BRPI0711376A2

BRPI0711376A2 - enzimas para degradação de herbicidas

Info

Publication number: BRPI0711376A2
Application number: BRPI0711376-5A
Authority: BR
Inventors: Carol J Hartley; Susan J Dorrian; Lyndall J Briggs; Michelle R Williams; Robyn J Russel; John G Oakeshoftt
Original assignee: Commw Scient Ind Res Org; Grains Res & Dev Corp
Priority date: 2006-05-12
Filing date: 2007-05-11
Publication date: 2011-11-01
Also published as: JP2009536819A; CA2651428A1; US20100199363A1; ZA200809620B; EP2021359A1; RU2008148945A; CN101484463A; WO2007131276A1; AU2007250526A1; EP2021359A4

Abstract

ENZIMAS PARA DEGRADAçAO DE HERBICIDAS A presente invenção está relacionada a um novo tipo de enzima que é capaz de degradar herbicidas que contêm amina como, por exemplo, glifosato e glufosinato, além de polinucleotídeos que codificam essas enzimas. A invenção também está relacionada a plantas transgênicas que produzem essas enzimas que são resistentes a um herbicida que contém atividade de amina. Além disso, a presente invenção fornece métodos de biorremediação que se baseiam na atividade desse novo tipo de enzima.

Description

ENZIMAS PARA DEGRADAÇÃO DE HERBICIDAS

Campo Da Invenção

A presente invenção está relacionada a um novo tipo de enzima que é capaz de degradar herbicidas que contêm amina como, por exemplo, glifosato e glufosinato, além de polinucleotídeos que codificam essas enzimas. A invenção também está relacionada a plantas transgênicas que produzem essas enzimas que são resistentes a um herbicida que contém atividade de amina. Além disso, a presente invenção fornece métodos de biorremediação que se baseiam na atividade desse novo tipo de enzima.

Fundamentos Da Invenção

Organofosfonatos são caracterizados por uma ligação carbono a fósforo (C-P) estável que transmite resistência relativa à degradação química, térmica e enzimática. Organofosfonatos naturais possuem um papel importante no ciclo biogeoquímico de fósforo, e organofosfonatos sintéticos possuem diversas aplicações na indústria química, principalmente como herbicidas como, por exemplo, glifosato (N-fosfonometil glicina) e fosfinotricina (Basta™) .

Glifosato (N-fosfonometil glicina) é um herbicida de fosfonato que inibe a enzima ácido 5-enolpiruvil-3- fosfochiquímico sintase (EPSPS), um componente da via do ácido chiquímico. As plantas utilizam a via do ácido chiquímico para a produção de aminoácidos aromáticos essenciais e vitaminas, e o glifosato rompe especificamente a conversão de ácido fosfoenolpirúvico e ácido 3- fosfochiquímico em ácido 5-enolpiruvil-3-fosfochiquímico pela EPSPS. Após os fosfonatos penetrarem no solo, a atividade microbiana é primariamente responsável por sua remoção, com a atividade microbiana dividida em duas vias principais: mecanismos dependentes da privação de fosfato regulados pelo regulon pho, por meio dos quais os micróbios utilizam os fosfonatos como a única fonte de fósforo (Wanner, 1994), e mecanismos independentes de fosfato, pelos quais as bactérias utilizam os fosfonatos como a única fonte de carbono, nitrogênio e fósforo (Ternan e cols., 1998a; Ternan e cols., 1998b; McGrath e cols., 1998). Também foram descritos isolados fúngicos capazes de utilizar fosfonatos (incluindo glifosato) como a única fonte de fosfato, e foi postulado que várias vias diferentes (possivelmente similares àquelas em bactérias) podem estar envolvidas (Kryskol-Lupicka e cols., 1997). Todos os isolados fúngicos testados produziram AMPA como o principal produto da degradação de glifosato, o que sugere que uma enzima fúngica similar à GOX bacteriana (W0 92/00377) está envolvida.

Foi gerado um grande interesse na degradação ou modificação enzimática do herbicida de glifosato, tanto em função das preocupações sobre o destino ambiental da molécula quanto como uma complementação adicional para os sistemas para o planejamento de plantas tolerantes aos herbicidas por aumento dos níveis de EPSPS na planta ou por substituição das EPSPS nativas por uma EPSPS modificada que confere tolerância ao glifosato. Verificou-se que a degradação do glifosato no solo é rápida e intensa, com aminometilfosfonato (AMPA) identificado como o produto mais comum (Wackett e cols. 1987), e tendo sido descritas várias culturas bacterianas únicas capazes de degradar glifosato (revisado em Malik e cols., 1989).

Foram caracterizadas duas vias para o metabolismo de glifosato em culturas bacterianas puras até agora (Figura 1). O metabolismo até AMPA e, por conseguinte, até a mineralização completa foi descrito para Flavobacterium sp. (Balthazor e Hallas, 1986), Pseudomonas sp. (Jacob e cols. 1988) e Arthrobacter atrocyaneus (Pipke e Amrhein, 1988) , enquanto a conversão de glifosato em sarcosina e fosfato inorgânico (Pi) pelo sistema C-P liase regulado por pho foi descrita para uma Pseudomonas sp. (Shinabarger e Braymer, 1986; Kishore e Jacob, 1987), Alcaligenes spec. cepa GL, Streptomyces sp. (Objoska e cols., 1999) e uma Arthrobacter sp. (Pipke e cols., 1988), e presumida para bactéria halofílica VHl (Hayes e cols., 2000) e Rhizobium meliloti 1021 (Liu e cols., 1991).

Yakoleva e cols. (1998) foram os primeiros a isolar e expressar o óperon phn de E. coli, codificando todos os genes envolvidos na atividade de C-P liase dependente de fosfato. White e Metcalf (2004) acompanharam descrevendo dois óperons distintos de Pseudomonas stutzeri - um homólogo do óperon phn de E. coli e outro óperon htx que codifica hipofosfito-2-oxoglutarato dioxigenase envolvida no metabolismo de fosfito. No entanto, nenhum desses sistemas de C-P liase foi capaz de clivar glifosato (White e Metcalf, 2004), similarmente à enzima fosfonoacetato hidrolase substrato-específica descrita por McGrath e cols. (1995) . A tolerância ao glifosato também pode ser conferida pela N-acetilação de glifosato com a utilização da enzima glifosato acetiltransferase (GAT), como descoberto por Castle e colaboradores (Castle e cols., 2004), que também utilizaram embaralhamento de DNA de três genes gat diferentes para aumentar a eficiência da enzima de GAT em quatro ordens de magnitude (Castle e cols., 2004; Siehl e cols., 2005).

As oportunidades de controle de plantas daninhas com a utilização dessas enzimas microbianas que metabolizam ou modificam herbicidas foram discutidas em detalhe por Padgette e cols. (1996) e Vasil (1996).

As enzimas atuais disponíveis para a degradação de glifosato, particularmente quando expressas em plantas, não possuem particularmente atividade elevada. Dessa forma, há a necessidade de identificação de enzimas adicionais que possam ser usadas para a degradação de herbicidas como, por exemplo, glifosato.

Sumário Da Invenção

Os presentes inventores identificaram uma bactéria que utiliza um mecanismo previamente desconhecido de metabolização de glifosato. Além disso, os inventores isolaram e caracterizaram o novo sistema de gene-enzima de degradação de glifosato dessa bactéria.

Em um aspecto, a presente invenção fornece um polipeptídeo substancialmente purificado que cliva glifosato para a produção de glicina.

Em outro aspecto, a presente invenção fornece um polipeptídeo substancialmente purificado que cliva a ligação carbono C-3 de fosfonometil ao nitrogênio de glifosato.

Em uma modalidade particularmente preferida, o polipeptídeo compreende uma única cadeia de aminoácidos. Dessa forma, o polipeptídeo não é parte de um complexo multienzimas que exige várias reações para a produção de glicina quando se utiliza glifosato como substrato.

Em uma modalidade adicional, o polipeptídeo cliva glifosato em glicina e ácido oxofosfônico (ou uma forma iônica deste).

Em uma modalidade adicional particularmente preferida, o polipeptídeo é solúvel. Dessa forma, o polipeptídeo não está ligado à membrana.

Em outra modalidade, não é produzido substancialmente nenhum glioxilato em conseqüência da clivagem de glifosato.

Em uma modalidade adicional, não é produzida substancialmente nenhuma sarcosina em conseqüência da clivagem glifosato.

Em um aspecto adicional, a presente invenção fornece um polipeptídeo substancialmente purificado que possui uma eficiência maior para a clivagem de glifosato do que GOX (ID. DE SEQ. N0: 3).

Ainda em outro aspecto, a presente invenção fornece um polipeptídeo substancialmente purificado que possui uma atividade específica para a clivagem de glifosato que é maior do que 550 μmol .min-1 .mg-1.

De preferência, a atividade específica é maior do que 6 00 μmol .min"1 .mg"1, mais preferivelmente maior do que 700 μmol .min-1.mg-1 e, ainda mais preferivelmente, maior do que 5.000 μmol .min-1.mg-1.

Em uma modalidade preferida, a atividade específica do polipeptídeo é determinada como aqui descrita no Exemplo 3.

Em um aspecto adicional, a presente invenção fornece um polipeptídeo substancialmente purificado que compreende aminoácidos que possuem uma seqüência selecionada de:

i) ID. DE SEQ. N°: 1, e

ii) uma seqüência de aminoácidos que é pelo menos 25% idêntica a (i),

em que o polipeptideo cliva um herbicida que contém amina.

Em uma modalidade, o polipeptideo compreende uma seqüência fornecida como o ID. DE SEQ. N°: 8 ou ID. DE SEQ. N° : 9.

Exemplos de herbicidas que contêm amina incluem, sem limitação, glifosato, glufosinato, bilanafos e glifosina. Em uma modalidade preferida, o herbicida que contém amina é glifosato ou glufosinato.

Em uma modalidade preferida, um polipeptideo da invenção pode ser purificado de uma espécie de Arthrobacter. De preferência, a espécie de Arthrobacter é Arthrobacter spTBD.

Em uma modalidade, o polipeptideo está fundido a pelo menos um outro polipeptideo.

Pelo menos um outro polipeptideo pode ser, por exemplo, um polipeptideo que aumente a estabilidade de um polipeptideo da presente invenção, ou um polipeptideo que ajude na purificação da proteína de fusão.

Em um aspecto adicional, a presente invenção fornece um polinucleotídeo isolado, o polinucleotídeo compreendendo nucleotideos que possuem uma seqüência selecionada de:

(i) ID. DE SEQ. N°: 2,

(ii) uma seqüência de nucleotideos que codifica um polipeptideo da invenção,

(iii) uma seqüência de nucleotideos que é pelo menos 25% idêntica a (i),

(iv) uma seqüência de nucleotídeos que hibridiza para (i) sob condições de baixo rigor,

(v) uma seqüência de nucleotídeos complementar a (i) a

(iv).

De preferência, o polinucleotídeo codifica um polipeptídeo que cliva um herbicida que contém amina. Mais preferivelmente, o herbicida que contém amina é glifosato ou glufosinato.

Em uma modalidade adicional, o polinucleotídeo codifica um polipeptídeo que compreende uma seqüência fornecida como o ID. DE SEQ. N0: 8 ou ID. DE SEQ. N0: 9.

Em uma modalidade preferida, o polinucleotídeo compreende uma seqüência que hibridiza para (i) sob condições de rigor moderado. Mais preferivelmente, o polinucleotídeo compreende uma seqüência que hibridiza para (i) sob condições rigorosas.

Em outro aspecto, a presente invenção fornece um polinucleotídeo recombinante que compreende um promotor que funciona em uma célula de planta, ligado operacionalmente a uma seqüência de DNA estrutural que codifica um polipeptídeo da invenção, ligada operacionalmente a uma seqüência de poliadenilação 3' que funciona na célula, em que o promotor é heterólogo em relação à seqüência de DNA estrutural e capaz de expressar a seqüência de DNA estrutural para aumentar a resistência da célula a um herbicida que contém amina.

Em um aspecto adicional, a presente invenção fornece um vetor que compreende um polinucleotídeo da invenção.

De preferência, o polinucleotídeo está ligado operacionalmente a um promotor.

Ainda em um aspecto adicional, a presente invenção fornece uma célula hospedeira que compreende pelo menos um polinucleotídeo da invenção e/ou pelo menos um vetor da invenção. A célula hospedeira pode ser qualquer tipo de célula. Em uma modalidade, a célula hospedeira é uma célula de planta.

Em outro aspecto, a presente invenção fornece uma célula recombinante que cliva glifosato e produz glicina.

De preferência, a célula compreende um polinucleotídeo da invenção, em que a célula não compreende naturalmente o referido polinucleotídeo.

Em outro aspecto, a presente invenção fornece uma célula recombinante que compreende um polipeptídeo introduzido que cliva glifosato para a produção de glicina.

Em um aspecto adicional, a presente invenção fornece uma célula recombinante que compreende um polipeptídeo introduzido que cliva a ligação carbono C-3 de fosfonometil ao nitrogênio de glifosato.

De preferência, o polipeptídeo é produzido pela célula pela expressão de um polinucleotídeo da invenção.

Em outro aspecto, a presente invenção fornece um processo para a preparação de um polipeptídeo da invenção, o processo compreendendo o cultivo de uma célula hospedeira da invenção que codifica o referido polipeptídeo, ou um vetor da invenção que codifica o referido polipeptídeo, sob condições que permitam a expressão do polinucleotídeo que codifica o polipeptídeo, e a recuperação do polipeptídeo expresso.

Também é fornecido um polipeptídeo produzido com o uso de um método da invenção.

Em um aspecto adicional, a presente invenção fornece um anticorpo isolado que se liga especificamente a um polipeptideo da invenção.

Ainda em outro aspecto, a presente invenção fornece uma composição que compreende pelo menos um polipeptideo da invenção, pelo menos um polinucleotídeo da invenção, um vetor da invenção, uma célula hospedeira da invenção, uma célula recombinante da invenção e/ou um anticorpo da invenção, e um ou mais veículos aceitáveis.

Em um aspecto adicional, a presente invenção fornece uma composição para a clivagem de um herbicida que contém amina, a composição que compreende pelo menos um polipeptideo da invenção e um ou mais veículos aceitáveis.

De preferência, a composição ainda compreende íons metálicos. Em uma modalidade preferida, os íons metálicos são íons metálicos divalentes. Mais preferivelmente, os íons metálicos são selecionados de Mg2+, Co2+, Ca2+, Zn2+, Mn2+, e combinações destes. Ainda mais preferivelmente, os

íons metálicos são selecionados de Mg2+, Zn2+, Co2+, e combinações destes.

Os polipeptídeos da invenção podem ser usados como um marcador selecionável para detectar uma célula recombinante. Dessa forma, também é fornecido o uso de um

polipeptideo da invenção, ou um polinucleotídeo que codifica o referido polipeptideo, como um marcador selecionável para a detecção e/ou seleção de uma célula recombinante.

Em um aspecto adicional, a presente invenção fornece um método para a detecção uma célula recombinante, o método compreendendo:

(i) o contato de uma célula ou de uma população de células com um polinucleotídeo que codifica um polipeptídeo da invenção sob condições que permitam a captação do polinucleotídeo pela(s) célula(s), e

(ii) a seleção de uma célula recombinante por exposição das células da etapa (i), ou células descendentes destas, a um herbicida que contém amina.

De preferência, o polinucleotídeo compreende um primeiro quadro de leitura aberta que codifica um polipeptídeo da invenção, e um segundo quadro de leitura aberta que não codifica um polipeptídeo da invenção.

Em uma modalidade, o segundo quadro de leitura aberta codifica um polipeptídeo. Em uma segunda modalidade, o segundo quadro de leitura aberta codifica um polinucleotídeo que não é traduzido. Em ambos os casos, prefere-se que o segundo quadro de leitura aberta esteja ligado operacionalmente a um promotor adequado.

De preferência, o polinucleotídeo que não é traduzido codifica um ácido nucléico catalítico, uma molécula de dsRNA ou uma molécula anti-senso.

Exemplos de uma célula adequada incluem, sem limitação, uma célula de planta, uma célula bacteriana, uma célula fúngica ou uma célula animal. De preferência, a célula é uma célula de planta.

De preferência, o herbicida que contém amina é glifosato ou glufosinato.

Em um aspecto adicional, a presente invenção fornece um método para a clivagem de um herbicida que contém amina, o método compreendendo: o contato de um herbicida que contém amina com um polipeptídeo da invenção.

Em uma modalidade, o polipeptídeo é produzido por uma célula hospedeira da invenção.

De preferência, o herbicida que contém amina é glifosato ou glufosinato.

Os polipeptídeos aqui fornecidos podem ser produzidos em plantas para aumentar a habilidade de crescimento das plantas hospedeiras quando expostas a um herbicida que contém amina como, por exemplo, glifosato.

Dessa forma, ainda em um aspecto adicional, a presente invenção fornece uma planta transgênica que compreende um polinucleotídeo exógeno, o polinucleotídeo codificando pelo menos um polipeptídeo da invenção.

De preferência, o herbicida que contém amina é glifosato ou glufosinato.

Em uma modalidade, o polipeptídeo é produzido pelo menos em uma parte aérea da planta transgênica.

De preferência, o polinucleotídeo é incorporado estavelmente no genoma da planta.

Também é fornecido um método de produção de plantas com resistência aumentada a um herbicida que contém amina, que compreende as etapas de: a) inserção no genoma de uma célula de planta de um polinucleotídeo que compreende: um promotor que funciona em células de plantas para causar a produção de uma seqüência de RNA, ligado operacionalmente a; uma seqüência de DNA estrutural que causa a produção de uma seqüência de RNA que codifica um polipeptídeo da invenção, ligada operacionalmente a; uma região não traduzida 3' que funciona em células de plantas para causar a adição de nucleotídeos poliadenil na extremidade 3' da seqüência de RNA; em que o promotor é heterólogo em relação à seqüência de DNA estrutural e adaptado para causar expressão suficiente do polipeptídeo para aumentar a resistência a um herbicida que contém amina de uma célula de planta transformada com a molécula de DNA; b) obtenção de uma célula de planta transformada; e c) regeneração a partir da célula de planta transformada de uma planta transformada geneticamente que possui resistência aumentada a um herbicida que contém amina.

Em um aspecto adicional, a presente invenção fornece uma planta transgênica produzida com o uso de um método da invenção.

Em outro aspecto, a presente invenção fornece um método para a clivagem de um herbicida que contém amina em uma amostra, o método compreendendo a exposição da amostra a uma planta transgênica da invenção.

De preferência, a amostra é solo. Esse solo pode estar em um campo.

Em outro aspecto, a presente invenção fornece um animal transgênico não humano que compreende um polinucleotideo exógeno, o polinucleotídeo codificando pelo menos um polipeptídeo da invenção.

Em um aspecto adicional, a presente invenção fornece uma cepa isolada de Arthrobacter sp depositada sob o número de acesso V06/010960 em 11 de abril de 2006 no "National Measurement Institute", Austrália.

Ainda em outro aspecto, a presente invenção fornece uma composição para a clivagem de um herbicida que contêm amina, a composição compreendendo a cepa da invenção e um ou mais veículos aceitáveis. Em um aspecto adicional, a presente invenção fornece um extrato de célula hospedeira da invenção, uma célula recombinante da invenção, uma planta transgênica da invenção, um animal transgênico não humano da invenção, ou uma cepa da invenção, que compreende um polipeptídeo da invenção.

Ainda em outro aspecto, a presente invenção fornece uma composição para a clivagem de um herbicida que contém amina, a composição compreendendo o extrato da invenção e um ou mais veículos aceitáveis.

Em um aspecto adicional, a presente invenção fornece um método para a clivagem de um herbicida que contém amina, o método compreendendo a exposição de um herbicida que contém amina à cepa da invenção e/ou ao extrato da invenção.

Também é fornecida uma bactéria isolada que produz um polipeptídeo da invenção.

De preferência, a bactéria é uma Arthrobacter sp.

Em um aspecto adicional, a presente invenção fornece o uso de uma bactéria isolada de ocorrência natural que produz um polipeptídeo da invenção para a clivagem de um herbicida que contém amina.

Em outro aspecto, a presente invenção fornece uma esponja ou espuma polimérica para a clivagem de um herbicida que contém amina, a espuma ou esponja compreendendo um polipeptídeo da invenção imobilizado em um suporte polimérico poroso.

Em um aspecto adicional, a presente invenção fornece um método para a clivagem de um herbicida que contém amina, o método compreendendo a exposição de um herbicida que contém amina a uma esponja ou espuma da invenção.

Em outro aspecto, a presente invenção fornece um produto produzido a partir de uma planta da invenção.

Exemplos de produtos incluem, sem limitação, amido, óleo, fibras vegetais de plantas como, por exemplo, algodão, malte e trigo.

Em um aspecto adicional, a presente invenção fornece uma parte de uma planta da invenção. Exemplos incluem, sem limitação, sementes, frutas e nozes.

Os polipeptideos da presente invenção podem ser mutados, e os mutantes resultantes avaliados quanto à atividade alterada como, por exemplo, atividade enzimática aumentada. Essas mutações podem ser realizadas com a utilização de qualquer metodologia conhecida na técnica incluindo, sem limitação, mutagênese in vitro e embaralhamento de DNA.

Dessa forma, em um aspecto adicional, a presente invenção fornece um método de produção de um polipeptídeo com habilidade aumentada para clivar um herbicida que contém amina, o método compreendendo:

(i) a alteração de um ou mais aminoácidos de um primeiro polipeptídeo da invenção,

(ii) a determinação da habilidade do polipeptídeo alterado obtido da etapa (i) para clivar um herbicida que contém amina, e

(iii) a seleção de um polipeptídeo alterado com habilidade aumentada para clivar um herbicida que contém amina, quando comparado ao primeiro polipeptídeo.

