DE3781855T2

DE3781855T2 - Mittel zum kalibrieren von durchflusszytometriegeraeten und anderen analysevorrichtungen.

Info

Publication number: DE3781855T2
Application number: DE8787306143T
Authority: DE
Inventors: Chia Huei Chen; Rickie S Kerndt; Michael R Loken; Diether J Recktenwald
Original assignee: Becton Dickinson and Co
Current assignee: Becton Dickinson and Co
Priority date: 1986-08-29
Filing date: 1987-07-10
Publication date: 1993-04-29
Anticipated expiration: 2007-07-11
Also published as: GR3006407T3; EP0258982B1; ES2035068T3; JPH0350211B2; EP0258982A3; JPS63171343A; EP0258983A2; US4704891A; EP0258983A3; ATE80947T1; EP0258982A2; JPH0350212B2; DE3778253D1; JPS63177038A; GR3004885T3; JPH0435709B2; DE3781855D1; EP0257759A2; JPS6363942A; ES2031507T3

Description

Die vorliegende Erfindung bezieht sich auf das Kalibrieren eines für die Teilchenanalyse verwendeten Instruments und betrifft insbesondere einen Reagenssatz für die Verwendung zum Kalibrieren von Durchflußzytometern vor der Verwendung solcher Instrumente zum Ableiten zumindest eines mit Licht im Zusammenhang stehenden Signals von das Instrument passierenden Teilchen.
Im Handel ist eine Anzahl von Instrumenten für die Verwendung einer Teilchen- oder Zellanalyse erhältlich. Merkmale von Teilchen, insbesondere von biologischen Teilchen oder Zellen, können dadurch bestimmt werden, daß die Teilchen während des Analysierens relativ ortsfest gehalten werden oder daß die Teilchen mit einer Strömung bewegt oder in einer Suspension mitgeführt werden. Es sind Durchflußzytometer bekannt und erhältlich, welche zum Feststellen gewisser Merkmale von in Bewegung befindlichen Teilchen oder zum Analysieren dieser Teilchen verwendet werden. In typischen Durchflußzytometriegeräten werden Zellen oder andere biologische Teilchen in solcher Weise in einem Flüssigkeitsstrom bewegt, daß jedes Teilchen, vorzugsweise ein einziges Teilchen während einer Zeitspanne, einen Abtastbereich durchwandert, in welchem physikalische oder chemische Merkmale der Teilchen gemessen werden. Ob zwar verschiedene mit verschiedenen Eigenschaften der Teilchen, darunter elektrischen, akustischen und radioaktiven Merkmalen im Zusammenhang stehende Signale erfaßt werden können, werden doch in Durchflußzytometern im allgemeinen optische Signale für die Analyse der durch das Gerät wandernden Teilchen herangezogen. Auf jeden Fall sind, gleichgültig ob das Analysegerät zum Analysieren der Teilchen in einem statischen Zustand oder dynamischen Zustand verwendet wird, im Regelfalle zuerst Einstellschritte zum Vorbereiten des Geräts für die Verwendung erforderlich. Da Zellen oder andere biologische Teilchen sehr klein sind und die von diesen Teilchen abgegebenen und zu erfassenden Signale häufig nur eine geringe Größe besitzen, ist vor Durchführung der Analyse eine geeignete Kalibrierung des Instruments erwünscht, um verläßliche Prüfergebnisse zu gewährleisten.
Derzeit angewendete Arbeitsweisen zum Kalibrieren von Instrumenten, welche für die Analyse biologischer Teilchen oder für die Zellanalyse verwendbar sind, sind in hohem Maße von der die Analyse durchführenden Person abhängig. Dies heißt in anderen Worten, daß man sich auf- das Urteil und die Erfahrung der Bedienungsperson während der Kalibrierschritte zum Einstellen der Einstellorgane, zum Festlegen geeigneter Schwellenwerte und zum Beistellen eines Satzes von Normen für die jeweils durchzuführende Prüfung verläßt. Erfahrene Bedienungspersonen sind zwar durchaus fähig ein Instrument vor seiner Verwendung zu kalibrieren, jedoch wendet eine solche Bedienungsperson ein beträchtliches Maß an Mutmaßungen und an Spekulation an, um zu erahnen ob eine geeignete Kalibrierung erreicht worden ist. Beispielsweise betrachtet die das Kalibrieren vornehmende Bedienungsperson beim Abgleichen verschiedener optischer Elemente eines Instruments, z. B. eines Durchflußzytometers, typischerweise einen Bildschirm oder CRT, wobei die Bedienungsperson durch Augenmaß bei Einstellung der verschiedenen Einstellorgane feststellt, daß das Instrument kalibriert worden ist. Naturgemäß werden bei Anwendung von Augenmaß die Prüfergebnisse hinsichtlich ihrer Reproduzierbarkeit beeinträchtigt.
