膜或尼龙膜上或通过例如照相平版印刷术固定至例如硅酸玻璃支持物(后者称作核酸阵列或微阵列或称作核酸芯片)上的情况下进行。为使杂交发生，通常将核酸分子热变性或化学变性以使双链解链成为两条单链和／或去除来自单链核酸的发夹或其它二级结构。

术语“严格性”指杂交发生的条件。杂交的严格性受条件如温度、盐浓度、离子强度和杂交缓冲液组成的影响。通常，将低严格条件选择成在限定的离子强度和pH时，低于特定序列的热解链温度(T_m)约30℃。中等严格条件是此时温度低于T_m约20℃并且高严格条件是此时温度低于T_m约10℃。高严格杂交条件一般用于分离与靶核酸序列具有高序列相似性的杂交序列。然而，核酸可以在序列上偏离并且因遗传密码子的简并性而依旧编码基本上相同的多肽。因而，有时候可能需要中等严格杂交条件以鉴定此类核酸分子。

T_m是在确定的离子强度和pH时的温度，50％的靶序列在所述温度与完全匹配的探针杂交。T_m取决于溶液条件和探针的碱基组成及长度。例如，较长的序列在较高的温度下特异性杂交。从低于T_m约16℃直至32℃获得最大杂交速率。杂交溶液中一价阳离子的存在降低两条核酸链之间的静电排斥作用，因而促进杂交分子形成；这种作用对于高达0.4M的钠浓度是显而易见的(对于更高浓度，可以忽略这种作用)。甲酰胺降低DNA-DNA和DNA-RNA双链体的解链温度，每百分数甲酰胺降低0.6-0.7℃，并且添加50％甲酰胺允许在30-45℃进行杂交，虽然杂交速率会降低。碱基对错配降低杂交速率及双链体的热稳定性。平均而言并且对于大的探针来说，每％碱基错配Tm下降约1℃。根据杂交分子的类型，可以使用以下等式计算T_m：

1)DNA-DNA杂交分子(Meinkoth和Wahl，Anal.Biochem.，138：267-284，1984)：

T_m=81.5℃+16.6xlog₁₀[Na⁺]^a+0.41x％[G／C^b]-500x[L^c]^-1-0.61x％甲酰胺

2)DNA-RNA或RNA-RNA杂交分子：

T_m=79.8℃+18.5(1og₁₀[Na⁺]^a)+0.58(％G／C^b)+11.8(％G／C^b)²-820／L^c

3)寡DNA杂交分子或寡RNA^d杂交分子：

对于<20个核苷酸：T_m=2(l_n)

对于20-35个核苷酸：T_m=22+1.46(l_n)

^a或对于其他一价阳离子，而仅在0.01-0.4M范围内是精确的。

^b仅对于％GC在30％至75％范围内是精确的。

^cL=双链体的长度(以碱基对计)。

^dOligo，寡核苷酸；l_n，=引物的有效长度=2×(G／C数)+(A／T数)。

可以使用许多已知技术的任何一种控制非特异性结合，例如用含有蛋白质的溶液封闭薄膜、添加异源性RNA、异源性DNA和SDS至杂交缓冲液，并且用RNA酶处理。对于非同源性探针，可以通过改变以下条件之一进行一系列杂交：(i)渐进地降低复性温度(例如从68℃至42℃)或(ii)渐进地降低甲酰胺浓度(例如从50％至0％)。技术人员了解杂交期间可以加以改变和将维持或改变严格条件的多种参数。

除了杂交条件之外，杂交特异性一般还取决于杂交后洗涤的功能。为除去因非特异性杂交所致的背景，样品用稀的盐溶液洗涤。此类洗涤的关键因素包括最终洗涤溶液的离子强度和温度：盐浓度越低并且洗涤温度越高，则洗涤的严格性越高。洗涤条件一般在杂交严格性上或低于杂交严格性而进行。阳性杂交产生至少两倍于背景信号的信号。通常，用于核酸杂交分析法或基因扩增检测方法的合适严格条件如上所述。也可以选择更严格或更不严格的条件。技术人员了解洗涤期间可以加以改变和将维持或改变严格条件的多种参数。

例如，用于长度大于50个核苷酸的DNA杂交分子的常见高严格杂交条件包括在65℃于1×SSC中或在42℃于1×SSC和50％甲酰胺中杂交，随后在65℃于0.3×SSC中洗涤。用于长度大于50个核苷酸的DNA杂交分子的中等严格杂交条件的实例包括在50℃于4×SSC或在40℃于6×SSC和50％甲酰胺中杂交，随后在50℃于2×SSC中洗涤。杂交分子的长度是杂交核酸的预期长度。当序列已知的核酸杂交时，可以通过比对序列并鉴定本文中所述的保守区而确定杂交分子长度。1×SSC是0.15M NaCl和15mM柠檬酸钠；杂交溶液和洗涤溶液可以额外地包括5×Denhardt试剂、0.5-1.0％SDS、100μg／ml变性的片段化鲑精DNA、0.5％焦磷酸钠。

为了定义严格性水平的目的，可以参考Sambrook等(2001)MolecularCloning：a laboratory manual，第3版，Cold Spring Harbor Laboratory出版，CSH，New York或参考Current Protocols in Molecular Biology，John Wiley&Sons，N.Y.(1989和年度更新版)。

剪接变体

如本文中所用的术语“剪接变体”包含其中已经切除、替换、移位或添加所选内含子和／或外显子或其中内含子已经缩短或加长的核酸序列的变体。此类变体将是基本上保留蛋白质的生物学活性的一类变体；这可以通过选择性地保留蛋白质的功能片段实现。此类剪接变体可以在自然界中找到或可以人工制造。用于预测和分离此类剪接变体的方法是本领域熟知的(见例如Foissac和Schiex(2005)BMC Bioinformatics.6：25)。

等位变体

“等位基因”或“等位变体”是给定基因的替代形式，位于相同染色***置内。等位变体包括单核苷酸多态性(SNP)，以及小***／缺失多态性(INDEL)。INDEL的尺寸通常小于100bp。SNP和INDEL形成在大部分生物的天然存在的多态性株系中的序列变体的最大集合。

内源基因

本文中对“内源”基因的称谓不仅指如植物中以其天然形式(即不存在任何人类干预情况下)存在的所讨论基因，还指处于分离形式的随后被(再)导入植物(转基因)的相同基因(或基本上同源的核酸／基因)。例如，含有这种转基因的转基因植物可以遇到转基因表达的明显降低和／或内源基因表达的明显降低。分离的基因可以从生物分离，或可以是人造的，例如通过化学合成法。

基因改组／定向进化

“基因改组”或“定向进化”由以下组成：反复DNA改组，随后适当筛选和／或选择产生编码具有改良生物学活性的蛋白质的核酸或其部分的变体而组成(Castle等人，(2004)Science304(5674)：1151-4；美国专利5,811,238和6,395,547)。

构建体

人工DNA(如但不限于质粒或病毒DNA)能够在宿主细胞中复制并且用于将目的DNA序列导入宿主细胞或宿主生物中。本发明的宿主细胞可以是选自细菌细胞(如大肠杆菌或农杆菌属物种细胞)、酵母细胞、真菌、藻类或蓝细菌(Cyanobacteria)细胞或植物细胞的任何细胞。技术人员非常清楚必须在所述基因构建体上存在以便成功转化、选择和增殖含有目的序列的宿主细胞的遗传元件。目的序列与如本文所述的一个或多个控制序列(至少与启动子)有效地连接。额外的调节元件可以包括转录增强子以及翻译增强子。本领域技术人员将知道可能适用于实施本发明的终止子和增强子序列。如定义部分中描述，内含子序列也可以添加至5′非翻译区(UTR)或编码序列中，以增加胞质溶胶中积累的成熟信息的量。其他控制序列(除启动子、增强子、沉默子、内含子序列、3′UTR和／或5′UTR区域之外)可以是蛋白质和／或RNA稳定化元件。此类序列将是已知的或可以由本领域技术人员容易地获得。

本发明的基因构建体可以还包括用于特定细胞类型中维持和／或复制所需要的复制起点序列。一个实例是基因构建体需要作为游离型遗传元件(例如质粒或粘粒分子)在细菌细胞中维持的情况。优选的复制起点包括但不限于f1-ori和colE1。

为检测如本发明方法中所用核酸序列的成功转移和／或选择包含这些核酸的转基因植物，使用标记基因(或报道基因)是有利的。因此，所述基因构建体可以任选地包含一种选择标记基因。在本文的“定义”部分中更详细地描述选择标记。一旦不再需要所述标记基因时，可以从转基因细胞中移除或切除它们。用于标记移除的技术是本领域已知的，有用的技术在上文定义部分中描述。

调节元件／控制序列／启动子

术语“调节元件”、“控制序列”和“启动子”均在本文中可相互交换地使用并且在广泛含义上意指能够实现与之连接的序列表达的调节性核酸序列。术语“启动子”一般指位于基因转录起点上游并参与识别和结合RNA聚合酶及其他蛋白质，因而指导有效连接的核酸转录的核酸控制序列。前述术语包括从典型的真核基因组基因(包括对于精确转录启动所需的TATA框，具有或没有CCAAT框序列)衍生的转录调节序列和应答发育性刺激和／或外部刺激或以组织特异性方式而改变基因表达的额外调节元件(即上游激活序列、增强子和沉默子)。本术语中还包括典型的原核基因的转录调节序列，在此情况下它可以包括-35框序列和／或-10框转录调节序列。术语“调节元件”也包含赋予、激活或增强核酸分子在细胞、组织或器官中表达的合成融合分子或衍生物。

“植物启动子”包含介导编码序列区段在植物细胞中表达的调节元件。因此，植物启动子不需要是植物来源的，而是可以源自病毒或微生物，例如来自侵袭植物细胞的病毒。“植物启动子”也可以源自植物细胞，例如来自用待于本发明方法中表达并且在本文中描述的核酸序列所转化的植物。这也适用于其他“植物”调节性信号，如“植物”终止子。用于本发明方法中的核苷酸序列上游的启动子可以通过一个或多个核苷酸取代、***和／或缺失进行修饰，但不干扰启动子、可读框(ORF)或3′调节区如终止子或远离ORF存在的其它3′调节区的功能性或活性。还有可能的是，所述启动子的活性因修饰其序列或它们被更活跃的启动子、甚至来自异源生物的启动子彻底替换而增加。为在植物中表达，如上所述，核酸分子必须有效连接至或包含合适的启动子，其中所述的启动子在正确时间点上并以所需要的空间表达模式表达基因。

为鉴定功能性等效启动子，候选启动子的启动子强度和／或表达模式可以通过将该启动子与报道基因有效连接并分析该报道基因在植物多种组织的表达水平和模式而进行分析。合适的熟知报道基因包括例如β-葡糖醛酸糖苷酶或β-半乳糖苷酶。启动子活性通过测量β-葡糖醛酸糖苷酶或β-半乳糖苷酶的酶活性进行分析。启动子强度和／或表达模式可以随后与参考启动子(如在本发明方法中使用的一种启动子)的启动子强度和／或表达模式比较。备选地，启动子强度可以使用本领域已知方法如RNA印迹法及放射自显影图的密度计分析法、定量实时PCR或RT-PCR(Heid等人，1996Genome Methods6：986-994)，通过量化mRNA水平或通过将本发明方法中所用核酸的mRNA水平与持家基因(如18S rRNA)的mRNA水平比较进行分析。通常，“弱启动子”意指驱动编码序列以低水平表达的启动子。“低水平”意指在每个细胞约1／10,000转录物至约1／100,000转录物、至约1／500,0000转录物的水平。相反，“强启动子”驱动编码序列在高水平，或在每个细胞约1／10转录物至约1／100转录物、至约1／1000转录物上表达。通常，“中等强度启动子”意指以下的启动子，其驱动编码序列以低于强启动子的水平、尤其在全部情况以低于受35S CaMV启动子控制时所获得水平的水平上表达。

有效地连接

如本文中所用的术语“有效地连接”指启动子序列与目的基因之间功能性地连接，以至于启动子序列能够启动目的基因转录。

组成型启动子

“组成型启动子”指在生长和发育的大部分、但不必全部阶段期间和在大部分环境条件下在至少一个细胞、组织或器官内有转录活性的启动子。下表2a给出组成型启动子的实例。

表2a：组成型启动子的实例

遍在启动子

“遍在启动子”在生物的基本上全部组织或细胞中有活性。

发育调节性启动子

“发育调节性启动子”在某些发育阶段期间或在经历发育变化的植物的部分中有活性。

诱导型启动子

诱导型启动子在应答化学刺激(综述见Gatz1997，Annu.Rev.PlantPhysiol.Plant Mol.Biol.，48：89-108)、环境刺激或物理刺激时具有受诱导或增加的转录启动作用，或可以是“胁迫可诱导的”，即当植物暴露于多种胁迫条件时被激活，或是“病原体可诱导的”，即当植物暴露于多种病原体时被激活。

器官特异性／组织特异性启动子

器官特异性或组织特异性启动子是能够优先在某些器官或组织如叶、根、种子组织等内启动转录的启动子。例如，“根特异性启动子”是在植物根中优势地具有转录活性的启动子，在植物的任何其它部分内基本上无活性，尽管在植物的这些其它部分内允许任何泄露表达。能够仅在某些细胞中启动转录的启动子在本文中称作“细胞特异的”。

下表2b中列出根特异性启动子的实例。

表2b：根特异性启动子的实例

“种子特异性启动子”主要在种子组织中有转录活性，但不必排他性地在种子组织中有转录活性(在泄露表达的情况下)。种子特异性启动子可以在种子发育期间和／或萌发期间有活性。种子特异性启动子可以是胚乳／糊粉／胚特异性的。下表2c至2f中显示种子特异性启动子(胚乳／糊粉／胚特异性)的实例。种子特异性启动子的其他实例在Qing Qu和Takaiwa(PlantBiotechnol.J.2，113-125，2004)中给出，所述文献的公开内容通过引用方式如完整给出那样并入本文。

表2c：种子特异性启动子的实例

表2d：胚乳特异性启动子的实例

表2e：胚特异性启动子的实例

基因来源	参考文献
		稻OSH1	Sato等人，Proc.Natl.Acad.Sci.USA，93：8117-8122，1996
KNOX	Postma-Haarsma等人，Plant Mol. Biol.39：257-71，1999
		PRO0151	WO2004／070039
PRO0175	WO2004／070039
		PRO005	WO2004／070039
PRO0095	WO2004／070039

表2f：糊粉特异性启动子的实例

如本文中所定义的绿色组织特异性启动子是在绿色组织中优势地具有转录活性的启动子，在植物的任何其它部分内基本上无活性，尽管在该植物的这些其他部分内仍允许任何泄露表达。

下表2g中显示可以用来实施本发明方法的绿色组织特异性启动子的实例。

表2g：绿色组织特异性启动子的实例

组织特异性启动子的另一个实例是分生组织特异性启动子，其在分生组织中优势地具有转录活性，在植物的任何其它部分内基本上无活性，尽管在该植物的这些其他部分中仍允许任意泄露表达。下表2h中显示可以用来实施本发明方法的绿色分生组织特异性启动子的实例。

表2h：分生组织特异性启动子的实例

终止子

术语“终止子”包括这样的控制序列，其是在转录单位末端的DNA序列，发出对初级转录物进行3′加工和多聚腺苷化以及终止转录的信号。终止子可以从天然基因、从多种其他植物基因或从T-DNA衍生。待添加的终止子可以源自例如胭脂碱合酶基因或章鱼碱合酶基因或备选地来自另一种植物基因或较不优选来自任何其他真核基因。

选择标记(基因)/报道基因

“选择标记”、“选择标记基因”或“报道基因”包括向细胞赋予表型的任何基因，其中在所述的细胞内表达所述基因以促进鉴定和／或选择用本发明的核酸构建体所转染或转化的细胞。这些标记基因能够通过一系列不同原理而鉴定核酸分子的成功转移。合适的标记可以选自赋予抗生素耐药性或除草剂抗性、导入新代谢性状或允许目视选择的标记。选择标记基因的实例包括赋予抗生素耐药性的基因(如使新霉素和卡那霉素磷酸化的nptII或使潮霉素磷酸化的hpt或赋予针对例如博来霉素、链霉素、四环素、氯霉素、氨苄青霉素、庆大霉素、遗传霉素(Geneticin)(G418)、壮观霉素或杀稻瘟素的抗性的基因)、赋予除草剂抗性的基因(例如提供

抗性的bar；提供草甘膦抗性的aroA或gox或赋予针对例如咪唑啉酮、膦丝菌素或磺脲类的抗性的基因)或提供代谢性状的基因(如允许植物使用甘露糖作为唯一碳源的manA，或利用木糖的木糖异构酶，或抗营养性标记如2-脱氧葡萄糖抗性)。目视标记基因的表达导致形成颜色(例如β-葡糖醛酸糖苷酶、GUS或β-半乳糖苷酶与其有色底物例如X-Gal)、发光(如萤光素／萤光素酶***)或荧光(绿色荧光蛋白GFP及其衍生物)。这个名单仅代表少数的可能标记。技术人员熟悉此类标记。取决于生物和选择方法，优选不同的标记。

已知当核酸稳定或瞬时地整合至植物细胞时，仅小部分的细胞摄取外来DNA，并且根据需要，将其整合至细胞的基因组中，这取决于所用的表达载体和使用的转染技术。为了鉴定并选择这些整合体，通常将编码选择标记(如上文所述之一)的基因连同目的基因一起导入宿主细胞。这些标记可以在其中这些基因因例如常规方法所致的缺失而无功能的突变体中使用。此外，编码选择标记的核酸分子可以导入宿主细胞中，与在包含编码本发明多肽或本发明方法中所用多肽的序列在同一载体上，或在单独的载体上。已经用导入的核酸稳定转染的细胞可以例如通过选择作用进行鉴定(例如具有整合的选择标记的细胞存活而其他细胞死亡)。

因为一旦已经成功导入了核酸，则转基因宿主细胞中不再需要或不希望有标记基因，尤其抗生素耐药性基因和除草剂抗性基因，因此用于导入核酸的本发明方法有利地使用能够去掉或切除这些标记基因的技术。一种这样的方法称作共转化法。共转化法使用同时用于转化的两种载体，一种载体携带本发明的核酸而第二种载体携带标记基因。高比例的转化体接受，或在植物的情况下，包含(高达40％或更多的转化体)这两种载体。在用农杆菌(Agrobacterium)转化的情况下，转化体通常仅接受载体的一部分，即侧翼有T-DNA的序列，它通常代表表达盒。标记基因随后可以通过进行杂交而从转化的植物中除去。在另一种方法中，整合至转座子的标记基因用来与想要的核酸一起进行转化(称作Ac／Ds技术)。转化体可以与转座酶来源植物杂交，或转化体用引起转座酶表达的核酸构建体瞬时或稳定转化。在一些情况下(大约10％)，转座子在已经成功发生转化时跳出宿主细胞的基因组并丢失。在其他更多情况下，转座子跳至不同的位置。在这些情况下，标记基因必须通过进行杂交而消除。在微生物学中，开发了实现或促进检测这类事件的技术。又一个有利的方法依赖于所谓重组***；此方法的优势在于不必通过杂交消除。该类型的最知名***称作Cre／lox***。Cre1是去除位于loxP序列之间序列的重组酶。如果标记基因整合于loxP序列之间，则一旦转化已经成功发生，通过重组酶的表达去除标记基因。其他重组***是HIN／HIX、FLP／FRT和REP／STB***(Tribble等，J.Biol.Chem.，275，2000：22255-22267；Velmurugan等，J.CellBiol.，149，2000：553-566)。有可能将本发明的核酸序列以位点特异性方式整合至植物基因组中。自然，这些方法也可以适用于微生物如酵母、真菌或细菌。