Também é fornecido um polipeptídeo produzido pelo método da invenção. Ainda em outro aspecto, a presente invenção fornece um método para avaliar um microorganismo capaz de clivar um herbicida que contém amina, o método compreendendo:

(i) o cultivo de um microorganismo candidato na presença de um herbicida que contém amina como a única fonte de nitrogênio, e

(ii) determinar se o microorganismo é capaz de crescimento e/ou divisão.

Em uma modalidade, o microorganismo é uma bactéria, um fungo ou um protozoário.

Em uma modalidade preferida, o microorganismo é um microorganismo recombinante. Além disso, prefere-se que uma população de microorganismos recombinantes seja avaliada, em que os microorganismos recombinantes compreendem as diversas moléculas diferentes de DNA estranho. Exemplos dessas moléculas de DNA estranho incluem bibliotecas de DNA genômico de plasmídeo ou cosmideo.

De preferência, o herbicida que contém amina é glifosato.

Também é fornecido um microorganismo isolado com o uso de um método da invenção.

Em um aspecto adicional, a presente invenção fornece um kit que compreende pelo menos um polipeptídeo da invenção, pelo menos um polinucleotídeo da invenção, um vetor da invenção, uma célula hospedeira da invenção, uma célula recombinante da invenção, um anticorpo da invenção, uma composição da invenção, pelo menos uma cepa da invenção, pelo menos um extrato da invenção, pelo menos uma bactéria da invenção, pelo menos uma esponja ou espuma polimérica da invenção, pelo menos um produto da invenção e/ou pelo menos uma parte de uma planta da invenção.

Como ficará evidente, recursos e características preferidas de um aspecto da invenção são aplicáveis a muitos outros aspectos da invenção.

Por toda esta especificação, a palavra "que compreende", ou variações como "compreende" ou "compreendendo", implicará implicitamente na inclusão de um elemento, número inteiro ou etapa definida, ou grupo de elementos, números inteiros ou etapas, mas não na exclusão de qualquer outro elemento, número inteiro ou etapa, ou grupo de elementos, números inteiros ou etapas.

A seguir, a invenção será descrita por meio dos Exemplos não limitantes seguintes e com referência às figuras que a acompanham.

BREVE DESCRIÇÃO DOS DESENHOS QUE ACOMPANHAM A INVENÇÃO

Figura 1. Vias do metabolismo de glifosato. I. Clivagem da ligação C-P pelo sistema de multienzimas C-P liase ligadas à membrana. II. Clivagem da ligação C2-N para a produção de ácido aminometilfosfônico (AMPA) e glioxilato. III. Suposto mecanismo de GloxA - clivagem da ligação C3-N para a produção de glicina e ácido oxofosfônico.

Figura 2. Comparação das supostas reações catalisadas por GloxA e GOX com glifosato como substrato (A) e perfis da reação de HPLC que resultam dessas reações enzimáticas (B) .

Figura 3. Hibridizações DNA:DNA para DNA de plasmídeo que codifica GOX ou GloxA. Construções digeridas de DNA de plasmídeo e cosmídeo foram transferidas para a membrana

HybondN+ e depois sondadas com um produto de PCR marcado radiativamente com 32P do gene gox.

Figura 4. Comparação da atividade de GloxA e GOX parcialmente purificados em direção a glifosato e ácido iminodiacético.

Figura 5. A expressão de GloxA em plantas confere tolerância a glifosato a cinco vezes a dose normal. Para obter a Classificação da Tolerância, as plantas foram avaliadas visualmente quanto à saúde da folha, raio da planta e florescência no 8o Dia pós-aplicação de herbicida. Controles não tratados com saúde perfeita receberam a classificação de 7-8 sob o mesmo sistema.

Informações Importantes Sobre A Listagem De Seqüências ID. DE SEQ. N° : 1 - Seqüência de aminoácidos de GloxA. ID. DE SEQ. N°: 2 - Seqüência de nucleotídeos que codifica GloxA.

ID. DE SEQ. N° : 3 - Seqüência de aminoácidos de GOX. IDS. DE SEQ. Nos: 4 e 5 - Iniciadores de oligonucleotldeo. ID. DE SEQ. N°: 6 - Seqüência codificadora de GloxA otimizada para expressão em plantas, inclui sítios de clonagem adicionados nas extremidades 5' e 3', além de AACA imediatamente antes do códon de início.

ID. DE SEQ. N°: 7 - Seqüência codificadora de GloxA otimizada para expressão em E. coli.

ID. DE SEQ. N° : 8 - BOBL de Brevibacterium linens BL2.

ID. DE SEQ. N° : 9 - GloxD de Arthobacter aurescens TC 1.

Descrição Detalhada Da Invenção Técnicas gerais

A menos que especificamente definido de forma diferente, todos os termos técnicos e científicos aqui

usados devem ser considerados como tendo o mesmo significado comumente entendido por aqueles habilitados na técnica (por exemplo, em cultura de células, genética molecular, imunologia, imunoistoquímica, química de proteínas e bioquímica).

A menos que indicado de forma diferente, a proteína recombinante, a cultura de células e as técnicas imunológicas utilizadas na presente invenção são procedimentos padronizados, bem conhecidos por aqueles habilitados na técnica. Essas técnicas são descritas e explicadas na literatura em fontes como, por exemplo, J. Perbal, "A Practical Guide to Molecular Cloning", John Wiley e Sons (1984), J. Sambrook e cols. , "Molecular Cloning: A Laboratory Manual", Cold Spring Harbour Laboratory Press (1989), T. A. Brown (editor), "Essential Molecular Biology: A Practical Approach", Volumes 1 e 2, IRL Press (1991), D.M. Glover e B.D. Hames (editores), "DNA Cloning: A Practical Approach", Volumes 1-4, IRL Press (1995 e 1996) e F.M. Ausubel e cols. (editores) , "Current Protocols in Molecular Biology", Greene Pub. Associates and Wiley-Interscience (1988, incluindo todas as atualizações até a presente data), Ed Harlow e David Lane (editores) "Antibodies: A Laboratory Manual", Cold Spring Harbour Laboratory, (1988) e J.E. Coligan e cols. (editores) wCurrent Protocols in Immunology", John Wiley & Sons (incluindo todas as atualizações até a presente data), e são aqui incorporados por referência. Herbicidas que contêm amina

Herbicidas que contêm amina incluem qualquer molécula com um grupo amina que, quando aplicado de forma exógena a uma planta, possua um efeito deletério sobre a referida planta. Em uma modalidade, o herbicida que contém amina é um organofosfonato. Exemplos de herbicidas que contêm amina incluem, sem limitação, glifosato, glufosinato, bilanafos e glifosina.

Como aqui usado, o termo "glifosato" refere-se coletivamente ao herbicida parente N-fosfonometilglicina (também conhecido como ácido de glifosato), às suas formas iônicas, a um sal ou éster deste, ou a um composto que seja convertido em N-fosfonometilglicina em tecidos de plantas ou que de algum outro modo forneça N-fosfonometilglicina em forma iônica (também conhecido como íon de glifosato) . Os sais de glifosato incluem, sem limitação, sais de metal alcalino, por exemplo, sais de sódio e potássio; sal de amônio; C1-16 alquilamônio, por exemplo, sais de dimetilamônio e isopropilamônio; C1-16 alcanolamônio, por exemplo, sais de monoetanolamônio; C1-16 alquilsulfônio, por exemplo, sais de trimetilsulfônio; misturas destes e semelhantes. A molécula de ácido de glifosato possui três sítios ácidos que possuem diferentes valores de pKa; conseqüentemente, podem ser usados sais mono-, di- e tribásicos, ou qualquer mistura destes, ou sais de qualquer nível intermediário de neutralização. O glifosato é I ingrediente ativo de Roundup™ (Monsanto Co.). Exemplos de formulações comerciais de glifosato incluem, sem restrição, aqueles vendidos pela Indústria Monsanto como os herbicidas ROUNDUP™, ROUNDUP™ ULTRA, ROUNDUP™ ULTRAMAX, ROUNDUP™ WEATHERMAX, ROUNDUP™ CT, ROUNDUP™ EXTRA, ROUNDUP™ BIACTIVE, ROUNDUP™ BIOFORCE, RODEO™, POLARIS™, SPARK™ e ACCORD™, todos contendo glifosato como seu sal de isopropilamônio; aqueles vendidos pela Indústria Monsanto como os herbicidas ROUNDUP™ DRY e RIVAL™, que contêm glifosato como seu sal de amônio; aquele vendido pela Indústria Monsanto como ROUNDUP™ GEOFORCE, que contém glifosato como seu sal de sódio; e aquele vendido por Syngenta Crop Protection como o herbicida TOUCHDOWN™, que contém glifosato como seu sal de trimetilsulf ônio. 0 glifosato é fitotóxico em função de sua inibição da via do ácido chiquímico, que fornece um precursor para a síntese de aminoácidos aromáticos. O glifosato inibe a enzima 5- enolpiruvil-3-fosfochiquimato sintase (EPSPS) encontrada em plantas.

Como aqui usado, o termo "glufosinato" refere-se ao ácido 2-amino-4-(hidroximetilfosfinil) butanõico e suas formas iônicas, ésteres e sais, particularmente o sal de amônio. 0 glufosinato é um herbicida sistêmico não seletivo que é o ingrediente ativo de BASTA™, RELY™, FINALE™, CHALLENGE™ e LIBERTY™. 0 gluf osinato interfere com a via biossintética do aminoãcido glutamina e com a detoxificação de amônia.

Como aqui usado, "bilanafos" refere-se à 4- hidróxi (metil) fosf inoil-L-homoalanil-L-alanil-L-alanina e suas formas iônicas, ésteres e sais.

Como aqui usado, "glifosina" refere-se à N,N-bis(p- fosfionometil)glicina e suas formas iônicas, ésteres e sais.

Polipeptídeos

O termo "polipeptídeo substancialmente purificado" ou "purificado" significa um polipeptídeo que foi separado de um ou mais lipídeos, ácidos nucléicos, outros polipeptídeos ou outras moléculas contaminantes com as quais está associado em seu estado nativo. Prefere-se que o polipeptídeo substancialmente purificado seja pelo menos 60% livre, mais preferivelmente pelo menos 75% livre, e mais preferivelmente pelo menos 90% livre de outros componentes com os quais está naturalmente associado. Como será observado por aqueles habilitados na técnica, o polipeptideo purificado pode ser um polipeptídeo produzido de forma recombinante.

Os termos "polipeptídeo" e "proteína" são geralmente usados de forma intercambiável e referem-se a uma única cadeia polipeptídica que pode ser ou não modificada por adição de grupos não aminoácidos. Entende-se que essas cadeias polipeptídicas podem se associar a outros polipeptídeos ou proteínas ou a outras moléculas como, por exemplo, co-fatores. Os termos "proteínas" e "polipeptídeos" de Willis, como aqui usados, também incluem variantes, mutantes, modificações, análogos e/ou derivados dos polipeptídeos da invenção, como aqui descritos.

Como aqui usado, um polipeptídeo "solúvel" não se associa a uma bicamada lipídica como, por exemplo, uma membrana celular.

O % de identidade de um polipeptídeo é determinado por análise GAP (Needleman e Wunsch, 1970) (programa GCG) com a penalidade de criação de gap (lacuna) =5, e uma penalidade de extensão de gap = 0,3. A seqüência em questão possui pelo menos 25 aminoácidos de comprimento, e a análise GAP alinha as duas seqüências sobre uma região de pelo menos 25 aminoácidos. Mais preferivelmente, a seqüência em questão possui pelo menos 50 aminoácidos de comprimento, e a análise GAP alinha as duas seqüências sobre uma região de pelo menos 50 aminoãcidos. Mais preferivelmente, a seqüência em questão possui pelo menos 100 aminoácidos de comprimento, e a análise GAP alinha as duas seqüências sobre uma região de pelo menos 100 aminoácidos. Ainda mais preferivelmente, a seqüência em questão possui pelo menos 250 aminoácidos de comprimento, e a análise GAP alinha as duas seqüências sobre uma região de pelo menos 250 aminoácidos. Ainda mais pref erivelmente, a análise GAP alinha as duas seqüências sobre todo o comprimento.

Como aqui usado, o termo fragmento "biologicamente ativo" é uma porção de um polipeptídeo da invenção que mantém uma atividade definida do polipeptídeo de comprimento total, sendo especificamente capaz de clivar um herbicida que contém amina, especialmente glifosato. Fragmentos biologicamente ativos podem ser de qualquer tamanho, desde que mantenham a atividade definida. De preferência, fragmentos biologicamente ativos possuem pelo menos 100,. mais preferivelmente pelo menos 200 e, ainda mais preferivelmente, pelo menos 350 aminoácidos de comprimento.

Com relação a um polipeptídeo definido, será observado que valores de % de identidade maiores do que aqueles fornecidos acima englobarão modalidades preferidas. Dessa forma, quando aplicável, à luz dos valores mínimos de % de identidade, prefere-se que o polipeptídeo compreenda uma seqüência de aminoácidos que é pelo menos 4 0%, mais preferivelmente pelo menos 45%, mais preferivelmente pelo menos 50%, mais preferivelmente pelo menos 55%, mais preferivelmente pelo menos 60%, mais preferivelmente pelo menos 65%, mais preferivelmente pelo menos 70%, mais preferivelmente pelo menos 75%, mais preferivelmente pelo menos 80%, mais preferi velmente pelo menos 85%, mais pref erivelmente pelo menos 90%, mais pref erivelmente pelo menos 91%, mais pref erivelmente pelo menos 92%, mais pref erivelmente pelo menos 93%, mais pref erivelmente pelo menos 94%, mais pref erivelmente pelo menos 95%, mais pref erivelmente pelo menos 96%, mais pref erivelmente pelo menos 97%, mais preferivelmente pelo menos 98%, mais pref erivelmente pelo menos 99%, mais preferivelmente pelo menos 99,1%, mais preferivelmente pelo menos 99,2%, mais preferivelmente pelo menos 99,3%, mais preferivelmente pelo menos 99,4%, mais preferivelmente pelo menos 99,5%, mais preferivelmente pelo menos 99,6%, mais preferivelmente pelo menos 99,7%, mais preferivelmente pelo menos 99,8% e, ainda mais preferivelmente, pelo menos 99,9% idêntica ao ID. DE SEQ. N0 proposto relevante.

Mutantes da seqüência de aminoácidos dos polipeptídeos da presente invenção podem ser preparados por introdução de mudanças de nucleotídeos apropriadas em um ácido nucléico da presente invenção, ou por síntese in vitro do polipeptídeo desejado. Esses mutantes incluem, por exemplo, eliminações, inserções ou substituições de resíduos dentro da seqüência de aminoácidos. Pode ser feita uma combinação de eliminação, inserção e substituição para se chegar à construção final, desde que o produto polipeptídico final possua as características desejadas.

Polipeptídeos mutantes (alterados) podem ser preparados com a utilização de qualquer metodologia conhecida na técnica. Por exemplo, um polinucleotídeo da invenção pode ser submetido a mutagênese in vitro. Tais técnicas de mutagênese in vitro incluem a subclonagem do polinucleotídeo em um vetor adequado, a transformação do vetor em uma cepa "mutadora" como, por exemplo, a E. coli XL-I vermelha (Stratagene) e a propagação das bactérias transformadas por um número adequado de gerações. Em outro exemplo, os polinucleotídeos da invenção são submetidos a técnicas de embaralhamento de DNA, descritas de forma ampla por Harayama (1998) . Essas técnicas de embaralhamento de DNA podem incluir genes relacionados àqueles da presente invenção, por exemplo, outras oxidorredutases de bactérias (por exemplo, um polinucleotídeo que codifica o ID. DE SEQ. N°: 8). Os produtos derivados do DNA mutado/alterado podem facilmente ser rastreados com o usa das técnicas aqui descritas para determinar se são capazes de clivar um herbicida que contém amina como, por exemplo, glifosato.

No projeção dos mutantes da seqüência de aminoácidos, a localização do sítio de mutação e a natureza da mutação dependerão da(s) característica (s) a ser modificada. Os sítios para mutação podem ser modificados individualmente ou em série, por exemplo, (1) substituindo-se, inicialmente, com escolhas de aminoácido conservadores e depois com seleções mais radicais, dependendo dos resultados obtidos, (2) eliminando-se o resíduo-alvo, ou (3) inserindo-se outros resíduos adjacentes ao sítio localizado.

Eliminações de seqüência de aminoácidos geralmente variam de cerca de 1 a 15 resíduos, mais preferivelmente cerca de 1 a 10 resíduos e, tipicamente, cerca de 1 a 5 resíduos contíguos.

Mutantes por substituição possuem pelo menos um resíduo de aminoácido na molécula de polipeptídeo removido, e um resíduo diferente inserido em seu lugar. Os sítios de maior interesse para a mutagênese por substituição incluem sítios identificados como importantes para a função.

Outros sítios de interesse são aqueles nos quais resíduos específicos obtidos de várias cepas ou espécies são idênticos. Essas posições podem ser importantes para a atividade biológica. Esses sítios, especialmente aqueles que caem dentro de uma seqüência de pelo menos três outros sítios conservados identicamente, são preferivelmente substituídos de uma forma relativamente conservadora. Essas substituições conservadoras são mostradas na Tabela 1 sob o cabeçalho de "substituições exemplares".

Tabela 1. Substituições exemplares

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Além disso, se desejado, aminoácidos não naturais ou análogos químicos de aminoácidos podem ser introduzidos como uma substituição ou adição nos polipeptídeos da presente invenção. Esses aminoácidos incluem, sem limitação, os isômeros D dos aminoácidos comuns, ácido 2,4- diaminobutírico, ácido α-amino isobutírico, ácido 4- aminobutírico, ácido 2-aminobutírico, ácido 6-amino hexanóico, ácido 2-amino isobutírico, ácido 3-amino propiônico, ornitina, norleucina, norvalina, hidroxiprolina, sarcosina, citrulina, homocitrulina, ácido cistéico, t-butilglicina, t-butilalanina, fenilglicina, ciclohexilalanina, β-alanina, flúor-aminoácidos, aminoácidos projetados como, por exemplo, β-metil aminoácidos, Ca-metil aminoácidos, Να-metil aminoácidos e análogos de aminoácidos em geral.

Também são incluídos dentro do escopo da invenção polipeptídeos da presente invenção que são modificados diferencialmente durante ou após a síntese, por exemplo, por biotinilação, benzilação, glicosilação, acetilação, fosforilação, amidação, derivatização por grupos de proteção/bloqueio conhecidos, clivagem proteolítica, ligação a uma molécula de anticorpo ou a outro ligante celular etc. Essas modificações podem servir para aumentar a estabilidade e/ou a bioatividade do polipeptídeo da invenção.

Os polipeptídeos da presente invenção podem ser produzidos de diversas formas, incluindo produção e recuperação de polipeptídeos naturais, produção e recuperação de polipeptídeos recombinantes e síntese química dos polipeptídeos. Em uma modalidade, um polipeptídeo isolado da presente invenção é produzido por cultivo de uma célula capaz de expressar o polipeptídeo sob condições eficazes para a produção do polipeptídeo, e recuperação do polipeptídeo. Uma célula preferida para a cultura é uma célula recombinante da presente invenção. Condições de cultura eficazes incluem, sem limitação, meios eficazes, condições do biorreator, temperatura, pH e oxigênio que permitem a produção do polipeptídeo. Um meio eficaz refere-se a qualquer meio no qual uma célula seja cultivada para a produção de um polipeptídeo da presente invenção. Esse meio tipicamente compreende um meio aquoso que possui fontes assimiláveis de carbono, nitrogênio e fosfato, e sais, minerais, metais e outros nutrientes apropriados, por exemplo, vitaminas. As células da presente invenção podem ser cultivadas em biorreatores de fermentação convencionais, frascos de agitação, tubos de ensaio, placas de microtitulação e placas de Petri. 0 cultivo pode ser efetuado em uma temperatura, pH e teor de oxigênio adequados a uma célula recombinante. Essas condições de cultivo estão incluídas no conhecimento daqueles habilitados na técnica. Polinucleotídeos e oligonucleotxdeos

O termo "polinucleotídeo isolado", incluindo DNA, RNA, ou uma combinação destes, de fita simples ou dupla, na orientação senso ou anti-senso ou uma combinação de ambas, dsRNA ou outro, significa um polinucleotídeo que é pelo menos parcialmente separado das seqüências polinucleotídicas com a qual está associado ou ligado em seu estado nativo. De preferência, o polinucleotídeo isolado é pelo menos 60% livre, preferivelmente pelo menos 75% livre e, principalmente, pelo menos 90% livre de outros componentes com os quais estão naturalmente associados. Como é do conhecimento daqueles habilitados na técnica, um polinucleotídeo isolado pode ser um polinucleotídeo exógeno presente, por exemplo, em um organismo transgênico que não compreende naturalmente o polinucleotídeo. Além disso, o termo "polinucleotídeo" é aqui usado de forma intercambiável com o termo "ácido nucléico".