Durchflußzytometer und andere Instrumente für die Analyse biologischer Teilchen werden in der Regel mittels Teilchen kalibriert, welche die Typen der erwartungsgemäß zu analysierenden Teilchen oder Zellen simulieren oder ihnen nahekommen. Die Kalibrierteilchen sollen dementsprechend so ausgewählt werden, daß deren Merkmale, z. B. hinsichtlich Größe, Volumen, Oberflächeneigenschaften, Kornstruktur, Färbung (Farbflecken der Zellen, Farbstoffe, immunofluoreszierende Markierungen u. dgl.), den Merkmalen der zu prüfenden Teilchen ähnlich sind. Bei früheren und derzeit durchgeführten Kalibrierverfahren für Durchflußzytometrieinstrumente werden unter anderem für die Kalibrierschritte rote Blutkörperchen aus Hühnerblut verwendet. Obzwar rote Blutkörperchen aus Hühnerblut in einigen Belangen für die Kalibrierverfahren verläßlich sind, sind sie dennoch, insbesondere wegen spektraler Abweichungen bei einigen mit Licht im Zusammenhang stehenden Merkmalen, nicht völlig zufriedenstellend. Zusätzlich zu biologischen Proben für Kalibrierverfahren sind für das Kalibrieren von Instrumenten für die Zellanalyse auch Perlen in Form von Mikrokugeln verfügbar geworden. Beispielsweise sind aus einem Latexmaterial hergestellte Perlen für die Verwendung zum Kalibrieren eines Teilchenzählgerätes in der US-Patentschrift Nr. 4,331,862 beschrieben. Ausgesprochen für das Kalibrieren von Durchflußzytometrieinstrumenten geeignete Perlen sind im Handel bei Flow Cytometry Standards Corporation, Research Triangle Park, North Carolina, erhältlich.
Ob zwar im Hinblick auf die Verfügbarkeit von Kalibrierperlen gewisse Verbesserungen bei den Kalibriermethoden von Geräten für die Teilchenanalyse erzielt worden sind, sind dennoch von der Bedienungsperson zahlreiche Vermutungen im Hinblick auf eine geeignete Kalibrierung des Instruments anzustellen. Es besteht dementsprechend nach wie vor der Wunsch und die Notwendigkeit Kalibrierverfahren zur Verfügung zu stellen, welche nicht nur reproduzierbare Prüfergebnisse ermöglichen, sondern auch jene Spekulationen und Vermutungen entbehrlich machen, welche derzeit bei Kalibriermethoden angewendet werden. Die vorliegende Erfindung ist nun auf die Erzielung solcher Verbesserungen gerichtet.

ZUSAMMENFASSUNG DER ERFINDUNG

Ein Reagenssatz für die Verwendung zum Kalibrieren eines Instruments ist in den unabhängigen Ansprüchen 1 und 9 definiert. Das Verfahren, welches mit dem erfindungsgemäßen Reagenssatz zum Kalibrieren eines Instruments durchgeführt werden kann und bei welchen dieses Instrument dazu dient, von den Teilchen zumindest ein mit Licht im Zusammenhang stehendes Signal abzuleiten, wird so durchgeführt, daß ein einfallender Lichtstrahl auf Kalibrierteilchen gerichtet wird, welche zumindest ein mit den erwartungsgemäß zu analysierenden Teilchen in Beziehung stehendes Merkmal aufweisen. Von den Kalibrierteilchen wird sowohl ein Lichtsignal als auch ein Rauschsignal abgeleitet. Vorzugsweise wird das Lichtsignal von einem im Kalibriergemisch befindlichen Teilchentyp, z. B. einem fluoreszierenden Teilchen, abgeleitet, wogegen das Rauschsignal von einem anderen im Kalibriergemisch befindlichen Teilchentyp, z. B. einem nicht fluoreszierenden Teilchen, abgeleitet wird. Es wird das Verhältnis des ermittelten Lichtsignals zum ermittelten Rauschsignal gemessen und festgehalten. Das gemessene Verhältnis wird mit einem vorbestimmten Verhältnis verglichen, welches einen Schwellenwert für ein Mindestansprechverhalten des Instruments darstellt. Bei diesem Verfahren wird, falls das vorbestimmte Verhältnis nicht erreicht worden ist, der Betrieb des Instruments bei im einfallenden Lichtstrahl befindlichen Kalibrierteilchen eingestellt, bis das gemessene Verhältnis das vorbestimmte Verhältnis erreicht oder überschreitet, womit das Instrument für das nachfolgende Ableiten des Lichtsignals von zu analysierenden Teilchen kalibriert wird.