转基因的／转基因／重组

为本发明目的，“转基因的”、“转基因”或“重组”就核酸序列而言意指包含该核酸序列的表达盒、基因构建体或载体或用本发明核酸序列、表达盒或载体转化的生物，全部这些构建体均通过重组方法产生，其中

(a)编码在本发明方法中有用的蛋白质的核酸序列，或

(b)与本发明核酸序列有效连接的基因控制序列，例如启动子，或

(c)a)和b)

不处于其天然遗传环境中或已经通过重组方法被修饰，修饰有可能采取例如取代、添加、倒位或***一个或多个核苷酸残基的形式。天然遗传环境理解为意指来源植物中的天然基因组基因座或染色体基因座或在基因组文库中存在。在基因组文库的情况下，优选保留、至少部分地保留该核酸序列的天然遗传环境。该环境分布在该核酸序列的至少一侧并且具有至少50bp，优选至少500bp、特别优选至少1000bp，最优选至少5000bp的序列长度。天然存在的表达盒-例如核酸序列的天然启动子与编码本发明方法中有用的多肽的对应核酸序列的天然存在组合，如上文所定义-在这种表达盒通过非天然的合成(“人工”)方法(如诱变处理)被修饰时，变成转基因表达盒。合适的方法例如在US5,565,350或WO00／15815中描述。

为本发明目的，如上所述，将转基因植物因而理解为意指在本发明方法中使用的核酸不处在所述植物基因组中它们的天然基因座内，所述核酸有可能同源或异源地表达。然而如所提及，转基因还意指尽管本发明核酸或在本发明方法中所用核酸处于植物基因组中该核酸的天然位置内，然而其序列相对于天然序列而言已经受到修饰，和／或所述天然序列的调节序列已经受到修饰。转基因优选理解为意指本发明核酸在基因组中的非天然基因座内表达，即发生核酸的同源表达或优选异源表达。在本文中提到了优选的转基因植物。

应当进一步指出，在本发明的上下文中，术语“分离的核酸”或“分离的多肽”在一些情况下可以分别视为同义于“重组核酸”或“重组多肽”，并且指不位于其天然遗传环境和／或已经通过重组方法修饰过的核酸或多肽。

调节

相对于表达或基因表达，术语“调节”意指这样的过程，在所述过程中与对照植物相比，表达水平因所述的基因表达而改变，该表达水平可以增加或减少。原初的、未调节的表达可以是任何类型的结构性RNA(rRNA、tRNA)或mRNA表达，伴随后续翻译。为了本发明的目的，原初、未调节的表达也可以是不存在任何表达。术语“调节活性”应当意指本发明核酸序列或所编码蛋白质的表达的任何变化，其导致增加的植物产量和／或增加的植物生长。表达可以从零(不存在表达或不可测量的表达)增加至某个量，或可以从某个量下降至不可测量的微小量或零。

表达

术语“表达”或“基因表达”意指一个特定基因或多个特定基因或特定基因构建体的转录。术语“表达”或“基因表达”尤其意指某个基因或多个基因或基因构建体转录成结构性RNA(rRNA、tRNA)或mRNA，所述mRNA随后翻译成或不翻译成蛋白质。该过程包括DNA的转录和所得mRNA产物的加工。

增加的表达／过量表达

如本文中所用的术语“增加的表达”或“过量表达”意指相对于原有野生型表达水平是额外的任何形式表达。为了本发明的目的，原始野生型表达水平也可以是零，即不存在表达或不可测量的表达。

用于增加基因或基因产物的表达的方法是本领域内充分记录的，并且包括例如由适宜启动子驱动的过量表达、使用转录增强子或翻译增强子。可以在非异源形式的多核苷酸的适宜位置(一般是上游)内导入作为启动子或增强子元件的分离核酸，以便上调编码目的多肽的核酸的表达。例如，内源性启动子可以通过突变、缺失和／或置换而在体内改变(见Kmiec，US5,565,350；Zarling等，WO9322443)，或可以将分离的启动子以相对于本发明基因的正确方向及距离导入植物细胞，以便控制基因表达。

如果需要多肽表达，则通常希望在多核苷酸编码区的3′末端包括多聚腺苷酸化区。多聚腺苷化区可以源自天然基因、来自多种其他植物基因或来自T-DNA。待添加的3′末端序列可以源自例如胭脂碱合酶基因或章鱼碱合酶基因或备选地来自另一种植物基因或较不优选来自任何其他真核基因。

内含子序列也可以添加至5′非翻译区(UTR)或部分编码性序列的编码序列上，以增加在胞浆内积累的成熟信息的量。已经证实可剪接内含子在植物表达构建体和动物表达构建体中转录单位内的包含在mRNA水平及蛋白质水平上增加基因表达至多达1000倍(Buchman和Berg(1988)Mol.Cell biol.8：4395-4405；Callis等(1987)Gens Dev1：1183-1200)。此类内含子增强基因表达的作用一般在所述内含子置于转录单位的5′末端附近时最强烈。玉米内含子Adh1-S内含子1、2和6、Bronze-1内含子的用途是本领域已知的。对于一般信息，见：《玉米手册》，第116章，编者Freeling和Walbot，Springer，N.Y.(1994)。

减少的表达

本文中对“减少的表达”或“降低或基本消除”表达的称谓意指内源基因表达和／或多肽水平和／或多肽活性相对于对照植物的减少。与对照植物相比，所述降低或基本上消除以增加的优选顺序是至少10％、20％、30％、40％或50％、60％、70％、80％、85％、90％或95％、96％、97％、98％、99％或更多降低。

为了降低或基本消除内源基因在植物中的表达，需要核酸序列的足够长度的基本上连续性核苷酸。为了开展基因沉默，这个长度可以是少至20、19、18、17、16、15、14、13、12、11、10个或更少核苷酸，或者这个长度可以多至整个基因(包括部分或全部的5′和／或3′UTR)。基本上连续的核苷酸片段可以来自编码目的蛋白的核酸(靶基因)或来自能够编码目的蛋白的直向同源物、旁系同源物或同源物的任何核酸。优选地，基本上连续的核苷酸的片段能够与靶基因(有义链或反义链)形成氢键，更优选地，基本上连续的核苷酸片段以增加的优选顺序与靶基因(有义链或反义链)具有50％、60％、70％、80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％、99％、100％的序列同一性。编码(功能性)多肽的核酸序列不是本文中所讨论的用于降低或基本消除内源基因表达的多种方法所需的。

表达的这种降低或基本消除可以使用常规工具和技术完成。用于降低或基本消除除内源基因表达的优选方法是在植物中导入并表达这样的基因构建体，其中核酸(在此情况下是来自目的基因或任何核酸的一段基本上连续的核苷酸序列，其中所述的任何核酸能够编码任何一种目的蛋白的直向同源物、旁系同源物或同源物)克隆至所述的基因构建体内作为由间隔区(非编码性DNA)隔开的(部分或完全的)反向重复序列。

在这种优选的方法中，使用核酸或其部分(在此情况下是从目的基因或从任何核酸中衍生的一段基本上连续的核苷酸序列，其中所述的任何核酸能够编码目的蛋白的直向同源物、旁系同源物或同源物)的反向重复序列(优选能够形成发夹结构)，通过RNA介导的沉默作用而降低或基本上消除内源基因的表达。将所述反向重复序列克隆于包含控制序列的表达载体中。非编码性DNA核酸序列(间隔序列，例如基质附着区片段(MAR)、内含子、多接头等)位于形成反向重复序列的两个反向核酸之间。在反向重复序列转录后，形成具有(部分或完全)自身互补结构的嵌合RNA。这种双链RNA结构称作发夹RNA(hpRNA)。hpRNA由植物加工为siRNA，其被掺入RNA诱导性沉默复合物(RISC)中。RISC进一步切开mRNA转录物，从而大幅度降低待翻译成多肽的mRNA转录物的数目。对于其他一般细节，见例如Grierson等人(1998)WO98／53083；Waterhouse等人(1999)WO99/53050。

本发明方法的实施不依赖在植物中导入并表达其中克隆入所述核酸作为反向重复序列的基因构建体，而是几种公知“基因沉默”方法的任何一种或多种方法可以用来实现相同的效果。

这样一种用于降低内源基因表达的方法是RNA介导的基因表达沉默(下调)。在这种情况下，沉默作用由基本上与内源性靶基因相似的双链RNA序列(dsRNA)在植物中触发。这种dsRNA被植物进一步加工成约20至约26个核苷酸，称作短干扰性RNA(siRNA)。siRNA被掺入RNA诱导性沉默复合物(RISC)内，其中所述RISC切割内源性靶基因的mRNA转录物，因而基本上降低待翻译成多肽的mRNA转录物的数目。优选地，双链RNA序列对应于靶基因。

RNA沉默方法的另一个实例包括将核酸序列或其部分(在此情况下是从目的基因或从任何核酸中衍生的一段基本上连续的核苷酸，其中所述的任何核酸能够编码目的蛋白的直向同源物、旁系同源物或同源物)以有义方向导入植物内。“有义方向”指与其mRNA转录物同源的DNA序列。因而将向植物中导入该核酸序列的至少一个拷贝。这种额外的核酸序列会降低内源基因的表达，产生称作共抑制作用的现象。将一个核酸序列的几个额外拷贝导入植物时，基因表达的减少将更明显，因为在高转录物水平与共抑制作用的触发之间存在正相关。

RNA沉默方法的另一个实例包括使用反义核酸序列。“反义”核酸序列包含与编码蛋白质的“有义”核酸序列互补，即与双链eDNA分子的编码链互补，或与mRNA转录物序列互补的核苷酸序列。反义核酸序列优选互补于待沉默的内源基因。这种互补性可以位于基因的“编码区”和／或“非编码区，，内。术语“编码区”指包含被翻译成氨基酸残基的密码子的核苷酸序列区。术语“非编码区”指分布在编码区侧翼的被转录但不翻译成氨基酸的5′和3′序列(也称作5′和3′非翻译区)。

反义核酸序列可以根据Watson和Crick碱基配对规则设计。反义核酸序列可以与完整核酸序列互补(在此情况下，来自目的基因或来自能够编码目的蛋白的直向同源物、旁系同源物或同源物的任何核酸中的一段基本上连续的核苷酸)，不过也可以仅与所述核酸序列的一部分(包括mRNA5′和3′UTR)反义的寡核苷酸。例如，反义寡核苷酸序列可以与编码多肽的mRNA转录物的翻译起点周围的区域互补。合适反义寡核苷酸序列的长度是本领域已知的并且可以从约50、45、40、35、30、25、20、15或10个核苷酸或更小的核苷酸长度开始。本发明的反义核酸序列可以利用本领域已知的方法，使用化学合成反应和酶连接反应额构建。例如，反义核酸序列(例如反义寡核苷酸序列)可以使用天然存在的核苷酸或多种修饰的核苷酸化学地合成，其中所述修饰的核苷酸被设计旨在增加分子的生物学稳定性或增加反义核酸序列与有义核酸序列之间所形成双链体的物理稳定性，例如，可以使用硫代磷酸酯衍生物和吖啶取代的核苷酸。可以用来产生反义核酸序列的修饰核苷酸的实例是本领域熟知的。已知的核苷酸修饰包括甲基化、环化和‘加帽’及用类似物(如肌苷)取代一个或多个天然存在的核苷酸。其他的核苷酸修饰是本领域熟知的。

这种反义核酸序列可以使用其中核酸序列已经以反义方向加以亚克隆(即从***的核酸中转录的RNA将与目的靶核酸呈反义方向)的表达载体以生物学方式产生。优选地，反义核酸序列在植物中的产生借助稳定整合的核酸构建体进行，其中所述的核酸构建体包含启动子、有效连接的反义寡核苷酸和终止子。

用于本发明方法中沉默作用的核酸分子(无论向植物中导入或在原位(in situ)产生)与编码多肽的mRNA转录物和／或基因组DNA杂交或结合，以便例如通过抑制转录和／或翻译而抑制蛋白质表达。杂交可以通过形成稳定双链体的常规核苷酸互补性所致，或在结合于DNA双链体的反义核酸序列的情况下，因双螺旋大沟内特异性相互作用所致。反义核酸序列可以通过转化或在特定组织部位直接注射而导入植物。备选地，反义核酸序列可以为了靶向所选择的细胞而受到修饰并且随后***性施用。例如，对于全身性施用，反义核酸序列可以被修饰以便它们特异结合表达在所选择的细胞表面上的受体或抗原，例如通过连接反义核酸序列至与细胞表面受体或抗原结合的肽或抗体。反义核酸序列也可以使用本文中所述的载体递送至细胞内。

根据又一个方面，反义核酸序列是α-异头核酸序列。α-异头核酸序列与互补性RNA形成特定双链杂交分子，其中与惯常b-单元相反，所述链相互平行(Gaultier等人(1987)Nucl Ac Res15：6625-6641)。反义核酸序列也可以包含2′-O-甲基核糖核苷酸(Inoue等人(1987)Nucl Ac Res15，6131-6148)或嵌合RNA-DNA类似物(Inoue等人(1987)FEBS Lett.215，327-330)。

内源基因表达的降低或基本上消除也可以使用核酶进行。核酶是具有核糖核酸酶活性的催化性RNA分子，能够切割与其具有互补区域的单链核酸序列，如mRNA。因此，核酶(例如锤头核酶(在Haselhoff和Gerlach(1988)Nature334，585-591中描述)可以用来催化性切割编码多肽的mRNA转录物，因而大幅度减少待翻译成多肽的mRNA转录物的数目。可以设计对核酸序列具有特异性的核酶(见例如：Cech等人，美国专利号4,987,071；和Cech等人，美国专利号5,116,742)。备选地，与核酸序列相对应的mRNA转录物可以用来从RNA分子的汇集物中选出具有特定核糖核酸酶活性的催化性RNA(Bartel和Szostak(1993)Science261，1411-1418)。核酶用于植物中基因沉默的用途是本领域已知的(例如Atkins等人(1994)WO94／00012；Lenne等人(1995)WO95／03404；Lutziger等人(2000)WO00／00619；Prinsen等人(1997)WO97／13865和Scott等人(1997)WO97／38116)。

基因沉默也可以通过***诱变(例如T-DNA***或转座子***)或通过如Angell和Baulcombe((1999)Plant J.20(3)：357-62)、(Amplicon VIGSWO98／36083)或Baulcombe(WO99／15682)及其他人描述的策略实现。

如果内源基因中存在突变和／或在随后导入植物的分离的基因／核酸中存在突变，则基因沉默也可以发生。降低或基本上消除可以由无功能的多肽引起。例如，该多肽可以与多种相互作用性蛋白质结合；一个或多个突变和／或截短作用因而可以提供仍能够结合相互作用性蛋白质(如受体蛋白质)但不能表现其正常功能的多肽(如起信号作用的配体)。

基因沉默的又一种方法是靶定与基因调节区(例如启动子和／或增强子)互补的核酸序列以形成阻止基因在靶细胞中转录的三螺旋结构。见Helene，C.，Anticancer Drug Res.6，569-84，1991；Helene等人，Ann.N.Y.Acad.Sci.660，27-36 1992；和Maher，L.J.，Bioassays14，807-15，1992。

技术人员将熟知其它方法，如使用针对内源性多肽的抗体以抑制此多肽在植物中的功能，或干扰所述多肽参与的信号途径。特别地，可以构思的是人造分子可以用于抑制靶多肽的生物学功能，或用于干扰靶多肽参与的信号途径。

备选地，可以建立筛选程序以鉴定在植物群体中基因的天然变体，其中所述的变体编码具有降低活性的多肽。此类天然变体也可以用于例如进行同源重组。

人工和／或天然的微RNA(miRNA)可以用来敲除基因表达和／或mRNA翻译。内源性miRNA是通常19-24个核苷酸长度的单链小RNA。它们的主要功能是调节基因表达和／或mRNA翻译。大多数的植物微RNA(miRNA)与其靶序列具有完全的或接近完全的互补性。然而，存在具有多达5个错配的天然靶。它们由切酶家族的双链特异性RNA酶从具有特征性折回结构的较长的非编码性RNA中加工而来。在加工时，它们通过与RNA诱导性沉默复合物(RISC)的主要成分Argonaute蛋白质结合而掺入该复合体。MiRNA充当RISC的特异性成分，因此它们与细胞质中的靶核酸(大多是mRNA)碱基配对。后续的调节事件包括靶mRNA切割和破坏和／或翻译抑制。miRNA过量表达的作用因此往往在靶基因降低的mRNA水平上反映出来。

通常21个核苷酸长度的人工微RNA(amiRNA)可以经基因工程化以特异性地负调节单个或多个目的基因的基因表达。植物微RNA靶的选择的决定因素是本领域熟知的。用于靶识别的经验参数已经确定并可以用来辅助设计特定的amiRNA(Schwab等人，Dev.Cell8，517-527，2005)。用于设计并产生amiRNA及其前体的便利工具也是公众可获得的(Schwab等人，Plant Cell.18：1121-1133，2006)。

为了最佳性能，用于降低植物中内源基因表达的基因沉默技术需要使用来自单子叶植物的核酸序列转化单子叶植物，和使用来自双子叶植物的核酸序列转化双子叶植物。优选地，将来自任何给定植物物种的核酸序列导入相同的物种内。例如，将来自稻的核酸序列转化至稻植物内。然而，并非绝对要求待导入的核酸序列起源于与该核酸序列将要导入的植物相同的植物物种。只要内源性靶基因与待导入的核酸之间存在相当大的同源性就足够了。

上文描述了用于降低或基本消除内源基因在植物中表达的多种方法的实例。本领域技术人员会容易地能够调整前述用于沉默的方法以至于例如通过利用合适启动子而实现降低内源基因在整株植物或在其部分中的表达。

转化

如本文中所提及的术语“导入”或“转化”包括外源性多核苷酸转移至宿主细胞内，无论用于转化的方法是什么。能够后续克隆性增殖(无论通过器官发生或胚发生)的植物组织可以用本发明的基因构建体转化并且可以从中再生完整植物。所选的具体组织根据可用于并且最好适于正在进行转化的具体物种的克隆性增殖***而变化。示例性靶组织包括叶盘、花粉、胚、子叶、下胚轴、大配子体、愈伤组织、现存的分生组织(例如顶端分生组织、腋芽和根分生组织)和诱导的分生组织(例如子叶分生组织和下胚轴分生组织)。多核苷酸可以瞬时或稳定地导入宿主细胞并且可以非整合地维持，例如作为质粒。备选地，多核苷酸可以整合至宿主基因组内。产生的转化植物细胞随后可以用来以本领域技术人员已知的方式再生出转化的植物。备选地，可以选择不能再生成植株的植物细胞作为宿主细胞，即所产生的转化的植物细胞不具有再生成(完整)植株的能力。