O % de identidade de um polinucleotídeo é determinado por análise GAP (Needleman e Wunsch, 1970) (programa GCG), com uma penalidade de criação de gap =5, e uma penalidade de extensão de gap = 0,3. A menos que estabelecido de forma diferente, a seqüência em questão possui pelo menos 45 nucleotídeos de comprimento, e a análise GAP alinha as duas seqüências sobre uma região de pelo menos 4 5 nucleotídeos. De preferência, a seqüência em questão possui pelo menos 150 nucleotídeos de comprimento, e a análise GAP alinha as duas seqüências sobre uma região de pelo menos 15 0 nucleotídeos. Mais preferivelmente, a seqüência em questão possui pelo menos 3 00 nucleotídeos de comprimento, e a análise GAP alinha as duas seqüências sobre uma região de pelo menos 3 00 nucleotídeos. Ainda mais preferivelmente, a análise GAP alinha as duas seqüências sobre todo o comprimento. Com relação aos polinucleotídeos definidos, será observado que valores do % de identidade maiores do que aqueles fornecidos acima englobarão modalidades preferidas. Dessa forma, quando aplicável, à luz dos valores mínimos do % de identidade, prefere-se que um polinucleotídeo da invenção compreenda uma seqüência que é pelo menos 40%, mais preferivelmente pelo menos 45%, mais preferivelmente pelo menos 50%, mais pref erivelmente pelo menos 55%, mais preferivelmente pelo menos 60%, mais preferivelmente pelo menos 65%, mais pref erivelmente pelo menos 70%, mais preferivelmente pelo menos 75%, mais preferivelmente pelo menos 80%, mais pref erivelmente pelo menos 85%, mais pref erivelmente pelo menos 90%, mais pref erivelmente pelo menos 91%, mais pref erivelmente pelo menos 92%, mais pref erivelmente pelo menos 93%, mais pref erivelmente pelo menos 94%, mais pref erivelmente pelo menos 95%, mais preferivelmente pelo menos 96%, mais preferivelmente pelo menos 97%, mais pref erivelmente pelo menos 98%, mais preferivelmente pelo menos 99%, mais preferivelmente pelo menos 99,1%, mais preferivelmente pelo menos 99,2%, mais preferivelmente pelo menos 99,3%, mais preferivelmente pelo menos 99,4%, mais preferivelmente pelo menos 99,5%, mais preferivelmente pelo menos 99,6%, mais preferivelmente pelo menos 99,7%, mais preferivelmente pelo menos 99,8% e, ainda mais preferivelmente, pelo menos 99,9% idêntica ao ID. DE SEQ. N0 proposto relevante.

Como aqui usado, o termo "gene" deve ser considerado em seu contexto mais amplo, e inclui as seqüências de desoxirribonucleotídeo que compreendem a região codificadora de proteína de um gene estrutural, e que inclui seqüências localizadas adjacentes à região codificadora tanto na extremidade 5' quanto na extremidade 31 , por uma distância de pelo menos cerca de 2 kb em uma das extremidades. As seqüências que estão localizadas 5' da região codificadora e que estão presentes no mRNA são denominadas seqüências não traduzidas 5. As seqüências que estão localizadas 3' ou abaixo da região codificadora e que estão presentes no mRNA são denominadas seqüências não traduzidas 3. O termo "gene" engloba tanto cDNA quanto formas genômicas de um gene. O termo "gene" inclui uma molécula sintética ou de fusão que codifica todas ou parte das proteínas da invenção aqui descritas, e uma seqüência de nucleotídeos complementar a qualquer uma das acima.

Como aqui usada, a frase "condições rigorosas" refere- se às condições sob as quais um polinucleotídeo, uma sonda, um iniciador e/ou um oligonucleotídeo irá hibridizar para sua seqüência-alvo, mas para nenhuma outra seqüência. Condições rigorosas são seqüência-dependentes, e serão diferentes em diferentes circunstâncias. Seqüências mais longas hibridizam especificamente em temperaturas mais elevadas do que seqüências mais curtas. Geralmente, condições rigorosas são selecionadas para serem cerca de 5°C mais baixas do que o ponto térmico de fusão (Tm) para a seqüência específica em uma força iônica e pH definidos. A Tm é a temperatura (sob força iônica, pH e ácido nucléico concentração definidos) na qual 50% das sondas complementares à seqüência-alvo hibridizam pra a seqüência- alvo em equilíbrio. Como as seqüências-alvo estão geralmente presentes em excesso, na Tm, 50% das sondas estão ocupadas em equilíbrio. Tipicamente, condições rigorosas serão aquelas nas quais a concentração de sal é menor do que cerca de 1,0 M de íon sódio, tipicamente cerca de 0,01 a 1,0 M de íon sódio (ou de outros sais) em pH 7,0 a 8,3, e a temperatura é de pelo menos cerca de 30°C para sondas, iniciadores ou oligonucleotídeos curtos (por exemplo, 10 nt a 50 nt) , e de pelo menos cerca de 60°C para sondas, iniciadores e oligonucleotídeos mais longos. Condições rigorosas também podem ser obtidas com a adição de agentes desestabilizantes como, por exemplo, formamida.

Condições rigorosas são conhecidas por aqueles habilitados na técnica, e podem ser encontradas em Ausubel e cols. (supra), "Current Protocols In Molecular Biology", John Wiley & Sons, N.Y. (1989), 6.3.1-6.3.6, bem como nos Exemplos aqui descritos. De preferência, as condições são tais que as seqüências pelo menos cerca de 65%, 70%, 75%, 85%, 90%, 95%, 98%, ou 99% homólogas entre elas tipicamente permanecem hibridizadas entre elas. üm exemplo não limitante de condições rigorosas de hibridização consiste na hibridização em um tampão de sal elevado que compreende 6 x SSC, 50 mM de Tris-HCl (pH 7,5), 1 mM de EDTA, PVP 0,02%, Ficoll 0,02%, BSA 0,02% e 500 mg/ml de DNA desnaturado de esperma de salmão a 65°C, seguido por uma ou mais lavagens em 0,2 x SSC, BSA 0,01% a 50°C. Em outra modalidade, é fornecida uma seqüência de ácidos nucléicos que pode ser hibridizada para a molécula de ácido nucléico que compreende a seqüência de nucleotídeos do ID. DE SEQ. N°: 2, 6 e/ou 7, sob condições de rigor moderado. Um exemplo não limitante de condições de hibridização de rigor moderado consiste na hibridização em 6 χ SSC, 5 x solução de Denhardt, SDS 0,5% e 100 mg/ml de DNA desnaturado de esperma de salmão a 55°C, seguida por uma ou mais lavagens em 1 χ SSC, SDS 0,1% a 37°C. Outras condições de rigor moderado que podem ser usadas são bem conhecidas na técnica; veja, por exemplo, Ausubel e cols. {supra) e Kriegler, 1990; uGene Transfer And Expression, A Laboratory Manual", Stockton Press, NY. Em outra modalidade, é fornecido um ácido nucléico que pode ser hibridizado para a molécula de ácido nucléico que compreende as seqüências de nucleotídeos do ID. DE SEQ. N°: 1, 6 e/ou 7, sob condições de baixo rigor. Um exemplo não limitante de condições de hibridização de baixo rigor consiste na hibridização em formamida 35%, 5 χ SSC, 50 mM de Tris-HCl (pH 7,5), 5 mM de EDTA, PVP 0,02%, Ficoll 0,02%, BSA 0,2%, 100 mg/ml de DNA desnaturado de esperma de salmão, 10% (peso/vol) sulfato de dextrana a 40°C, seguido por uma ou mais lavagens em 2 χ SSC, 25 mM de Tris-HCl (pH 7,4), 5 mM de EDTA e SDS 0,1% a 50°C. Outras condições de baixo rigor que podem ser usadas são bem conhecidas na técnica; veja, por exemplo, Ausubel e cols. (supra) e Kriegler, 1990, "Gene Transfer And Expression, A Laboratory Manual", Stockton Press, NY, bem como os Exemplos aqui fornecidos.

Os polinucleotídeos da presente invenção podem possuir, quando comparados com as moléculas de ocorrência natural, uma ou mais mutações que sejam eliminações, inserções ou substituições de resíduos de nucleotídeos. Os mutantes podem ser de ocorrência natural (ou seja, isolados de uma fonte natural) ou sintéticos (por exemplo, com a realização de mutagênese sítio-dirigida no ácido nucléico) .

Os oligonucleotídeos da presente invenção podem ser RNA, DNA ou derivados de um dos dois. Embora os termos polinucleotídeo e oligonucleotídeo possuam um significado sobreposto, os oligonucleotídeos são tipicamente moléculas de fita simples relativamente curtas. O tamanho mínimo desses oligonucleotídeos é o tamanho necessário para a formação de um híbrido estável entre um oligonucleotídeo e uma seqüência complementar em uma molécula de ácido nucléico-alvo. De preferência, os oligonucleotídeos possuem comprimento de pelo menos 15 nucleotídeos, mais preferivelmente pelo menos 18 nucleotídeos, mais preferivelmente pelo menos 19 nucleotídeos, mais preferivelmente pelo menos 20 nucleotídeos, ainda mais preferivelmente pelo menos 25 nucleotídeos.

Normalmente, monômeros de um polinucleotídeo ou um oligonucleotídeo estão ligados por ligações fosfodiéster ou análogos destas, para formar oligonucleotídeos com tamanho que varia de unidades monoméricas relativamente curtas, por exemplo, 12-18, a várias centenas de unidades monoméricas. Análogos de ligações fosfodiéster incluem: fosforotiotato, fosforoditiotato, fosforoselenoato, fosforodisselenoato, fosforoanilotiotato, fosforanilidato, fosforamidato.

A presente invenção inclui oligonucleotídeos que podem ser usados como, por exemplo, sondas, para identificar moléculas de ácido nucléico, ou iniciadores para a produção de moléculas de ácido nucléico. Os oligonucleotídeos da presente invenção usados como sonda são tipicamente conjugados a um marcador detectável como, por exemplo, um radioisótopo, uma enzima, biotina, uma molécula fluorescente ou uma molécula quimioluminescente.

Sondas e/ou iniciadores podem ser usados para clonar homólogos dos polinucleotídeos da invenção de outras espécies. Além disso, também podem ser utilizadas metodologias de hibridização conhecidas na técnica para rastrear bibliotecas genômicas ou de cDNA em busca desses homólogos.

Vetores recombinantes

Uma modalidade da presente invenção inclui um vetor recombinante, que compreende pelo menos uma molécula de polinucleotídeo isolado da presente invenção, inserida em qualquer vetor capaz de liberar a molécula de polinucleotídeo em uma célula hospedeira. Um vetor desse tipo contém seqüências polinucleotídicas heterõlogas, ou seja, seqüências polinucleotídicas que não são encontradas naturalmente adjacentes às moléculas de polinucleotídeo da presente invenção, e que preferivelmente são derivadas de uma espécie diferente daquela espécie da qual as moléculas de polinucleotídeo são derivadas. 0 vetor pode ser RNA ou DNA, procarótico ou eucariõtico, e tipicamente é um transposon (como descrito, por exemplo, na Patente U.S. 5.792.294), um vírus ou um plasmídeo.

Um tipo de vetor recombinante compreende uma molécula de polinucleotídeo da presente invenção ligada operacionalmente a um vetor de expressão. A frase "ligada operacionalmente" refere-se à inserção de uma molécula de polinucleotídeo em um vetor de expressão de tal forma que a molécula seja capaz de ser expressa quando transformada em uma célula hospedeira. Como aqui usado, o termo "vetor de expressão" é um vetor de DNA ou RNA que é capaz de transformar uma célula hospedeira e de efetuar a expressão de uma molécula de polinucleotídeo especificada. De preferência, o vetor de expressão também é capaz de se replicar dentro da célula hospedeira. Vetores de expressão podem ser procarióticos ou eucarióticos, e são tipicamente vírus ou plasmídeos. Os vetores de expressão da presente invenção incluem quaisquer vetores que funcionam (ou seja, dirigem a expressão gênica) em células recombinantes da presente invenção, incluindo em células bacterianas, fúngicas, de endoparasitas, de artrópodes, de animais e de plantas. Os vetores da invenção também podem ser usados para a produção do polipeptídeo em um sistema de expressão sem células, por exemplo, sistemas bem conhecidos na técnica.

O termo "ligado operacionalmente", como aqui usado, refere-se a um relacionamento funcional entre dois ou mais segmentos de ácido nucléico (por exemplo, DNA) . Tipicamente, refere-se ao relacionamento funcional de um elemento regulador da transcrição com uma seqüência transcrita. Por exemplo, um promotor está ligado operacionalmente a uma seqüência codificadora, por exemplo, um polinucleotídeo aqui definido, caso ele estimule ou module a transcrição da seqüência codificadora em uma célula hospedeira apropriada e/ou em um sistema de expressão sem células. Geralmente, elementos promotores reguladores da transcrição que estão ligados operacionalmente a uma seqüência transcrita são fisicamente contíguos à seqüência transcrita, ou seja, eles possuem atuação eis. No entanto, alguns elementos reguladores da transcrição, por exemplo, intensificadores, não precisam estar fisicamente contíguos ou localizados proximamente às seqüências codificadoras cuja transcrição intensificam.

Em particular, os vetores de expressão da presente invenção contêm seqüências reguladoras como, por exemplo, seqüências de controle da transcrição, seqüências de controle da tradução, origens de replicação e outras seqüências reguladoras que sejam compatíveis com a célula recombinante e que controlem a expressão das moléculas de polinucleotídeo da presente invenção. Em particular, as moléculas recombinantes da presente invenção incluem seqüências de controle da transcrição. Seqüências de controle da transcrição são seqüências que controlam a iniciação, prolongamento e terminação da transcrição. Seqüências de controle da transcrição particularmente importantes são aquelas que controlam a iniciação da transcrição, por exemplo, seqüências promotoras, intensificadoras, operadoras e repressoras. Seqüências de controle da transcrição adequadas incluem qualquer seqüência de controle da transcrição que possa funcionar em pelo menos uma das células recombinantes da presente invenção. Várias dessas seqüências de controle da transcrição são conhecidas por aqueles habilitados na técnica. Seqüências de controle da transcrição preferidas incluem aquelas que funcionam em células bacterianas, de leveduras, de artrópodes, de nematódeos, de plantas ou de mamíferos como, por exemplo, sem limitação, promotores tac, lac, trp, trc, oxi-pro, omp/lpp, rrnB, de bacteriófago lambda, de bacteriófago T7, T7lac, de bacteriófago T3, de bacteriófago SP6, de bacteriófago SPOl, de metalotioneína, de fator de combinação alfa, de álcool oxidase Pichia, subgenômico de alfavírus (por exemplo, promotores subgenômicos do vírus Sindbis), gene de resistência a antibiótico, baculovírus, de vírus de inseto Heliothis zea, do vírus da vacínia, de herpesvírus, poxvírus do guaxinim, outros poxvírus, adenovírus, citomegalovírus (por exemplo, promotores iniciais intermediários), vírus símio 40, retrovírus, actina, repetição do terminal longo retroviral, vírus do sarcoma de Rous, do choque térmico, seqüências de controle da transcrição fosfato e nitrato, além de outras seqüências capazes de controlar a expressão gênica em células procarióticas ou eucarióticas.

As seqüências codificadoras dos polipeptídeos da invenção podem ser otimizadas para maximizar a expressão em uma célula hospedeira específica com o uso de técnicas conhecidas. Por exemplo, o ID. DE SEQ. N°: 6 fornece um quadro de leitura aberta que codifica o ID. DE SEQ. N°: 1 construído para a expressão aumentada em uma célula de planta, enquanto o ID. DE SEQ. N°: 7 fornece um quadro de leitura aberta que codifica o ID. DE SEQ. N°: 1 construído para a expressão aumentada em E. coli. Células hospedeiras

Outra modalidade da presente invenção inclui uma célula recombinante que compreende uma célula hospedeira transformada com uma ou mais moléculas recombinantes da presente invenção, ou células descendentes destas. A transformação de uma molécula de polinucleotídeo em uma célula pode ser obtida por qualquer método pelo qual uma molécula de polinucleotídeo possa ser inserida na célula. Técnicas de transformação incluem, sem limitação, transfecção, eletroporação, microinjeção, lipofecção, adsorção e fusão de protoplasto. Uma célula recombinante pode permanecer unicelular ou pode crescer em um tecido, órgão ou um organismo multicelular. As moléculas de polinucleotldeo transformadas da presente invenção podem permanecer extracromossômicas ou podem ser integrar em um ou mais sítios dentro de um cromossomo da célula transformada (ou seja, recombinante) de tal forma que sua habilidade para ser expressa seja retida.

Células hospedeiras adequadas para transformação incluem qualquer célula que possa ser transformada com um polinucleotldeo da presente invenção. As células hospedeiras da presente invenção podem ser capazes endogenamente (ou seja, naturalmente) de produzir os polipeptídeos da presente invenção, ou podem ser capazes de produzir esses polipeptídeos após serem transformadas com pelo menos uma molécula de polinucleotldeo da presente invenção. As células hospedeiras da presente invenção podem ser qualquer célula capaz de produzir pelo menos uma proteína da presente invenção, e incluem células bacterianas, füngicas (incluindo leveduras), de parasitas, de nematódeos, de artrópodes, de animais e de plantas. Exemplos de células hospedeiras incluem Salmonellal Escheriehia, Bacillus, histeria, Saccharomyces, Spodoptera, Myeobaeterial Trichoplusia, células BHK (rim de filhote de hamster), células MDCK, células CRFK, células CV-1, células COS (por exemplo, COS-7) e células Vero. Exemplos adicionais de células hospedeiras são E. eoli, incluindo derivados K-12 de E. eoli; Salmonella typhi; Salmonella typhimurium, incluindo cepas atenuadas; Spodoptera frugiperda; Trichoplusia ni; e células não tumorigênicas de mioblasto de camundongo G8 (por exemplo, ATCC CRL 124 6). Células hospedeiras particularmente preferidas são células de plantas. Podem ser usadas tecnologias de DNA recombinante para aumentar a expressão de uma molécula de polinucleotídeo transformada por manipulação, por exemplo, do número de cópias da molécula de polinucleotídeo dentro de uma célula hospedeira, da eficiência com a qual aquelas moléculas de polinucleotídeo são transcritas, da eficiência com a qual os transcritos resultantes são traduzidos e da eficiência de modificações pós-tradução. Técnicas recombinantes úteis para o aumento da expressão de moléculas de polinucleotídeo da presente invenção incluem, sem limitação, a ligação operacional de moléculas de polinucleotídeo a plasmídeos com número de cópia elevado, integração da molécula de polinucleotídeo em um ou mais cromossomos da célula hospedeira, adição de seqüências de estabilidade de vetor aos plasmídeos, substituições ou modificações dos sinais de controle da transcrição (por exemplo, promotores, operadores, intensificadores), substituições ou modificações de sinais de controle da tradução (por exemplo, sítios de ligação de ribossomo, seqüências de Shine-Dalgarno), modificação de moléculas de polinucleotídeo da presente invenção para corresponder ao uso de códon da célula hospedeira e a eliminação de seqüências que desestabilizam os transcritos.

Plantas transgênicas

O termo "planta", quando aqui usado como substantivo, refere-se a plantas inteiras, mas quando usado como adjetivo, refere-se a qualquer substância que esteja presente em, seja obtida de, derivada de, ou relacionada a uma planta, como, por exemplo, órgãos de plantas (por exemplo, folhas, caules, raízes, flores), células únicas (por exemplo, pólen), sementes, células de plantas e semelhantes.

As plantas contempladas para uso na prática da presente invenção incluem tanto monocotiledôneas quanto 5 dicotiledôneas. Plantas-alvo incluem, sem limitação, as seguintes: cereais (trigo, cevada, centeio, aveia, arroz, sorgo e cultivos relacionados); beterraba (beterraba sacarina e beterraba-forrageira) ,· maçãs, frutas com caroço e frutas sem caroço (maçãs, pêras, ameixas, pêssegos, amêndoas, cerejas, morangos, framboesas e amoras silvestres); plantas leguminosas (feijões, lentilhas, ervilhas, sojas); plantas oleaginosas (colza, mostarda, papoula, olivas, girassóis, coco, plantas de óleo de rícino, grãos de cacau, amendoins); plantas de pepino (abóboras, pepinos, melões); plantas de fibra (algodão, linho, cânhamo, juta); frutas cítricas (laranjas, limões, toronja, mandarinas); vegetais (espinafre, alface, aspargo, repolhos, cenouras, cebolas, tomates, batatas, páprica); lauráceas (abacates, canela, cânfora); ou plantas como milho, tabaco, nozes, café, cana de açúcar, chá, vinhas, lúpulo, turfa, bananas e plantas de borracha natural, além de plantes ornamentais (flores, arbustos, árvores com folhas amplas e perenes, por exemplo, coníferas). De preferência, as plantas são angiospermas.

Plantas transgênicas, como definidas no contexto da presente invenção, incluem plantas (além de partes e células das referidas plantas) e sua prole que foram modificadas geneticamente com o uso de técnicas recombinantes para causar a produção de pelo menos um polipeptídeo da presente invenção na planta ou órgão de planta desejado. Plantas transgênicas podem ser produzidas com o uso de metodologias conhecidas na técnica, por exemplo, aquelas descritas de forma geral em A. Slater e cols., "Plant Biotechnology - The Genetic Manipulation of Plants", Oxford University Press (2003), e P. Christou e H. Klee, "Handbook of Plant Biotechnology", John Wiley e Sons (2004) .

Uma "planta transgênica" refere-se a uma planta que contém uma construção gênica ("transgene") não encontrada em uma planta do tipo selvagem da mesma espécie, variedade ou cultivar. Um "transgene", como aqui citado, possui o significado normal na técnica da biotecnologia, e inclui uma seqüência genética que foi produzida ou alterada por tecnologia de DNA ou RNA recombinante, e que foi introduzida na célula de planta. 0 transgene pode incluir seqüências genéticas derivadas de uma célula de planta. Tipicamente, o transgene foi introduzido na planta por manipulação humana como, por exemplo, por transformação, mas qualquer método pode ser usado, como é reconhecido por aqueles habilitados na técnica.

Em uma modalidade preferida, as plantas transgênicas são homozigotas para cada um e para todos os genes que foram introduzidos (transgene), de forma que sua prole não segregue o fenótipo desejado. As plantas transgênicas também podem ser heterozigotas para o(s) transgene(s) introduzido (s) como, por exemplo, na prole Fl que foi desenvolvida partir da semente híbrida. Essas plantas podem fornecer vantagens bem conhecidas na técnica como, por exemplo, vigor híbrido.