Bei Verwendung des erfindungsgemäßen Reagenssatzes bei einem Verfahren zum Kalibrieren eines Durchflußzytometriegerätes werden Kalibrierteilchen, welche mit den Merkmalen der erwartungsgemäß zu prüfenden Teilchen in Beziehung stehende Merkmale besitzen, in einem Flüssigkeitsstrom in solcher Weise durch einen einfallenden Lichtstrahl gefördert, daß jedes Kalibrierteilchen, im wesentlichen ein einziges zu einem Zeitpunkt, durch den einfallenden Lichtstrahl hindurchwandert. Ein mit den Kalibrierteilchen im Zusammenhang stehendes Lichtsignal und auch ein Rauschsignal wird erfaßt, worauf das Verhältnis des Lichtsignals zum Rauschsignal bestimmt wird. Dieses Verhältnis wird als gemessener Trennwert zwischen dem Lichtsignal und dem Rauschsignal aufgezeichnet. Der gemessene Trennwert wird mit einem vorbestimmten Trennwert verglichen, welcher einen- Schwellenwert für das Mindestansprechverhalten des Instruments darstellt. Die Einstellung der Arbeit des Instruments wird, falls der vorbestimmte Trennwert nicht erreicht worden ist, durchgeführt bis der gemessene Trennwert den vorbestimmten Trennwert erreicht, womit das Instrument für das Nachfolgende Ableiten von Lichtsignalen von zu analysierenden Teilchen kalibriert wird.
Anspruch 1 der vorliegenden Anmeldung definiert einen Reagenssatz für die Verwendung zum Kalibrieren eines Instruments zum Durchführen einer Zweifarbenfluoreszenzanalyse von Teilchen. Der Reagenssatz besitzt einen ersten Behälter mit darin enthaltenen Kalibrierteilchen, welche befähigt sind bei einer ersten Wellenlänge Fluoreszenzstrahlung auszusenden. Ein zweiter Behälter enthält Kalibrierteilchen, welche befähigt sind bei einer zweiten Wellenlänge Fluoreszenzstrahlung auszusenden. Ein dritter Behälter enthält Kalibrierteilchen, welche im wesentlichen unfähig sind Fluoreszenzstrahlung auszusenden. Dieser Reagenssatz ist für die Verwendung beim oben beschriebenen Verfahren zum Kalibrieren eines Durchflußzytometrieinstruments geeignet.
Ein weiterer Aspekt der vorliegenden Erfindung bezieht sich auf Normteilchen zum Kalibrieren von Fluoreszenzanalyseinstrumenten, welche Teilchen auf Osmiumtetroxid fixierte rote Blutkörperchen aus Hühnerblut darstellen und nicht in der Lage sind Fluoreszenzstrahlung, einschließlich Autofluoreszenzstrahlung, auszusenden, so lange sie nicht mit einem spezifischen Fluorophor umgesetzt worden sind.
In Übereinstimmung mit den Grundsätzen der vorliegenden Erfindung schafft der beanspruchte Reagenssatz wesentliche Verbesserungen gegenüber derzeit bekannten und verwendeten Kalibriermethoden. Die vorliegende Erfindung ermöglicht es der Bedienungsperson ein Instrument für die Teilchenanalyse gestützt auf Kalibriernormen und/oder Schwellenwerte zu kalibrieren, welche im vorhinein festgelegt und der Bedienungsperson zur Verfügung gestellt wurden. Vorzugsweise werden die Schwellenwerte zum Erzielen eines Mindestansprechverhaltens des Instruments der Bedienungsperson während der Kalibrierschritte angezeigt, so daß ein Kalibrierziel bekannt ist. Durch Einstellen und Abgleichen der einzelnen Teile des Instruments bis zum Erreichen der Schwellenwerte wird der Bedienungsperson Sicherheit darüber gegeben, daß das Instrument bei den durchzuführenden Prüfungen einwandfrei arbeitet. Vermutungen und Augenmaß beim Kalibrieren werden beim erfindungsgemäßen Kalibrierverfahren ausgeschaltet, so daß Kalibrierfehler verringert oder überhaupt beseitigt werden und die Reproduzierbarkeit der Prüfungen erhöht wird. Die mit dem erfindungsgemäßen Reagenssatz durchführbaren Kalibrierverfahren sind insbesondere für Durchflußzytometriegeräte geeignet, da durch richtiges Kalibrieren eine genaue Ausrichtung optischer Teile des Instruments sichergestellt wird, durch Anwendung von Kompensationsmethoden einem spektralen Übersprechen Rechnung getragen wird und die Bedienungsperson über die Empfindlichkeit des Instruments, insbesondere hinsichtlich einer Optimierung des Verhaltens des Instruments bei der Immunofluoreszenzanalyse von Teilchen, informiert wird. Es soll darauf hingewiesen werden, daß die Vorteile und Merkmale des erfindungsgemäßen Reagenssatzes sich über Durchflußzytometrieinstrumente hinaus erstrecken und bei anderen Analysegeräten wie automatisierten Mikroskopen, Fluoreszenzmikroskopen, quantitativen Mikroskopen, Bildanalysatoren u. dgl. genützt werden können.