外来基因转移至植物基因组内称作转化。植物物种的转化现在是相当常规的技术。有利地，几种转化方法中的任一方法可以用来将目的基因导入合适的祖先细胞。用于从植物组织或植物细胞中转化并再生出植物所述的方法可以用于瞬时转化或用于稳定转化。转化方法包括使用脂质体、电穿孔法、增加游离DNA摄入的化学品、DNA直接注射至植物、粒子枪轰击法、使用病毒或花粉的转化法和显微投射法(microprojection)。转化方法可以选自用于原生质体的钙／聚乙二醇法(Krens，F.A.等人，(1982)Nature296，72-74；Negrutiu I等人(1987)Plant Mol Biol8：363-373)；原生质体的电穿孔法(Shillito R.D.等人(1985)Bio／Technol3，1099-1102)；对植物材料的微量注射法(Crossway A等人，(1986)Mol.Gen Genet202：179-185)；DNA或RNA涂布的粒子轰击法(Klein TM等人，(1987)Nature327：70)、(非整合性)病毒感染等。转基因植物，包括转基因作物植物，优选通过农杆菌介导的转化法产生。有利的转化方法是在植物中的转化法。为此目的，例如有可能将农杆菌作用于植物种子或有可能用农杆菌接种植物分生组织。根据本发明，已经证明将转化的农杆菌悬液作用于完整植物或至少作用于花原基是特别有利的。随后继续培育该植物直至获得所处理植物的种子(Clough和Bent，Plant J.(1998)16，35-743)。用于农杆菌介导的稻转化的方法包括用于稻转化的熟知方法，如以下任一文献中描述的那些方法：欧洲专利申请EP1198985A1、Aldemita和Hodges(Planta199：612-617，1996)；Chan等人(Plant Mol Biol22(3)：491-506，1993)、Hiei等人(Plant J6(2)：271-282，1994)，所述文献的公开内容通过引用的方式如同充分描述那样并入本文。在玉米转化的情况下，优选的方法如Ishida等人(Nat.Biotechnol14(6)：745-50，1996)或Frame等人(Plant Physiol129(1)：13-22，2002)描述，其公开内容通过引用的方式如同充分描述那样并入本文。所述方法例如还在B.Jenes等人，Techniques for Gene，引自：TransgenicPlants，第1卷，Engineering and Utilization，编者S.D.Kung和R.Wu，Academic出版(1993)128-143和Potrykus Annu.Rev.Plant Physiol.Plant Molec.Biol.42(1991)205-225)中描述。待表达的核酸或构建体优选克隆至适于转化根癌农杆菌的载体，例如pBin19(Bevan等人，Nucl.Acids Res.12(1984)8711)。由这种载体转化的农杆菌随后可以按照已知方式用于转化植物，例如作为模型使用的植物，如拟南芥属植物(拟南芥属于本发明的范围，不视为作物植物)，或作物植物，例如烟草植物，通过在农杆菌溶液中浸泡擦伤的叶或切碎的叶并随后将它们在合适培养基中培育。植物借助根癌农杆菌的转化例如由和Willmitzer在Nucl.Acid Res.(1988)16，9877中描述，或尤其从F.F.White，用于高等植物中基因转移的载体(Vectors for Gene Transfer in Higher Plants)；引自Transgenic Plants，第1卷，Engineering and Utilization，S.D.Kung和R.Wu编著，Academic出版，1993，第15-38页中获知。

除了转化随后不得不被再生成完整植物的体细胞之外，也可以转化植物分生组织的细胞，并且尤其那些发育成配子的细胞。在这种情况下，转化的配子遵循天然的植物发育过程，产生转基因植物。因此，例如，将拟南芥种子用农杆菌处理并且从发育植物中获得种子，其中一定比例的所述植物受到转化并且因此是转基因的[Feldman，KA和Marks MD(1987)MolGen Genet208：1-9；Feldmann K(1992)，引自：编者C Koncz，N-H Chua和J Shell，Methods in Arabidopsis Research.Word Scientific，Singapore，第274-289页]。替代性方法基于反复去掉花序并使莲座叶丛中心中的切除部位与转化的农杆菌温育，因而转化的种子同样可以在较晚的时间点获得(Chang(1994)Plant J.5：551-558；Katavic(1994)Mol Gen Genet，245：363-370)。然而，尤其有效的方法是改良的真空渗入法，如“花浸染”法。在真空浸润拟南芥属植物的情况下，将完整的植株在减压下用农杆菌悬液处理[Bechthold，N(1993).C R Acad Sci Paris Life Sci，316：1194-1199]，而在“花浸染法”的情况下，将正在发育的花组织与表面活性剂处理的农杆菌混悬液短暂孵育[Clough，SJ和Bent，AF(1998)The Plant J.16，735-743]。在两种情况下均收获一定比例的转基因种子，并且这些种子可以通过在如上所述的选择条件下培育而与非转基因种子区分。此外，质体的稳定转化是有利的，因为质体在大部分作物中以母系方式遗传，这降低或消除了转基因经花粉流动的风险。叶绿体基因组的转化一般通过已经在Klaus等人，2004[Nature Biotechnology22(2)，225-229]中示意性展示的方法实现。简而言之，将待转化的序列连同选择标记基因一起克隆至与叶绿体基因组同源的侧翼序列之间。这些同源性侧翼序列指导位点特异性整合至原质体系内。已经对许多不同的植物物种描述了质体转化法，并且综述出自Bock(2001)Transgenic plastids in basic research and plantbiotechnology(基础研究和植物生物技术中的转基因质体).J Mol Biol.2001年月21日；312(3)：425-38或Maliga，P(2003)Progress towardscommercialization of plastid transformation technology(质体转化技术商业化进展)，Trends Biotechnol.21，20-28。其他的生物技术进展最近已经以无标记质体转化体的形式报道，其中所述无标记质体转化体可以通过瞬时共整合的标记基因产生(Klaus等人，2004，Nature Biotechnology22(2)，225-229)。

可以借助技术人员熟悉的全部方法再生出基因修饰的植物细胞。合适的方法可以在S.D.Kung和R.Wu，Potrykus或

和Willmitzer的上述出版物中找到。备选地，基因修饰的植物细胞不可再生成完整植株。

通常，在转化后，对植物细胞或细胞群体选择一个或多个标记的存在，其中所述的标记由连同目的基因一起被共转移的植物可表达基因编码，随后将转化的材料再生成完整植物。为了选出转化的植物，转化中所获得的植物材料原则上经历选择性条件，从而转化的植物可以与未转化的植物区分。例如，按上述方式获得的种子可以种植，并且在初始培育期后，经受喷洒所致的合适选择作用。另一种可能性在于将种子(如果适宜，在消毒后)在使用合适选择剂的琼脂板上培育，从而仅转化的种子可以长成植物。备选地，对转化的植物筛选选择标记(如上文所述的选择标记)的存在。

在DNA转移和再生后，也可以对推定转化的植物，例如使用DNA印迹分析，评价目的基因的存在、拷贝数和／或基因组构造。备选或额外地，可以使用RNA印迹分析和／或蛋白质印迹分析，监测新导入的DNA的表达水平，这两项技术均是本领域普通技术人员熟知的。

可以通过多种手段增殖产生的转化植物，如通过克隆性增殖或经典育种技术。例如，第一世代(或T1)转化植物可以自交并且可以选择纯合的第二世代(或T2)转化体，并且随后可以通过经典育种技术进一步增殖T2植物。产生的转化生物可以采取多种形式。例如，它们可以是转化细胞与非转化细胞的嵌合体；克隆性转化体(例如，经转化以含有表达盒的全部细胞)；转化组织的和未转化组织的移植体(例如，在植物中，嫁接至未转化接穗的转化根砧木)。

T-DNA激活标签化

“T-DNA激活”标签化(Hayashi等Science(1992)1350-1353)涉及在目的基因的基因组区域内或基因编码区上游或下游10kb处以如此结构***T-DNA(通常含有启动子(也可以是翻译增强子或内含子))，使得启动子指导被靶定基因的表达。通常，由靶定基因的天然启动子对所述靶定基因表达的调节作用遭到破坏并且该基因处在新导入的启动子控制下。该启动子一般嵌入T-DNA内。这种T-DNA随机地***植物基因组，例如通过农杆菌感染，并且导致在所***T-DNA附近的基因的受调节表达。因靠近所导入启动子的基因的改良表达，产生的转基因植物表现显性表型。

TILLING

术语“TILLING”是“基因组内定向诱导的局部损伤”的缩写并且指用于产生和／或鉴定核酸的诱变技术，其中所述的核酸编码具有受调节表达和／或活性的蛋白质。TILLING也允许选择携带此类突变变体的植物。这些突变变体可以展示在强度或在位置或在时间方面受到调节的表达(例如，如果所述突变影响启动子)。这些突变变体可以显示比由处于其天然形式的基因所显出活性更高的活性。TILLING将高密度诱变法与高通量筛选法组合。一般在TILLING中遵循的步骤是：(a)EMS诱变(Redei GP和KonczC(1992)在Methods in Arabidopsis Research，Koncz C，Chua NH，Schell J编著，Singapore，World Scientific Publishing Co，第16-82页；Feldmann等人，(1994)引自Meyerowitz EM，Somerville CR编著，Arabidopsis.ColdSpring Harbor Laboratory出版，Cold Spring Harbor，NY，第137-172页；Lightner J和Caspar T(1998)引自J Martinez-Zapater，J Salinas编著，Methods on Molecular Biology，第82卷，Humana出版，Totowa，NJ，第91-104页)；(b)DNA制备和个体的汇集；(c)PCR扩增目的区；(d)变性和复性以允许形成异源双链体；(e)DHPLC，其中将异源双链体是否在汇集物中的存在检测为色谱图中的一个额外峰；(f)鉴定突变个体；和(g)对突变PCR产物测序。用于TILLING的方法是本领域熟知的(McCallum等人，(2000)Nat Biotechnol18：455-457；综述见Stemple(2004)Nat Rev Genet5(2)：145-50)。

同源重组

“同源重组”允许选择的核酸在基因组中于确定的所选择位置内导入。同源重组是生物科学中常规用于低等生物如酵母或苔藓剑叶藓(Physcomitrella)的标准技术。用于在植物中开展同源重组的方法已经不仅对模式植物(Offringa等，1990EMBO J9(10)：3077-84)，而且对作物植物例如稻(Terada等人，(2002)Nat Biotech20(10)：1030-4；Iida和Terada(2004)Curr Opin Biotech15(2)：132-8)进行描述，并且存在与靶生物无关而通常适用的方法(Miller等人，Nature Biotechnol.25，778-785，2007)。

产量相关性状

“产量相关性状”是与植物产量相关的性状或特征。产量相关性状可以包括以下非限制特征清单中的一个或多个：早期开花时间、产量、生物量、种子产量、早期生长势、绿度指数、生长速率、农艺性状例如淹没耐受性(这导致稻中的产量)、水使用效率(WUE)、氮使用效率(NUE)等。

本文谈及的相对于对照植物而言增强的产量相关性状意指以下一者或多者：早期生长势和／或植物的一个或多个部分的生物量(重量)的增加，所述的部分可以包括(i)地上部分和优选上可收获部分和／或(ii)地下部分和优选可收获的地下部分。特别地，这类可收获部分是种子。

产量

术语“产量”通常意指经济价值的可测量结果，一般与指定作物、与面积并且与时间段有关。基于其数目、大小和／或重量，独立的植物部分直接对产量作出贡献，或实际产量是某种作物和一年的每平方米产量，这通过总产量(包括收获的产量和评估的产量)除以种植的平方米数而确定

术语植物的“产量”并且“植物产量”在本文中可互换地使用，并意指营养体生物量如根和／或苗生物量，意指繁殖器官和／或意指繁殖体，如该植物的种子。

玉米中的花是单性的；雄性花序(雄穗)源自顶端茎并且雌性花序(雌穗)来自腋芽顶端。雌性花序在中轴(玉米芯)表面上产生成对小穗。雌性小穗的每一个包封两朵能育性小花，一旦受精，它们中至少一朵将通常成熟为玉米谷粒。因此，玉米中的产量增加可以表现为以下一项或多项：每平方米已建立的植物数目增加、每株植物的谷穗数增加、行数、每行核粒数、核粒重、千粒核重、谷穗长度/直径的增加、种子充实率(其为充实小花(即含有种子的小花)数除以小花总数并乘以100的数值)增加，及其他。

花序在稻植物中命名为圆锥花序。圆锥花序携带小穗，小穗是圆锥花序的基本单位并由花梗和小花组成。小花生于花梗上并且包括花，花由两片保护性颖苞覆盖：较大颖苞(外稃)和较短颖苞(内稃)。因此，以稻为例，产量增加可以自身表现为以下一项或多项的增加：每平方米植物数、每株植物的圆锥花序数、圆锥花序长度、每个圆锥花序的小穗数、每个圆锥花序的花(或小花)数、种子充实率(其为充实小花(即含有种子的小花)数除以小花总数并乘以100的数值)增加、千粒重增加，及其他。

早期开花时间

如本文所用的具有“早期开花时间”的植物是比对照植物更早开始开花的植物。因而，该术语指显示较早开始开花的植物。植物的开花时间可以通过计数播种与第一花序出现之间的天数(“至开花的时间”)进行评估。可以例如使用如WO2007／093444中所述的方法确定植物的“开花时间”。

早期生长势

“早期生长势”指活跃、健康、充分平衡的生长，尤其是植物生长早期阶段期间，并且可以因增加的植物适应性所致，其中所述增加的植物适应性原因是例如植物更好地适应其环境(即优化能源的使用和在幼苗与根之间的分配)。具有早期生长势的植物也显示增加的幼苗存活和更好的作物建立，这经常导致高度均一的田块(作物以均匀方式生长，即大多数植物在基本上相同的时间达到各个发育阶段)和往往更好及更高的产量。因而，早期生长势可以通过测量多种因素如千粒核重、萌发百分数、出苗百分数、幼苗生长、幼苗高度、根长度、根和苗生物量和许多其他因素等来确定。

增加的生长速率

增加的生长速率可以专指植物的一个或多个部分(包括种子)，或可以基本上遍及整株植物。具有增加的生长速率的植物可以具备较短的生活周期。植物的生活周期可以意指从成熟种子生长直至植物已经产生与起始材料相似的成熟种子的阶段所需要的时间。这个生活周期可以受诸多因素如萌发速度、早期生长势、生长速率、绿度指数、开花时间和种子成熟速度影响。生长速率的增加可以在植物生活周期的一个或多个阶段或基本上在植物整个生活周期期间发生。在植物生活周期中的早期阶段间，增加的生长速率可以反映增强的生长势。生长速率的增加可以改变植物的收获周期，从而允许植物更晚播种和／或更早收获，而这本来是不可能的(在开花时间更旱情况下，可以获得相似的效果)。如果生长速率充分地增加，则可以允许进一步播种相同植物物种的种子(例如播种并收获稻植物，随后播种并收获其他稻植物，全部稻植物均处于一个常规的生长时期内)。类似地，如果生长速率充分地增加，则可以允许进一步播种不同植物物种的种子(例如播种并收获玉米植物，随后例如播种并任选收获大豆、马铃薯或任何其他合适的植物)。在一些作物植物的情况下，从相同砧木收获额外的次数也可以是可能的。改变植物的收获周期可以导致每平方米一年生物量生产的增加(原因在于可以培育并收获任何具体植物的次数(即在一年中)增加)。生长速率的增加也可以允许转基因植物在比野生型对应物更广泛的地理区域内栽培，因为栽培某作物的地域限制往往由栽种时间(早季)或收获时间(晚季)的不利环境条件决定。如果缩短收获周期，则可以避开这类不利条件。生长速率可以通过从生长曲线推算多项参数来确定，此类参数可以是：T-Mid(植物达到其50％最大尺寸所耗费的时间)和T-90(植物达到其90％最大尺寸所耗费的时间)，以及其他参数。

胁迫抗性

与对照植物相比，无论植物处于非胁迫条件下或无论植物暴露于多种胁迫，均出现产量和／或生长速率的增加。植物一般通过生长得更慢而应答暴露于胁迫。在严重胁迫的情况下，植物甚至可能完全停止生长。另一方面，轻度胁迫在本文中定义为植物所暴露的任何胁迫，其不导致植物完全停止生长，但同时不能恢复生长。与非胁迫条件下的对照植物相比，轻度胁迫在本发明的意义下导致受胁迫植物的生长减少小于40％、35％、30％或25％，更优选小于20％或15％。由于农业实践(灌溉、施肥、杀虫剂处理)的进步，栽培的作物植物中并不经常遭遇严重胁迫。因此，由轻度胁迫诱导的受损生长对农业而言往往是不受欢迎的特征。非生物胁迫可以因干旱或过量的水、缺氧胁迫、盐胁迫、化学毒性、氧化胁迫和热、寒冷或冰冻温度所致。

“生物胁迫”一般是由病原体如细菌、病毒、真菌、线虫和昆虫引起的那些胁迫。

“非生物胁迫”可以是因水胁迫(尤其归咎于干旱)、盐胁迫或冰冻胁迫引起的渗透胁迫。非生物胁迫也可以是氧化胁迫或寒冷胁迫。“冰冻胁迫”意指归因于冰冻温度(即，可用水冷冻并变成冰的温度)的胁迫。“寒冷胁迫”，也称作“低温胁迫”意指寒冷温度，例如，10℃以下或优选5℃以下的温度，但是在所述温度处水分子不冻结。如Wang等人(Planta(2003)218：1-14)中所报道，非生物胁迫导致一系列不利影响植物生长及生产力的形态学、生理学、生物化学和分子变化。干旱、盐度、极端温度和氧化胁迫已知是相互联系的，并且可以通过相似的机制引起生长损害及细胞损害。Rabbani等人(Plant Physiol(2003)133：1755-1767)描述了干旱胁迫与高盐度胁迫之间特别高程度的“交互作用”。例如，干旱和／或盐化作用主要表现为渗透胁迫，从而导致细胞内稳态和离子分布的破坏。氧化胁迫，其经常伴随高温或低温、盐度或干旱胁迫，可以造成功能蛋白和结构蛋白变性。因此，这些多样的环境胁迫常常激活相似的细胞信号传导途径和细胞应答，如产生胁迫蛋白、上调抗氧化物质、积累兼容性溶质和生长停滞。如本文中所用的术语“非胁迫”条件是允许植物最佳生长的那些环境条件。本领域技术人员清楚给定地点的正常土壤条件和气候条件。伴有最佳生长条件(在非胁迫条件下培育)的植物一般以增加的优选顺序产生该植物在给定环境中至少97％、95％、92％、90％、87％、85％、83％、80％、77％或75％的平均产量。平均产量可以基于收获量和／或季节计算。本领域技术人员清楚作物的平均生产产量。

特别地，本发明的方法可以在非胁迫条件下实施。在一个实例中，本发明的方法可以在非胁迫条件如轻度干旱下实施以产生相对于对照植物具有增加的产量的植物。

在另一个实施方案中，本发明的方法可以在胁迫条件下实施。

在一个实例中，本发明的方法可以在胁迫条件如干旱下实施以产生相对于对照植物具有增加的产量的植物。

在另一个实例中，本发明的方法可以在胁迫条件如养分缺乏下实施以产生相对于对照植物具有增加的产量的植物。

养分缺乏可以因缺少养分如氮、磷酸盐和其他含磷化合物、钾、钙、镁、锰、铁和硼及其他元素所致。

在又一个实例中，本发明的方法可以在胁迫条件如盐胁迫下实施以产生相对于对照植物具有增加的产量的植物。术语“盐胁迫”不限于普通盐(NaCl)，不过可以是NaCl、KCl、LiCl、MgCl₂、CaCl₂等中的任意一种或多种。

在又一个实例中，本发明的方法可以在胁迫条件如寒冷胁迫或冰冻胁迫下实施以产生相对于对照植物具有增加的产量的植物。

增加／改善／增强

术语“增加”、“改善”或“增强”是可互换的并且在本申请的含义下应当指与如本文中定义的对照植物相比至少3％、4％、5％、6％、7％、8％、9％或10％，优选至少15％或20％，更优选25％、30％、35％或40％更多的产量和／或生长。

种子产量

增加的种子产量可以本身表现为以下一项或多项：

(a)种子生物量(种子总重量)的增加，这可以基于单粒种子和／或每株植物和／或每平方米而言计算；

(b)每株植物增加的花数；

(c)增加的种子数；

(d)增加的种子充实率(其表述为充实小花数除以小花总数之间的比率)；

(e)增加的收获指数，其表述为可收获部分(如种子)的产量除以植物地上部分的生物量的比率；和

(f)增加的千粒核重(TKW)，其从计数的充实种子数及其总重量外推而来。增加的TKW可以因增加的种子尺寸和／或种子重量引起，并且也可以因胚尺寸和／或胚乳尺寸增加引起。