Um polinucleotídeo da presente invenção pode ser expresso constitutivamente nas plantas transgênicas durante todos os estágios de desenvolvimento. Dependendo do uso da planta ou dos órgãos da planta, os polipeptídeos podem ser expressos de uma forma estágio-específica. Além disso, os polinucleotideos podem ser expressos de uma forma tecido- especifica.

Seqüências reguladoras que são conhecidas ou que comprovadamente causam a expressão de um gene que codifica um polipeptídeo de interesse em plantas podem ser usadas na presente invenção. A escolha das seqüências reguladoras usadas depende da planta-alvo e/ou do órgão-alvo de interesse. Essas seqüências reguladoras podem ser obtidas a partir de plantas ou vírus de plantas, ou podem ser sintetizadas quimicamente. Essas seqüências reguladoras são bem conhecidas por aqueles habilitados na técnica.

Diversos vetores adequados à transfecção estável de células de plantas ou para o estabelecimento de plantas transgênicas foram descritos, por exemplo, em Pouwels e cols., "Cloning Vectors: A Laboratory Manual", 1985, supl. 1987; Weissbach e Weissbach, "Methods for Plant Molecular Biology", Academic Press, 1989; e Gelvin e cols., "Plant Molecular Biology Manual", Kluwer Academic Publishers, 1990. Tipicamente, vetores de expressão de plantas incluem, por exemplo, um ou mais genes clonados de plantas sob o controle de transcrição de seqüências reguladoras 51 e 31 e um marcador selecionável dominante. Esses vetores de expressão de planta também podem conter uma região promotora reguladora (por exemplo, uma região reguladora que controla a expressão indutível ou constitutiva, regulada pelo ambiente ou pelo desenvolvimento, ou célula- ou tecido-específica), um sítio de iniciação da transcrição, um sitio de ligação de ribossomo, um sinal de processamento de RNA, um sítio de terminação da transcrição e/ou um sinal de poliadenilação.

Foram descritos vários promotores constitutivos que são ativos em células de plantas. Promotores adequados à expressão constitutiva em plantas incluem, sem limitação, o promotor do vírus do mosaico da couve-flor (CaMV) 3 5S, o vírus do mosaico de Scrophularia (FMV) 3 5S, o promotor de vírus baciliforme da cana de açúcar, o promotor do vírus mosqueado de trapoeraba amarela, o promotor indutível pela luz da subunidade pequena da ribulose-1,5-bis-fosfato carboxilase, o promotor de triosefosfato isomerase citosõlica do arroz, o promotor de adenina fosforibosiltransferase de Arabidopsis, o promotor do gene de actina 1 do arroz, os promotores de manopina sintase e octopina sintase, o promotor de Adh, o promotor de sacarose sintase, o promotor do complexo gênico Reo promotor do gene da proteína de ligação de clorofila α/β. Esses promotores foram utilizados para criar vetores de DNA que foram expressos em plantas; veja, por exemplo, publicação PCT WO 8402913. Todos esses promotores foram usados para criar vários tipos de vetores de DNA recombinante que podem ser expressos em plantas.

Para a expressão em tecidos da planta-fonte, por exemplo, a folha, a semente, a raiz ou o caule, prefere-se que os promotores utilizados na presente invenção possuam expressão relativamente elevada nesses tecidos específicos. Para essa finalidade, pode-se escolher dentre inúmeros promotores para genes com expressão tecido- ou célula- específica ou aumentada. Exemplos desses promotores relatados na literatura incluem o promotor de glutamina sintetase de cloroplasto da ervilha GS2, o promotor de frutose-1,6-bifosfatase de cloroplasto do trigo, o promotor nuclear fotossintético ST-LS 1 da batata, o promotor de serina/treonina quinase e o promotor de glicoamilase (CHS) de Arabidopsis thaliana. Também são relatados como ativos em tecidos ativos em termos fotossintéticos o promotor de ribulose-1,5-bisfosfato carboxilase de lariço oriental (Larix laricina) , o promotor para o gene Cab, Cab6, do pinheiro, o promotor para o gene Cab-I do trigo, o promotor para o gene Cab-I do espinafre, o promotor para o gene Cab IR do arroz, o promotor de piruvato, ortofosfato diquinase (PPDK) de Zea mays, o promotor para o gene Lhcbl *2 do tabaco, o promotor de sacarose-H30 simporter de Arabidopsis thaliana Suc2, e o promotor para os genes da proteína da membrana tilacóide do espinafre (PsaD, PsaF, PsaE, PC, FNR, AtpC, AtpD, Cab, RbcS).

Outros promotores para as proteínas de ligação α/β de clorofila também podem ser utilizados na presente invenção como, por exemplo, os promotores para o gene LhcB e o gene PsbP da mostrada branca (Sinapis alba). Diversos promotores de genes de plantas que são regulados em resposta a sinais ambientais, hormonais, químicos e/ou de desenvolvimento, também podem ser usados para a expressão de genes de RNA- proteína de ligação em células de plantas, incluindo promotores regulados pelo (1) calor, (2) luz (por exemplo, promotor RbcS-3A da ervilha, promotor RbcS do milho); (3) hormônios, por exemplo, ácido abscísico, (4) ferimento (por exemplo, WunI); ou (5) substâncias químicas, por exemplo, metil jasminato, ácido salicílico, hormônios esteróides, álcool, protetores (WO 9706269), ou também pode ser vantajoso empregar (6) promotores orgão-especificos.

Para a expressão em tecidos da planta enterrados, por exemplo, tubérculo da planta de batata, a fruta do tomate ou a semente da soja, canola, algodão, Zea mays, trigo, arroz e cevada, prefere-se que os promotores utilizados na presente invenção possuam expressão relativamente elevada nesses tecidos específicos. São conhecidos diversos promotores para genes com expressão tubérculo-específica ou aumentada, incluindo o promotor de patatina da classe I, o promotor para genes do tubérculo de batata ADPGPP, tanto a subunidade grande quanto a pequena, o promotor de sacarose sintase, o promotor para as proteínas principais do tubérculo, incluindo os complexos protéicos de 22 kD e inibidores de proteinase, o promotor para o gene de amido sintase ligado ao grânulo (GBSS), e outros promotores de patatinas das classes I e II. Outros promotores também podem ser usados para expressar uma proteína em tecidos específicos, por exemplo, sementes ou frutas. 0 promotor para β-conglicinina ou outros promotores semente- específicos, por exemplo, os promotores de napina e faseolina, podem ser utilizados. Um promotor particularmente preferido para expressão do endosperma de Zea mays é o promotor para o gene de glutelina do arroz, mais particularmente o promotor Osgt-l. Exemplos de promotores adequados à expressão no trigo incluem aqueles promotores para as subunidades de ADPglicose pirossintase (ADPGPP), a amido sintase ligada ao grânulo e outras amido sintases, as enzimas de ramificação e desramificação, as proteínas abundantes na embriogênese, as gliadinas e as gluteninas. Exemplos desses promotores no arroz incluem aqueles promotores para as subunidades ADPGPP1 a amido sintase ligada ao grânulo e outras amido sintases, as enzimas de ramificação, as enzimas de desramificação, sacarose sintases e as glutelinas. Um promotor particularmente preferido ê o promotor para arroz glutelina, gene Osgt-I. Exemplos desses promotores para cevada incluem aqueles para as subunidades ADPGPP, a amido sintase ligada ao grânulo e outras amido sintases, as enzimas de ramificação, as enzimas de desramificação, sacarose sintases, as hordeínas, as globulinas do embrião e as proteínas específicas da aleurona.

Também podem ser utilizados promotores específicos da raiz. Um exemplo desse tipo de promotor é o promotor para o gene de ácido quitinase. A expressão em tecido da raiz também poderia ser obtida utilizando-se os subdomínios específicos para a raiz do promotor CaMV 35S que foram identificados.

A seqüência não traduzida líder 51 pode ser derivada do promotor selecionado para expressar a seqüência gênica heteróloga do polinucleotídeo da presente invenção, e pode ser especificamente modificada, se desejado, de forma a aumentar a tradução de mRNA. Para uma revisão sobre a otimização da expressão de transgenes, veja Koziel e cols. (1996) . Um exemplo de uma seqüência líder otimizada desse tipo está incluído no ID. DE SEQ. N°: 6. As regiões não traduzidas 51 também podem ser obtidas a partir de RNAs virais de plantas (vírus do mosaico do tabaco, vírus etch do tabaco, vírus do mosaico do nanismo do milho, vírus do mosaico da alfafa, dentre outros) a partir de genes eucarióticos adequados, genes de plantas (líder do gene da proteína de ligação α/β da clorofila de trigo e milho) , ou a partir de uma seqüência gênica sintética. A presente invenção não se limita às construções nas quais a região não traduzida é derivada da seqüência não traduzida 51 que acompanha a seqüência promotora. A seqüência líder também poderia ser derivada de uma seqüência promotora ou codificadora não relacionada. Seqüências líderes úteis no contexto da presente invenção compreendem o líder Hsp70 do milho (U.S. 5.362.865 e U.S. 5.859.347), e o elemento Omega TMV.

A terminação da transcrição é obtida por uma seqüência de DNA não traduzida 3 1 ligada operacionalmente no vetor quimérico ao polinucleotídeo de interesse. A região não traduzida 3' de uma molécula de DNA recombinante contém um sinal de poliadenilação que funciona em plantas para causar a adição de nucleotídeos adenilato à extremidade 3' do RNA. A região não traduzida 3' pode ser obtida de vários genes que são expressos em células de plantas. A região não traduzida de 3' nopalina sintase, a região não traduzida 3' do gene Rubisco da subunidade pequena de ervilha, a região não traduzida 3' do gene da proteína de armazenamento de semente 7S de soja são comumente usadas nessa capacidade. As regiões não traduzidas 3' transcritas, que contêm o sinal de poliadenilato dos genes de plasmídeo de Agrobacterium indutores de tumor (Ti), também são adequadas.

Foram descritos quatro métodos gerais para a liberação direta de um gene em células: (1) métodos químicos (Graham e cols., 1973); (2) métodos físicos como, por exemplo, microinjeção (Capecchi, 1980); eletroporação (veja, por exemplo, WO 87/06614, U.S. 5.472.869, 5.384.253, WO 92/09696 e WO 93/21335) ; e a pistola de gene (veja, por exemplo, U.S. 4.945.050 e U.S. 5.141.131); (3) vetores virais (Clapp, 1993; Lu e cols., 1993; Eglitis e cols., 1988); e (4) mecanismos mediados por receptores (Curiel e cols., 1992; Wagner e cols., 1992).

Métodos de aceleração que podem ser usados incluem, por exemplo, bombardeamento de microprojétil e semelhantes. Um exemplo de um método para a liberação de moléculas de transformação de ácido nucléico às células de plantas ê o bombardeamento de microprojétil. Esse método foi revisado por Yang e cols., "Particle Bombardment Technology for Gene Transfer", Oxford Press, Oxford, Inglaterra (1994). Partículas não biológicas (microprojéteis) podem ser revestidas com ácidos nucléicos e liberadas em células por uma força propelente. Partículas exemplares incluem aquelas compostas por tungstênio, ouro, platina, e semelhantes. Uma vantagem particular do bombardeamento de microprojétil, além de ser um meio eficaz de transformação reprodutível de monocotilédones, é que não são necessários o isolamento de protoplastos, nem a susceptibilidade à infecção por Agrobacterium. Uma modalidade ilustrativa de um método para a liberação de DNA em células de Zea mays por aceleração é um sistema biolístico de liberação de partículas a, que pode ser usado para propelir partículas revestidas com DNA através de uma tela, por exemplo, uma tela de aço inoxidável ou de Nytex, sobre uma superfície de filtro coberta com células de milho cultivadas em suspensão. Um sistema de liberação de partículas adequado para uso com a presente invenção é a pistola de aceleração de hélio PDS- 1000/He, disponível por Bio-Rad Laboratories.

Para o bombardeamento, as células em suspensão podem ser concentradas em filtros. Filtros contendo as células a serem bombardeadas são posicionados em uma distância apropriada abaixo da placa de parada de microprojétil. Caso desejado, uma ou mais telas também são posicionadas entre a pistola e as células a serem bombardeadas.

Alternativamente, embriões imaturos ou outras células- alvo podem ser dispostos em um meio de cultura sólido. As células a serem bombardeadas são posicionadas em uma distância apropriada abaixo da placa de parada de microprojétil. Caso desejado, uma ou mais telas também são posicionadas entre o dispositivo de aceleração e as células a serem bombardeadas. Por meio do uso de técnicas aqui apresentadas, pode-se obter até 1.000 ou mais focos de células que expressam transitoriamente um gene marcador. 0 número de células em um foco que expressam o produto gênico exógeno 4 8 horas pós-bombardeamento freqüentemente varia de um a dez e, na média, é de um a três.

Na transformação por bombardeamento, pode-se otimizar as condições de cultivo pré-bombardeamento e os parâmetros do bombardeamento para gerar os números máximos de transformantes estáveis. Tanto os parâmetros físicos quanto os biológicos para o bombardeamento são importantes nessa tecnologia. Fatores físicos são aqueles que envolvem a manipulação do precipitado de DNA/microprojétil ou aqueles que afetam o vôo e a velocidade dos macro- ou microprojéteis. Fatores biológicos incluem todas as etapas envolvidas na manipulação de células antes e imediatamente depois do bombardeamento, o ajuste osmótico de células-alvo para ajudar a aliviar o trauma associado ao bombardeamento, e também a natureza do DNA de transformação, por exemplo, DNA linearizado ou plasmídeos superenovelados intactos. Acredita-se que as manipulações pré-bombardeamento são especialmente importantes para a transformação bem sucedida de embriões imaturos.

Em outra modalidade alternativa, plastídeos podem ser transformados estavelmente. O método revelado para a transformação de plastídeo em plantas superiores inclui a liberação de DNA com pistola de partículas contendo um marcador selecionável, e direcionando-se o DNA ao genoma do plastídeo por meio de recombinação homóloga (U.S. 5.451.513, U.S. 5.545.818, U.S. 5.877.402, U.S. 5.932.479 e WO 99/05265) .

Conseqüentemente, contempla-se que se pode desejar ajustar vários aspectos dos parâmetros do bombardeamento em estudos de pequena escala para otimizar totalmente as condições. Pode-se desejar particularmente ajustar os parâmetros físicos como, por exemplo, a distância de lacuna (gap) , distância de vôo, distância do tecido e pressão do hélio. Pode-se também minimizar os fatores de redução de trauma por modificação das condições que influenciam o estado fisiológico das células receptoras e que podem, portanto, influenciar as eficiências de transformação e de integração. Por exemplo, o estado osmótico, a hidratação do tecido e o estágio de subcultivo ou ciclo celular das células receptoras podem ser ajustados para a transformação ótima. A execução de outros ajustes de rotina será conhecida por aqueles habilitados na técnica à luz da presente revelação.

A transferência mediada por Agrobacterium é um sistema amplamente aplicável para a introdução de genes em células de plantas, pois o DNA pode ser introduzido em tecidos de plantas inteiros contornando, dessa forma, a necessidade de regeneração de uma planta intacta a partir de um protoplasto. 0 uso de vetores de integração de planta mediada por Agrobacterium para a introdução de DNA em células de plantas é bem conhecido na técnica (veja, por exemplo, U.S. 5.177.010, U.S. 5.104.310, U.S. 5.004.863, U.S. 5.159.135). Além disso, a integração do T-DNA é um processo relativamente preciso que resulta em poucos rearranjos. A região de DNA a ser transferida é definida pelas seqüências fronteiriças, e o DNA de interveniência é normalmente inserido no genoma da planta.

Os vetores de transformação de Agrobacterium modernos são capazes de replicação em E. coli, bem como em Agrobacterium, o que permite manipulações convenientes como descritas (Klee e cols., Em: "Plant DNA Infectious Agents", Hohn e Schell, eds. , Springer-Verlag, Nova York, pp. 179- 203 (1985)) . Além disso, os avanços tecnológicos em vetores para a transferência gênica mediada por Agrobacterium aperfeiçoaram o rearranjo de genes e os sítios de restrição nos vetores para facilitar a construção de vetores capazes de expressar vários genes codificadores de polipeptídeos. Os vetores descritos possuem regiões multivinculadoras convenientes flanqueadas por um promotor e um sítio de poliadenilação para expressão direta de genes codificadores de polipeptídeos inseridos, e são adequados para os objetivos presentes. Além disso, Agrobacterium que contém genes Ti tanto armados quanto desarmados pode ser usado para as transformações. Naquelas variedades de plantas nas quais a transformação mediada por Agrobac terium é eficiente, ele é o método de escolha, por causa da natureza fácil e definida da transferência gênica.

Uma planta transgênica formada com o uso dos métodos de transformação com Agrobacterium tipicamente contém um único lócus genético em um cromossomo. Essas plantas transgênicas podem ser consideradas como sendo hemizigotas para o gene adicionado. Prefere-se principalmente uma planta transgênica que seja homozigota para o gene estrutural adicionado; ou seja, uma planta transgênica que contenha dois genes adicionados, um gene no mesmo lócus em cada cromossomo de um par de cromossomos. Uma planta transgênica homozigota pode ser obtida combinando-se sexualmente (autopolinização - selfing) uma planta transgênica segregante independente que contenha um único gene adicionado, germinando-se algumas das sementes produzidas e analisando-se as plantas resultantes quanto ao gene de interesse.

Deve-se entender também que duas plantas transgênicas diferentes também podem ser combinadas para a produção de uma prole que contenha dois genes exógenos que segregam independentemente. A autopolinização da prole apropriada pode produzir plantas que são homozigotas para ambos os genes exógenos. O retrocruzamento para uma planta parente e a polinização cruzada com uma planta não transgênica também são contemplados, bem como a propagação vegetativa. Descrições de outros métodos de cultivo que são comumente usados pra traços e plantios diferentes podem ser encontradas em Fehr, Em: "Breeding Methods for Cultivar Development", Wilcox J. ed., "American Society of Agronomy", Madison Wis. (1987).

A transformação de protoplastos de plantas pode ser obtida com a utilização de métodos baseados na precipitação de fosfato de cálcio, tratamento com polietileno glicol, eletroporação e combinações desses tratamentos. A aplicação desses sistemas a diferentes variedades de planta depende da habilidade para regenerar aquela cepa de planta em particular de protoplastos. São descritos métodos ilustrativos para a regeneração de cereais a partir de protoplastos (Fujimura e cols., 1985; Toriyama e cols., 1986; Abdullah e cols., 1986).

Outros métodos de transformação de células também podem ser usados e incluem, sem limitação, introdução de DNA em plantas por transferência direta de DNA no pólen, por injeção direta de DNA em órgãos reprodutores de uma planta, ou por injeção direta de DNA nas células de embriões imaturos, seguida pela reidratação de embriões dessecados.

A regeneração, o desenvolvimento e o cultivo de plantas a partir de transformantes de um único protoplasto de planta ou a partir de vários explantes transformados é bem conhecido na técnica (Weissbach e cols., Em: "Methods for Plant Molecular Biology", Academic Press, San Diego, Califórnia, (1988)). Esse processo de regeneração e crescimento tipicamente inclui as etapas de seleção de células transformadas, cultivo daquelas células individualizadas por meio dos estágios usuais de desenvolvimento embriológico pelo estágio de plântula enraizada. Os embriões e as sementes transgênicas são regenerados de forma similar. Os brotos enraizados transgênicos resultantes são posteriormente plantados em um meio de crescimento de planta apropriado como, por exemplo, solo.

O desenvolvimento ou a regeneração de plantas que contêm o gene exógeno, estranho, é bem conhecido na técnica. De preferência, as plantas regeneradas são autopolinizadas para a geração de plantas transgênicas homozigotas. De outro modo, o pólen obtido das plantas regeneradas é cruzado com plantas desenvolvidas a partir de sementes de linhagens agricolamente importantes. Inversamente, o pólen de plantas dessas linhagens importantes é usado para polinizar plantas regeneradas. Uma planta transgênica da presente invenção que contém um ácido nucléico exógeno desejado é cultivada com o uso de métodos bem conhecidos por aqueles habilitados na técnica.

Métodos para a transformação de dicotiledôneas, basicamente com o uso Agrobacterium tumefaciens, e obtenção de plantas transgênicas foram publicados para algodão (U.S. 5.004.863, U.S. 5.159.135, U.S. 5.518.908); soja (U.S. 5.569.834, U.S. 5.416.011); brãssica (U.S. 5.463.174); amendoim (Cheng e cols., 1996); e ervilha (Grant e cols., 1995) .

Métodos para a transformação de plantas de cereais como, por exemplo, trigo e cevada, para a introdução de variação genética na planta por introdução de um ácido nucléico exógeno e para a regeneração de plantas a partir de protoplastos ou embriões imaturos de plantas são bem conhecidos na técnica; veja, por exemplo, Pedido de Patente Canadense N0 2.092.588, Pedido de Patente Australiana N0 61781/94, Patente Australiana N0 667939, Patente U.S. N0 6.100.447, Pedido de Patente Internacional PCT/US97/10621, Patente U.S. N0 5.589.617, Patente U.S. N0 6.541.257 e outros métodos são apresentados na especificação de Patente WO 99/14314. De preferência, plantas transgênicas de trigo ou cevada são produzidas por procedimentos de transformação mediada por Agrobacterium tumefaciens. Vetores que carregam a construção de ácido nucléico desejada podem ser introduzidos em células de trigo regeneráveis de plantas ou explantes cultivadas em tecido, ou sistemas de plantas adequados como, por exemplo, protoplastos.

As células de trigo regeneráveis são preferivelmente do escutelo de embriões imaturos, embriões maduros, calos derivados destes, ou do tecido meristemático.

Plantas que expressam um polipeptídeo da invenção podem ser produzidas com a utilização dos métodos descritos em U.S. 20050022261, em que um polinucleotídeo da invenção substitui um ácido nucléico que codifica uma proteína GOX ou EPSPS.