KURZE BESCHREIBUNG DER ZEICHNUNG

Die Fig. 1(a) bis 1(d) sind graphische Darstellungen von Histogrammen, welche die Anzahl von Ereignissen (Zählungen) in Abhängigkeit von den Kanälen für die vier Parameter Volumen, Seitenstreuung, Fluoreszenzfarbe 1 bzw. Fluoreszenzfarbe 2 erläutern, wobei Fig. 1 auch die auf Rauschereignisse und Durchschnittskanalstatistik bezogenen Volumsergebnisse und Werte für Signal, Rauschen, Trennung und Mindestwerte im Hauptkanalmaßstab für die Seitenstreuung, die Fluoreszenzfarbe 1 und die Fluoreszenzfarbe 2 erläutert,
Fig. 2(a) eine graphische Darstellung einer Punktpopulation für eine Zweifarbenfluoreszenzanalyse, (FL 2 vs FL 1) und Fig. 2(b) eine graphische Darstellung einer Punktpopulation der Seitenstreuung versus Fluoreszenzanalyse zeigt, wobei Fig. 2 auch Darstellungen der Kanaldurchschnittswerte für die Zwecke des Instrumentenabgleichs zeigt,
Fig. 3(a) eine graphische Darstellung einer Punktpopulation für eine Zweifarbenfluoreszenzanalyse (FL 2 vs FL 1) und Fig. 3(b) eine graphische Darstellung einer Punktpopulation der Seitenstreuung versus Volumsanalyse zeigt, wobei Fig. 3 weiters die Kanaldurchschnitte für die Populationen der Fluoreszenzfarbe 1 (FL 1), der Fluoreszenzfarbe 2 (FL2) und der Seitenstreuung (SSC) für die Einstellung der Photovervielfacherröhre (PMT) des Instruments angibt, und
Fig. 4(a) eine graphische Darstellung der Punktpopulation für eine Zweifarbenfluoreszenzanalyse (FL 2 vs FL 1) zwecks Erläuterung einer nicht kompensierten Fluoreszenzanalyse und auch die Durchschnittskanaldifferenz zwischen der ungefärbten Population und der angefärbten Population für die Fluoreszenzfarbe 1 (FL 1) und Fig. 4(b) eine graphische Darstellung einer Punktpopulation für eine Zweifarbenfluoreszenzanalyse (FL 2 vs FL 1) zwecks Erläuterung einer kompensierten Fluoreszenzanalyse zeigt, wobei Fig. 4(b) auch die Durchschnittskanaldifferenz der ungefärbten Population und der Population der Fluoreszenzfarbe 2 (FL 2) nach durchgeführter Kompensation veranschaulicht.

EINGEHENDE BESCHREIBUNG

Ob zwar der beanspruchte Reagenssatz zum Durchführen von Kalibrierverfahren in vielen verschiedenen Ausführungsformen geeignet ist, wird in der Zeichnung im einzelnen ein Beispiel eines Kalibrierverfahrens gezeigt und im folgenden dieses Beispiel unter dem Hinweis darauf beschrieben, daß dieses Beispiel als exemplarisch für die Grundsätze der Verwendung des erfindungsgemäßen Reagenssatzes dient und es nicht beabsichtigt ist den Reagenssatz auf die beschriebene Ausführungsform zu beschränken. Der Schutzumfang der Erfindung ist an den beigefügten Ansprüchen und ihren Äquivalenten zu messen.