术语“充实的小花”和“充实的种子”可以视为同义词。

种子产量的增加也可以表现为种子尺寸和／或种子体积的增加。此外，种子产量的增加也可以自身表现为种子面积和／或种子长度和／或种子宽度和／或种子周长的增加。

绿度指数

如本文中所用的“绿度指数”从植物的数字图像计算。对于属于该图像上植物目标的每个像素，计算绿色值对红色值的比率(以编码颜色的RGB模式)。绿度指数表述为绿色／红色比超过给定阈值的像素的百分数。在正常生长条件下，在盐胁迫生长条件下和在养分可利用性降低的生长条件下，在开花前的最后成像中测量植物的绿度指数。相反，在干旱胁迫生长条件下，在干旱后的首次成像中测量植物的绿度指数。

生物量

如本文所用的术语“生物量”意指植物的总重量。在生物量的定义范围内，可以在植物的一个或多个部分的生物量之间做出区分，所述的部分可以包括以下任何一者或多者：

-地上部分，如但不限于苗生物量、种子生物量、叶生物量等；

-地上可收获部分，如但不限于苗生物量、种子生物量、叶生物量等；

-地下部分，如但不限于根生物量、块茎、鳞茎等；

-地下可收获部分，如但不限于根生物量、块茎、鳞茎等；

-部分地下的可收获部分，如但不限于甜菜和植物的其他下胚轴区域、根状茎、匍匐茎或攀爬根茎；

-营养体生物量如根生物量、苗生物量等；

-繁殖器官；和

-繁殖体如种子。

标记辅助育种

此类育种计划有时需要通过使用例如EMS诱变法对植物进行诱变处理来导入等位变异；或者，所述计划可以始于一组并非故意造成的所谓“自然”来源性等位变体开始。随后进行等位变体的鉴定，例如通过PCR法。而后是步骤：选择所讨论序列的并且导致产量增加的优异等位变体。一般通过监测含有所讨论序列的不同等位变体的植物的生长性能实施选择。可以在温室中或在田间监测生长性能。其他任选的步骤包括将其中鉴定到优异等位变体的植物与另一株植物杂交。这可能用来例如产生感兴趣的表型特征的组合。

用作(基因作图)中的探针

编码目的蛋白的核酸用于对基因进行遗传和物理作图的用途仅需至少15个核苷酸长度的核酸序列。这些核酸可以用作限制性片段长度多态性(RFLP)标记。限制性消化的植物基因组DNA的DNA印迹物(Sambrook J，Fritsch EF和Maniatis T(1989)Molecular Cloning，A Laboratory Manual)可以用编码目的蛋白的核酸探测。所得的带型随后可以使用计算机程序如MapMaker(Lander等人(1987)Genomics1：174-181)，进行遗传分析以构建遗传图。此外，所述核酸可以用来探测含有一组个体的限制性核酸内切酶处理的基因组DNA的DNA印迹物，其中所述的一组个体代表确定的遗传杂交的亲本和子代。DNA多态性的分离是明显的并且用来计算编码目的蛋白的核酸在先前使用这个群体所获得的遗传图中的位置(Botstein等人(1980)Am.J.Hum.Genet.32：314-331)。

在Bernatzky和Tanksley(1986)Plant Mol.Biol.Reporter4：37-41中描述了植物基因来源的探针的产生及其在遗传作图中的用途。许多出版物描述了使用上文概述的方法学或其变型对特定cDNA克隆的遗传作图。例如，F2互交群、回交群、随机交配群、邻近纯合系和其他个体群体可以用于作图。此类方法学是本领域技术人员熟知的。

这些核酸探针也可以用于物理作图(即序列在物理图上的排列；见Hoheisel等人，引自：Non-mammalian Genomic Analyasis：A PracticalGuide，Academic出版1996，第319-346页及其中引用的参考文献)。

在另一个实施方案中，所述核酸探针可以用于直接荧光原位杂交(FISH)作图中(Trask(1991)Trends Genet.7：149-154)。尽管现有的FISH作图法支持大克隆(几个kb至几百个kb；见Laan等人(1995)Genome Res.5：13-20)的使用，然而灵敏度的改善可以允许使用更短探针进行FISH作图。

多种基于核酸扩增的用于遗传作图及物理作图的方法可以使用所述核酸实现。实例包括等位基因特异性扩增法(Kazazian(1989)J.Lab.Clin.Med11：95-96)、PCR扩增片段的多态性(CAPS；Sheffield等人(1993)Genomics16：325-332)、等位基因特异性连接(Landegren等人(1988)Science241：1077-1080)、核苷酸延伸反应(Sokolov(1990)Nucleic Acid Res.18：3671)、放射杂交作图(Walter等人(1997)Nat.Genet.7：22-28)和Happy作图法(Dear和Cook(1989)Nucleic Acid Res.17：6795-6807)。对于这些方法，将核酸的序列用来设计并且产生在扩增反应或在引物延伸反应中所使用的引物对。此类引物的设计是本领域技术人员熟知的。在使用基于PCR的遗传作图方法中，可能需要鉴定在对应于本发明核酸序列的区域内作图交叉的亲本之间的DNA序列差异。然而，对作图法而言，这通常不是必需的。

植物

如本文中所用的术语“植物”包含整株植物、植物的祖先及子代和植物部分，包括种子、苗、茎、叶、根(包括块茎)、花和组织及器官，其中每个所提及的对象包含目的基因／核酸。术语“植物”也包括植物细胞、悬浮培养物、愈伤组织、胚、分生组织区、配子体、孢子体、花粉和小孢子，再次地，其中提及的每种对象均包含目的基因／核酸。

在本发明方法中特别有用的植物包括属于植物界(Viridiplantae)超家族、尤其单子叶和双子叶植物的全部植物，包括饲用或饲料豆科植物、观赏植物、粮食作物、树或灌木，其中所述植物选自包含以下物种的名单：槭树属物种(Acer spp.)、猕猴桃属物种(Actinidia spp.)、秋葵属物种(Abelmoschus spp.)、剑麻(Agave sisalana)、冰草属物种(Agropyron spp.)、匍匐剪股颖(Agrostis stolonifera)、葱属物种(Allium spp.)、苋属物种(Amaranthus spp.)、欧洲海滨草(Ammophila arenaria)、凤梨(Ananascomosus)、番荔枝属物种(Annona spp.)、旱芹(Apium graveolens)、蜘蛛兰属物种(Arachis spp.)、木波罗属物种(Artocarpus spp.)、石刁柏(Asparagusofficinalis)、燕麦属物种(Avena spp.)(例如燕麦(Avena sativa)、野燕麦(Ayena fatua)、比赞燕麦(Avena byzantina)、野燕麦原变种(Avena fatua var.sativa)、杂种燕麦(Avena hybrida)、阳桃(Averrhoa carambola)、箣竹属(Bambusa sp.)、冬瓜(Benincasa hispida)、巴西栗(Bertholletia excelsea)、甜菜(Beta vulgaris)、芸苔属物种(Brassica spp.)(例如欧洲油菜(Brassicanapus)、芜青物种(Brassica rapa ssp.)[卡诺拉、油菜(oilseed rape)、蔓青(turnip rape)])、Cadaba farinosa、茶(Camellia sinensis)、美人蕉(Cannaindica)、***(Cannabis sativa)、辣椒属物种(Capsicum spp.)、Carex elata、番木瓜(Carica papaya)、大果假虎刺(Carissa macrocarpa)、山核桃属物种(Carya spp.)、红花(Carthamus tinctorius)、栗属物种(Castanea spp.)、美洲木棉(Ceiba pentandra)、苦苣(Cichorium endivia)、樟属物种(Cinnamomum spp.)、西瓜(Citrullus lanatus)、柑桔属物种(Citrus spp.)、椰子属物种(Cocos spp.)、咖啡属物种(Coffea spp.)、芋头(Colocasiaesculenta)、非洲梧桐属物种(Cola spp.)、黄麻属(Corchorus sp.)、芫荽(Coriandrum sativum)、榛属物种(Corylus spp.)、山楂属物种(Crataegusspp.)、番红花(Crocus sativus)、南瓜属物种(Cucurbita spp.)、香瓜属物种(Cucumis spp.)、菜蓟属物种(Cynara spp.)、胡萝卜、山马蝗属物种(Desmodium spp.)、龙眼(Dimocarpus longan)、薯蓣属物种(Dioscoreaspp.)、柿树属物种(Diospyros spp.)、稗属物种(Echinochloa spp.)、油棕属(Elaeis)(例如油棕(Elaeis guineensis)、美洲油棕(Elaeis oleifera))、穇子(Eleusine coracana)、埃塞俄比亚画眉草(Eragrostis tef)、蔗茅属物种(Erianthus sp.)、枇杷(Eriobotrya japonica)、桉属物种(Eucalyptus sp.)、红仔果(Eugenia uniflora)、荞麦属物种(Fagopyrum spp.)、水青冈属物种(Fagus spp.)、苇状羊茅(Festuca arundinacea)、无花果(Ficus carica)、金桔属物种(Fortunella spp.)、草莓属物种(Fragaria spp.)、银杏(Ginkgo biloba)、大豆属(Glycine spp.)(例如大豆(Glycine max)、大豆(Soja hispida)或大豆(Soja max))、陆地棉(Gossypium hirstum)、向日葵属物种(Helianthusspp.)(例如向日葵(Helianthus annuus))、长管萱草(Hemerocallis fulva)、木槿属物种(Hibiscus spp.)、大麦属(Hordeum spp.)(例如大麦(Hordeumvulgare))、甘薯(Ipomoea batatas)、核桃属物种(Juglans spp.)、莴苣(Lactucasativa)、山黧豆属物种(Lathyrus spp.)、兵豆(Lens culinari)、亚麻(Linumusitatissimum)、荔枝(Litchi chinensis)、百脉根属物种(Lotus spp.)、棱角丝瓜(Luffa acutangula)、羽扇豆属物种(Lupinus spp.)、Luzula sylvatica、番茄属物种(Lycopersicon spp.)(例如番茄(Lycopersicon esculentum、Lycopersicon lycopersicum、Lycopersicon pyriformc))、硬皮豆属物种(Macrotyloma spp.)、苹果属物种(Malus spp.)、凹缘金虎尾(Malpighiaemarginata)、牛油果(Mammea americana)、芒果(Mangifera indica)、木薯属物种(Manihot spp.)、人心果(Manilkara zapota)、苜蓿(Medicagosativa)、草木樨属物种(Melilotus spp.)、薄荷属物种(Mentha spp.)、芒(Miscanthus sinensis)、苦瓜属物种(Momordica spp.)、黑桑(Morus nigra)、芭蕉属物种(Musa spp.)、烟草属物种(Nicotiana spp.)、木犀榄属物种(Oleaspp.)、仙人掌属物种(Opuntia spp.)、鸟足豆属物种(Ornithopus spp.)、稻属(Oryza spp.)(例如稻、阔叶稻(Oryza latifolia))、稷(Panicum miliaceum)、柳枝稷(Panicum virgatum)、鸡蛋果(Passiflora edulis)、欧防风(Pastinacasativa)、狼尾草属物种(Pennisetum sp.)、鳄梨属物种(Persea spp.)、欧芹(Petroselinum crispum)、虉草(Phalaris arundinacea)、菜豆属物种(Phaseolus spp.)、猫尾草(Phleum pratense)、刺葵属物种(Phoenix spp.)、南方芦苇(Phragmites australis)、酸浆属物种(Physalis spp.)、松属物种(Pinus spp.)、阿月浑子(Pistacia vera)、豌豆属物种(Pisum spp.)、早熟禾属物种(Poa spp.)、杨属物种(Populus spp.)、牧豆草属物种(Prosopis spp.)、李属物种(Prunus spp.)、番石榴属物种(Psidium spp.)、石榴(Punicagranatum)、西洋梨(Pyrus communis)、栎属物种(Quercus spp.)、萝卜(Raphanus sativus)、波叶大黄(Rheum rhabarbarum)、茶蔗子属物种(Ribesspp.)、蓖麻(Ricinus communis)、悬钩子属物种(Rubus spp.)、甘蔗属物种(Saccharum spp.)、柳属物种(Salix sp.)、接骨木属物种(Sambucus spp.)、黑麦(Secale cereale)、胡麻属物种(Sesamum spp.)、白芥属物种(Sinapissp.)、茄属(Solanum spp.)(例如马铃薯(Solanum tuberosum)、红茄(Solanumintegrifolium)或番茄)、两色蜀黍(Sorghum bicolor)、菠菜属物种(Spinaciaspp.)、蒲桃属物种(Syzygium spp.)、万寿菊属物种(Tagetes spp.)、酸豆(Tamarindus indica)、可可树(Theobroma cacao)、车轴草属物种(Trifoliumspp.)、鸭茅状摩擦禾(Tripsacum dactyloides)、Triticosecale rimpaui、小麦属(Triticum spp.)(例如普通小麦(Triticum aestivum)、硬粒小麦(Triticumdurum)、圆柱小麦(Triticum turgidum)、Triticum hybcrnum、马卡小麦(Triticum macha)、普通小麦(Triticum sativum)或普通小麦(Triticumvulgare))、小金莲花(Tropaeolum minus)、金莲花(Tropaeolum majus)、越桔属物种(Vaccinium spp.)、野碗豆属物种(Vicia spp.)、豇豆属物种(Vignaspp.)、香堇(viola odorata)、葡萄属物种(Vitis spp.)、玉米(Zea mays)、Zizania palustris、枣属物种(Ziziphus spp.)及其他。

对照植物

合适的对照植物的选择是实验设计的例行部分，并且可以包括相应的野生型植物或无目的基因的相应植物。对照植物一般是相同的植物物种或甚至是与待评估植物相同的品种。对照植物也可以是待评估植物的失效合子。失效合子(或失效对照植物)是因分离而丢失转基因的个体。另外，将对照植物在与本发明植物的培育条件相同的培育条件下培育，即在本发明植物附近并与之同时培育。如本文中所用的“对照植物”不仅指完整植物，也指植物部分，包括种子和种子部分。

附图简述

本发明现在将参考以下图进行描述，其中：

图1代表用于在稻GOS2启动子(pGOS2)控制下增加WAK-样编码核酸在稻中表达的双元载体。

图2代表由SEQ ID NO：318代表的CDKB-RKA多肽与来自拟南芥(AT2G38620.2；SEQ ID NO：320)的CDKB多肽(CDKB1，2)的比对结果，保守结构域示出。

图3代表多种全长CDKB多肽的多重比对结果。星号表示在多个蛋白质序列之间相同的氨基酸，冒号代表高度保守的氨基酸置换，并且点号代表保守性较小的氨基酸置换；在其余位置不存在序列保守性。当使用保守氨基酸时，这些比对结果可以用于定义其他基序或标签序列。保守细胞周期蛋白结合结构域由黑框代表。

图4代表用于在合适启动子控制下增加如本文定义的CDKB-RKA编码核酸在稻中表达的双元载体。

图5代表具有保守基序2至7和bHLH结构域(粗体且加下划线)的SEQ ID NO：407的结构域结构。

图6代表多种UPA20-样多肽的多重比对结果。比对序列具有如图7图例中所述的SEQ ID NO。当使用保守氨基酸时，这些比对结果可以用于定义其他基序或标签序列。bHLH结构域用方框表示。

图7显示实施例3的MATGAT表。所代表的多肽与下列图例对应：

1.毛果杨575437；2.琴叶拟南芥(A.lyrata)472791；3.琴叶拟南芥476021；4.琴叶拟南芥491205；5.琴叶拟南芥494918；6.琴叶拟南芥495154；7.拟南芥AT1G26260.1；8.拟南芥AT1G68920.1；9.拟南芥AT3G07340.1；10.拟南芥AT5G48560.1；11.拟南芥AT5G50915.1；12.耧斗菜属物种TC24120；13.耧斗菜属物种TC24680；14.耧斗菜属物种TC26724；15.欧洲油菜(B.napus)TC73386；16.辣椒(C.annuum)NP13055023；17.辣椒TC15396；18.甜橙(C.sinensis)TC686；19.陆地棉(G.horsutum)TC144761；20.大豆Glyma01g09400.1；21.大豆Glyma02g13860.1；22.大豆Glyma03g21770.1；23.大豆Glyma04g37690.1；24.大豆Glyma05g38450.1；25.大豆Glyma06g17420.1；26.大豆Glyma08g46040.1；27.大豆Glyma18g32560.1；28.大豆GM06MC189975969107318643；29.雷蒙德氏棉(G.raimondii)TC6315；30.雷蒙德氏棉TC9358；31.菊芋(H.tuberosus)TA27374233；32.苹果(M.domestica)TC28668；33.蒺藜苜蓿AC15084212.5；34.蒺藜苜蓿AC17126617.4；35.普通烟草FG645212；36.稻LOC Os04g28280.1；37.稻LOC Os05g01256.1；38.稻LOC Os06g16400.1；39.稻LOC Os08g41320.1；40.稻LOC Os08g42470.1；41.稻LOC Os09g32510.4；42.稻LOC Os09g33580.1；43.碧冬茄(Petuniahybrida)TC3261；44.蟠桃(P.persica)TC11169；45.毛果杨553223；46.毛果杨572918；47.毛果杨773249；48.柳枝稷TC28308；49.菜豆(P.vulgaris)TC12782；50.蓖麻(R.communis)TA28483988；51.两色蜀黍(S.bicolor)Sb02g029530.1；52.两色蜀黍Sb07g025920.1；53.番茄(S.lycopersicum)TC196509；54.番茄TC215759；55.甘蔗(S.officinarum)TC78398；56.马铃薯(S.tuberosum)TC168229；57.普通小麦(T.aestivum)TC301717；58.毛果杨(Poptr)TA1；59.直果草属物种(Triphysaria sp)TC7138；60.葡萄(V.vinifera)GSVIVT00014998001；61.玉米(Z.mays)TC460846；62.玉米TC476562；63.玉米TC511518；64.玉米ZM07MC24807BFb0298G1424734；65.玉米ZM07MC32776BFb0337M2232678；66.姜(Z.officinale)TA598994328。

图8代表用于在稻GOS2启动子(pGOS2)控制下增加UPA20-样编码核酸在稻中表达的双元载体。

图9显示许多UPA20-样多肽的进化***树。

实施例

本发明现在参考如下实施例进行描述，所述实施例仅是说明性的。以下实施例不意在限制本发明的范围。除非另外说明，否则本发明采用植物生物学、分子生物学、生物信息学和植物育种的常规技术和方法。

DNA操作：除非另外说明，否则重组DNA技术根据(Sambrook(2001)Molecular Cloning：a laboratory manual，第3版Cold Spring HarborLaboratory出版，CSH，New York)或Ausubel等人(1994)，CurrentProtocols in Molecular Biology，Current Protocols第1卷和第2卷中所述的标准方案进行。在BIOS科学出版有限责任公司(BIOS ScientificPublications Ltd(英国))和Blackwell科学出版社(Blackwell ScientificPublications)(英国)出版的R.D.D.Cray的Plant Molecular BiologyLabfax(1993)中描述了用于植物分子研究工作的标准材料和方法。