Trigo resistente ao glifosato pode ser produzido com a utilização dos métodos descritos em U.S. 20040133940, em que o DNA que codifica EPSPS é substituído com uma molécula de ácido nucléico que codifica um polipeptídeo da invenção. Alternativamente, trigo resistente ao glifosato pode ser produzido com o uso de um método descrito em U.S. 20030154517 para a introdução e uma construção gênica que codifica um polipeptídeo da invenção em uma célula de trigo. Para confirmar a presença dos transgenes em células e plantas transgênicas, pode ser realizada uma amplificação por reação em cadeia de polimerase (PCR) ou uma análise Southern blot com o uso de métodos conhecidos por aqueles habilitados na técnica. A expressão produtos dos transgenes pode ser detectada por qualquer uma de diversas formas, dependendo da natureza do produto, e incluem Western blot e ensaio de enzima. Uma forma particularmente útil para quantificar a expressão de proteína e para detectar a replicação em diferentes tecidos de plantas é a utilização de um gene repórter, por exemplo, GUS. Após a obtenção das plantas transgênicas, elas podem crescer para a produção de tecidos ou partes de plantas que possuam o fenótipo desejado. O tecido de planta as ou partes de plantas podem ser colhidas e/ou terem a semente colhida. A semente pode servir como uma fonte para o crescimento de plantas adicionais com tecidos ou partes que possuam as características desejadas.

As plantas produzidas com a utilização dos métodos aqui descritos podem ser testadas quanto à resistência a um herbicida, por exemplo, glifosato, com o uso dos procedimentos apresentados de forma geral em U.S. 20050022261 ou U.S. 20060059581.

As plantas transgênicas da invenção podem compreender transgenes adicionais, além daqueles da invenção, que intensificam a tolerância/resistência das plantas aos herbicidas que contêm amina. Exemplos incluem a expressão de variantes bacterianas de EPSPS e variantes de plantas de EPSPS que possuam uma afinidade mais baixa por glifosato e, portanto, retenham sua atividade catalítica na presença de glifosato (Patentes U.S. Nos 5.633.435, 5.094.945, 4.535.060 e 6.040.497), bem como a expressão de GOX, que também degrada glifosato (U.S. 5.776.760).

Animais transgênicos não humanos

Um "animal transgênico não humano" refere-se a um animal, que não um ser humano, que contém uma construção gênica ("transgene") não encontrada em um animal do tipo selvagem da mesma espécie ou raça. Um "transgene", como aqui citado, possui o significado normal na técnica de biotecnologia, e inclui uma seqüência genética que foi produzida ou alterada por tecnologia de DNA ou RNA recombinante, e que foi introduzida em uma célula animal. 0 transgene pode incluir seqüências genéticas derivadas de uma célula animal. Tipicamente, o transgene foi introduzido no animal por manipulação humana como, por exemplo, por transformação, mas qualquer método pode ser usado, como é reconhecido por aqueles habilitados na técnica.

As metodologias para a produção de animais transgênicos são bem conhecidas na técnica. Um livro-texto geral útil sobre esse assunto é "Houdebine, Transgenic animais - Generation and Use" (Harwood Academic, 1997) .

O DNA heterólogo pode ser introduzido, por exemplo, em óvulos mamíferos fertilizados. Por exemplo, células-tronco totipotentes ou pluripotentes podem ser transformadas por microinjeção, mediada por precipitação de fosfato de cálcio, fusão de lipossomo, infecção retroviral ou outros meios, as células transformadas são então introduzidas no embrião, e o embrião então desenvolve um animal transgênico. Em um método altamente preferido, embriões em desenvolvimento são infectados com um retrovírus que contém ο DNA desejado, e os animais transgênicos produzidos pelo embrião infectado. Em um método mais preferido, no entanto, os DNAs apropriados são co-injetados no pronúcleo ou citoplasma de embriões, preferivelmente no estágio de célula única, e permite-se que os embriões se desenvolvam em animais transgênicos maduros.

Outro método usado para a produção de um animal transgênico envolve a microinjeção de um ácido nucléico em ovos em estágio pró-nuclear por métodos padronizados. Os ovos injetados são então cultivados, antes da transferência nos ovidutos de receptores pseudográvidos.

Animais transgênicos também podem ser produzidos por tecnologia de transferência nuclear. Com a utilização desse método, fibroblastos de animais doadores são transfectados estavelmente com um plasmídeo que incorpora as seqüências codificadoras para um domínio de ligação ou parceiro de ligação de interesse, sob o controle de seqüências reguladoras. Os transfectantes estáveis são então fundidos aos oócitos enucleados, cultivados e transferidos em receptoras fêmeas.

Composições

As composições da presente invenção podem incluir um "veículo aceitável". Exemplos desses veículos aceitáveis incluem água, solução salina, solução de Ringer, solução de dextrose, solução de Hank e outras soluções salinas aquosas fisiologicamente balanceadas. Veículos não aquosos, por exemplo, óleos fixos, óleo de gergelim, oleato de etila ou triglicerídeos, também podem ser usados. A natureza exata do "veículo aceitável" dependerá do uso da composição. Considerando os usos aqui descritos e a natureza do componente da invenção na composição, aqueles habilitados na técnica podem facilmente determinar "veículos aceitáveis" adequados para um uso específico.

Polipeptídeos e/ou construções de expressão que os codificam, podem ser usados para o tratamento de pacientes, por exemplo, seres humanos, animais e peixes, que foram expostos a um herbicida que contém amina. Dessa forma, uma composição da invenção pode incluir um "veículo farmaceuticamente aceitável" para produzir uma "composição farmacêutica". Veículos farmaceuticamente aceitáveis são bem conhecidos na técnica (veja, por exemplo, "Remington: The Science and Practice of Pharmacy", Alfonso R. Gennaro, Mack Publishing Company, Easton, Pa., 19a Edição (1995)).

Um polipeptídeo da presente invenção pode ser fornecido em uma composição que aumenta a taxa e/ou o grau de degradação de um herbicida que contém amina, ou aumenta a estabilidade do polipeptídeo. Por exemplo, o polipeptídeo pode ser imobilizado em uma matriz de poliuretano (Gordon e cols., 1999), ou encapsulado em lipossomos apropriados (Petrikovics e cols. 2000 a e b). 0 polipeptídeo também pode ser incorporado em uma composição que compreende uma espuma, por exemplo, aquelas usadas rotineiramente no combate a incêndios (LeJeune e cols., 1998).

Como seria observado por aqueles habilitados na técnica, o polipeptídeo da presente invenção poderia ser usado facilmente em uma esponja ou espuma, como revelado em WO 00/64539, cujo conteúdo é aqui incorporado em sua totalidade.

Uma modalidade da presente invenção é uma formulação de liberação controlada que é capaz de liberar lentamente um polipeptideo da presente invenção em um animal, uma planta, um material de animal ou planta, ou no ambiente (incluindo amostras de solo e água) . Como aqui usado, a formulação de liberação controlada compreende uma composição da presente invenção em um veiculo de liberação controlada. Veículos de liberação controlada adequados incluem, sem limitação, polímeros biocompatíveis, outras matrizes poliméricas, cápsulas, microcápsulas, micropartícuias, preparações embolo, bombas osmóticas, dispositivos de difusão, lipossomos, lipoesferas e sistemas de liberação transdérmica. Formulações de liberação controlada preferidas são biodegradáveis (ou seja, passíveis de bioerosão).

Uma formulação de liberação controlada preferida da presente invenção é capaz de liberar uma composição da presente invenção no solo ou na água que está em uma área pulverizada com um herbicida que contém amina, particularmente glifosato. A formulação é liberada preferivelmente ao longo de um período de temo que varia de cerca de 1 a cerca de 12 meses. Uma formulação de liberação preferida controlada da presente invenção é capaz de efetuar um tratamento preferivelmente por pelo menos cerca de 1 mês, mais preferivelmente por pelo menos cerca de 3 meses, ainda mais preferivelmente por pelo menos cerca de 6 meses, ainda mais preferivelmente por pelo menos cerca de 9 meses e, ainda mais preferivelmente, por pelo menos cerca de 12 meses.

A concentração do polipeptideo, vetor ou célula hospedeira etc. da presente invenção que será necessária para produzir composições eficazes para a degradação de um herbicida que contém amina dependerá da natureza da amostra a ser descontaminada, da concentração do herbicida que contém amina na amostra, e da formulação da composição. A concentração eficaz do polipeptídeo, vetor, ou célula hospedeira etc. dentro da composição pode ser facilmente determinada experimentalmente, como será compreendido por aqueles habilitados na técnica. Anticorpos

A invenção também fornece anticorpos monoclonais ou policlonais para os polipeptídeos da invenção, ou fragmentos destes. Dessa forma, a presente invenção ainda fornece um processo para a produção de anticorpos monoclonais ou policlonais para os polipeptídeos da invenção.

O termo "se liga especificamente" refere-se à habilidade do anticorpo para se ligar a pelo menos um polipeptídeo da presente invenção, mas não a outras proteínas conhecidas.

Como aqui usado, o termo "epitopo" refere-se e uma região de um polipeptídeo da invenção que está ligada pelo anticorpo. Um epitopo pode ser administrado a um animal para a geração de anticorpos contra o epitopo; no entanto, os anticorpos da presente invenção se ligam, de preferência, especificamente à região do epitopo no contexto do polipeptídeo inteiro.

Caso sejam desejados anticorpos policlonais, um mamífero selecionado (por exemplo, camundongo, coelho, cabra, cavalo etc.) é imunizado com um polipeptídeo imunogênico da invenção. O soro do animal imunizado é coletado e tratado de acordo com procedimentos conhecidos. Se o soro que contém anticorpos policlonais contiver anticorpos para outros antígenos, os anticorpos policlonais podem ser purificados por cromatografia por imunoafinidade. Metodologias para a produção e processamento de anti-soros policlonais são conhecidas na técnica. A fim de que esses anticorpos possam ser feitos, a invenção também fornece polipeptideos da invenção ou fragmentos destes haptenizados com outro polipeptídeo para uso como imunógenos em animais.

Anticorpos monoclonais dirigidos contra polipeptideos da invenção também podem ser facilmente produzidos por aqueles habilitados na técnica. A metodologia geral para a produção de anticorpos monoclonais por hibridomas é bem conhecida. Linhagens de células imortais que produzem anticorpos podem ser criadas por fusão celular, e também por outras técnicas como, por exemplo, transformação direta de linfócitos B com DNA oncogênico, ou transfecção com o vírus de Epstein-Barr. Painéis de anticorpos monoclonais produzidos podem ser rastreados quanto a várias propriedades; por exemplo, quanto ao isótipo e afinidade de epitopo.

Uma técnica alternativa envolve o rastreamento de bibliotecas de exibição de fago nas quais, por exemplo, os fagos expressam fragmentos scFv na superfície de seu revestimento com uma grande variedade de regiões determinantes de complementaridade (CDRs). Essa metodologia é bem conhecida na técnica.

Para os objetivos desta invenção, o termo "anticorpo", a menos que especificado de forma diferente, inclui fragmentos de anticorpos inteiros que retêm sua atividade de ligação para um antígeno-alvo. Esses fragmentos incluem fragmentos Fv, F(ab') e F(ab')2, além de anticorpos de cadeia simples (scFv). Além disso, os anticorpos e fragmentos destes podem ser anticorpos humanizados, por exemplo, como descrito em EP-A-239400.

Os anticorpos da invenção podem estar ligados a um suporte sólido e/ou embalados em kits em um recipiente adequado, juntamente com reagentes, controles, instruções adequados, e semelhantes.

Em uma modalidade, os anticorpos da presente invenção são marcados de forma detectável. Marcadores detectáveis exemplares que permitem a medida direta da ligação de anticorpo incluem marcadores radioativos, fluoróforos, corantes, glóbulos magnéticos, substâncias quimioluminescentes, partículas coloidais, e semelhantes.

Exemplos de marcadores que permitem a medida indireta da ligação incluem enzimas nas quais o substrato pode fornecer um produto colorido ou fluorescente. Marcadores detectáveis exemplares adicionais incluem enzimas ligadas covalentemente capazes de fornecer um sinal de produto detectável após adição de substrato adequado. Exemplos de enzimas adequadas para uso em conjugados incluem peroxidase de raiz-forte, fosfatase alcalina, malato desidrogenase e semelhantes. Quando não disponíveis comercialmente, esses conjugados anticorpo-enzima são facilmente produzidos por metodologias conhecidas por aqueles habilitados na técnica.

Marcadores detectáveis exemplares adicionais incluem biotina, que se liga com afinidade elevada à avidina ou estreptavidina; fluorcromos (por exemplo, ficobiliproteínas, ficoeritrina e aloficocianinas ; fluoresceína e vermelho Texas), que podem ser usados com um separador celular ativado por f luorescência; haptenos,· e semelhantes. De preferência, o marcador detectável permite a medida direta em um luminômetro de placas, por exemplo, biotina. Esses anticorpos marcados podem ser usados em metodologias conhecidas na técnica para detectar polipeptídeos da invenção.

Detalhes do depósito de microorganismos

Arthrobacter sp. TBD foi depositado em 11 de abril de 2006 com o "National Measurement Institute" , 51-65 Clarke Street, South Melbourne, Victoria 3205, Austrália, sob o número de acesso V06/010960.

0 depósito foi feito sob as regras do Tratado de Budapeste no "International Recognition of the Deposit of Microorganisms for the Purpose of Patent Procedure" e sob seus regulamentos. Isso assegura a manutenção de culturas viáveis por 3 0 anos a partir da data do depósito. Os organismos ficarão disponíveis pelo "National Measurement Institute" sob os termos do Tratado de Budapeste, que assegura a disponibilidade permanente e irrestrita da prole da cultura ao público mediante emissão da patente pertinente.

O requerente do presente pedido concordou que, caso o depósito da cultura morra ou se perca, ou seja destruído quando cultivado sob condições adequadas, ele será prontamente substituído mediante notificação por um espécime viável da mesma cultura. A disponibilidade de uma cepa depositada não deve ser considerada como uma licença para a prática da invenção em transgressão dos direitos concedidos sob a autoridade de qualquer governo de acordo com suas leis de patentes. EXEMPLOS

Exemplo 1 - Isolamento de bactérias que degradam glifosato

Materiais e métodos

Substâncias químicas

N-(fosfonometil)glicina (glifosato) foi obtida de ICN ou Sigma. Todos os outros reagentes analíticos foram obtidos de Sigma-Aldrich.

Meios

A menos que estabelecido de forma diferente, meio mínimo sem uma fonte de nitrogênio compreende sais M9 [6 g de Na2HPO4, 3 g de KH2PO4, 1 g de NaCl] , microelementos, incluindo íons metálicos e vitaminas, 200 μΜ de MgCl2, 200 μΜ de CaCl2 e glicose 1% como fonte de carbono.

Isolamento de bactérias de degradação de glifosato

Vários isolados de solo e nosso banco de cepas laboratoriais foram testados quanto à habilidade para utilizar glifosato como a única fonte de nitrogênio em cultura líquida. Os isolados foram cultivados de um dia para o outro em temperatura apropriada em meio líquido rico, tanto caldo nutriente (Merck) ou caldo de Luria (como em Sambrook e cols., 1989), e depois diluídos até uma OD60Onm de 0,01 em meio mínimo contendo glifosato 0,2% (11,8 mM) como a única fonte de nitrogênio. 0 crescimento foi avaliado por medida da OD6Oonm de 2 00 μΐ de cultura em m flexiplate (BD Biosciences) com a leitora de placas Softmax Pro (Molecular Devices).

Identificação de Arthrobacter sp. TBD

DNA genômico extraído de Arthrobacter sp. TBD e iniciadores universais foram usados para amplificar por PCR 16SrDNA e o produto de 1,35 kb resultante foi seqüenciado. Métodos analíticos

A detecção de glifosato e AMPA por análise por HPLC foi realizada com o uso de uma versão modificada do método de Tomita e cols. (1991) (Coluna: C18 4,6 μΜ, coluna de 5 À. Fase móvel: 0,2 M de K2HPO4, acetonitrila 15%). Os analisados foram derivatizados com cloreto de tosila, e detectados em um comprimento de onda de 24 0 nm. Um ml de sobrenadante da reação foi misturado com 0,5 ml de 0,4 M NaHPO4, pH 11,0, seguido por adição de 200 μ de solução de cloreto de tosila (10 mg/ml"1 de sulfonilcloreto de p- tolueno [Sigma] em acetonitrila) . Após incubação a 500C por 5 minutos, 20 μΐ de produto de reação filtrado foram injetados na HPLC para análise.

Resultados

Foram identificadas várias bactérias capazes de utilizar glifosato como a única fonte de nitrogênio, tanto do enriquecimento do solo quanto do rastreamento de nossa coleção de laboratório de microorganismos que degradam pesticidas. As bactérias de degradação incluíram uma cepa isolada de Arthrobacter sp. TBD, que se mostrou capaz de crescer rapidamente até a confluência em meio líquido mínimo usando glifosato como a única fonte de nitrogênio.

A comparação da seqüência de 16SrDNA de comprimento total com a Base de Dados Ribossômica (Cole e cols., 2005) e BLAST (McGinnis e Madden, 2004) mostrou que o isolado bacteriano era mais similar à cepa de Arthrobacter sp. cl38 (Futamata e cols., 2005), que possui 99,49% de identidade de nucleotídeo em relação ao gene seqüenciado de 16SrDNA de 1,35 kb.

A análise por HPLC dos sobrenadantes de cultura revelou que Arthrohacter sp. TBD podia remover 70% (8,28 mM) do glifosato no meio de cultura em até 72 horas. Exemplo 2 - Isolamento do gene responsável pela atividade de degradação de glifosato de Arthrobacter sp. TBD

Materiais e métodos

Preparação e rastreamento de uma biblioteca de DNA genômico de Arthrobacter sp. TBD

Células bacterianas foram cultivadas até a saturação com glifosato como a única fonte de nitrogênio, e DNA genômico foi extraído com o uso do método de Ausubel e cols. (supra) . O DNA genômico foi parcialmente digerido com Sau3Al, e uma biblioteca de cosmídeos criada com a utilização do vetor pWEB::TNC (Epicentre) digerido com BaJTiHI. A biblioteca foi transformada em células DHlOB, e os plasmldeos individuais foram rastreados quanto à habilidade para conferir crescimento com o uso de glifosato como a única fonte de nitrogênio em meio mínimo suplementado com solução C.

As colônias positivas foram selecionadas, e a seguir a habilidade para conferir crescimento com glifosato como a única fonte de nitrogênio confirmada em 10 ml de culturas desenvolvidas com agitação a 37°C. A fração sobrenadante da cultura foi analisada por HPLC para confirmar a remoção de glifosato do meio.

Isolamento de gene que codifica GloxA

O cosmídeo pWEB::A112 foi digerido com Eco RI, e as 6 bandas produzidas foram subclonadas no vetor pK18 preparado. Durante a preparação do vetor, pK18 foi linearizado com EcoRl(NEB), e desfosforilado com fosfatase alcalina de camarão de acordo com as instruções do fabricante (Promega). A minibiblioteca de fragmentos Eco Rl do cosmídeo foi avaliada quanto à atividade, como descrito acima, e verificou-se que um fragmento de 9 kb confere atividade de degradação de glifosato em células de E. coli.

Uma biblioteca shotgun de fragmentos recortados dessa construção foi então seqüenciada até um padrão de cobertura de 6 vezes (AGRF, Austrália). A análise e comparação de seqüências com bases de dados de nucleotídeos e de proteínas foram feitas com o uso dos programas "Vector NTI Advance 9.0" (Informax, Invitrogen) e "NCBI BLAST" (Altschul e cols., 1997, 2004). Análise de bioinformática relacionada a GloxA

Os dados de seqüências e as seqüências de aminoácidos previstas foram analisados, compilados, anotados e comparados com bases de dados com o uso dos programas "Vector NTI v. 9" (Informax.Inc. EUA; Invitrogen, Austrália) e "NCBI Blast" (Altshul e cols., 1997). Genbank do NCBI e a base de dados de domínios conservados CDD foram as principais bases de dados usadas para comparação.

Resultados

Isolamento do gene que codifica GloxA

O rastreamento da biblioteca de cosmídeos do DNA genômico de Arthrobacter sp. TBD revelou apenas um cosmídeo que conferiria a habilidade para o crescimento com a utilização de glifosato como a única fonte de nitrogênio, designado pWEB::A112. Seis fragmentos de enzima de restrição EcoRl dessa construção foram avaliados, e a atividade de degradação de glifosato localizada em um fragmento EcoRl de 9,5 kb, na construção pKWElC12. A seqüência total dessa região de 9.520 bp revelou apenas uma proteína prevista com a habilidade de clivar glifosato, uma suposta oxidorredutase codificada pelo ORF 9.

A proteína de degradação de glifosato foi designada GloxA, e a subclonagem de gloxA em um vetor de expressão e a avaliação quanto ã atividade de degradação de glifosato confirmaram que as células que expressam GloxA recombinante eram capazes de degradar glifosato, com ensaios biocatalíticos de células em repouso que possuem atividade de degradação de glifosato de 3 00 pmol .min"1.mg"1 de massa de célula úmida, e extratos de enzima brutos que possuem uma atividade de 841 pmol .min-1.mg de proteína total (Tabela 2) . De importância é que glicina não foi detectada como um produto nesse estágio da análise de GloxA, e presume-se que tenha sido rapidamente metabolizada por outras enzimas contidas dentro das células de E. coli em repouso e da preparação de extrato de enzima. Tabela 2: Efeito dos íons metálicos e co-fatores sobre atividade enzimática de GloxA recombinante parcialmente purificada. A atividade específica bruta foi baseada em toda a concentração de proteína do extrato parcialmente purificado, e é apenas um valor aproximado.