Bevor unmittelbar auf die Zeichnung Bezug genommen wird, soll darauf hingewiesen werden, daß die im folgenden und im Zusammenhang mit der Zeichnung zu beschreibende Kalibriertechnik einem Durchflußzytometrieinstrument zugeordnet ist. Die als Beispiel zu beschreibenden Kalibriermaßnahmen sind auf einen FACS®-Analysator bezogen, welcher von Becton Dickinson Immunocytometry Systems, Mountain View, Kalifornien, auf den Markt gebracht wird. Die ein Histogramm zeigende Darstellung gemäß Fig. 1 und die Darstellungen von Punktpopulationen gemäß den Fig. 2 bis 4 sind auf dem Bildschirm des FACS-Analysators während der Kalibriermaßnahmen sichtbare typische Anzeigen. Für die Durchführung der Kalibrierschritte mittels des erfindungsgemäßen Reagenssatzes geeignete Software kann für das Durchflußzytometrieinstrument beschafft werden, um die verschiedenen Kalibriermaßnahmen und -funktionen zu erleichtern.
Das zu kalibrierende Durchflußzytometrieinstrument besitzt kurz gesagt eine Düse od. dgl. zum Erzeugen einer Flüssigkeitsströmung mit darin befindlichen zu analysierenden Teilchen. Der Teilchen enthaltende Flüssigkeitsstrom wird typischerweise durch eine Hüllflüssigkeit ummantelt, so daß der Teilchenstrom hydrodynamisch focussiert werden kann, während er einen einfallenden Lichtstrahl durchsetzt, welcher in der Regel im rechten Winkel zum Teilchenstrom steht. Während die Teilchen den Lichtstrom passieren, können mit jedem Teilchen in Zusammenhang stehende Lichtcharakteristika erfaßt werden. Aus diesem Grunde ist zumindest ein Lichtdetektor vorgesehen, wobei die Detektoren dazu bestimmt sind die Fluoreszenz, die Lichtstreuung (in einer oder in mehreren Richtungen), die Absorption u. dgl. zu messen. Diese Lichtdetektoren besitzen Photovervielfacherröhren (photomultiplier tubes = PMT's), welche Lichtsignale in elektrische Signale umwandeln. Zusätzlich zum Erfassen von mit den Teilchen in Zusammenhang stehendem Licht kann auch eine Messung elektrischer Impedanz vorgenommen werden, während die Teilchen eine Öffnung passieren. Diese Impedanzmessung steht mit dem Teilchenvolumen im Zusammenhang und beruht auf dem gut bekannten Coulter-Prinzip. Im FACS-Analysator, dessen Kalibrierung später zu beschreiben ist, sind Photovervielfacherröhren (PMTS's) zum Erfassen von zwei verschiedenen Fluoreszenzfarben und der Lichtstreuung in diesem Falle der Seitenstreuung, vorgesehen, um die von den Teilchen ausgehende Streustrahlung im wesentlichen in einem Winkel von 90º zum einfallenden Lichtstrahl zu messen. Der FACS-Analysator sorgt weiters für die Messung der dem Teilchenvolumen zugeordneten elektrischen Impedanz. Es können somit vier verschiedene Parameter oder Merkmale der Teilchen erfaßt oder gemessen werden, welche allesamt vor Verwendung des Instruments zum Messen dieser Merkmale von Teilchen einer zu prüfenden Probe kalibriert werden sollen.
Die Kalibriermaßnahmen dienen dazu, die das Instrument bedienende Person darüber zu informieren, daß das Instrument auf Grund von vorbestimmten Schwellenwerten, welche für das Minimalbetriebsverhalten des Instruments repräsentativ sind, kalibriert worden ist. Diese Mindestschwellenwerte geben einen Hinweis auf die Empfindlichkeit des Instruments bei Durchführung einer Teilchenanalyse, insbesondere auf das Immunofluoreszenzverhalten. Zusätzlich zur Seitenstreuung und zum Teilchenvolumen kann beispielsweise das beschriebene spezifische Durchflußzytometrieinstrument zwei verschiedene Fluoreszenzfarben, aus insgesamt vier verschiedenen Parametern, erfassen. Im Hinblick auf die folgende Erörterung soll lediglich beispielsweise angenommen werden, daß die erste Fluoreszenzfarbe von zu analysierenden Teilchen im grünen Spektralbereich liegt und Teilchen zugeordnet ist, welche mit Fluorescein markiert sind und angefärbte FITC-Zellen darstellen, und daß die zweite Fluoreszenzfarbe der zu analysierenden Teilchen im roten Spektralbereich liegt und Teilchen zugeordnet ist, welche mit Phycoerytbrin markiert sind und angefärbte PE-Zellen darstellen. Selbstverständlich können je nach den durchzuführenden Prüfungen und je nach den zu analysierenden Teilchen oder Zellen auch andere Fluorochrome oder Markierungsmittel verwendet werden.