实施例1：鉴定与本发明方法中所用的核酸序列相关的序列

1.WAK-样多肽

使用数据库序列搜索工具，如基本局部比对工具(BLAST)(Altschul等人(1990)J.Mol.Biol.215：403-410；和Altschul等人(1997)Nucleic AcidsRes.25：3389-3402)，在国家生物技术信息中心(NCBI)的Entrez核苷酸数据库中维护的那些序列中鉴定了与SEQ ID NO：1和SEQ ID NO：2相关的(全长cDNA、ESTs或基因组)序列。该程序用来通过将核酸序列或多肽序列与序列数据库比较并且计算匹配的统计显著性来找到序列之间的局部相似区域。例如，将SEQ ID NO：1的核酸所编码的多肽用于TBLASTN算法中，采用默认设置和过滤程序以忽略低复杂性序列抵消。该分析的输出结果通过逐对比较进行检验，并根据概率评分(E-值)评级，其中所述的评分反映特定比对结果偶然发生的概率(E-值越低，命中的显著性越高)。除E-值外，比较也可以由同一性百分数评定。同一性百分数指所比较的两个核酸(或多肽)序列之间在特定长度范围内的相同核苷酸(或氨基酸)的数目。在一些情况下，可以调整默认参数以调节搜索的严格性。例如，可以增加E-值以显示较不严格的匹配。以这种方式，可以鉴定到几乎精确的短匹配。

表A1提供与SEQ ID NO：1和SEQ ID NO：2相关的一系列核酸序列。

表A1：WAK-样核酸和多肽的实例：

2.CDKB-RKA多肽

由SEQ ID NO：319代表且编码由SEQ ID NO：320代表的B型CDK(CDKB)多肽的核酸分子是具有催化激酶活性的全长CDKB多肽的实例。

从此序列开始，使用数据库序列搜索工具，如基本局部比对工具(BLAST)(Altschul等人(1990)J.Mol.Biol.215：403-410；和Altschul等人(1997)Nucleic Acids Res.25：3389-3402)，在国家生物技术信息中心(NCBI)的Entrez核苷酸数据库中维护的那些序列中鉴定了与SEQ ID NO：319和SEQ ID NO：320相关的其他序列(全长cDNA、EST或基因组)。该程序用来通过将核酸序列或多肽序列与序列数据库比较并且计算匹配的统计显著性来找到序列之间的局部相似区域。例如，将SEQ ID NO：319的核酸编码的多肽用于TBLASTN算法中，采用默认设置和过滤程序以忽略低复杂性序列抵消。该分析的输出结果通过逐对比较进行检验，并根据概率评分(E-值)评级，其中所述的评分反映特定比对结果偶然发生的概率(E-值越低，命中的显著性越高)。除E-值外，比较也可以由同一性百分数评定。同一性百分数指所比较的两个核酸(或多肽)序列之间在特定长度范围内的相同核苷酸(或氨基酸)的数目。在一些情况下，可以调整默认参数以调节搜索的严格性。例如，可以增加E-值以显示较不严格的匹配。以这种方式，可以鉴定到几乎精确的短匹配。

表A2提供与SEQ ID NO：319和SEQ ID NO：320相关并包括SEQ IDNO：319和SEQ ID NO：320的一系列核酸序列。

表A2：B型核酸和多肽的实例

植物来源	核酸序列	氨基酸序列
			拟南芥_AT2G38620.2#1	319	320
拟南芥_AT3G54180.1#1	321	322
			拟南芥_AT2G38620.1#1	323	324
拟南芥_AT1G76540.1#1	325	326
			拟南芥_AT1G20930.1#1	327	328
大豆_Glyma14g39760.1#1	329	330
			大豆_Glyma07g02400.1#1	331	332
大豆_Glyma07g07640.1#1	333	334
			大豆_Glyma09g08250.1#1	335	336
大豆_Glyma17g38210.1#1	337	338
			向日葵_CD855729#1	339	340
大麦_TC160457#1	341	342
			大麦_TC172640#1	343	344
蒺藜苜蓿_TC115190#1	345	346
			蒺藜苜蓿_TC117212#1	347	348
稻_LOC_Os01g67160.1#1	349	350
			稻_LOC_Os08g40170.1#1	351	352
小立碗藓_TC41028#1	353	354
			小立碗藓_NP13120379#1	355	356
小立碗藓_NP13127560#1	357	358
			小立碗藓_TC43373#1	359	360
小立碗藓_TC35664#1	361	362
			小立碗藓_TC47562#1	363	364
毛果杨_scaff_28.331#1	365	366

毛果杨_scaff_XVI.1376#1	367	368
			毛果杨_scaff_II.31#1	369	370
毛果杨_scaff_3712.1#1	371	372
			番茄_TC198540#1	373	374
番茄_TC205060#1	375	376
			普通小麦_TC283074#1	377	378
普通小麦_TC290551#1	379	380
			普通小麦_TC282781#1	381	382
玉米_c62195783gm03040312303#1	383	384
			紫苜蓿_P93321	385	386
蓖麻_XP_002519974.1	387	388
			烟草_AAG01532.1	389	390
番茄_CAC15503.1	391	392
			百脉根(Lotus japonicus)	393	394
葡萄_XP002266623.1	395	396
			金鱼草属_CAA66235.1	397	398
红叶藜_CAC17703.1	399	400
			两色蜀黍XP_002441781.1	401	402

如上表A2中所示的那些与SEQ ID NO：320相关的多肽可用于本发明，条件是这些多肽序列具有降低的催化激酶活性或优选缺少催化激酶活性。因此，从序列如表A2中所列的那些序列开始，可设计本发明的CDKB-RKA多肽，例如通过在所述多肽中导入一种或多种突变，且优选在所述多肽的催化激酶结构域中导入一种或多种突变，或通过部分或基本全部截短来自CDKB多肽的催化激酶结构域。

3.UPA20-样多肽

使用数据库序列搜索工具，如基本局部比对工具(BLAST)(Altschul等人(1990)J.Mol.Biol.215：403-410；和Altschul等人(1997)Nucleic AcidsRes.25：3389-3402)，在国家生物技术信息中心(NCBI)的Entrez核苷酸数据库中维护的那些序列中鉴定了与SEQ ID NO：406和SEQ ID NO：407相关的(全长cDNA、EST或基因组)序列。该程序用来通过将核酸序列或多肽序列与序列数据库比较并且计算匹配的统计显著性来找到序列之间的局部相似区域。例如，将SEQ ID NO：406的核酸编码的多肽用于TBLASTN算法中，采用默认设置和过滤程序以忽略低复杂性序列抵消。该分析的输出结果通过逐对比较进行检验，并根据概率评分(E-值)评级，其中所述的评分反映特定比对结果偶然发生的概率(E-值越低，命中的显著性越高)。除E-值外，比较也可以由同一性百分数评定。同一性百分数指所比较的两个核酸(或多肽)序列之间在特定长度范围内的相同核苷酸(或氨基酸)的数目。在一些情况下，可以调整默认参数以调节搜索的严格性。例如，可以增加E-值以显示较不严格的匹配。以这种方式，可以鉴定到几乎精确的短匹配。

表A3提供SEQ ID NO：406和SEQ ID NO：407和与SEQ ID NO：406和SEQ ID NO：407相关的一系列核酸序列。

表A3.UPA20-样核酸和多肽的实例：

序列已经由研究机制如基因组研究所(TIGR；始于TA)初步地组装并且公开披露。例如，真核生物基因直向同源物(EGO)数据库可以用来通过关键词检索或通过使用BLAST算法以目的核酸序列或多肽序列鉴定此类相关序列。已经为特定生物(例如针对某些原核生物)创建了专有核酸序列数据库，如由联合基因组研究所(Joint Genome Institute)创建。另外，登录专利数据库已经允许鉴定新的核酸序列和多肽序列。

实施例2：序列与本发明方法中所用多肽序列的比对

1.WAK-样多肽

在标准设置(缓慢比对，相似性矩阵：Gonnet，空位开口罚分：10，空位延伸罚分：0.2)下，使用累进比对ClustalW2.0算法(Thompson等人(1997)Nucleic Acids Res25：4876-4882；Chenna等人(2003).NucleicAcids Res31：3497-3500)进行多肽序列的比对。进行少许手工编辑以进一步优化该比对。

使用MAFFT(Katoh和Toh(2008)-Briefings in Bioinformatics9：286-298)，通过比对WAK-样序列，构建WAK-样多肽的进化***树。使用Quick-Tree(Houwe等人(2002)，Bioinformatics18(11)：1546-7)，100次自展重复，计算邻接树。使用Dendroscope(Huson等人(2007)，BMC Bioinformatics8(1)：460)绘制该***树。对主要分支化显示100次自展重复的置信度水平。

2.CDKB-RKA多肽

在标准设置(缓慢比对，相似性矩阵：Gonnet，空位开口罚分：10，空位延伸罚分：0.2)下，使用累进比对ClustalW1.81算法(Thompson等人(1997)Nucleic Acids Res25：4876-4882；Chenna等人(2003).NucleicAcids Res31：3497-3500)进行表A2所示CDKB多肽序列的比对。进行少许手工编辑以进一步优化该比对。在图3中比对B型CDK(CDKB)多肽。

3.UP A20-样多肽

在标准设置(缓慢比对，相似性矩阵：Gonnet，空位开口罚分：10，空位延伸罚分：0.2)下，使用累进比对ClustalW2.0算法(Thompson等人(1997)Nucleic Acids Res25：4876-4882；Chenna等人(2003).NucleicAcids Res31：3497-3500)进行多肽序列的比对。进行少许手工编辑以进一步优化该比对。在图6中比对有代表性数量UPA20-样多肽。

使用MAFFT(Katoh和Toh(2008)-Briefings in Bioinformatics9：286-298)，通过比对UPA20-样序列，可构建大量UPA20-样多肽的进化***树(图5)。使用Quick-Tree(Houwe等人(2002)，Bioinformatics18(11)：1546-7)，100次自展重复，计算邻接树。使用Dendroscope(Huson等人(2007)，BMC Bioinformatics8(1)：460)绘制该***树。对主要分支化显示100次自展重复的置信度水平。

又注意到根据Toledo-Ortiz等人(2003)给出的拟南芥bHLH树，来自进化支A和进化支B的蛋白质都属于本文图2所示的亚进化支18。

实施例3：计算多肽序列之间的总体同一性百分数

使用本邻域可用的方法之一MatGAT(矩阵总体比对工具)软件(BMCBioinformatics.20034：29.MatGAT：an application that generatessimilarity／identity matrices using protein or DNA sequences(MatGAT：使用蛋白质序列或DNA序列产生相似性／同一性矩阵的一项应用)，Campanella JJ，Bitincka L，Smalley J；该软件由Ledion Bitincka维护)，确定在实施本发明方法中有用的全长多肽序列之间的总体相似性和同一性百分数。MatGAT产生DNA序列或蛋白质序列的相似性／同一性矩阵，无需数据的预先比对。该程序使用Myers和Miller总体比对算法(空位开口罚分：12，空位延伸罚分：2)执行一系列配对比对，使用例如Blosum62(用于多肽)计算相似性和同一性，并且随后将结果置于距离矩阵中。

该分析结果显示在该多肽序列的全长范围内总体相似性和同一性的分析结果。序列相似性在分割线下半部分显示，并且序列同一性在对角分割线的上半部分显示。比较中使用的参数是：评分矩阵：Blosum62，第一空位：12，延伸空位：2。也可制作用于特异结构域的局部比对的MatGAT表格，或特异结构域间的百分比同一性／相似性数据。

1.UPA20-样多肽

图7中显示在有代表性数量的UPA20-样多肽序列的全长范围内总体相似性和同一性的分析结果。序列相似性在分割线下半部分显示，并且序列同一性在对角分割线的上半部分显示。比较中使用的参数是：评分矩阵：Blosum62，第一空位：12，延伸空位：2。与SEQ ID NO：407相比，在实施本发明方法中有用的UPA20-样多肽序列之间的序列同一性(以％计)通常高于25％。

表B1中显示许多多肽序列的全长范围内分析的总体相似性和同一性的结果，其中在构建进化***树(如图9中所绘制的一个进化***树)中使用时，所述多肽序列与包含如SEQ ID NO：407所代表的氨基酸序列的多肽组聚类，而不与任何其他组聚类。在这个表中，使用以下注释：1.毛果杨575437；2.琴叶拟南芥495154；3.拟南芥AT5G50915.1；4.耧斗菜属物种TC24680；5.欧洲油菜TC73386；6.辣椒NP13055023；7.甜橙TC686；8.大豆Glyma04g37690.1；9.大豆Glyma05g38450.1；10.大豆Glyma06g17420.1；11.雷蒙德氏棉TC6315；12.苹果TC28668；13.烟草FG645212；14.稻LOC Os05g01256.1；15.稻LOC Os08g42470.1；16.稻LOC Os09g33580.1；17.碧冬茄TC3261；18.毛果杨773249；19.柳枝稷TC28308；20.两色蜀黍Sb02g029530.1；21.两色蜀黍Sb07g025920.1；22.甘蔗TC78398；23.普通小麦TC301717；24.玉米TC460846.25.玉米TC476562；26.玉米TC511518；27玉米ZM07MC24807BFb0298G1424734；28.玉米ZM07MC32776BFb0337M2232678

表B1

	1	2	3	4	5	6	7	8	9	10	11	12	13	14	15	16	17
																		1		38	39	43	39	50	51	54	50	54	53	54	40	34	41	38	41
2	53		87	38	60	43	38	42	40	41	41	38	37	36	43	39	39
																		3	53	90		39	61	41	39	42	41	41	40	40	37	35	41	39	38
4	66	56	56		39	45	45	47	42	46	45	45	35	36	40	39	38
																		5	55	70	72	60		41	37	41	38	41	41	38	34	36	38	36	35
6	66	58	57	68	59		46	47	46	50	51	48	56	36	42	39	55
																		7	67	52	51	62	52	62		52	46	51	47	53	37	36	39	37	40
8	74	54	56	69	56	67	67		63	94	54	56	42	35	39	38	41
																		9	67	54	54	64	55	64	61	78		64	50	52	40	34	39	36	39

10	74	55	56	69	55	68	67	96	78		55	57	42	36	38	38	42
																		11	71	57	57	66	58	70	64	73	66	73		51	42	38	40	40	43
12	72	53	55	64	54	65	67	72	65	72	67		38	36	38	35	40
																		13	49	55	53	50	48	61	47	52	50	52	53	50		33	39	39	83
14	50	50	50	54	53	57	49	51	51	54	52	51	43		39	35	32
																		15	56	60	60	57	53	57	53	56	55	56	57	50	53	55		63	39
16	54	58	56	57	49	57	51	55	53	54	55	51	55	51	78		41
																		17	50	55	53	51	47	59	50	51	48	50	54	50	91	44	53	56
18	86	55	56	67	56	66	69	76	69	76	72	74	50	54	54	53	49
																		19	54	55	54	56	51	60	55	57	55	57	57	54	52	54	86	78	52
20	54	58	56	57	48	54	52	53	50	52	51	52	56	50	75	86	53
																		21	52	59	58	58	52	58	54	56	53	54	59	54	54	53	87	79	54
22	38	41	42	41	37	39	38	38	37	37	39	39	46	38	47	53	45
																		23	45	54	53	49	50	49	46	46	46	45	47	45	55	43	64	70	60
24	54	51	52	53	49	51	48	51	50	51	49	51	50	53	70	75	49
																		25	53	50	53	57	54	57	50	57	53	56	54	50	47	50	79	69	48
26	54	57	56	57	50	52	52	55	51	54	53	53	53	51	74	82	52
																		27	55	52	55	59	52	57	54	54	53	52	58	54	51	52	82	72	51
28	51	55	57	53	51	51	51	52	49	52	50	51	50	49	67	73	50

	18	19	20	21	22	23	24	25	26	27	28
												1	77	39	38	38	31	35	38	35	37	38	37
2	39	41	40	41	32	39	36	36	39	37	37
												3	42	41	39	41	33	39	36	36	37	40	37
4	46	39	38	41	30	35	37	36	37	38	35
												5	39	36	37	40	30	36	35	35	37	36	38
6	47	42	39	43	31	38	36	36	37	40	35
												7	53	41	37	39	30	33	36	34	34	37	34
8	59	40	38	41	31	34	37	39	37	38	36
												9	53	38	36	38	30	33	36	35	35	38	33
10	59	39	38	39	30	32	36	36	37	37	36
												11	53	39	37	40	31	34	38	36	35	37	34
12	57	38	34	37	29	34	34	36	35	35	34
												13	38	39	39	39	29	36	37	36	37	35	36
14	34	39	36	37	30	34	37	36	37	38	35

15	39	76	60	75	41	51	55	65	57	69	50
												16	37	61	67	62	44	58	59	52	62	56	54
17	41	38	39	39	31	39	38	36	38	34	38
												18		40	36	39	31	37	35	35	36	37	36
19	55		59	87	43	48	53	72	56	79	50
												20	54	74		60	61	58	79	51	86	56	76
21	55	92	76		40	51	54	75	55	82	50
												22	40	49	64	48		53	52	35	56	41	56
23	44	63	70	65	63		52	43	55	48	54
												24	51	72	84	70	55	63		49	75	51	67
25	55	84	66	85	44	56	65		48	70	43
												26	54	71	92	75	60	67	83	65		53	90
27	54	87	71	87	48	61	68	83	69		48
												28	51	65	84	69	61	65	77	59	93	64

实施例4：鉴定在实施本发明方法中有用的多肽序列中所包含的结构域

蛋白质家族、结构域和位点的集成资源(InterPro)数据库是针对基于文本及基于序列的搜索法的常用特征标识数据库的集成界面。InterPro数据库合并了这些数据库，所述数据库使用不同的方法学及有关充分表征的蛋白质的程度各异的生物学信息以获得蛋白质特征标识(proteinsignatures)。合作数据库包括SWISS-PROT、PROSITE、TrEMBL、PRINTS、ProDom和Pfam、Smart和TIGRFAM。Pfam是覆盖许多常见蛋白质结构域和家族的多重序列比对结果和隐匿马尔科夫模型(HMM)的大集合。Pfam在英国Sanger研究所服务器上维护。Interpro在英国欧洲生物信息学研究所维护。

1.CDKB-RKA多肽

在表C1中给出如SEQ ID NO：320所代表的多肽序列的InterPro扫描(Interpro数据库，版本31.0)结果。

表C1：SEQ ID NO：320所代表的全长多肽序列的InterPro扫描结果(主登录号)

2.UPA20-样多肽

在表C2中给出如SEQ ID NO：407所代表的多肽序列的InterPro扫描(Interpro数据库，版本30.0)结果。

表C2：SEQ ID NO：407所代表的多肽序列的InterPro扫描结果(主登录号)

实施例5：实施本发明方法有用的多肽序列的拓扑结构预测

TargetP1.1预测真核蛋白的亚细胞定位。基于任何N端前序列：叶绿体转运肽(cTP)、线粒体靶向肽(mTP)或分泌途径信号肽(SP)的预测存在进行定位指派。作为最终预测基础的评分并不真正是概率，并且它们不是必须相加在一起。然而，根据TargetP，具有最高评分的定位是最可能的，并且评分之间的关系(可靠性级别)可以指示该预测具有多大确定性。可靠性级别(RC)范围从1至5，其中1表示最可靠的预测。在丹麦技术大学(Technical University of Denmark)的服务器上维护TargetP。

对于预测含有N端前序列的序列而言，也可以预测潜在的切割位点。

可以选择许多参数，如生物组别(非植物或植物)、截短值集合(无、预定义的截短值集合或用户指定的截短值集合)和切割位点预测的计算(是或否)。

许多的其他算法可以用来执行此类分析，它们包括：

·在丹麦技术大学服务器上维护的ChloroP1.1；

·在澳大利亚布里斯班昆士兰大学分子生物科学研究所的服务器上维护的Protein Prowler亚细胞定位预测者1.2版；

·在加拿大阿伯特省埃德蒙顿市阿尔伯塔大学的服务器上维护的PENCE蛋白组分析专家PA-GOSUB2.5；

·在丹麦技术大学服务器上维护的TMHMM：

·PSORT(URL：psort.org)