<table>table see original document page 70</column></row><table> <table>table see original document page 71</column></row><table>

GloxA é uma proteína de 4 73 aminoácidos (ID. DE SEQ. N°: 1) com um peso molecular de cerca de 52,5 kDa, um ponto isoelétrico previsto de 5,78 e carga em pH 7 de cerca de 11,61. A seqüência codificadora é fornecida como ID. DE SEQ. N°: 2. Notavelmente, o códon de início é um GTG (que codifica um resíduo valina) , o que não é incomum para genes bacterianos. A substituição da Val de início por uma Met não altera substancialmente a atividade de degradação de glifosato da enzima (Tabela 3) .

Tabela 3: Comparação da atividade da enzima bruta de proteínas recombinantes expressas por construções pKWElC12 (códon de início GTG-Val) e pETGloxA2-4 (códon de início ATG-Met).

<table>table see original document page 71</column></row><table>

Análise bioinformática

A seqüência de aminoácidos deduzida de GloxA (ID. DE SEQ. N°: 1) compartilha 56% de identidade de seqüência de aminoácidos (72% de similaridade) com uma suposta oxidorredutase de Streptomyces coelicolor A3 (Número de Acesso CAA20218) . Prevê-se que essa flavoproteína de amina oxidase catalise a desaminação oxidativa de aminoácidos, bem como aminas primárias e secundárias, compartilhando parcialmente especificidade de substrato com a sarcosina oxidase monomérica (Mórtl e cols., 2004). A amina oxidase não possui papel metabólico definido, mas mostra uma especificidade de substrato ampla para pequenas aminas com uma eficiência cinética baixa. Exemplo 3 - Atividade enzimática de GloxA

Materiais e métodos

Ensaios enzimáticos

Extratos brutos de enzima de células de E. coli foram preparados da seguinte forma: as células foram coletadas e os péletes de células ressuspensos em 1 ml de tampão de lise (25 mM de Tris-Cl pH 7,5 com 1 mg/ml-1 de lisozima) , e lisados por sonificação no gelo (sonificador Branson, 60% de ciclo de trabalho, 30 segundos ligado, 30 segundos desligado por dez repetições). A fração solúvel foi coletada por centrifugação a 5.000 g por 5 minutos e o teor de proteína medido com o uso do ensaio de ligação/corante de proteína Biorad (BIORAD). Foram preparados extratos parcialmente purificados por purificação da proteína GloxA marcada com S ou marcada com HIS da CFE solúvel usando proteína S agarose (Novagen) do Sistema de Purificação HIS- tag Talon (BD Biosciences) , de acordo com as instruções do fabricante. GloxA parcialmente pura foi eluída da coluna usando 3 M de MgCl2 ou 2,5 mM de imidazol no tampão de carga. Foram preparadas reações enzimáticas contendo 500 μΐ de extrato de enzima bruto ou 250 μΐ de extrato de enzima parcialmente purificado (aproximadamente 10 pg de lisado de proteína) em 25 mM de Tris-Cl, pH 7,5, 1 mM de FAD, 0,1 mM de MgCl2. Após pré-incubação a 3 7°C por 2 minutos, 1 mM de glifosato foi adicionado à reação, que foi então incubada com agitação por mais 10-60 minutos. Após o tempo de reação necessário, as reações foram derivatizadas com cloreto de tosila e analisadas por HPLC, como descrito acima. Todos os ensaios enzimáticos foram realizados em triplicata e repetidos pelo menos duas vezes para confirmar os dados. Para determinação dos parâmetros da cinética aparente, as concentrações de substrato foram variadas em um intervalo adequado, e os dados ajustados para uma soma de equações exponenciais como o uso de Kaleidagraph (Software Synergy) ou Hyper 1.1 (J.S. Easterby). Resultados

Ao contrário da maioria dos relatos prévios na literatura, não detectamos produção de AMPA a partir de glifosato por GloxA. Glicina era o produto mais abundante detectado da reação com glifosato tanto dos extratos brutos quanto da proteína GloxA parcialmente purificada. A partir desse fato e da homologia da seqüência de aminoácidos prevista de GloxA para outras flavoproteínas de oxidorredutase, concluímos que GloxA usa provavelmente um mecanismo de oxirredução para clivar a ligação carbono C-3 de fosfonometil ao nitrogênio de glifosato para gerar glicina e ácido oxofosfônico. 0 ácido oxofosfônico não é detectável nos sobrenadantes da reação, mas seria de se esperar que fosse rapidamente oxidado sob condições aquosas.

A glicina também foi o produto final da clivagem de glifosato encontrado em Pseudomonas sp. cepa PG2982, como identificado por análise de RMN em estado sólido de culturas de crescimento bacteriano (Kent-Moore e cols. , 1983; Jacob e cols., 1985; Fitzgibbon e Braymer, 1990) e Pseudomonas sp. cepa LBr (Jacob e cols., 1988). Arthrobacter sp. cepa GLP-10 também foi relatada para a produção de glicina a partir de glifosato, mas isso deriva da clivagem da ligação C-P no glifosato pelo complexo de multienzimas C-P liase, para a produção de sarcosina e subseqüente conversão em glicina (Kishore e Jacob, 1987) (veja a aFigura 1) . A reação de C-P liase é catalisada por um sistema complexo de proteína ligada à membrana que envolve pelo menos 4 proteínas diferentes (Metcalf e Wanner, 1993), nenhuma delas compartilhando similaridade de aminoácidos com GloxA. Dessa forma, a atividade de clivagem de glifosato em glicina de GloxA de uma forma sem células representa um novo mecanismo para a clivagem de glifosato (Figura 2).

As condições de reação exatas para a atividade máxima de GloxA parecem envolver íons metálicos e, possivelmente, o uso de FAD como um co-fator, com base na atividade específica relativa de GloxA quando na ausência desses dois componentes (Tabela 2).

A gama de substratos da enzima GloxA recombinante parcialmente purificada é fornecida na Tabela 4. Notavelmente, GloxA também é capaz de clivar glufosinato, que é um herbicida encontrado em Basta™.

Tabela 4: Gama de substratos da atividade enzimática de GloxA recombinante parcialmente purificada.

<formula>formula see original document page 75</formula>

A Tabela 5 fornece uma comparação da atividade enzimática de GloxA sobre glifosato e glufosinato, comparada com algumas outras enzimas conhecidas que degradam esses compostos. Sob as condições utilizadas, GloxA teve uma atividade de degradação de glifosato superior, quando comparada com as enzimas conhecidas. tabela 5

<table>table see original document page 76</column></row><table> A Tabela 2 acima mostra que, das condições testadas, a presença de Mg2+ e FAD resultou na maior atividade. Foram testados íons metálicos divalentes adicionais (Tabela 6), sendo observada atividade enzimática na ausência de íons metálicos ou FAD. A adição de Co2+ à reação resultou em atividade máxima, quando comparada com as outras condições testadas.

Tabela 6: Efeito de íons metálicos sobre a atividade enzimática de GloxA parcialmente purificada.

<table>table see original document page 77</column></row><table>

Exemplo 4 Comparação de GloxA com GOX

Materiais e métodos

Hibridizações DNA:DNA

Construções de DNA genômico, plasmídeo e cosmídeo foram completamente digeridas com enzimas de restrição apropriadas, e transferidas para uma membrana de náilon HybondN+ (Amersham, atualmente GE Biosciences) usando transferência alcalina, como descrito pelo fabricante.

Uma sonda marcada radiativamente foi gerada por PCR assimétrica com o uso de 3 0 ng de DNA-modelo (pLSGOX) em uma reação que contém 4 μl de 5 X Tampão Expand HiFidelity™ (Roche) ; 12,5 μmol de iniciador anti-senso (CGOXlB; ATGGCTGAGAACCACAAAAAAGTAG) (ID. DE SEQ. N°: 4); 0,1 μmol de iniciador senso (CG0X2B; TTAACTTGCCGGACCCGTTTGCTTG) (ID. DE SEQ. Ν°: 5); 200 μΜ de cada um de dTTP, dCTP, aGTP; 5 μΜ de dATP; 0,33 μΜ de a- 32P-dATP (Amersham) e 2 U de DNA polimerase Expand HiFidelity (Roche) . A reação foi ciclada a 940C por 3 minutos, seguido por 3 0 ciclos de (940C por 4 5 segundos, 480C por 4 5 segundos, 720C por 3 0 segundos) , com uma extensão final de 72°C por 5 minutos. O produto de PCR radiomarcado resultante foi purificado com o uso da coluna de purificação de DNA QIAQuick (Qiagen) , e eluido em 3 0 μΐ de água estéril. As membranas foram prê-hibridizadas em uma solução contendo 6 χ SSC, 5 χ solução de Denhardt, pirofosfato de sódio 0,1% (NaPPi), SDS 0,5%, incubadas a 650C (em um forno Hybaid) por 2 horas, antes da adição de 5 μl (aproximadamente 50 pCi) de sonda radiomarcada à garrafa de hibridização. Permitiu-se então que a hibridização procedesse de um dia para o outro (18 horas) a 65 0C (condições rigorosas) ou 420C (condições de baixo rigor). Foram feitas lavagens de rigores variáveis, como descrito por Ausubel e cols. (supra).

Expressão de GOX

Para realizar uma comparação direta entre as enzimas, foi feita uma construção sintética que codifica o gene GOX com base no ID. DE SEQ. N°: 17 da U.S. 5.776.760. A construção sintética foi subclonada por pLSGOX (fabricada sob medida por Topgene, Canadá) no sitio Eco Rl do vetor de expressão pET29a (Novagen) para produzir a enzima com um S- tag no terminal Ν. A expressão da proteína GOX solúvel foi otimizada sob condições variáveis de temperatura e IPTG, e a expressão da proteína GOX foi detectada por análise por SDS-PAGE corada com Coomasie, e a atividade enzimática de GOX foi testada como descrito acima para GloxA, com análise por HPLC da atividade para detectar a remoção de glifosato e produção de AMPA de acordo com métodos analíticos acima.

Resultados

Antes da obtenção da seqüência gênica total para as construções de degradação de glifosato descritas acima, a homologia do DNA isolado para o gene gox foi testada por hibridização DNA:DNA. Os southern blots resultantes ilustraram que não havia ligação específica detectável entre as construções de DNA e o gene grox sob condições padronizadas ou não rigorosas (Figura 3).

A glifosato oxidorredutase (GOX) é a única outra enzima relatada na literatura que pode clivar glifosato em uma etapa enzimática única, produzindo AMPA a partir de glifosato supostamente por re-oxidando flavina reduzida para degradar a ligação carbono C2 ao nitrogênio de glifosato para produzir AMPA e glioxilato (W0 92/00377; U.S. 5.776.760). A atividade específica de GOX variante ν. 24 7 foi descrita na U.S. 5.776.760 como 3-4 vezes maior do que os 15 nmol .min"1 .mg"1 de GOX do tipo selvagem, representando uma atividade aproximada de 60 nmol .min"3Mng" 1. Nossos dados iniciais da atividade da enzima bruta para GloxA sugeriam que GloxA tinha uma atividade específica bem maior do que GOX (Tabela 3, 841 μmol. min"1. mg"1) .

A comparação direta era necessária para confirmar esse achado e, portanto, preparamos extratos brutos de uma construção sintética de GOX da mesma forma que a nossa variante de GloxA, e testamos as duas enzimas lado a lado. Sob essas condições, a atividade específica de GloxA em direção ao glifosato foi quase duas vezes maior do que GOX (Figura 4) , mas similar á GOX em direção ao ácido iminodiacético (0,9 vez menos, Figura 4). As diferenças na atividade entre os dados de WO 92/00377 e os nossos estão relacionadas a vários fatores: à purificação apenas parcial das enzimas no nosso caso, e às diferenças nos sistemas de expressão e condições usados.

Ambas as enzimas exibiram atividade significativamente maior em direção ao ácido iminodiacético, e ambas produziram glicina e glioxilato. Isso ainda é consistente com uma preferência pela clivagem da ligação carbono C2 ao nitrogênio para GOX, e uma preferência pela clivagem da ligação carbono C3 ao nitrogênio para GloxA, na medida em que ambas as reações de clivagem produziriam glioxilato e glicina a partir do ácido iminodiacético (veja a Figura 2). Exemplo 5 - Comparação de GloxA com outras proteínas homólogas

Materiais e métodos

As seqüências de nucleotídeos e aminoácidos de GloxA foram comparadas com as bases de dados não redundantes de nucleotídeos e proteínas do NCBI com o uso de BLASTN e BLASTP (Altschul e cols., 1997), respectivamente. Supostas proteínas homólogas GloxA-Iike selecionadas foram então expressas e testadas quanto à atividade de degradação de glifosato. As seqüências de nucleotídeos codificadoras de supostos homólogos selecionados foram sintetizadas comercialmente (Geneart, GmBH), clonadas e expressas com o uso do Sistema de Expressão Champion pET200D/TOPO (Invitrogen), de acordo com as instruções do fabricante. A expressão da proteína recombinante foi verificada e quantificada por análise SDS-PAGE corada por Coomasie e densitometria spot como o uso do sistema de visualização e documentação AlphaImager 2200 (Alpha Innotech).

Foram realizados ensaios enzimãticos para avaliar a degradação de glifosato, com a utilização dos estratos de proteína solúveis sem células (proteína parcialmente purificada) em um volume de 1 ml contendo 100 μg de proteína total sem células (aproximadamente 10 μg extrato de enzima) , 1 mM de MgCl2, 1 mM de glicina em 20 mM de Tris-Cl, pH 7,2. Os controles negativos incluíam extratos sem células de E. coli BL21 Star, ambos sem conter vetor de expressão e contendo pET200D/TOPO sem uma inserção. Resultados

GloxA nao foi descrita previamente, mas é mais similar a uma suposta proteína oxidorredutase recentemente prevista pela anotação completa do genoma de Arthrobacter aurescens TCl (8 6% de identidade de aminoácidos; N0 de acesso no NCBI CP000474.1), e também compartilha um suposto domínio conservado de proteína com a família DadA de proteínas amina oxidase (CDD COGO665).

Glox A compartilha identidade de seqüência de proteína com várias outras proteínas nas bases de dados não redundantes de proteínas. Os homólogos incluem uma suposta proteína glicina oxidase prevista pela anotação do genoma de Brevibacterium linens BL2 (N° de acesso no NCBI ZP_00381186), que demonstrou que também é capaz de clivar glifosato para a produção de glicina (Tabela 7). tabela 7

<table>table see original document page 82</column></row><table> Exemplo 6 - Expressão de GloxA em Arabidopsis

Um DNA que codifica GloxA foi otimizado para expressão de plantas (ID. DE SEQ. N°: 6) . A seqüência fornecida no ID. DE SEQ. N°: 6 inclui sítios de clonagem adicionados nas extremidades 5' e 31 , além de AACA imediatamente antes do códon de início. As seqüências codificadoras transpõem os nucleotídeos 16 a 1.432 do ID. DE SEQ. N°: 6. 0 DNA que codifica GloxA foi clonado no vetor de transferência de Agrobacteriuml p277 (obtido de CSIRO Plant Industry, Canberra, Austrália) . Esse vetor foi construído por inserção do fragmento NotI de ρART7 em pART27 (Gleave, 1992) . O vetor p277 contém o promotor CaMV 35S e finalizador OCS para expressão de planta, marcadores para seleção de antibióticos e as seqüências necessárias para a transformação de plantas. A construção foi sintetizada por PCR e clonada de forma direcional no plasmídeo de transferência p277.

A transformação de Agrobacterium cepa GV3101 foi obtida com a utilização do método de combinação tri- parental. Isso envolve a co-semeadura de culturas de A. tumefaciens GV3101, E. coli carregando um plasmídeo auxiliar, RK2013 e E. coli carregando o plasmídeo recombinante p27 7 desejado em uma placa LB não seletiva. A incubação de um dia para o outro a 280C resulta em uma cultura mista que foi coletada e semeada por diluição nas placas LB que selecionaram para A. tumefaciens GV3101 carregando o plasmídeo recombinante p277.

Plantas Arabidopsis foram cultivadas por métodos padronizados a 230C com um período de luz de 18 horas por dia. A transformação de plantas Arabidopsis foi realizada por imersão floral. As plantas crescem até uma idade de 3-5 semanas, quando havia muitos caules de flores apresentando flores em vários estágios de desenvolvimento. Uma cultura de um dia para o outro de A. tumefaciens transformada GV3101 é peletizada e ressuspensa em sacarose 5% contendo o agente umidificante Silwet-77. As flores foram imersas na suspensão bacteriana e cuidadosamente umedecidas com o uso de um movimento de varredura. As plantas foram embrulhadas em uma película plástica e deixadas de um dia para o outro no tampo de uma bancada em temperatura ambiente, antes de serem desembrulhadas e colocadas de volta em um armário de crescimento de plantas mantido a 21°C. A imersão foi repetida 1-2 semanas mais tarde para aumentar o número de sementes transformadas. As sementes foram coletadas 3-4 semanas após a imersão, secas em envelopes de sementes pelo período de tempo apropriado para cada ecótipo, e depois esterilizadas e germinadas em placas de ágar Noble contendo antibióticos seletivos e um agente antifúngico.

Os transformantes positivos foram transplantados em portes Arasystem (Betatech), desenvolvidos até a maturidade dentro dos manguitos do sistema Aracon, e as sementes foram colhidas cuidadosamente. Plantas Arabidopsis transformadas (geração TI) foram rastreadas por PCR e por PCR transcriptase reversa (RT-PCR) para confirmar a presença e a expressão do gene recombinante. 0 DNA genômico foi extraído das folhas de plantas transformadas com a construção com o uso de kits de PCR de Planta Extract-N-Amp e Reagente Extract-N-Amp (Sigma). A PCR nos extratos foi realizada com o uso de iniciadores específicos para a seqüência codificadora de GloxA. Para RT-PCR, cerca de 8 plantas transformadas com a construção foram selecionadas aleatoriamente para análise. As folhas dessas plantas são congeladas e moídas em nitrogênio liquido com o uso de um pilão e almofariz. O RNA é isolado com o uso do kit de Planta RNeasy (Qiagen) . O cDNA é preparado a partir do RNA com o uso do kit de síntese de cDNA iScript (Bio-Rad) . A PCR foi realizada com o uso de 1 μl de cDNA, Tag polimerase recombinante (Invitrogen), uma temperatura de anelamento de 540C e iniciadores específicos para GloxA. Três μl de cada 25 μl da reação de PCR são visualizados em um gel de agarose 1,2%. A PCR quantitativa foi realizada com o uso do sistema de PCR em tempo real Applied Biosystems 7 000, com um gene doméstico de Arabidopsis araPTB (número de acesso TAIR AT3G01150) como gene de referência. Plantas T2 e T3 resistentes à canamicina selecionadas expressavam mRNA de GloxA em níveis que variam de 30 a 100 vezes mais do que o gene de referência (Tabela 8).

Tabela 8: Análise de RT-PCR quantitativa da expressão de GloxA em plantas Arabidopsis.

<table>table see original document page 85</column></row><table> * Observações: Ct - ciclo-limite; dCT - diferença no ciclo- limite (GloxA-alvo - araPTB de referência).

As mudas Tl podem ser transplantadas e cultivadas para semente através de duas gerações para eventualmente isolar as sementes T3 homozigotas. As plantas T2 e T3 foram então rastreadas quanto à resistência aumentada ao glifosato, basicamente com a utilização dos métodos descritos por Jander e cols. (2003), mas com Ά. thaliana var. Landsberg, e não Columbia, e com a utilização de doses de tratamento que variam de 2,5-25 kg a.i. ha"1. As pontuações dadas na Figura 5 são para uma dose de 5 χ a dose Iioo esperada (12,5 kg a.i. ha"1) .

As folhas de plantas transgênicas dos estágios T1-T3 também podem ser analisadas por extração de proteína total da planta (por exemplo, com o uso do Kit de Extração de Proteína de Planta Pierce P-PER) e avaliação da expressão da proteína GloxA dentro das células de plantas com o uso de sistemas de detecção de anticorpo Western Blot e ensaio de extrato de enzima. Para análise Western Blotl os extratos de proteína de planta foram inicialmente diluídos dez vezes em 20 mM de Tris-Cl, pH 7,2 e depois quantificados por Corante de Proteína Biorad (Biorad). Quantidades equivalentes de proteína de planta foram carregadas em cada poço de um gel de SDS 10%- poliacrilamida, e separadas por eletroforese. As proteínas foram então colocadas em uma membrana de nitrocelulose usando um aparelho Mini-Blot (por exemplo, Biorad), de acordo com as instruções do fabricante. A imunodetecção pode então ser feita, de acordo com as instruções do kit "Western Breeze Chemiluminescent Detection Kit" (Invitrogen), usando um a anticorpo primário preparado contra proteína GloxA recorabinante purificada (por exemplo, IgG policlonal purificada de coelho preparada pelo wInstitute of Veterinary and Medicai Science", Adelaide, Austrália). A proteína GloxA foi detectada em células de folhas de Arabidopsis transgênica que expressa GloxA (Figura 5) em níveis de até 0,8 ng/μg de proteína total.

Extratos de proteína de plantas transgênicas também foram testados quanto à atividade de GloxA por combinação de 100 pg de proteína total (80 ng de GloxA estimados por dados de Western Blot) com 25 mM de Tris-Cl, pH 7,2, 0,1 mM de MgCl2. Após pré-incubação a 370C por 2 minutos, 1 mM de glifosato foi adicionado à reação, que foi então incubada com agitação por mais 60-120 minutos. Após o tempo de reação necessário, as reações foram derivatizadas com cloreto de tosila, e analisadas por HPLC, como descrito acima. Todos os ensaios enzimáticos foram realizados em triplicata e repetidos pelo menos duas vezes para confirmar os dados. A atividade significativa pode ser detectada de folhas de plantas T2 que expressam mRNA de GloxA (com base nos dados de qPCR) e proteína GloxA (com base nos dados de Western Blot) .