Wenn die Bedienungsperson, beispielsweise zu Beginn eines Tages, zwecks Vorbereitung der vorgesehenen Prüfungen das Instrument einschaltet, können die optischen Geräte des Instruments nicht aufeinander abgestimmt sein. Falls die vorzunehmenden Prüfungen dem Erwerb von Daten zum Überwachen von Teilchen des Immunsystems, z. B. Leucocytenproben, dienen, wird die Bedienungsperson möglicherweise feststellen wollen ob das Instrument auf die zur Durchführung dieser Prüfungen geeignete Empfindlichkeit kalibriert ist. Das Empfindlichkeitsverhalten des Instruments und die damit bedingten Ergebnisse sind in Fig. 1 erläutert. Bei Beschreibung der Eigenheiten der Fig. 1 ist zu berücksichtigen, daß die Empfindlichkeitsprüfung lediglich eine Prüfung ist, welche bestätigen soll, ob das Instrument für das Analysieren gewisser Typen von Teilchen, z. B. Leucozyten oder anderen Zellen oder Teilchen des Immunsystems, richtig kalibriert ist. Falls die Ergebnisse der Empfindlichkeitsprüfungen darauf hinweisen, daß die Schwellenwerte für das Mindestbetriebsverhalten des Instruments erfüllt sind, wird das Instrument als richtig kalibriert angesehen, womit für das nachfolgende Benützen des Instruments für die Teilchenanalyse keine weiteren Einstellungen, Ausrichtungen oder Abgleichmaßnahmen erforderlich sind. Da jedoch in der Regel das Instrument für verläßliches Arbeiten in einem gewissen Maß abgeglichen und eingestellt werden muß, ist möglicherweise die Bedienungsperson veranlaßt noch vor dem Bestimmen der Empfindlichkeit im Zusammenhang mit den Darstellungen gemäß Fig. 1 die unten im Zusammenhang mit den Fig. 2 bis 4 erläuterten Einstell- und Kalibrierschritte durchzuführen. Im Zuge der Erörterung wird zunächst im Zusammenhang mit den Darstellungen gemäß Fig. 1 die Bestimmung der Empfindlichkeit und die hiefür erforderliche Arbeitsweise erläutert.
Um diesen Vorgang einzuleiten, verwendet die Bedienungsperson die erfindungsgemäßen Kalibrierteilchen. Es wird ein Reagenssatz vorgesehen, welcher vorzugsweise drei verschiedene Behälter umfaßt, von welchen jeder eine andere Art aus Kunststoff bestehender Mikrokügelchen oder Perlen enthält. Bei der bevorzugten Ausführungsform werden die verschiedenen Perlen in einer phosphatgepufferten Kochsalzlösung (PBS) verwahrt, welche Gelatine, 0,1 % Tween 20 und als Konservierungsmittel 0,1 % Natriumazid enthält. Im ersten Behälter sind mit Fluorescein markierte (FITC) Perlen mit einem Durchmesser von etwa 5 um enthalten. Im zweiten Behälter sind mit Phycoerythrin markierte (PE) Perlen mit einem Durchmesser von etwa 5 um enthalten. Im dritten Behälter sind nicht markierte Perlen mit einem Durchmesser von etwa 4,5 um enthalten. Die Konzentration der Perlen in jedem der drei Behälter beträgt etwa 106 Teilchen je Milliliter. Die Bedienungsperson vermischt in einem Proberohr die FITC-Perlen, PE-Perlen und nicht markierte Perlen im Verhältnis von 1:1:1, indem ein Tropfen eines jeden der drei Reagenzien zu 3 ml steriler phosphatgepufferter Kochsalzlösung (PBS) zugesetzt wird. Das dieses Gemisch enthaltende Proberohr wird sodann in den FACS-Analysator eingesetzt, welcher in bekannter Weise so bedient wird, daß die Perlen im wesentlichen einzeln einen einfallenden Lichtstrahl passieren.
Zusätzlich zu den mit dem Volumen, der Lichtstreuung und den beiden Fluoreszenzdeterminanten betreffenden Signalen werden durch das Instrument für jeden Parameter auch Rauschsignale erfaßt. Fig. 1 zeigt eine Darstellung auf dem Bildschirm des Instruments für die vier vorhandenen Parameter in Form eines Histogramms. Die Y-Achse der Histogramme betrifft gezählte Teilchen und die X-Achse gibt die Anzahl der elektrischen Kanäle an, über welche Daten erfaßt werden. In den beschriebenen Ausführungsformen sind entlang der X-Achse der verschiedenen Histogramme 255 Kanäle vorgesehen. Es wird vorgezogen die Histogramme in einem logarithmischen Maßstab aufzuzeichnen bzw. anzuzeigen, so daß die Trennung der Histogrammscheitel zwischen Rauschen und Signal als eine Differenz sichtbar wird, jedoch tatsächlich als ein linearisiertes Verhältnis ausgedrückt wird.