·PLOC(Park和Kanehisa，Bioinformatics，19，1656-1663，2003)。

实施例6：与用于实施本发明方法的多肽序列相关的功能测定法

1.CDKB-RKA多肽

根据本发明，提供CDKB-RKA多肽用于本发明的方法中的用途，其中所述多肽与(未修饰或全长)CDKB多肽相比具有降低的催化激酶活性，或优选缺少催化激酶活性。本领域技术人员已知，有许多方法测量激酶活性。

在一实施方案中，如本文定义的突变的或截短的CDBK多肽的催化激酶活性可通过激酶测定法测定，并与对应未修饰的CDKB多肽的激酶活性相当。

例如，可按Cockcroft等人，2000(Nature，405(6786)，575-579)所述实施激酶测定法。该测定法涉及在液氮中研磨植物材料并在合适的缓冲液(如1ml的50mM Tris-HCl pH7.5，75mM NaCl，15mM EGTA，15mMMgCl₂，1mM二硫苏糖醇，0.1％Tween20，1X complete Tm蛋白酶抑制剂，1mM NaF，0.2mM NaV，2mM焦磷酸钠，60mMβ-磷酸甘油)中再混旋。随后将该混悬液均匀化4X30秒，均匀化之间在冰上30秒。随后将该上清液用20微升蛋白A琼脂糖凝胶(50％混悬液)在4℃下孵育30分钟。将该上清液用1微升抗血清(针对CDC2b蛋白的羧基末端肽，如Setiady等人，1996(Plant Cell Physiology37(3)，369-376所述)在冰上孵育2小时，随后加入20微升蛋白A琼脂糖凝胶并将样品在4℃下旋转1小时。用激酶缓冲液(50mM Tris-HCl pH7.5，100mM NaCl，5mM EGTA，1mM DTT)冲洗样品2次，在15微升测定缓冲液(50mM Tris-HCl pH7.5，100mMNaCl，5mM EGTA，10mM MgCl₂，1mM DTT，1mM NaF，0.2mMNa-Vanadate，2mM焦磷酸钠，25mMβ-磷酸甘油，0.5mM组蛋白H1作为基质，0.5mM PMSF，和74kBq[伽玛³²p ATP(>185TBq mmol-1)每15微升反应物)中再混旋，并在室温下孵育30分钟。可通过添加凝胶加样缓冲液停止该反应，并且可使用SDS-PAGE分析样品并使用磷酸成像仪(分子动力学)定量样品。

实施例7：克隆本发明方法中使用的核酸序列

1.WAK-样多肽

使用定制的稻幼苗cDNA文库作为模板，通过PCR扩增核酸序列。使用在50μl PCR混合物中的200ng模板，在标准条件下使用市售的具有校读功能的Taq DNA聚合酶进行PCR。所用的引物是prm16798(SEQ IDNO：307；有义)：5’-ggggacaagtttgtacaaaaaagcaggcttaaacaatgaccaagcttctccac-3’和prm16761(SEQ ID NO：308；反向，互补的)：5’-ggggaccactttgtacaagaaagctgggttcattatttgatgagctgtagctttc-3’，其包括用于Gateway重组的AttB位点。还使用标准方法纯化扩增的PCR片段。随后进行Gateway方法的第一步骤，即BP反应，在此期间PCR片段与pDONR201质粒在体内重组以产生根据Gateway术语学的“进入克隆”，pWAK-样。从Invitrogen购买质粒pDONR201，其中所述质粒pDONR201是作为

技术的一部分。

包含SEQ ID NO：1的进入克隆随后在LR反应中与用于稻转化的目的载体一起使用。这种载体在T-DNA边界内部含有以下作为功能性元件：植物选择标记、筛选标记表达盒和意在与已经克隆于这个进入克隆中的目的核酸序列发生LR体内重组的Gateway盒。用于组成型表达的稻GOS2启动子(SEQ ID NO：306)位于这个Gateway盒上游。

在LR重组步骤后，将所得的表达载体pGOS2：：WAK-样(图1)根据本领域熟知的方法转化至农杆菌菌株LBA4044内。

以同样方法制备包含SEQ ID NO：3的表达载体：使用引物prm16656(SEQ ID NO：309；有义)：5’-atggcaaagatgatgcttta-3'和prm16657(SEQ IDNO：310；反向，互补的)：5’-ggggaccactttgtacaagaaagctgggttcattactgtcttatcttcg caagtttt-3’。

此外，还以同样方法制备包含SEQ ID NO：5的表达载体：使用引物prm16710(SEQ ID NO：311；有义)：5’-ggggacaagtttgtacaaaaaagcaggcttaaacaatgagcctcttcgatggattac-3’和prm16711(SEQ ID NO：312；反向，互补的)：5’-ggggaccactttgtacaagaaagctgggttcattattgcttttgtatgtcttttttcca-3’；制备包含SEQ ID NO：7的表达载体：使用引物prm16603(SEQ ID NO：313；有义)：5’-ggggacaagtttgtacaaaaaagcaggcttaaaeaatgggacctgtgctgctgt-3’和prm16604(SEQ ID NO：314；反向，互补的)：5’-ggggaccactttgtacaagaaagctgggttcatta ttttctttgcatatgtctcctcc-3’；制备包含SEQ ID NO：9的表达载体：使用引物prm16118(SEQ ID NO：315；有义)：5’-ggggacaagtttgtacaaaaaagcaggcttaaacaatgtctccccaccgag-3’和prm16119(SEQ ID NO：316；反向，互补的)：5’-ggggaccactttgtacaagaaagctgggtcategatcatctcgcaa-3’。

2.CDKB-RKA多肽

包含SEQ ID NO：317的进入克隆在LR反应中与用于稻转化的目的载体一起使用。这种载体在T-DNA边界内部含有以下作为功能性元件：植物选择标记、筛选标记表达盒和意在与已经克隆于这个进入克隆中的目的核酸序列发生LR体内重组的Gateway盒。用于组成型表达的稻高移动组蛋白(HMGP)启动子(SEQ ID NO：405)位于这个Gateway盒上游。在LR重组步骤后，将所得的表达载体：：CDKB-RKA(图4)根据本领域熟知的方法转化至农杆菌菌株LBA4044内。

SEQ ID NO：317代表的核酸序列可通过使用定制的拟南芥幼苗cDNA文库(即，拟南芥生态型An-1)作为模板，应用一般的PCR技术容易地获得。使用在50μlPCR混合物中的200ng模板，在标准条件下使用市售的具有校读功能的Taq DNA聚合酶进行PCR。

通过在SEQ ID NO：320的位点388的核苷酸置换(此处A由T置换(由此终止密码子置换Lys))获得由SEQ ID NO：318代表并由SEQ ID NO：317编码的CDKB-RKA多肽。基于此信息，技术人员可设计正向和反向引物用于在PCR混合物中使用。上文所指的点突变可包括在反向引物的任意位置，其被设计为具有与正向引物相似的解链温度。可制作多个置换，例如制作除TAA(TAG,TGA)外的其他终止密码子。正向和反向引物都包括用于Gateway重组的AttB位点。还使用标准方法纯化扩增的PCR片段。随后进行Gateway方法的第一步骤，即BP反应，在此期间PCR片段与pDONR201质粒在体内重组以产生根据Gateway术语学的“进入克隆”，pCDKB-RKA。从Invitrogen购买质粒pDONR201，其中所述质粒pDONR201是作为

技术的一部分。

3.UPA20-样多肽

3.1SEQ ID NO406

使用定制的毛果杨幼苗cDNA文库作为模板，通过PCR扩增所述核酸序列。使用在50μlPCR混合物中的200ng模板，在标准条件下使用市售的具有校读功能的Taq DNA聚合酶进行PCR。所用的引物是prm15499(SEQ ID NO：548；有义，起始密码子黑体)：5’-ggggacaagtttgtacaaaaaagcaggcttaaacaatggcaggcttttcatatcaa-3’和prm15500(SEQ ID NO：549；反向，互补的)：5’-ggggaccactttgtacaagaaagctgggtggcagcgcttggtatatttatt-3’，其中所述引物包括用于Gateway重组的AttB位点。还使用标准方法纯化扩增的PCR片段。随后进行Gateway方法的第一步骤，即BP反应，在此期间PCR片段与pDONR201质粒在体内重组以产生根据Gateway术语学的“进入克隆”，pUP20A。从Invitrogen购买质粒pDONR201，其中所述质粒pDONR201是作为

技术的一部分。

包含SEQ ID NO：406的进入克隆随后在LR反应中与用于稻转化的目的载体一起使用。这种载体在T-DNA边界内部含有以下作为功能性元件：植物选择标记、筛选标记表达盒和意在与已经克隆于这个进入克隆中的目的核酸序列发生LR体内重组的Gateway盒。用于组成型表达的稻GOS2启动子(SEQ ID NO：545)位于这个Gateway盒上游。

在LR重组步骤后，将所得的表达载体pGOS2：：UP20A样(图8)根据本领域熟知的方法转化至农杆菌菌株LBA4044中。

3.2SEQ ID NO410

使用定制的拟南芥幼苗eDNA文库作为模板，通过PCR扩增所述核酸序列。使用在50μl PCR混合物中的200ng模板，在标准条件下使用市售的具有校读功能的Taq DNA聚合酶进行PCR。所用的引物是prm15497(SEQ ID NO：550；有义，起始密码子黑体)：5’-ggggacaagtttgtacaaaaaagcaggcttaaacaatggcaactttctcttatttc-3’和prm15498(SEQ ID NO：551；反向，互补的)：5’-ggggaccactttgtacaagaaagctgggttttgtgtcgacatgtaatttt-3’，其中所述引物包括用于Gateway重组的AttB位点。还使用标准方法纯化扩增的PCR片段。随后进行Gateway方法的第一步骤，即BP反应，在此期间PCR片段与pDONR201质粒在体内重组以产生根据Gateway术语学的“进入克隆”，pUP20A。从Invitrogen购买质粒pDONR201，其中所述质粒pDONR201是作为

技术的一部分。

包含SEQ ID NO：410的进入克隆随后在LR反应中与用于稻转化的目的载体一起使用。这种载体在T-DNA边界内部含有以下作为功能性元件：植物选择标记、筛选标记表达盒和意在与已经克隆于这个进入克隆中的目的核酸序列发生LR体内重组的Gateway盒。用于组成型表达的稻GOS2启动子(SEQ ID NO：545)位于这个Gateway盒上游。

在LR重组步骤后，将所得的表达载体pGOS2：：UP20A样(类似如图8所示)根据本领域熟知的方法转化至农杆菌菌株LBA4044中。

3.3SEQ ID NO440

使用定制的毛果杨幼苗cDNA文库作为模板，通过PCR扩增所述核酸序列。使用在50μl PCR混合物中的200ng模板，在标准条件下使用市售的具有校读功能的Taq DNA聚合酶进行PCR。所用的引物是prm15501(SEQ ID NO： 552；有义，起始密码子黑体)：5’-ggggacaagtttgtacaaaaaagcaggcttaaacaatggcagccttttcgtatc-3’和prm15502(SEQ ID NO：553；反向，互补的)：5’-ggggaccactttgtacaagaaagctgggtagggcagctcttggtatctat-3’，其中所述引物包括用于Gateway重组的AttB位点。还使用标准方法纯化扩增的PCR片段。随后进行Gateway方法的第一步骤，即BP反应，在此期间PCR片段与pDONR201质粒在体内重组以产生根据Gateway术语学的“进入克隆’’，pUP20A。从Invitrogen购买质粒pDONR201，其中所述质粒pDONR201是作为

技术的一部分。

包含SEQ ID NO：440的进入克隆随后在LR反应中与用于稻转化的目的载体一起使用。这种载体在T-DNA边界内部含有以下作为功能性元件：植物选择标记、筛选标记表达盒和意在与已经克隆于这个进入克隆中的目的核酸序列发生LR体内重组的Gateway盒。用于组成型表达的稻GOS2启动子(SEQ ID NO：545)位于这个Gateway盒上游。

在LR重组步骤后，将所得的表达载体pGOS2：：UP20A样(类似如图8所示、)根据本领域熟知的方法转化至农杆菌菌株LBA4044中。

3.4SEQ ID NO 508

使用定制的稻幼苗cDNA文库作为模板，通过PCR扩增所述核酸序列。使用在50μl PCR混合物中的200ng模板，在标准条件下使用市售的具有校读功能的Taq DNA聚合酶进行PCR。所用的引物是prml4919(SEQ ID NO： 554；有义，起始密码子黑体)：5’-ggggacaagtttgtacaaaaaagcaggcttaaacaatgaatgagaaggacgcca-3’和prm14920(SEQ ID NO： 555；反向，互补的)：5’-ggggaccactttgtacaagaaagctgggtcttgcttcagttgtggaatca-3’，其中所述引物包括用于Gateway重组的AttB位点。还使用标准方法纯化扩增的PCR片段。随后进行Gateway方法的第一步骤，即BP反应，在此期间PCR片段与pDONR201质粒在体内重组以产生根据Gateway术语学的“进入克隆”，pUP20A。从Invitrogen购买质粒pDONR201，其中所述质粒pDONR201是作为

技术的一部分。

包含SEQ ID NO：508的进入克隆随后在LR反应中与用于稻转化的目的载体一起使用。这种载体在T-DNA边界内部含有以下作为功能性元件：植物选择标记、筛选标记表达盒和意在与已经克隆于这个进入克隆中的目的核酸序列发生LR体内重组的Gateway盒。用于组成型表达的稻GOS2启动子(SEQ ID NO：545)位于这个Gateway盒上游。

实施例8：植物转化

稻转化

含有表达载体的农杆菌用来转化稻植物。将粳稻栽培品种Nipponbare的成熟干燥种子脱壳。通过在70％乙醇中孵育1分钟，随后在次氯酸钠溶液中孵育30分钟至60分钟，优选30分钟(取决于污染等级)，随后用无菌蒸馏水洗涤3至6次，优选4次。消毒的种子随后在含有2,4-D的培养基(愈伤组织诱导培养基)上萌发。在光照下孵育6日后，将盾片衍生的愈伤组织用如下文所述的农杆菌转化。

将含有所述表达载体的农杆菌菌株LBA4404用于共培育。将农杆菌接种在含有适宜抗生素的AB培养基上并在28℃培养3日。随后将细菌收集并且在液体共培育培养基中悬浮至密度(OD₆₀₀)约1。将愈伤组织浸入该悬液1至15分钟。随后将愈伤组织在滤纸上吸干并转移至固化的共培育培养基上并且在黑暗中于25℃孵育3日。在洗去农杆菌后，将愈伤组织在光照下在含有2,4-D的培养基上于28℃-32℃在选择剂存在下培育10至14日(indica的生长时间：3周)。在此时段期间，形成迅速生长的抗性愈伤组织。在转移这种材料至再生培养基后，胚发生潜能释放并且幼苗在随后的4至6周内发育。将苗从愈伤组织切下并且在含有植物生长素的培养基上孵育2至3周，其中将苗从所述培养基转移至土壤。硬化的苗在温室中在高湿度和短日照下培育。

稻栽培品种indica的转化也可以根据技术人员熟知的技术以上文给出的相似方式进行。

对于一个构建体，产生35至90个独立的T0稻转化体。将原代转化体从组织培养箱转移至温室。在定量PCR分析以验证T-DNA***物的拷贝数后，仅保留对选择剂表现耐受性的单拷贝转基因植物用于收获T1种子。种子随后在移植后3至5个月收获。该方法以超过50％的比例产生单基因座转化体(Aldemita和Hodges1996，Chan等人，1993，Hiei等人，1994)。

实施例9：其他作物的转化

玉蜀黍转化

玉米(Zea mays)的转化根据对Ishida等人，(1996)，Nature Biotech14(6)：745-50)所述方法的修改形式进行。在玉蜀黍中，转化是基因型依赖的并且仅特定基因型可操作用于转化和再生。近交系A188(明尼苏达大学)或以A188作为亲本的杂种是用于转化的供体材料的良好来源，不过其他基因型也可以成功地使用。谷穗从授粉后大约11日(DAP)的玉蜀黍植物收获，此时不成熟的胚的长度是大约1至1.2mm。将不成熟的胚与含有表达载体的根癌农杆菌共培育，并且通过器官发生回收转基因植物。将切下的胚在愈伤组织诱导培养基上、随后在玉米再生培养基上培育，其中所述的再生培养基含有选择剂(例如咪唑啉酮，但可以使用多种选择标记)。培养平板在25℃于光照下培养2-3周，或直至苗发育。将绿色苗从每个胚转移至玉米生根培养基并在25℃培养2-3周，直至根发育。将生根的苗移栽至温室中的土壤。从表现选择剂耐受性并且含有单拷贝T-DNA***物的植物中产生T1种子。

小麦转化

小麦的转化用Ishida等人(1996)Nature Biotech14(6)：745-50描述的方法进行。通常在转化中使用(从墨西哥CIMMYT可获得的)栽培品种Bobwhite。不成熟的胚与含有所述表达载体的根癌农杆菌共培育，并且转基因植物通过器官发生而恢复。与农杆菌温育后，将胚在愈伤组织诱导培养基上、随后在再生培养基上体外培育，其中所述的再生培养基含有选择剂(例如咪唑啉酮，但可以使用多种选择标记)。培养平板在25℃于光照下培养2-3周，或直至苗发育。将绿色苗从每个胚转移至生根培养基并在25℃培养2-3周，直至根发育。将生根的苗移栽至温室中的土壤。从表现选择剂耐受性并且含有单拷贝T-DNA***物的植物中产生T1种子。

大豆转化

根据Texas A&M美国专利5,164,310中描述的改良方法转化大豆。几个商业大豆品种对于通过这种方法的转化是可行的。栽培品种Jack(从Illinois种子基金会可获得)通常用于转化。对大豆种子消毒以便体外播种。从7日龄幼苗中切下下胚轴、胚根和一片子叶。进一步培育上胚轴和余下的子叶以发育腋生结节。将这些腋生结节切下并与含有表达载体的根癌农杆菌孵育。在共培育处理之后，将外植体洗涤并转移至选择培养基。将再生的苗切下并置于苗伸长培养基上。将长度不超过1cm的苗置于生根培养基上直至根发育。将生根的苗移栽至温室中的土壤。从表现选择剂耐受性并且含有单拷贝T-DNA***物的植物中产生T1种子。

油菜／卡诺拉转化

使用5-6日龄年幼幼苗的子叶柄和下胚轴作为组织培养用外植体并且根据Babic等人(1998，Plant Cell Rep17：183-188)进行转化。商业栽培品种Westar(Agriculture Canada)是用于转化的标准品种，不过也可以使用其他品种。对卡诺拉种子作表面消毒以便体外播种。从体外幼苗中切下具有附着子叶的子叶柄外植体，并以(含有表达载体的)农杆菌通过叶柄外植体的切口端浸入细菌混悬液而接种。随后将外植体在23℃，16小时光照下在含有3mg／lBAP、3％蔗糖、0.7％植物琼脂的MSBAP-3培养基上培养2日。在与农杆菌共培育2日后，将叶柄外植体转移至含有的3mg／lBAP、头孢噻肟、羧苄青霉素或特美汀(300mg／l)的MSBAP-3培养基上持续7日，并且随后在含头孢噻肟、羧苄青霉素或特美汀和选择剂的MSBAP-3培养基上培养，直至苗再生。当苗具有5-10mm长度时，将苗切下并且转移至苗伸长培养基(含0.5mg／lBAP的MSBAP-0.5)。将长度大约2cm的苗转移至用于根诱导的生根培养基(MS0)。将生根的苗移栽至温室中的土壤。从表现选择剂耐受性并且含有单拷贝T-DNA***物的植物中产生T1种子。