Tabela 9: Atividade de GloxA em células de plantas Arabidopsis que expressam GloxA

<table>table see original document page 87</column></row><table> <table>table see original document page 88</column></row><table>

Exemplo 7 - Produção de milho transgênico que expressa GloxA

Um gene quimérico que compreende um cDNA que codifica o ID. DE SEQ. N°: 1 na orientação senso com relação ao promotor de ubiqüitina de milho (EP 342 926) que está localizado 5' em relação ao fragmento de cDNA, e a extremidade 31 de 10 kD de zeína que está localizada 3' em relação ao fragmento de cDNA, pode ser construído. O fragmento de cDNA desse gene pode ser gerado por reação em cadeia de polimerase (PCR) do clone de cDNA com o uso de iniciadores de oligonucleotídeos apropriados. Os sítios de clonagem (PciI e SmaI, respectivamente) podem ser incorporados nos oligonucleotídeos usados para amplificar o cDNA para fornecer uma orientação adequada do fragmento de DNA, quando inserido no vetor pML103 digerido (N° de Acesso ATCC 97366) . A amplificação é então realizada em uma reação de PCR padronizada. 0 DNA amplificado é então digerido com enzimas de restrição PciI e SmaI apropriadas e fracionado em um gel de agarose. A banda apropriada pode ser isolada do gel e combinada com o plasmídeo pML103. O segmento de DNA de pML103 contém um fragmento do promotor de 1,05 kb SalI-NcoI do gene de zeína de 27 kD do milho que é substituído, com o uso de técnicas padronizadas com o promotor de ubiqüitina do milho, e um fragmento de 0,96 kb de SmaI-SalI da extremidade 3' do gene de zeína de 10 kD do milho no vetor pGem9Zf(+) (Promega) .O vetor e o DNA da inserção podem ser ligados a 15 0C de um dia para o outro com o uso de procedimentos padronizados. 0 DNA ligado pode então ser usado para transformar E. coli XLl-Blue (Stratagene). Os transformantes bacterianos podem ser avaliados por digestão por enzima de restrição do DNA de plasmídeo e análise limitada da seqüência de nucleotídeos com o uso do método de terminação de cadeia didesoxi. A construção de plasmídeo resultante compreenderia um gene quimérico que codifica, na direção 5' a 3', o promotor de ubiqüitina zeína do milho, um cDNA que codifica GloxA, e a região 3' de zeína de 10 kD.

O gene quimérico descrito acima pode então ser introduzido em células de milho pelo seguinte procedimento: embriões imaturos de milho podem ser dissecados de cariopses em desenvolvimento derivados de cruzamentos das linhagens de milho endogâmicas H99 e LH132. Os embriões são isolados 10 a 11 dias após a polinização quando possuem um comprimento de 1,0 a 1,5 mm. Os embriões são então colocados com o lado do eixo virado para baixo e em contato com meio N6 solidificado com agarose (Chu e cols., 1975). Os embriões são mantidos no escuro a 27 °C. Calos embriogênicos friáveis que consistem em massas indiferenciadas de células com pró-embróides somáticos e embrióides, apoiados em estruturas suspensoras se proliferam a partir do escutelo desses embriões imaturos. 0 calo embriogênico isolado do explante primário pode ser cultivado no meio N6 e subcultivado nesse meio a cada 2 a 3 semanas.

O método de bombardeamento de partículas (Klein e cols. , 1987) pode ser usado para a transferência de genes para as células de cultura de calo. De acordo com esse método, partículas de outro (com 1 pm de diâmetro) são revestidas com DNA com o uso da seguinte técnica: 10 pg de DNAs de plasmídeo são adicionados a 5 0 μl de uma suspensão de partículas de outro (60 mg por ml) . Cloreto de cálcio (50 μl de uma solução de 2,5 M) e base sem espermidina (20 μl de uma solução de 1,0 M) são adicionados às partículas. A suspensão é turbilhonada durante a adição dessas soluções. Após 10 minutos, os tubos são centrifugados brevemente (5 segundos a 15.000 rpm), e o sobrenadante removido. As partículas são ressuspensas em 200 μl de etanol absoluto, centrifugadas novamente, e o sobrenadante removido. O enxágüe de etanol é realizado novamente, e as partículas ressuspensas em um volume final de 3 0 μl de etanol. Uma alíquota (5 μl) das partículas de ouro revestidas com DNA pode ser colocada no centro de um disco Kapton™ (Bio-Rad Labs). As partículas são então aceleradas no tecido de milho com um Biolistic™ PDS-1000/14e (Bio-Rad Instruments, Hercules Calif.), usando uma pressão de hélio de 6.894,75 kPa, uma distância de lacuna de 0,5 cm e uma distância de vôo de 1,0 cm.

Para o bombardeamento, o tecido embriogênico é colocado no papel de filtro sobre meio N6 solidificado com agarose. O tecido é disposto em um campo fino e cobre uma área circular de cerca de 5 cm de diâmetro. A placa de Petri que contém o tecido pode ser colocada na câmara do PDS-1000/He, aproximadamente 8 cm da tela de parada. O ar na câmara é então evacuado até um vácuo de 28 mmHg. 0 macrotransportador é acelerado com uma onda de choque de hélio com o uso de uma membrana de ruptura que se rompe quando a pressão do hélio no tubo de choque alcança 6.894,75 kPa.

Sete dias após o bombardeamento, o tecido pode ser transferido para o meio N6 que contém glifosato (2 mg por litro) . Após mais 2 semanas, o tecido pode ser transferido para meio N6 fresco contendo glifosato. Após 6 semanas, áreas de cerca de 1 cm de diâmetro de calos em crescimento ativo podem ser identificadas em algumas das placas que contêm o meio suplementado com glifosato. Esses calos podem continuar a crescer quando subcultivados no meio seletivo.

As plantas podem ser regeneradas do calo transgênico transferindo-se, inicialmente, agrupamentos de tecido ao meio N6. Após duas semanas, o tecido pode ser transferido par ao meio de regeneração (Fromm e cols., 1990).

Exemplo 8 - Produção de soja transgênica que expressa GloxA

Um cassete de expressão composto pelo promotor do vírus do mosaico da couve-flor 35S (Odell e cols., 1985) e pelo finalizador de transcrição do gene que codifica a subunidade β da proteína faseolina de armazenamento de semente do grão Phaseolus vulgaris pode ser usado para expressão das presentes enzimas em soja transformada.

Um fragmento de cDNA que codifica uma enzima da invenção pode ser gerado por reação em cadeia de polimerase (PCR) com o uso de iniciadores de oligonucleotídeo apropriados. Sítios de clonagem podem ser incorporados nos oligonucleotídeos para fornecer uma orientação adequada do fragmento de DNA, quando inserido no vetor de expressão. A amplificação é então realizada como descrito acima, e o fragmento isolado é inserido em um vetor pUC18 que carrega o cassete de expressão.

Embriões de soja podem então ser transformados com o vetor de expressão. Para induzir embriões somáticos, cotilédones, com 3-5 mm de comprimento, dissecados de sementes imaturas, esterilizada na superfície, do cultivar de soja A2872, podem ser cultivados na luz ou no escuro a 26°C em um meio ágar apropriado por 6-10 semanas. Embriões somáticos que produzem embriões secundários são então removidos e colocados em um meio líquido adequado. Após seleção repetida em busca de agrupamentos de embriões somáticos que se multiplicaram na fase inicial, embriões em estágio globular, as suspensões são mantidas como descrito abaixo.

Culturas de suspensão embriogênica de soja podem ser mantidas em 35 ml de meio líquido em um agitador rotatório, a 150 rpm, a 26°C, com luzes florescentes em um esquema de dia/noite de 16:8 horas. As culturas são subcultivados a cada duas semanas por inoculação de aproximadamente 35 mg de tecido em 35 ml de meio líquido. Culturas de suspensão embriogênica de soja podem então ser transformadas pelo método bombardeamento com pistola de partículas (U.S. 4.945.050). Um instrumento Biolistic™ DuPont PDS 1000/HE (adequado ao hélio) pode ser usado para essas transformações.

Um gene de marcador selecionável que pode ser usado para facilitar a transformação de soja é um gene quimérico composto pelo promotor 3 5S do vírus do mosaico da couve- flor, pelo gene de fosfotransferase de higromicina do plasmídeo pJR225 (de E. coli) e pela região 31 do gene de nopalina sintase do T-DNA do plasmídeo Ti de Agrobacterium tumefaciens. O cassete de expressão pode ser isolado como um fragmento de restrição. Esse fragmento pode então ser inserido em um sítio de restrição único do vetor que carrega o gene marcador.

A 50 μl de 60 mg/ml de suspensão de partículas de ouro

de 1 μm, são adicionados, em ordem: 5 μl de DNA (1 pg/μl) , espermidina de 20 μl (0,1 Μ) e 50 μl de CaCl2 (2,5 Μ). A preparação de partículas é então agitada por três minutos, centrifugada em uma microcentrífuga por 10 segundos, e o sobrenadante removido. As partículas revestidas com DNA são então lavadas uma vez em 400 μl de etanol 70%, e ressuspensas em 40 μl de etanol anidro. A suspensão de DNA/partículas pode ser sonificada três vezes por um segundo cada. Cinco μl das partículas de ouro revestidas com DNA são então carregados em cada disco de macrotransportador.

Aproximadamente 300-400 mg de uma cultura de suspensão feita há duas semanas são colocados em uma placa de Petri vazia de 60 χ 15 mm, e o líquido residual removido do tecido com uma pipeta. Para cada experimento de transformação, aproximadamente 5-10 placas de tecido são normalmente bombardeadas. A pressão de ruptura da membrana é ajustada em 7.584,23 kPa, e a câmara é evacuada até um vácuo de 28 mmHg. O tecido é colocado afastado aproximadamente 8,89 centímetros da tela de retenção e bombardeado três vezes. Após o bombardeamento, o tecido pode ser dividido à metade e colocado de volta no líquido, e cultivado como descrito acima.

Cinco a sete dias pós-bombardeamento, os meios líquidos podem ser trocados com meios frescos, e 11 a 12 dias pós-bombardeamento com meios frescos contendo 50 mg/ml de higromicina. Os meios seletivos podem ser renovados semanalmente. Sete a oito semanas pós-bombardeamento, pode ser observado tecido transformado verde, que cresce de agrupamentos embriogênicos necróticos, não transformados. 0 tecido verde isolado é removido e inoculado em frascos individuais, para gerar novas culturas de suspensão embriogênicas transformadas, propagadas de forma clonal. Cada nova linhagem pode ser tratada como um evento de transformação independente. Essas suspensões podem então ser subcultivadas e mantidas como agrupamentos de embriões imaturos, ou regeneradas em plantas inteiras por maturação e germinação de embriões somáticos individuais.

As plantas são testadas quanto à habilidade para crescer quando expostas ao glifosato.

Exemplo 9 - Produção de algodão transgênico que expressa GloxA

Para a produção de GloxA em algodão, a seqüência codificadora de uma proteína da invenção pode ser ligada operacionalmente ao promotor do vírus atrofia do trevo subterrâneo (S7; WO 96/06932) . 0 gene quimérico é ligado operacionalmente a um gene marcador selecionável e introduzido em um vetor de T-DNA. As plantas de algodão são transformadas com o uso da técnica de transformação mediada por Agrobacterium. As linhagens transgênicas de algodão são identificadas por exposição dos transformantes candidatos ao glifosato.

Exemplo 10 - Produção de trigo transgênico que expressa GloxA

A fim de produzir GloxA no trigo, o polinucleotídeo que compreende uma seqüência de nucleotídeos fornecido no ID. DE SEQ. N°: 6 é subclonado em um vetor pPlex (Schunmann e cols., 2003), de tal forma que o promotor do vírus da atrofia do trevo subterrâneo seja capaz de conduzir a transcrição do gene em uma célula de trigo.

A transformação de embriões de trigo do cultivar Bobwhite 26 é realizada de acordo com o método de Pellegrineschi e cols. (2002) . Para confirmar que as plantas que foram produzidas continham a construção, é feita análise por PCR no DNA genômico extraído das folhas usando um kit FastDNA® (BIO 101 Inc., Vista, Califórnia, EUA) de acordo com as instruções dos fornecedores. O DNA é eluído em 100 μl de água deionizada estéril, e 1 μl é usado na PCR.

Exemplo 11- Produção de canola transgênica que expressa GloxA

Mudas de Brassica napus são estabelecidas em potes de 5 cm. Elas crescem em uma câmara de crescimento a 24°C, com um período de luz de 16/8 horas. Após 2,5 semanas, elas são transplantadas para potes de 15 cm, e crescem em uma câmara de crescimento em uma temperatura de dia/noite de 15/10°C, com um período de luz de 16/8 horas.

Quatro internódios terminais de plantas imediatamente antes da fixação ou no processo de fixação, mas antes da florescência, são removidos e esterilizados na superfície em etanol 70% v/v por 1 minuto, hipoclorito de sódio 2% p/v por 20 minutos, e enxaguados 3 vezes com água deionizada estéril. Os caules com as folhas anexadas podem ser refrigerados em sacos plásticos umedecidos por até 72 horas, antes da esterilização. Seis a sete segmentos do caule são cortados em discos de 5 mm, mantendo a orientação da extremidade basal.

Agrobacterium que expressa o ID. DE SEQ. N°: 6 cresce de um dia para o outro em um agitador a 24°C em 2 ms de Calo de Luria contendo 50 mg/l de canamicina, 24 mg/l de cloranfenicol e 100 mg/l de espectinomicina. É feita uma diluição de 1:10, gerando aproximadamente 9 χ 10^8 células por ml. Isso é confirmado por leituras de densidade óptica a 66 0 μm. Os discos de caule (explantes) são inoculados com 1,0 ml de Agrobacterium, e o excesso é aspirado dos explantes.

Os explantes são colocados com o lado basal para baixo em placas de Petri contendo l/10x sais MS padronizados, vitaminas B5, sacarose 3%, ágar 0,8%, pH 5,7, 1,0 mg/l de 6-benziladenina (BA). As placas são estratifiçadas com 1,5 ml de meios contendo sais MS, vitaminas B5, sacarose 3%, pH 5,7, 4,0 mg/l de ácido p-clorofenoxiacético, 0,005 mg/l de cinetina, e cobertas com papel de filtro estéril.

Após uma co-cultura de 2 a 3 dias, os explantes foram transferidos para placas de Petri profundas contendo sais MS, vitaminas B5, sacarose 3%, ágar 0,8%, pH 5,7, 1 mg/l de BA, 500 mg/l de carbenicilina, 50 mg/l de cefotaxima, 200 mg/l de canamicina ou 175 mg/l de gentamicina para seleção. Sete explantes são colocados em cada placa. Após 3 semanas, eles são transferidos para meios frescos, 5 explantes por placa. Os explantes são cultivados em uma sala de crescimento a 25°C, com luz contínua (Branca Suave).

Exemplo 12 - Produção de cevada transgênica que expressa GloxÀ

A fim de produzir GloxA em cevada, o polinucleotídeo que compreende uma seqüência de nucleotídeos fornecido no ID. DE SEQ. N0 : 6 é subclonado em um vetor pPlex (Schunmann e cols., 2003), de tal forma que o promotor do vírus da atrofia do trevo subterrâneo seja capaz de conduzir a transcrição gênica em uma célula de cevada.

A transformação de embriões de cevada é realizada de acordo com o método como descrito de forma geral por Pellegrineschi e cols. (2002) . Para confirmar que as plantas que foram produzidas continham a construção, é feita a análise por PCR no DNA genômico extraído de folhas com o uso de um kit FastDNA® (BIO 101 Inc., Vista, Califórnia, EUA) de acordo com as instruções dos fornecedores. 0 DNA é eluído em 100 μΐ de água deionizada estéril, e 1 μl é usado em PCR.

Será observado por aqueles habilitados na técnica que podem ser feitas várias variações e/ou modificações à invenção, como mostrada nas modalidades específicas, sem se afastar do espírito ou escopo da invenção como descrita de forma ampla. As presentes modalidades devem ser consideradas, portanto, em todos os aspectos, como ilustrativas e não restritivas.

Todas as publicações aqui discutidas e/ou citadas são aqui incorporadas em sua totalidade.

Este pedido reivindica prioridade da U.S. 60/747.151, cujo conteúdo integral é aqui incorporado por referência.

Qualquer discussão de documentos, atos, materiais, dispositivos, artigos ou semelhantes, que tenham sido incluídos na presente especificação, tem a finalidade exclusiva de fornecer um contexto para a presente invenção. Não deve ser considerada uma admissão de que qualquer ou todos esses materiais formem parte da técnica estabelecida ou que fossem de conhecimento geral no campo relevante para a presente invenção, na medida em que existiam antes da data de prioridade de cada reivindicação desse pedido.

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<110> Commonwealth Scientific and Industrial Organisation Grains Research and Development Corporation

<120> Enzimas para a degradação <130> 505440 <150> <151> 60/747,151 12/05/2006 <160> 9 <170> PatentIn versão 3.3 <210> <211> <212 > <213> 1 472 PRT Arthrobacter sp. TBD <400> 1

Val Lys Thr Thr Val Phe Glu Arg Asn Val Pro Gln Thr Ala Val Val 1 5 10 15

Ser His Ala Leu Ala Gly Ala Ala His Arg Pro Tyr Trp Ile Asp His 20 25 30

Leu Gln Asp Ser Ala Thr Arg Tyr Pro Gln Leu Asp Gly Asp Ala Ala 35 40 45

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260 265 270

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340 345 350

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<213> Arthrobacter sp. TBD

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cagttccact attaccgcat caccaaggac caccggatct tgttcggagg ctacgacgcg 960

ctctacttct ggggacgccg cgttgaccaa aagcacgaac accagccggc aacgtgggag 1020

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ctgacgcgct ggtccatgga ccgggccgac cacaatcagg gcaaaaggaa catcatcctc 13 8 0

aaagccctcg acgccgtggg cctgggtttc gactcctga 1419

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<213> Pseudomonas sp. LBAA

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Met Ser Glu Asn His Lys Lys Val Gly Ile Ala Gly Ala Gly Ile Val 15 10 15

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100 105 110

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<223> Primer de oligonucleotídeo

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<223> Primer de oligonucleotídeo

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ttaacttgcc ggacccgttt gcttg 25

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<223> seqüência de codificação GloxA otimizada para expressão em plantas, que inclui sítios de clonagem adicionados nas extremidades 5' e 3' assim como AACA exatamente antes do códon de iniciação.

<400> 6 ggtacctcga ggacaaatga aaactactgt gttcgagaga aacgttcctc agactgctgt 60 tgtttctcat gctcttgctg gtgctgctca tagaccttac tggatcgatc acctccaaga 120 ttctgctact agataccctc agctcgatgg tgatgctgct gctgatcttg ttatcgtggg 180 tggaggatat actggacttt ggactgctct cagagctaaa gagagagatc ctggaagaac 240 tgtgatcctt cttgagggtg aacaagttgc ttgggctgct tctggaagaa atggtggatt 300 ctgcgaggct tctctcactc atggacacga gaacggaaag aacagatggc ctgatgagct 360 tgagactctc gatagactcg gaatggaaaa cctcgataga atgcaagagg ctgtggagaa 420 gtacgctatg gattgtgagt gggagagaac tggtgaactt aacgttgctg tggagcctca 480 tcaagttgca tggctccaag aggatgatac tcctggatct gtgttccttg atcaggatgc 540 tgttagagct gaggtgaact ctcctactta ccttgctgga agatggcata aggattctgt 600 ggctatggtg catccttaca agcttggact cgaacttgct agagtggcta ctgagcttgg 660 agttgtgatc tacgagggaa ctagagtgag agagcttaac gatcacgagc atggtgttac 720 tgttgtgact gagagaggaa tcgttgaggc tggacatgtt gttcttggaa ctaacgtgtt 780 cccttctctc cttaagagaa accagctcat gactgtgcct gtttacgatt acgctctcat 840 gactgagcct cttactgctg aacagcttga gtctatcgga tggggaaaga gacaaggtat 900 cggagatgtg gctaaccagt tccactacta cagaatcact aaggatcaca gaatcctctt 960 cggaggatac gatgctcttt acttctgggg aagaagagtt gatcagaagc acgagcatca 1020 acctgctact tgggagaaga tcgcttctca cttcttcact actttccctc agcttgaggg 1080 acttaagttc actcataagt gggctggacc tatcgattct tctactcagt tctgcgcttt 1140 cttcggaact gctagaaagg gaagagttgc ttacgctgct ggattcactg gacttggagt 1200 tggagctact gctttcgctg ctgatgttct tcttgatctc ctcgctggac ttgatactga 1260 gagaactaga cttgagatgg tgagaaagag acctcttcct tttcctcctg agcctcttgc 1320 ttctcttggt atcaacctca ctagatggtc tatggataga gctgatcaca accagggaaa 1380 gagaaacatc agctc atcctcaagg ctcttgatgc tgttggactc ggattcgatt cttaatctag 1440 1445

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<213> Artificial

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<223> Seqüência de codificação GloxA otimizada para expressão em E. coli

<400> 7 atgaaaacca ccgtgtttga acgtaacgtg ccgcagaccg cggttgttag ccatgcgctg 60 gccggtgcgg cgcatcgtcc gtattggatt gatcatctgc aggatagcgc gacccgttat 120 ccgcagctgg atggcgatgc ggcagcggat ctggtgattg tgggcggtgg ctataccggt 180 ctgtggaccg cgctgcgtgc gaaagaacgt gatccgggcc gtaccgtgat tctgctggaa 240 ggcgaacagg ttgcgtgggc ggcgagcggt cgtaacggcg gcttttgcga agcgagcctg 300 acccatggcc atgaaaacgg caaaaaccgt tggccggatg agctggaaac cctggatcgt 360 ctgggcatgg aaaatctgga tcgtatgcag gaagcggttg aaaaatacgc gatggattgc 420 gaatgggaac gtaccggcga gctgaacgtg gcggtggaac cgcatcaggt ggcgtggctg 480 caggaagatg ataccccggg cagcgtgttt ctggatcagg atgcggtgcg tgcggaagtg 540 aacagcccga cctatctggc cggtcgttgg cataaagata gcgtggcgat ggtgcatccg 600 tataaactgg gcctggagct ggcccgtgtg gcgaccgagc tgggcgtggt gatttatgaa 660 ggcacccgtg tgcgtgagct gaacgatcat gaacatggcg tgaccgtggt gaccgaacgt 720 780 840 900 960 1020 1080 1140