Die in den Fig. 1(b), (c) und (d) gezeigten und mit Licht im Zusammenhang stehenden Signale beziehen sich auf die Seitenstreuung (SSC), FITC-Perlen bzw. PE-Perlen. Wie zuerst Fig. 1(b) zeigt, wird das Signal für Seitenstreuung durch die Kurve 12 veranschaulicht, wogegen das Rauschen im Bereich 14 gezeigt ist. In ähnlicher Weise ist in Fig. 1(c) das Signal für die FITC-Perlen durch die Kurve 16 veranschaulicht, wogegen das Rauschen im Bereich 18 veranschaulicht ist. In Fig. 1(d) ist das Signal für die PE-Perlen durch die Kurve 20 veranschaulicht, wogegen das Rauschen im Bereich 22 veranschaulicht ist. In Fig. 1(a) ist das Volumssignal unter der Kurve 24 angezeigt, wogegen das erfaßte Rauschen unterhalb der Histogramme als Anzahl der Rauschereignisse angezeigt ist.
Im Zusammenhang mit den auf Licht bezogenen Signalen der Streuung und der Fluoreszenz, u. zw. den Fig. 1(b), (c) und (d), ist ersichtlich, daß eine Trennung- bzw. Differenz zwischen den Scheiteln des tatsächlichen Lichtsignals und dem Rauschsignal besteht. Obzwar diese Trennung zwischen Signal und Rauschen vorzugsweise in einem logarithmischen Maßstab berechnet wird, wird, wie oben erwähnt, das Verhältnis von Signal zu Rauschen auf der X-Achse der Histogramme als lineare Differenz ausgedrückt. Bei Betrachtung der Histogramme kann man somit einfach den Abstand oder die Trennung zwischen den Scheiteln von Signal und Rauschen mit Bezug auf Streuung, FITC-Perlen und PE-Perlen erkennen.
In den Histogrammen der Fig. 1(c) und (d) für die Fluoreszenzanalyse wird tatsächlich der Betrag der Trennung zwischen durchschnittlicher Fluoreszenzintensität markierter Perlen im Vergleich zu nicht markierten Perlen gemessen, wie er sich durch die zuvor erwähnten Reagenzien ergibt. In Fig. 1(c) stellt deshalb die Kurve 16 die durchschnittliche Fluoreszenzintensität der mit FITC markierten Perlen dar, wogegen die Kurve 18 die Intensität des Rauschens darstellt, welches das Ergebnis der nicht markierten Perlen im für Kalibrierzwecke verwendeten Reagenziengemisch ist. In ähnlicher Weise stellt in Fig. 1(d) die Kurve 20 die durchschnittliche Fluoreszenzintensität von mit PE markierten Perlen dar, wogegen die Kurve 22 die durchschnittliche Intensität des Rauschens von unmarkierten Perlen darstellt, welche durch das für das Kalibrieren verwendete Reagenziengemisch beigestellt werden. Dadurch daß ein einziges Reagenziengemisch aus gleichen Mengen mit FITC markierten Perlen, aus mit PE markierten Perlen und aus unmarkierten Perlen beigestellt wird, kann das Instrument in einfacher Weise für Zweifarbenfluoreszenzanalyse kalibriert werden.
Im Zusammenhang mit dem in Fig. 1(b) veranschaulichten Seitenstreuungssignal ist festzusteilen, daß tatsächlich ein Rauschen eingeführt wird, so daß ein Trennwert zwischen Rauschen und Signal gemessen werden kann. Dies ist erforderlich, weil das durch den Bereich 14 der Fig. 1(b) veranschaulichte Rauschen nicht von nicht markierten Zellen herrührt wie dies im Fluoreszenzsignal der Fall ist. Gemäß dieser Figur wird das Rauschen der Seitenstreuung (SSC) auf ein in keiner Relation stehendes Signal ausgerichtet, um ein Bezugssignal für Rauschen zu erzeugen. Dementsprechend wird das (FL 2)-Signal willkürlich dafür ausgewählt ein Bezugssignal zu erzeugen. Rauschen wird dadurch in das Signal für Seitenstreuung eingeführt, daß am Durchflußzytometrieinstrument die Einstellglieder für FL 2 so eingestellt werden, daß die Ereignisrate (oder Strömungsgeschwindigkeit von das Instrument passierenden Teilchen) etwa das Doppelte der Ereignisrate zum Gewinnen von Daten über Volumen, FL 1 und FL 2 beträgt. Unter dieser Maßgabe tritt im Signal für Seitenstreuung Rauschen in solcher Weise auf, daß der linearisierte Betrag der Trennung zwischen Rausch- und Streusignalen bestimmt werden kann.