苜蓿转化

使用(McKersie等，1999Plant Physiol119：839-847)的方法加以转化苜蓿的再生性克隆。苜蓿的再生和转化是基因型依赖性的并且因而需要再生性植物。已经描述了获得再生性植物的方法。例如，这些再生性植物可以选自栽培品种Rangelander(Agrieulture Canada)或如Brown DCW与AAtanassov(1985.Plant Cell Tissue Culture4：111-112)描述的任何其它商业苜蓿品种。备选地，已经选择RA3品种(威斯康星大学)用于组织培养(Walker等人，1978Am J Bot65：654-659)。将叶柄外植体与含有表达载体的根癌农杆菌C58C1pMP90(McKersie等人，1999Plant Physiol119：839-847)或LBA4404的过夜培养物共培育。将外植体在黑暗下于含有288mg/L Pro、53mg／L硫代脯氨酸、4.35g／L K2SO4和100μm乙酰丁香酮的SH诱导培养基上共培育3日。将外植体在半浓度的Murashige-Skoog培养基(Murashige和Skoog，1962)中洗涤并且铺种在不含乙酰丁香酮而含有抑制农杆菌生长的合适选择剂和合适抗生素的相同SH诱导培养基上。几周后，将体细胞胚转移至不合生长调节剂、不含抗生素和含有50g／L蔗糖的BOi2Y发育培养基。体细胞胚随后在半浓度的Murashige-Skoog培养基上萌发。将生根的幼苗移植入盆钵并且在温室中培育。从表现选择剂耐受性并且含有单拷贝T-DNA***物的植物中产生T1种子。

棉花转化

使用根癌农杆菌，根据US5,159,135中所述的方法转化棉花。将棉花种子在3％次氯酸钠溶液中表面消毒20分钟并且在含500μg／ml头孢噻肟的蒸馏水中洗涤。将种子随后转移至含有50μg／ml苯菌灵的SH培养基用于萌发。将4至6日龄幼苗的下胚轴取下，切成0.5cm小片并且置于0.8％琼脂上。农杆菌悬液(每毫升大约10⁸个细胞，从含有用目的基因和合适选择标记转化的过夜培养物中稀释)用于接种下胚轴外植体。在室温和光照下3日后，将组织转移至固体培养基(1.6g／l脱乙酰吉兰糖胶)，所述固体培养基含有带维生素B5的Murashige和Skoog盐(Gamborg等人，Exp.Cell Res.50：151-158(1968))、0.1mg／l2,4-D、0.1mg／l6-呋喃甲基氨基嘌呤和750μg／ml MgCL₂以及杀死残余细菌的50至100μg／ml头孢噻肟和400-500μg／ml羧苄青霉素。各个细胞系在2至3个月(每隔4至6周传代培养)后分离并且在用于组织增殖的选择培养基上进一步培育(30℃，16小时光周期)。将转化的组织随后在非选择培养基上进一步培育持续2至3个月以产生体细胞胚。将至少4mm长度的外观健康胚转移至含有细蛭石中SH培养基的管中，所述SH培养基补充有0.1mg／l吲哚乙酸、6-呋喃甲基氨基嘌嘌呤和赤霉酸。在30℃以16小时光周期培育胚，并且将处于2至3叶期的小植物转移至具有蛭石和养分的盆钵。使植物硬化并随后移至温室以进一步培育。

糖料甜菜转化

将糖料甜菜(甜菜(Beta vulgaris L.))的种子在70％乙醇中消毒1分钟，随后在20％次氯酸盐漂白粉(例如

常规漂白粉(从Clorox，1221Broadway，Oakland，CA94612，USA可商业获得))中摇动20分钟。将种子用无菌水漂洗并且风干，随后铺种到萌发培养基(基于Murashige和Skoog(MS)的培养基(Murashige，T.和Skoog，1962.Physiol.Plant，第15卷，473-497)上，所述培养基包含B5维生素(Gamborg等人；Exp.Cell Res.，第50卷，151-8)，补充有10g／l蔗糖和0.8％琼脂)。根据Hussey和Hepher，将下胚轴组织基本上用于苗培养的启动(Hussey，G.和Hepher，A.，1978.Annals of Botany，42，477-9)并且在pH5.8的基于MS的培养基上在23-25℃以16小时光周期维持，所述培养基补充有30g／l蔗糖外加0.25mg／L苄氨基嘌呤和0.75％琼脂。在转化实验中使用携带双元质粒的根癌农杆菌菌株，所述双元质粒载有选择标记基因例如nptII。在转化之前1日，将包含抗生素的液体LB培养物在摇床上培育(28℃，150转／分钟)直至600nm处的光密度(O.D.)达到约1。将过夜培育的细菌培养物离心并且重悬于pH5.5的包含乙酰丁香酮的接种培养基(O.D.约1)中。将苗基组织切成小片(大约1.0cm x1.0cm x2.0mm)。将组织浸入细菌液体接种培养基中30秒。通过滤纸吸干除去多余的液体。在含有30g／l蔗糖的基于MS的培养基上共培育24-72小时，随后是一个无选择时期，包括在含有30g／l蔗糖的基于MS的培养基上孵育，所述培养基含有诱导苗发育的1mg／L BAP和用于消除农杆菌的头孢噻肟。在3-10日后，将外植体转移至含有例如卡那霉素或G418(依赖基因型，50-100mg／L)的相似选择培养基。将组织每2-3周转移至新鲜培养基以维持选择压力。非常快的苗启动(在3-4日后)表示现存分生组织的再生，而非新发育的转基因分生组织的器官发生。在几轮传代培养后，将小苗转移至含有5mg／L NAA和卡那霉素或G418的根诱导培养基。采取额外的步骤以减少产生嵌合(部分转基因的)转化植物的可能性。来自再生苗的组织样品用于DNA分析。用于糖料甜菜的其他转化方法是本领域已知的，例如Linsey和Gallois的那些方法(Linsey，K.和Gallois，P.，1990.Journal of Experimental Botany；第41卷，第226期；529-36)或在作为WO9623891A公开的国际申请中所公布的方法。

甘蔗转化

从田间培育的6月龄甘蔗植物分离纺锤体(Spindle)(见Arencibia等人，1998.Transgenic Research，第7卷，213-22；Enriquez-Obregon等人，1998.Planta，第206卷，20-27)。通过在20％次氯酸盐漂白粉(例如

常规漂白粉(从Clorox，1221Broadway，Oakland，CA94612，USA可商业获得))中浸泡，将材料消毒。将约0.5cm的横断切片以顶朝上的方向置于培养基上。将植物材料在基于MS(Murashige，T.和Skoog，1962.Physiol.Plant，第15卷，473-497)的培养基上在23℃于黑暗下培育4周，所述培养基包含B5维生素(Gamborg，O.等人，1968，Exp.Cell Res，第50卷，151-8)，补充有20g／l蔗糖、500mg／L酪蛋白水解物、0.8％琼脂和5mg／L2,4-D。在4周后，将培养物转移到相同的新鲜培养基上。在转化实验中使用携带双元质粒的根癌农杆菌菌株，所述双元质粒载有选择标记基因，例如hpt。在转化之前1日，将包含抗生素的液体LB培养物在摇床上培育(28℃，150转／分钟)直至600nm处的光密度(O.D.)达到约0.6。将过夜培育的细菌培养物离心并且重悬于pH5.5的包含乙酰丁香酮的基于MS的接种培养基(O.D.约0.4)中。基于形态学特征如致密结构和黄颜色，将甘蔗胚发生性愈伤组织片(2-4mm)分离并且在层流罩(floW hood)干燥20分钟，随后浸入细菌接种液体培养基中10-20分钟。通过滤纸吸干除去多余的液体。于黑暗下在滤纸上共培育3-5日，其中所述滤纸置于包含B5维生素的含有1mg／L2,4-D的基于MS的培养基顶部。在共培育后，愈伤组织用无菌水洗涤，接着是在相似培养基上的一个无选择培养时期，所述相似培养基含有500mg/l头孢噻肟以消除剩余的农杆菌细胞。在3-10日后，将外植体转移至包含B5维生素的基于MS的选择培养基持续另外3周，所述选择培养基含有1mg／L2,4-D，载有25mg／L潮霉素(依赖于基因型)。全部处理在23℃在黑暗条件下进行。抗性愈伤组织进一步在缺少2,4-D的包含1mg／L BA和25mg／L潮霉素的培养基上以16小时光周期培育，导致苗结构的发育。将苗分离并且在选择性生根培养基(基于MS，包含20g／l蔗糖、20mg／L潮霉素和500mg／L头孢噻肟)上培育。来自再生苗的组织样品用于DNA分析。用于甘蔗的其他转化方法是本领域已知的，例如来自作为WO2010／151634A公布的国际申请和授权的欧洲专利EP1831378。

实施例10：表型评价方法

10.1评价建立

产生35至90个独立的T0稻转化体。将原代转化体从组织培养室转移至温室以培育并且收获T1种子。留下6个事件，其中所述事件的T1子代以3：1比例对所述转基因的存在／不存在分离。对于这些事件中的每一个，通过监测目视标记表达选出大约10株含有该转基因的T1幼苗(杂合子和纯合子)和大约10株缺少该转基因的T1幼苗(失效合子)。以随机位置并排培育转基因植物和相应的失效合子。温室条件是短日照(12小时光照)，光照下28℃和黑暗下22℃和70％相对湿度。在非胁迫条件下培育的植物以规律的间隔期浇水，以确保水和养分不是限制性的并确保满足植物完整生长和发育的需要，除非这些植物用于胁迫筛选中。

使植物从播种期至成熟期数次通过数字成像室。在每个时间点上，从至少6个不同角度拍摄每株植物的数字图像(2048x1536像素，1600万颜色)。

按照如对T1世代相同的评价方法，在T2世代中可进一步评价T1事件，例如每个事件采用更少的事件和／或采用多个体。

干旱筛选

将T1或T2植物在盆栽土壤中在正常条件下培育直至它们达到抽穗期。随后将它们转移至不予灌溉的“干燥”地段。将土壤水分探针***随机选择的盆钵内，以监测土壤水含量(SWC)。当SWC下降低于某些阈值时，自动地对所述植物连续地再灌溉直至再次达到正常水平。随后将植物再次转移至正常条件。剩余的培养(植物成熟、种子收获)与不在非生物胁迫下培育的植物相同条件。如正常条件下生长所详述那样，记录生长和产量参数。

氮使用效率筛选

将T1或T2植物在盆栽土壤中在除营养液之外的正常条件下培育。从移植至成熟期间用含有降低的、通常7至8倍之间更少的氮(N)含量的特定营养液浇灌盆钵。剩余的培养(植物成熟、种子收获)与不在非生物胁迫下培育的植物相同。如正常条件下生长所详述那样，记录生长和产量参数。

盐胁迫筛选

将T1或T2植物在由椰子纤维和焙烤粘土颗粒(Argex)(3：1比率)构成的基质上培育。在温室中移植小植物后，在头两周期间使用正常营养液。在头两周后，添加25mM盐(NaCl)至所述营养液，直至收获植物。如正常条件下生长所详述那样，记录生长和产量参数。

10.2统计分析：F-检验

使用两因素ANOVA(方差分析)作为总体评价植物表型特征的统计模型。对用本发明基因转化的全部事件的全部植物的全部所测量参数实施F检验。实施F检验以检查该基因对全部转化事件的影响并验证该基因的整体作用(又称作总体基因作用)。对于F检验而言，真实总体基因作用的显著性的阈值设在5％概率水平上。显著性F检验值指出基因作用，这意味不仅是仅基因的存在或位置才造成表型上的差异。

10.3测量的参数

使植物从播种期至成熟期数次通过数字成像室。在每个时间点上，从至少6个不同角度拍摄每株植物的数字图像(2048x1536像素，1600万颜色)，如WO2010／031780中所述。将这些量值用来测定不同的参数。

生物量相关的参数测量

植物地上面积(或叶生物量)通过计数来自植物地上部分的数字图像上与背景区别的像素总数而确定。这个值对相同时间点上从不同角度拍摄的画面进行平均化并且通过校正过程换算成以平方mm表述的物理表面值(physical surface value)。实验显示以这种方式测量的地上部分植物面积与地上植物部分的生物量相关。地上部分面积是在植物已经实现其最大叶生物量的时间点上所测量的面积。

根生物量的增加表述为根总生物量增加(度量为在植物生命期间观察到的最大根生物量)；或表述为根／冠(根／苗)指数增加，度量为根和苗的活跃生长时期中根质量与苗质量之间的比例。换句话说，将根／冠指数定义为在根和苗活跃生长时期中根生长速度对苗生长速度的比率。可以使用如WO2006／029987中所述的方法确定根生物量。

与发育时间相关的参数

早期生长势是萌发后3周的植物地上面积。通过计数来自植物地上部分中与背景区别的像素总数确定早期生长势。这个值对相同时间点上从不同角度拍摄的画面进行平均化并且通过校正过程换算成以平方mm表述的物理表面值。

AreaEmer是快速早期发育的指标，当与对照植物相比时这个值下降。它是植物需要产生30％最终生物量的时间和需要产生90％最终生物量的时间之间的比率(以％表述)。

可以使用如WO2007／093444中所述的方法确定植物的“至开花时间”或“开花时间”。

种子相关的参数测量值

将成熟的原发花序收获、计数、装袋、加条形码标记并且随后在干燥箱内于37℃干燥3日。随后将花序脱粒，并且收集和计数全部种子。种子通常由干燥外部覆盖物-谷壳覆盖。使用鼓风装置，将充实粒(本文也称为充实小花)与空粒分开。弃去空粒并且再次计数剩余部分。在分析天平上称重充实粒。

通过计数分离步骤后仍留下的充实粒数目确定种子总数。通过称量从一株植物收获的全部充实粒测量种子总重量。

通过计数从一株植物收获的籽粒(无论是否充实)数确定每株植物的种子(或小花)总数。

从计数的种子数及它们的总重量外推出千粒核重(TKW)。

本发明中的收获指数(HI)定义为种子总重量与地上部分面积(mm²)之间的比率，乘以系数10⁶。

如本发明中定义的每花序花数是种子总数与成熟原发花序数目之间的比率。

如本发明中定义的“种子充实率”或“种子填充率”是充实种子(即含有种子的小花)对种子总数(即小花总数)的比例(表述为％)。换句话讲，种子充实率是填充有种子的小花的百分比。

实施例10：转基因植物的表型评价结果

1.WAK-样多肽

下文中给出了在非胁迫条件下评价转基因稻植物的结果，所述转基因稻植物表达WAK-样多肽。转基因植物的产生细节见前面实施例。

下文中给出了在非胁迫条件下评价T1世代且表达包含SEQ ID NO：1的核酸的转基因稻植物的结果。

观察到种子充实率增加至少5％和千粒重(TKW)的正面影响。

表D1：在非胁迫条件下表达包含SEQ ID NO：1的核酸的转基因稻植物的数据总结；对于每个参数，显示总体增加百分比，对于每个参数，p-值<0.05。

参数	总体增加
		充实率	5.6

下文中给出了在如上文所述的氮使用效率筛选条件下评价T1世代且表达包含SEQ ID NO：3的核酸的转基因稻植物的结果。

观察到根生物量增加；以及种子充实率、每圆锥花序花数和绿度的正面影响。

下文中给出了在非胁迫条件下评价T1世代且表达包含SEQ ID NO：5的核酸的转基因稻植物的结果。

观察到种子充实率增加至少5％，和种子产量在总种子重和饱满种子数方面的正面影响、以及收获指数的正面影响。

表D2：在非胁迫条件下表达包含SEQ ID NO：5的核酸的转基因稻植物的数据总结；对于每个参数，显示总体增加百分比，对于每个参数，p-值<0.05。

参数	总体增加
		充实率	6.6

如上文所述的干旱筛选条件下评价T1世代且表达包含SEQ ID NO：7的核酸的转基因稻植物，显示提高的种子产量由于更好的充实率。

在非胁迫条件下评价T1世代且表达包含SEQ ID NO：9的核酸的转基因稻植物，显示提高的种子产量由于更好的充实率和更多的每圆锥花序花数。

2.CDKB-RKA多肽

下文表D3中给出了在非胁迫条件下评价转基因稻植物的结果，所述转基因稻植物在T1世代并且表达SEQ ID NO：318的CDKB-RKA多肽的编码核酸。

在非胁迫条件下生长时，观察到地上生物量(AreaMax)、根生物量(RootMax和RootThinMax)，和包括总种子重(totalwgseeds)的种子产量、种子数(nrfilledseed)增加至少5％。此外，表达SEQ ID NO：318的CDK多肽的编码核酸的植物显示早期生长势(EmerVigor)。

表D3：转基因稻植物的数据总结；对于每个参数，显示总体增加百分比用于核实(T2世代)，对于每个参数，p-值<0.05。

参数	总体增加
		AreaMax	10.5
早期生长势	24.8
		RootMax	7.2
totalwgseeds	14.1
		nrfilledseed	13.2
RootThinMax	5.0

3.UPA20-样多肽

3.1.非胁迫条件下SEQ ID NO：406

下文表D4中给出了在非胁迫条件下评价转基因稻植物的结果，所述转基因稻植物为T1世代并且表达SEQ ID NO：407的UPA20-样多肽的编码核酸。

在非胁迫条件下生长时，观察到参数千粒重(TKW)增加至少3％和下述参数增加至少5％，所述参数如生物量，包括地上生物量(area max)和根生物量(root max和root thick max)和包括总种子重的种子产量、收获指数、饱满种子数和每圆锥花序花数。此外，注意到至少一个事件的植物与对照植物相比还显示增加至少5％的饱满率。

表D4：转基因稻植物的数据总结；对于每个参数，显示T1世代的植物与对照植物相比总体增加百分比，对于每个参数，p-值<0.05。

参数	总体增加
		AreaMax	9.1
RootMax	7.9
		totalwgseeds	19.2
harvestindex	8.8
		Nrfilledseed	13.7
RootThickMax	8.8

3.2.非胁迫条件下SEQ ID NO：410

在非胁迫条件下，T1世代并且表达SEQ ID NO：411的UPA20-样多肽的编码核酸的转基因稻植物的评价结果显示，在非胁迫条件下生长时，转基因植物与对照植物相比显示增加至少5％、且尤其9.4％的每圆锥花序花数。

3.3.非胁迫条件下SEQ ID NO：440

下文表D5中给出了在非胁迫条件下评价转基因稻植物的结果，所述转基因稻植物为T1世代并且表达SEQ ID NO：441的UPA20-样多肽的编码核酸。

在非胁迫条件下生长时，观察到增加至少5％的参数如：开花时间和种子产量，包括千粒重和充实率。此外，注意到至少两个事件的植物与对照植物相比还显示参数如收获指数和饱满种子数至少5％的显著增加。

表D5：转基因稻植物的数据总结；对于每个参数，显示T1世代的植物与对照植物相比总体增加百分比，对于每个参数，p-值<0.05。

参数	总体增加
		开花时间	5.6
充实率	17.7
		千粒重	5.8

3.3.胁迫条件下SEQ ID NO：508

在胁迫条件下、更尤其在缺氮条件下，T1世代并且表达SEQ ID NO：509的UPA20-样多肽的编码核酸的转基因稻植物与对照植物相比显示如下结果：

1.至少两个事件的植物显示生物量、更尤其地上生物量增加至少5％；

2.至少一个事件的植物与对照植物相比在参数如地上生物量、总种子重、充实率、收获指数和饱满种子数上显示至少5％的增加和与对照植物相比在千粒重上显示至少3％的增加；

3.至少两个事件的植物与对照植物相比在千粒重上显示至少5％的增加。

Claims

1.一种用于相对于对照植物增强植物中产量相关性状的方法，所述方法包含调节植物中编码WAK-样多肽的核酸的表达，其中所述的WAK-样多肽包含EGF结构域和跨膜结构域。