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Tyr Tyr Arg Leu Ser Ala Asp Asn Arg Ile Leu Phe Gly Gly Trp Asp 305 310 315 320

Ala Val Tyr His Tyr Gly Arg Gln Val Ser Trp Lys Tyr Asp Gln Arg 325 330 335

Ala Glu Thr Phe Glu Thr Leu Ala Ala His Phe Tyr Glu Thr Phe Pro 340 345 350

Gln Leu Gln Gly Val Lys Phe Thr His Lys Trp Gly Gly Pro Ile Asp 355 360 365

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Val Ala Met Ala Ala Gly Phe Thr Gly Leu Gly Val Gly Ala Ser Arg 385 390 395 400

Phe Ala Gly Thr Val Met- Leu Asp Leu Leu Ser Gly Gln Asp Thr Glu 405 410 415

Leu Thr Gln Leu Glu Met Val Arg Lys Leu Pro Leu Pro Phe Pro Pro 420 425 430

Glu Pro Val Ala Trp Leu Gly Ile Gln Met Thr Thr Asn Ala Leu Ile 435 440 445

Lys Ala Asp Gly Asn Glu Gly Arg Arg Gly Pro Leu Leu Lys Ala Leu 450 455 460

Asp Ala Val Gly Met Gly Phe Asp Ser 465 470 <210> 9 <211> 472 <212 > PRT <213> Arthrobacter aurescens TCl <400> 9

Met Asn Thr Thr Val Phe Glu Arg Asn Val Pro Gln Ala Ala Val Val 15 10 15

Ser Arg Ala Leu Ala Gly Ala Ala His Arg Pro Phe Trp Ile Asp Asp 20 25 30

Leu Asn Asp Ser Ala Thr Arg Tyr Pro Gln Leu Gly Gly Asp Ala Ala 35 40 45

45

Ala Asp Leu Val Ile Val Gly Gly Gly Tyr Thr Gly Leu Trp Thr Ala 50 55 60

Leu Arg Ala Lys Glu Arg Asp Pro Gly Arg Thr Val Ile Leu Leu Glu 65 70 75 80

Gly Glu Arg Val Ala Trp Ala Ala Ser Gly Arg Asn Gly Gly Phe Cys

85 90 95

Glu Ala Ser Leu Thr His Gly His Glu Asn Gly Arg Asn Arg Trp Pro 100 105 110 Glu Glu Leu 115

S Met Gln Glu 130

Thr Gly Glu 10 145

Gln Glu Asp

15

Arg Ala Glu

20

Asp Ser Val 195

25 Arg Val Ala 210

Arg Glu Leu 30 225

Gly Asn Val

35

Ser Leu Leu

40

Ala Leu Met 275

4 5 Trp Gly Lys 290

Tyr Arg Ile 50 305

Leu Tyr Phe

55

Ala Thr Trp

60 Leu Glu Gly 355

Glu Ile Leu Glu

Ala Val Glu Lys 135

Leu Asn Val Ala 150

Asp Ser Pro Gly 165

Val Asn Ser Pro 180

Ala Met Val His

Thr Glu Leu Gly 215

Lys Asp His Glu 230

Glu Ala Gly His 245

Lys Arg Asn Gln 260

Thr Glu Pro Leu

Arg Gln Gly Ile 295

Thr Lys Asp His 310

Trp Gly Arg Arg 325

Glu Lys Ile Ala 340

Leu Lys Phe Thr

Arg Leu Gly Met Glu 120

Tyr Gly Met Asp Cys 140

Val Glu Pro His Gln 155

Ser Val Phe Leu Asp 170

Thr Tyr Leu Ala Gly 185

Pro Tyr Lys Leu Gly 200

Val Val Ile His Glu 220

Gln Gly Val Thr Val 235

Val Val Leu Gly Thr 250

Leu Met Thr Val Pro 265

Thr Ala Glu Gln Leu 280

Gly Asp Val Ala Asn 300

Arg Ile Leu Phe Gly 315

Val Asp Gln Arg His 330

Ser His Phe Phe Thr 345

His Lys Trp Ala Gly 360

Asn Leu Asp Arg 125

Glu Trp Glu Arg

Val Ser Trp Leu 160

Gln Glu Ala Val 175

Arg Trp His Lys 190

Leu Glu Leu Ala 205

Gly Thr Arg Val

Val Thr Glu Arg 240

Asn Val Phe Pro 255

Val Tyr Asp Tyr 270

Glu Ser Ile Gly 285

Gln Phe His Tyr

Gly Tyr Asp Ala 320

Glu His Gln Pro 335

Thr Phe Pro Gln 350

Pro Ile Asp Ser 365 Ser Thr Gln Phe Cys Ala Phe Phe Gly Thr Ala Arg Lys Gly Arg Val 370 375 380

Ala Tyr Ala Ala Gly Phe Thr Gly Leu Gly Val Gly Ala Thr Ala Phe 385 390 395 400

Ala Ala Asp Val Leu Leu Asp Leu Leu Ala Gly Leu Asp Thr Glu Arg 10 405 410 415

Thr Arg Val Glu Met Val Arg Lys Arg Pro Leu Pro Phe Pro Pro Glu 420 425 430

15

435 440 445

Pro Leu Ala Ser Leu Gly Ile Asn Leu Thr Arg Trp Ser Met Asp Arg

20

Ala Asp His Asn Gln Gly Lys Arg Asn Leu Ile Leu Lys Ala Leu Asp 450 455 460

25 Ala Val Gly Leu Gly Phe Asp Ser 465 470

Claims

1. Polipeptídeo substancialmente purificado caracterizado pelo fato de clivar glifosato para a produção de glicina.

2. Polipeptídeo substancialmente purificado caracterizado pelo fato de clivar a ligação carbono C-3 de fosfonometil ao nitrogênio de glifosato.

3. Polipeptídeo, de acordo com a reivindicação 1 ou 2, caracterizado pelo fato de compreender uma única cadeia de aminoácidos.

4. Polipeptídeo, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1, 2 ou 3, caracterizado pelo fato de que o polipeptídeo é solúvel.

5. Polipeptídeo, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1, 2, 3 ou 4, caracterizado pelo fato de que não é produzido substancialmente nenhum glioxilato em conseqüência da clivagem de glifosato.

6. Polipeptídeo, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1, 2, 3, 4 ou 5, caracterizado pelo fato de que não é produzida substancialmente nenhuma sarcosina em conseqüência da clivagem de glifosato.

7. Polipeptídeo substancialmente purificado caracterizado pelo fato de possuir uma eficiência maior para a clivagem de glifosato do que GOX (ID. DE SEQ. N°: -3) .

8. Polipeptídeo substancialmente purificado caracterizado pelo fato de possuir uma atividade específica para a clivagem de glifosato que é maior do que 550 μmol. min-1. mg-1.

9. Polipeptídeo substancialmente purificado caracterizado pelo fato de compreender uma seqüência selecionada de: (i) uma seqüência de aminoácidos fornecida no ID. DE SEQ. N°: 1, e (ii) uma seqüência de aminoácidos que é pelo menos 25% idêntica a (i) , em que o polipeptídeo cliva um herbicida que contém amina.

10. Polipeptídeo, de acordo com a reivindicação 9, caracterizado pelo fato de que o herbicida que contém amina é glifosato ou glufosinato.

11. Polipeptídeo, de acordo com a reivindicação 9 ou -10, caracterizado pelo fato de que o polipeptídeo compreende uma seqüência de aminoácidos que é pelo menos -60% idêntica ao ID. DE SEQ. N°: 1.

12. Polipeptídeo, de acordo com a reivindicação 9 ou -10, caracterizado pelo fato de que o polipeptídeo compreende uma seqüência de aminoácidos que é pelo menos -90% idêntica ao ID. DE SEQ. N°: 1.

13. Polipeptídeo, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11 ou 12, caracterizado pelo fato de que o polipeptídeo pode ser purificado de uma espécie de Arthrobacter.

14. Polipeptídeo, de acordo com a reivindicação 13, caracterizado pelo fato de que a espécie de Arthrobacter ê Arthrobacter sp. TBD.

15. Polipeptídeo, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13 ou -14, caracterizado por estar fundido a pelo menos um outro polipeptídeo.

16. Polinucleotídeo isolado caracterizado por compreender nucleotídeos que possuem uma seqüência selecionada de: (i) ID. DE SEQ. N0: 2, (ii) uma seqüência de nucleotídeos que codifica um Polipeptídeo de qualquer uma das reivindicações 1, 2, 3, 4, -5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14 OU 15, (iii) uma seqüência de nucleotídeos que é pelo menos -25% idêntica a (i), (iv) uma seqüência de nucleotídeos que hibridiza para (i) sob condições de baixo rigor, (v) uma seqüência de nucleotídeos complementar a de (i) a (iv) .

17. Polinucleotídeo, de acordo com a reivindicação 16, caracterizado por codificar um polipeptídeo que cliva um herbicida que contém amina.

18. Polinucleotídeo, de acordo com a reivindicação 17, caracterizado pelo fato de que o herbicida que contém amina é glifosato ou glufosinato.

19. Polinucleotídeo, de acordo com qualquer uma das reivindicações 16, 17 ou 18, caracterizado por compreender uma seqüência que hibridiza para (i) sob condições rigorosas.

20. Polinucleotídeo recombinante caracterizado por compreender um promotor que funciona em uma célula de planta, ligado operacionalmente a uma seqüência de DNA estrutural que codifica um Polipeptídeo de qualquer uma das reivindicações 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, -14 ou 15, ligado operacionalmente a uma seqüência de poliadenilação 3' que funciona na célula, em que o promotor é heterólogo em relação à seqüência de DNA estrutural e capaz de expressar a seqüência de DNA estrutural para aumentar a resistência da célula a um herbicida que contém amina.

21. Vetor caracterizado por compreender um Polinucleotídeo, de qualquer uma das reivindicações 16, 17, -18, 19 ou 20.

22. Vetor, de acordo com a reivindicação 21, caracterizado pelo fato de que o polinucleotídeo está ligado operacionalmente a um promotor.

23. Célula hospedeira caracterizada por compreender pelo menos um Polinucleotídeo de qualquer uma das reivindicações 16, 17, 18, 19 ou 20 e/ou pelo menos um Vetor da reivindicação 21 ou 22.

24. Célula hospedeira , de acordo com a reivindicação -23, caracterizada por ser uma célula de planta.

25. Célula recombinante caracterizada por clivar glifosato e produzir glicina.

26. Célula recombinante caracterizada por compreender um polipeptídeo introduzido que cliva a ligação carbono C-3 de fosfonometil ao nitrogênio de glifosato.

27. Processo de preparação de um polipeptídeo de qualquer uma das reivindicações 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, -10, 11, 12, 13, 14 ou 15 caracterizado pelo fato de compreender o cultivo de uma célula hospedeira da reivindicação 23 que codifica o referido polipeptídeo, ou um Vetor da reivindicação 22 que codifica o referido polipeptídeo, sob condições que permitam a expressão do polinucleotídeo que codifica o polipeptídeo, e a recuperação do polipeptídeo expresso.

28. Polipeptídeo caracterizado por ser produzido utilizando-se um processo da reivindicação 27.

29. Anticorpo isolado caracterizado por se ligar especificamente a um Polipeptldeo de qualquer uma das reivindicações 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, -14 ou 15.

30. Composição caracterizada por compreender pelo menos um PolipeptIdeo de qualquer uma das reivindicações 1, -2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14 ou 15, pelo menos um Polinucleotídeo, de qualquer uma das reivindicações 16, 17, 18, 19 ou 20, um Vetor, da reivindicação 21 ou 22, uma Célula hospedeira , da reivindicação 23 ou 24, uma célula recombinante da reivindicação 25 ou 26 e/ou um anticorpo da reivindicação -29, e um ou mais veículos aceitáveis.

31. Composição para clivagem de um herbicida que contém amina caracterizada pelo fato de que compreende pelo menos um Polipeptxdeo, de qualquer uma das reivindicações -1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14 ou 15, e um ou mais veículos aceitáveis.

32. Composição, de acordo com a reivindicação 30 ou -31, caracterizada por ainda compreender íons metálicos.

33. Composição, de acordo com a reivindicação 32, caracterizada pelo fato de que os íons metálicos são Co2+, Zn2+ e/ou Mg2+.

34. Uso de um polipeptídeo de qualquer uma das reivindicações 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, -14 ou 15, ou de um polinucleotídeo que codifica o referido polipeptídeo, caracterizado pelo fato de ser como um marcador selecionável para a detecção e/ou seleção de uma célula recombinante.

35. Método de detecção de uma célula recombinante caracterizado pelo fato de compreender: (i) o contato de uma célula ou de uma população de células com um polinucleotídeo que codifica um Polipeptídeo, de qualquer uma das reivindicações 1, 2, 3, -4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14 ou 15 sob condições que permitam a captação do polinucleotídeo pela(s) célula(s), e (ii) a seleção de uma célula recombinante por exposição das células da etapa (i), ou células descendentes destas, a um herbicida que contém amina.

36. Método, de acordo com a reivindicação 35, caracterizado pelo fato de que o polinucleotídeo compreende um primeiro quadro de leitura aberta que codifica um Polipeptídeo, de qualquer uma das reivindicações 1, 2, 3, -4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14 ou 15, e um segundo quadro de leitura aberta que não codifica um Polipeptídeo, de qualquer uma das reivindicações 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, -9, 10, 11, 12, 13, 14 OU 15.

37. Método, de acordo com a reivindicação 36, caracterizado pelo fato de que o segundo quadro de leitura aberta codifica um polipeptídeo.

38. Método, de acordo com a reivindicação 36, caracterizado pelo fato de que o segundo quadro de leitura aberta codifica um polinucleotídeo que não é traduzido.

39. Método, de acordo com a reivindicação 38, caracterizado pelo fato de que o polinucleotídeo que não é traduzido codifica um ácido nucléico catalítico, uma molécula de dsRNA ou uma molécula anti-senso.

40. Método, de acordo com qualquer uma das reivindicações 35, 36, 37, 38 ou 39, caracterizado pelo fato de que a célula é uma célula de planta, uma célula bacteriana, uma célula fúngica ou uma célula animal.

41. Método, de acordo com a reivindicação 40, caracterizado pelo fato de que a célula é uma célula de planta.

42. Método, de acordo com qualquer uma das reivindicações 35, 36, 37, 38, 39, 40 ou 41, caracterizado pelo fato de que o herbicida que contém amina é glifosato ou glufosinato.

43. Método de clivagem de um herbicida que contém amina caracterizado pelo fato de que compreendendo o contato de um herbicida que contém amina com um polipeptídeo, de qualquer uma das reivindicações 1, 2, 3, -4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14 ou 15.

44. Método, de acordo com a reivindicação 43, caracterizado pelo fato de que o polipeptídeo é produzido por uma célula hospedeira da reivindicação 23 ou 24.

45. Planta transgênica caracterizada por compreender um polinucleotídeo exógeno, o polinucleotídeo codificando pelo menos um Polipeptídeo, de qualquer uma das reivindicações 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, -14 ou 15.

46. Planta transgênica, de acordo com a reivindicação -45, caracterizada pelo fato de que o polipeptídeo é produzido pelo menos em uma parte aérea da planta transgênica.

47. Planta transgênica, de acordo com a reivindicação -45 ou 46, caracterizada pelo fato de que o polinucleotídeo é incorporado estavelmente no genoma da planta.

48. Método de produção de plantas com resistência aumentada a um herbicida que contém amina caracterizado pelo fato de que compreende as etapas de: (a) inserção no genoma de uma célula de planta de um polinucleotídeo que compreende: um promotor que funciona em células de plantas para causar a produção de uma seqüência de RNA, ligada operacionalmente a; uma seqüência de DNA estrutural que causa a produção de uma seqüência de RNA que codifica um Polipeptídeo, de qualquer uma das reivindicações 1, 2, 3, -4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14 ou 15, ligado operacionalmente a; uma região não traduzida 3' que funciona em células de plantas para causar a adição de nucleotídeos poliadenil na extremidade 3' da seqüência de RNA; em que o promotor é heterõlogo em relação â seqüência de DNA estrutural e adaptado para causar expressão suficiente do polipeptídeo para aumentar a resistência a um herbicida que contém amina de uma célula de planta transformada com a molécula de DNA; (b) obtenção de uma célula de planta transformada; e (c) regeneração a partir da célula de planta transformada de uma planta transformada geneticamente que possui resistência aumentada a um herbicida que contém amina.

49. Planta transgênica caracterizada por ser produzida utilizando-se um método da reivindicação 48.

50. Método de clivagem de um herbicida que contém amina em uma amostra caracterizado pelo fato de que compreende a exposição da amostra a uma planta transgênica de qualquer uma das reivindicações 45, 46, 47 ou 49.

51. Método, de acordo com a reivindicação 50, caracterizado pelo fato de que a amostra é solo.

52. Animal transgênico não humano caracterizado por compreender um polinucleotídeo exógeno, o polinucleotídeo codificando pelo menos um Polipeptideof de qualquer uma das reivindicações 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, -14 ou 15.

53. Cepa isolada de Arthrobacter sp. caracterizada por estar depositada sob o número de acesso V06/010960 em 11 de abril de 2006 no "National Measurement Institute", Austrália.

54. Composição para clivagem de um herbicida que contém amina caracterizada pelo fato de que compreende a cepa da reivindicação 53, e um ou mais veículos aceitáveis.

55. Extrato da Célula hospedeira da reivindicação 23 ou 24, uma célula recombinante da reivindicação 25 ou 26, uma planta transgênica de acordo com qualquer uma das reivindicações 45 a 47 ou 48, um animal transgênico não humano da reivindicação 52, ou uma cepa da reivindicação -53, caracterizado por compreender um polipeptídeo de qualquer uma das reivindicações 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, -10, 11, 12, 13, 14 OU 15.

56. Composição para clivagem de um herbicida que contém amina caracterizada pelo fato de que compreende o extrato da reivindicação 55 e um ou mais veículos aceitáveis.

57. Método de clivagem de um herbicida que contém amina caracterizado por compreender a exposição de um herbicida que contém amina à cepa da reivindicação 53 e/ou ao extrato da reivindicação 55.

58. Bactéria isolada caracterizada por produzir um Polipeptídeo, de qualquer uma das reivindicações 1, 2, 3, -4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14 ou 15.

59. Bactéria, de acordo com a reivindicação 58, caracterizada por ser uma Arthrobacter sp.

60. Uso de uma bactéria isolada de ocorrência natural caracterizada por produzir um polipeptídeo de qualquer uma das reivindicações 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, -13, 14 ou 15 para a clivagem de um herbicida que contém amina.

61. Esponja ou espuma polimérica para a clivagem de um herbicida que contém amina caracterizada por compreender um Polipeptídeo, de qualquer uma das reivindicações 1, 2, 3, -4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14 ou 15 imobilizado em um suporte polimérico poroso.

62. Método de clivagem de um herbicida que contém amina caracterizado por compreender a exposição de um herbicida que contém amina a uma esponja ou espuma da reivindicação 61.

63. Produto caracterizado por ser produzido a partir de uma planta de qualquer uma das reivindicações 45, 46, 47 ou 49.

64. Parte de uma planta caracterizada pelo fato da planta ser conforme qualquer uma das reivindicações 45, 46, -47 ou 4 9.

65. Parte de uma planta, de acordo com a reivindicação -64, caracterizada por ser uma semente.

66. Método de produção de um polipeptídeo com habilidade aumentada para clivar um herbicida que contém amina caracterizado por compreender: (i) a alteração de um ou mais aminoácidos de um primeiro Polipeptídeo de qualquer uma das reivindicações 1, -2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14 ou 15, (ii) a determinação da habilidade do polipeptídeo alterado obtido da etapa (i) para clivar um herbicida que contém amina, e (iii) a seleção de um polipeptídeo alterado com habilidade aumentada para clivar um herbicida que contém amina, quando comparado ao primeiro polipeptídeo.

67. Polipeptídeo caracterizado por ser produzido pelo método da reivindicação 66.

68. Método de avaliação de um microorganismo capaz de clivar um herbicida que contém amina caracterizado por compreender. (i) o cultivo de um microorganismo candidato na presença de um herbicida que contém amina como a única fonte de nitrogênio, e (ii) determinar se o microorganismo é capaz de crescimento e/ou divisão.

69. Kit caracterizado por compreender pelo menos um Polipeptídeo, de qualquer uma das reivindicações 1, 2, 3, -4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 28 ou 67, pelo menos um Polinucleot ídeo, de qualquer uma das reivindicações 16, 17, 18, 19 ou 20, um Vetor, da reivindicação 21 ou 22, uma Célula hospedeira , da reivindicação 23 ou 24, uma célula recombinante da reivindicação 25 ou 26, um anticorpo da reivindicação 29, uma composição de qualquer uma das reivindicações 30, 31, -32, 33, 54 ou 56, pelo menos uma cepa da reivindicação 53, pelo menos um extrato da reivindicação 55, pelo menos uma bactéria da reivindicação 58 ou 59, pelo menos uma esponja ou espuma polimérica da reivindicação 61, pelo menos um produto da reivindicação 63 e/ou pelo menos uma parte reivindicação 64 ou 65.