2.根据权利要求1的方法，其中所述受调节的表达通过在植物中导入并且表达编码所述WAK-样多肽的所述核酸实现。

3.根据权利要求1或2的方法，其中所述增强的产量相关性状包含相对于对照植物增加的产量，且优选包含相对于对照植物增加的生物量和／或增加的种子产量。

4.根据权利要求1-3中任一项权利要求的方法，其中所述增强的产量相关性状在非胁迫条件下获得。

5.根据权利要求1-3中任一项权利要求的方法，其中所述增强的产量相关性状在干旱胁迫或缺氮条件下获得。

6.根据权利要求1-5中任一项权利要求的方法，其中所述编码WAK-样多肽的核酸是植物来源的，优选来自单子叶植物，还优选来自禾本科，更优选来自稻属，最优选来自稻。

7.根据权利要求1-6中任一项权利要求的方法，其中所述编码WAK-样多肽的核酸编码表A1中所列的任一种多肽，或是这种核酸的一部分，或是能与这种核酸杂交的核酸，条件是这些多肽包含EGF结构域和跨膜结构域。

8.根据权利要求1-7中任一项权利要求的方法，其中所述核酸序列编码表A1中给出的任意多肽的直向同源物或旁系同源物，条件是这些多肽包含EGF结构域和跨膜结构域。

9.根据权利要求1-8中任一项权利要求的方法，其中所述核酸编码由SEQ ID NO：2或4代表的多肽。

10.根据权利要求1-9中任一项权利要求的方法，其中所述的核酸与组成型启动子有效连接，优选与中等强度组成型启动子有效连接，优选与植物启动子有效连接，更优选与GOS2启动子有效连接，最优选与来自稻的GOS2启动子有效连接。

11.通过根据权利要求1-10中任一项权利要求的方法获得的植物、其植物部分，包括种子或植物细胞，其中所述植物、植物部分或植物细胞包含编码如权利要求1、4-9中任一项权利要求所定义的WAK-样多肽的重组核酸。

12.构建体，其包含：

(i)编码如权利要求1、4-9中任一项权利要求所定义的WAK-样的核酸；

(iii)转录终止序列。

13.根据权利要求12的构建体，其中所述控制序列之一是组成型启动子，优选是中等强度组成型启动子，优选是植物启动子，更优选是GOS2启动子，最优选是来自稻的GOS2启动子。

14.根据权利要求12或13的构建体在制备植物的方法中的用途，所述植物具有增强的产量相关性状，优选相对于对照植物具有增加的产量，且更优选相对于对照植物具有增加的种子产量和／或增加的生物量。

15.用根据权利要求12或13的构建体转化的植物、植物部分或植物细胞。

(i)在植物细胞或植物中导入并且表达编码如权利要求1、4-9中任一项权利要求所定义的WAK-样多肽的核酸；和

17.转基因植物或源自所述转基因植物的转基因植物细胞，其因编码如权利要求1、4-9中任一项权利要求所定义的WAK-样多肽的核酸的受调节表达而相对于对照植物具有增强的产量相关性状，优选相对于对照植物具有增加的产量，并且更优选具有增加的种子产量和／或增加的生物量。

18.根据权利要求11、15或17的转基因植物或源自其的转基因植物细胞，其中所述植物是作物植物，如甜菜、糖料甜菜或苜蓿，或单子叶植物如甘蔗；或谷类，如稻、玉米、小麦、大麦、粟、黑麦、黑小麦、高粱、二粒小麦、斯卑尔脱小麦、单粒小麦、埃塞俄比亚画眉草、芦粟或燕麦。

19.根据权利要求18的植物的可收获部分，其中所述可收获部分优选是苗生物量和／或种子。

20.产品，其来自根据权利要求18的植物和／或来自根据权利要求19的植物的可收获部分。

21.编码如权利要求1、4-9中任一项权利要求所定义的WAK-样多肽的核酸的用途，用于相对于对照植物增强植物中的产量相关性状，优选用于增加产量，且更优选用于相对于对照植物增加植物中的种子产量和／或增加生物量。

22.生产产品的方法，其包括培育根据权利要求11、14、15、17或18的植物的步骤，和从或由以下生产所述产品：

(i)所述植物；或

(ii)所述植物的部分，包括种子。

23.根据权利要求12或13构建体，其包含在植物细胞中。

24.重组染色体DNA，其包含根据权利要求12或13的构建体。

25.一种用于相对于对照植物增加植物中产量的方法，所述方法包括在所述植物中导入和表达编码CDKB-RKA多肽的核酸分子，其中所述CDKB-RKA多肽是经修饰的CDKB多肽，且其中所述CDKB-RKA多肽与所述CDKB多肽相比具有降低的催化激酶活性。

26.根据权利要求25的方法，其中所述CDKB-RKA多肽缺少催化激酶活性。

27.根据权利要求25或26的方法，其中所述CDKB-RKA多肽是突变的CDKB多肽。

28.根据权利要求25、26或27的方法，其中所述CDKB-RKA多肽是包含突变的激酶结构域的CDKB多肽。

29.根据权利要求25-28中任一项权利要求的方法，其中所述CDKB-RKA多肽是截短的CDKB多肽。

30.根据权利要求25-29中任一项权利要求的方法，其中所述CDKB-RKA多肽是截短的CDKB多肽，其在所述多肽的C端一半处包含删除，其降低所述CDKB的激酶活性，且优选基本上灭活所述CDKB的激酶活性。

31.根据权利要求25-30中任一项权利要求的方法，其中所述CDKB-RKA多肽是截短的CDKB多肽，所述CDKB-RKA多肽包含所述CDKB多肽的激酶结构域的删除。

32.根据权利要求25-30中任一项权利要求的方法，其中所述CDKB-RKA多肽是截短的CDKB多肽，所述CDKB-RKA多肽包含所述CDKB多肽的激酶结构域的一部分的删除，其中所述部分优选包含至少1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11或12个氨基酸。

33.根据权利要求25-32中任一项权利要求的方法，其中所述CDKB多肽的所述激酶结构域由来自SEQ ID NO：320的氨基酸140至氨基酸152的保守结构域代表。

34.根据权利要求25-33中任一项权利要求的方法，其中所述CDKB多肽具有细胞周期蛋白结合活性。

35.根据权利要求25-34中任一项权利要求的方法，其中所述CDKB-RKA多肽包含细胞周期蛋白结合结构域，优选包含由不具有错配或在从左到右的2位和／或4位具有错配的PPTALRE基序代表的细胞周期蛋白结合结构域，且更优选包含由SEQ ID NO：403代表的细胞周期蛋白结合结构域，且更优选包含由SEQ ID NO：404代表的细胞周期蛋白结合结构域。

36.根据权利要求25-35中任一项权利要求的方法，其中所述CDKB-RKA多肽包含蛋白激酶抑制结构域。

37.根据权利要求25-36中任一项权利要求的方法，其中所述CDKB-RKA多肽缺少T环激活激酶结构域。

38.根据权利要求25-37中任一项权利要求的方法，其中所述编码CDKB-RKA的核酸选自：

-核酸，其衍生自编码表A2所列出的任一多肽的核酸；

-下述核酸的部分，所述核酸编码表A2中给出的任一多肽或表A2中给出的任意多肽的直向同源物或旁系同源物；

39.根据权利要求25-38中任一项权利要求的方法，其中所述核酸编码由SEQ ID NO：318代表的多肽或其同源物、直向同源物或旁系同源物，或所述核酸的部分，或能与所述核酸杂交的核酸。

40.根据权利要求25-39中任一项权利要求的方法，其中编码所述CDKB多肽的所述核酸是植物来源，优选来自双子叶植物，进一步优选来自十字花科，更优选来自拟南芥属，最优选来自拟南芥。

41.根据权利要求25-40中任一项权利要求的方法，其中所述核酸编码下述多肽，所述多肽与SEQ ID NO：318具有至少约30-40％，优选至少约41-50％，更优选至少约51-60％、61-70％、71-80％、81-85％、86-90％、91-95％、96-99％或超过99％总体序列同一性，且优选与SEQ ID NO：318相对应。

42.根据权利要求25-41中任一项权利要求的方法，其中所述相对于对照植物增加的产量包含(i)增加的种子产量和／或(ii)增加的营养生物量，例如增加的叶生物量和／或增加的根生物量。

43.根据权利要求25-42中任一项权利要求的方法，其中所述增强的产量相关性状在非胁迫条件下获得。

44.根据权利要求25-43中任一项权利要求的方法，其中所述核酸与组成型启动子有效连接，优选与组成型植物启动子有效连接，更优选与中等强度组成型植物启动子有效连接。

45.根据权利要求25-44中任一项权利要求的方法获得的转基因植物，转基因植物部分、包括种子或转基因植物细胞，其中所述植物、植物部分或植物细胞包含编码如权利要求25和41中任一项权利要求中定义的CDKB-RKA多肽的重组核酸。

46.构建体，其包含：

(i)编码如权利要求25-41中任一项权利要求所定义的CDKB-RKA多肽的核酸；

(iii)转录终止序列。

47.根据权利要求46的构建体，其中所述控制序列之一是组成型启动子，优选是组成型植物启动子，更优选是中等强度组成型植物启动子。

48.根据权利要求46或47的构建体在制备植物的方法中的用途，所述植物具有增强的产量相关性状，优选相对于对照植物具有增加的产量，和更优选相对于对照植物具有增加的种子产量和／或增加的生物量。

49.用根据权利要求46或47的构建体转化的转基因植物、转基因植物部分或转基因植物细胞。

50.用于产生转基因植物的方法，所述转基因植物相对于对照植物具有增强的产量相关性状，优选相对于对照植物具有增加的产量，并且更优选相对于对照植物具有增加的种子产量和／或增加的生物量，所述方法包括：

(i)在植物细胞或植物中导入并且表达编码如权利要求25-41中任一项权利要求所定义的CDKB-RKA多肽的核酸；和

51.转基因植物或源自所述转基因植物的转基因植物细胞，其因编码如权利要求25-41中任一项权利要求所定义的CDKB-RKA多肽的核酸导入和表达而相对于对照植物具有增强的产量相关性状，优选相对于对照植物具有增加的产量，并且更优选具有增加的种子产量和／或增加的生物量。

52.根据权利要求45、49或51的转基因植物或源自其的转基因植物细胞，其中所述植物是作物植物，如甜菜、糖料甜菜或苜蓿，或单子叶植物如甘蔗；或谷类，如稻、玉米、小麦、大麦、粟、黑麦、黑小麦、高粱、二粒小麦、斯卑尔脱小麦、单粒小麦、埃塞俄比亚画眉草、芦粟或燕麦。

53.根据权利要求45、49、51或52中任一项权利要求的植物的可收获部分，其中所述可收获部分优选是种子。

54.产品，其来自根据权利要求53的植物和／或来自根据权利要求45、49、51或52中任一项权利要求的植物的可收获部分。

55.编码如权利要求25-41中任一项权利要求所定义的CDKB-RKA多肽的核酸的用途，用于相对于对照植物增强植物中的产量相关性状，优选用于增加产量，且更优选用于相对于对照植物增加植物中的种子产量和／或增加生物量。

56.生产产品的方法，其包括培育根据权利要求45、49、51或52中任一项权利要求的植物的步骤，和从或由以下生产所述产品：

(i)所述植物；或

(ii)所述植物的部分，包括种子。

57.根据权利要求46或47构建体，其包含在植物细胞中。

58.重组染色体DNA，其包含根据权利要求46或47的构建体。

59.编码如权利要求25-41中任一项权利要求所定义的CDKB-RKA多肽的核酸的用途，作为分子标记用于相对于对照植物选择植物中增强的产量相关性状，优选用于相对于对照植物选择增加的产量，且更优选用于相对于对照植物选择植物中增加的种子产量和／或用于相对于对照植物选择增加的生物量。

60.一种用于相对于对照植物增强植物中产量相关性状的方法，所述方法包括在所述植物中调节编码UPA20-样多肽的核酸表达，其中所述UPA20-样多肽包含bHLH结构域，且优选包含选自以下的一个或多个结构域：SM00353、PTHR12565：SF7、PTHR12565、PF00010、PS50888、SSF47459；和G3DSA：4.10.280.10。

61.根据权利要求60的方法，其中所述受调节的表达通过在植物中导入并且表达编码所述UPA20-样多肽的所述核酸实现。

62.根据权利要求60或61的方法，其中所述增强的产量相关性状包含相对于对照植物增加的产量，且优选包含相对于对照植物增加的种子产量和增加的生物量。

63.根据权利要求60-62中任一项权利要求的方法，其中所述增加的种子产量包含增加的总种子重、增加的种子数量、增加的每圆锥花序花数、增加的千粒重和增加的充实率中的任意一种或多种。

64.根据权利要求60-63中任一项权利要求的方法，其中所述增强的产量相关性状在非胁迫条件下获得。

65.根据权利要求60-63中任一项权利要求的方法，其中所述增强的产量相关性状在干旱胁迫、盐胁迫或缺氮条件下获得。

66.根据权利要求60-65中任一项权利要求的方法，其中所述bHLH结构域包含与SEQ ID NO：544代表的氨基酸具有至少50％总体序列同一性的氨基酸序列。

67.根据权利要求60-66中任一项权利要求的方法，其中所述UPA20-样多肽包含一个或多个以下基序：

(ii)基序3：DEIINYVQSLQ[RN]QVEFLSMKLA[ST]V[NS]P[RLV]L[DY](SEQ IDNO：539)，

(iii)基序4：[MN][AS][RK]KRK[SA][RA]x[KG][FGS](SEQ ID NO：540)。

68.根据权利要求60-67中任一项权利要求的方法，其中所述UPA20-样多肽还包含一个或多个以下基序：

(iii)基序7：[KR][LI]AS[LMV]ISN]P[VLM][LF]Y[DG]FGMD[LSR](SEQ ID NO：543)。

69.根据权利要求60-68中任一项权利要求的方法，其中所述UPA20-样多肽包含保守结构域(或基序)，其与下述保守结构域具有至少50％总体序列同一性，该保守结构域选自：

(i)SEQ ID NO：2中的氨基酸186至氨基酸236(基序8-SEQ ID NO：556)；

(ii)SEQ ID NO：2中的氨基酸174至氨基酸231(基序9-SEQ ID NO：557)；

(iii)SEQ ID NO：2中的氨基酸183至氨基酸230(基序10-SEQ IDNO：558)；

(iv)SEQ ID NO：2中的氨基酸181至氨基酸231(基序11-SEQ IDNO：559)；

(v)SEQ ID NO：2中的氨基酸176至氨基酸255(基序12-SEQ ID NO：560)；和

(vi)SEQ ID NO：2中的氨基酸176至氨基酸257(基序13-SEQ IDNO：561)。

70.根据权利要求60-69中任一项权利要求的方法，其中所述编码UPA20-样多肽的核酸是植物来源，优选来自双子叶植物，进一步优选来自茄科，更优选来自毛白杨属，最优选地，该核酸来自毛果杨。

71.根据权利要求60-70中任一项权利要求的方法，其中所述编码UPA20-样多肽的核酸编码表A3所列出的任一多肽或此核酸的一部分，或能与此核酸杂交的核酸。

72.根据权利要求60-71中任一项权利要求的方法，其中所述核酸序列编码表A3中给出的任意多肽的直向同源物或旁系同源物。

73.根据权利要求60-72中任一项权利要求的方法，其中所述核酸编码由SEQ ID NO：407代表的多肽或其同源物。

74.根据权利要求60-73中任一项权利要求的方法，其中所述的核酸与组成型启动子有效连接，优选与中等强度组成型植物启动子有效连接，优选与植物启动子有效连接，更优选与GOS2启动子有效连接，最优选与来自稻的GOS2启动子有效连接。

75.根据权利要求60-74中任一项权利要求的方法获得的植物、其植物部分，包括种子或植物细胞，其中所述植物、植物部分或植物细胞包含编码如权利要求60、66-73中任一项权利要求所定义的UPA20-样多肽的重组核酸。

76.根据权利要求75的植物或源自其的植物细胞，其中所述植物是作物植物，如甜菜、糖料甜菜或苜蓿，或单子叶植物如甘蔗；或谷类，如稻、玉米、小麦、大麦、粟、黑麦、黑小麦、高粱、二粒小麦、斯卑尔脱小麦、黑麦草、单粒小麦、埃塞俄比亚画眉草、芦粟或燕麦。

77.构建体，其包含：

(i)编码如权利要求60、66-73中任一项权利要求所定义的UPA20-样多肽的核酸；

(iii)转录终止序列。

78.根据权利要求77的构建体，其中所述控制序列之一是组成型启动子，优选是中等强度组成型启动子，优选是植物启动子，更优选是GOS2启动子，最优选是来自稻的GOS2启动子。

79.根据权利要求77或78的构建体在制备植物的方法中的用途，所述植物具有增强的产量相关性状，优选相对于对照植物具有增加的产量，和更优选相对于对照植物具有增加的种子产量和／或增加的生物量。

80.用根据权利要求77或78的构建体转化的植物、植物部分或植物细胞。

81.根据权利要求80的植物或源自其的植物细胞，其中所述植物是作物植物，如甜菜、糖料甜菜或苜蓿，或单子叶植物如甘蔗；或谷类，如稻、玉米、小麦、大麦、粟、黑麦、黑小麦、高粱、二粒小麦、斯卑尔脱小麦、黑麦草、单粒小麦、埃塞俄比亚画眉草、芦粟或燕麦。

82.用于产生转基因植物的方法，所述转基因植物相对于对照植物具有增强的产量相关性状，优选相对于对照植物具有增加的产量，并且更优选相对于对照植物具有增加的种子产量和／或增加的生物量，所述方法包括：

(i)在植物细胞或植物中导入并且表达编码如权利要求60、66-73中任一项权利要求所定义的UPA20-样多肽的核酸；和

83.转基因植物或源自所述转基因植物的转基因植物细胞，其因编码如权利要求60、66-73中任一项权利要求所定义的UPA20-样多肽的核酸的受调节表达而相对于对照植物具有增强的产量相关性状，优选相对于对照植物具有增加的产量、并且更优选具有增加的种子产量。

84.根据权利要求83的转基因植物或源自其的转基因植物细胞，其中所述植物是作物植物，如甜菜、糖料甜菜或苜蓿，或单子叶植物如甘蔗；或谷类，如稻、玉米、小麦、大麦、粟、黑麦、黑小麦、高粱、二粒小麦、斯卑尔脱小麦、黑麦草、单粒小麦、埃塞俄比亚画眉草、芦粟或燕麦。

85.根据权利要求75-76、80-81和83-84中任一项权利要求的植物的可收获部分，其中所述可收获部分优选是苗生物量和／或种子。

86.产品，其来自根据权利要求75-76、80-81和83-84中任一项权利要求的植物和／或来自根据权利要求85的植物的可收获部分。

87.分离的核酸分子，其选自：

(i)由任一SEQ ID NO：458、460和496代表的核酸；

(ii)由任一SEQ ID NO：458、460和496代表的核酸的互补核酸；

88.分离的多肽，其选自：

(i)由任一SEQ ID NO：459、461和497代表的氨基酸序列；

(iii)以上(i)或(ii)中给出的任一氨基酸序列的衍生物。

89.编码如权利要求60、66-73和87中任一项权利要求所定义的UPA20-样多肽的核酸的用途，用于相对于对照植物增强植物中的产量相关性状，优选用于增加产量，且更优选相对于对照植物用于增加植物中的种子产量。

90.如权利要求87中所定义的并且编码UPA20-样多肽的核酸的用途，用于相对于对照植物增强植物中产量相关性状，优选用于增加产量，且更优选用于相对于对照植物增加植物种子产量。

91.编码如权利要求60、66-73和88中任一项权利要求所定义的UPA20-样多肽的核酸作为分子标志物的用途。

92.如权利要求87中所定义并且编码如权利要求60、66-73和88中任一项权利要求所定义的UPA20-样多肽的核酸作为分子标志物的用途。