Zusätzlich zu den vorzugsweise in Form eines Histogramms zur Verfügung gestellten graphischen Anzeigen kann der Bildschirm des zu kalibrierenden Instruments so programmiert werden, daß die Ergebnisse digital ausgeworfen werden. Software für das Instrument, auch für die Kalibriermaßnahmen einschließlich, kann in einfacher Weise so programmiert werden, daß, eine auf die gesammelten Daten Bezug nehmende Information erhalten wird. Es kann somit der Fig. 1 unterhalb der Histogramme entnommen werden, daß Volumsergebnisse digital angezeigt werden, so daß Rauschereignisse und ein Durchschnittskanalsignal von der Bedienungsperson abgelesen werden können. Beim Kalibrieren eines Instruments wie eines FACS-Analysators soll der Mittelkanal für das Volumen etwa in der Mitte des Histogramms für das Volumen liegen. Eine Ablesung etwa in der Mitte der Skala weist darauf hin, daß die von den Teilchen durchströmte Öffnung richtig gewählt worden ist und daß am Gerät die Einstellglieder für das Volumen richtig eingestellt worden sind. Ein vorzugsweise unter 500 liegender- Pegel für Rauschereignisse deutet auf eine richtige Einstellung des Instruments hin.
Fig. 1 zeigt am Bildschirm auch die den Histogrammen gemäß den Fig. 1(b), (c) bzw. (d) zugeordneten Digitalanzeigen. Die verschiedenen Parameter von SSC, FL 1 und FL 2 sind zusammen mit den Anzeigen für Signal, Rauschen, Trennung, Minimum und Kennzahl der Charge (lot ID) angegeben. Die Kennzahl und die Mindestwerte stehen miteinander in Beziehung. Die Bedienungsperson ist beauftragt die Kennzahl für die Charge (ID-Nummer) vor dem Einführen des Gemisches von Kalibrierperlen zwecks Einregelung der Kalibriermaßnahmen in das Programm einzugeben. Da die Kalibrierperlen wechselnde Eigenschaften, darunter verschiedenartige Fluoreszenzhelligkeit, Intensität u. dgl., besitzen können, sollen beim Kalibrieren des Instruments diese wechselnden Eigenschaften, berücksichtigt werden. Je nach Art der durch die ID-Nummer identifizierten, verwendeten Kalibrierperlen werden verschiedene vorbestimmte Trennwerte als Mindest- oder Schwellenwerte für das Mindestbetriebsverhalten des Instruments festgelegt. Da die Software vorprogrammiert werden kann, wird der vorbestimmte Mindesttrennwert für die Anzeige auf Fig. 1 so lange gehalten als die ID-Nummer der Charge von der Bedienungsperson zu Beginn der Kalibriermaßnahmen in das Programm eingegeben wurde.
Am unteren Rand der Fig. 1 sind die durchschnittlichen Mittelkanalwerte für Signal und Rauschen für die den Histogrammen gemäß den Fig. 1(b), (c) bzw. (d) zugeordneten Werte für Seitenstreuung, FL 1 und FL 2 dargestellt. Beispielsweise ist das Signal für Seitenstreuung so dargestellt als läge der durchschnittliche Mittelkanal bei 192, wogegen der durchschnittliche Mittelkanal für Rauschen bei 16 liegt. Die Trennung zwischen diesen Signal- und Rauschergebnissen ist bei 176 angegeben. Der vorbestimmte Mindesttrennwert des Signals für Seitenstreuung ist mit 160 angegeben. Dieser Mindestwert für die Trennung der Seitenstreuung ist der für das Instrument erwünschte Pegel für hinreichende Kalibrierung für ein verläßliches Durchführen von Messungen der Seitenstreuung. Da die tatsächlich gemessene Trennung bei 176 liegt, wird das Minimum überschritten. Das Instrument wird dementsprechend als für anschließende Prüfungen von Teilchen als kalibriert erachtet, bei welchen die Seitenstreuung ein zu erfassendes Signal ist.
Digitale Anzeigen des durchschnittlichen Mittelkanals für Signal, Rauschen und Trennung sind auch für die Signale für FL 1 und FL 2 angegeben. Wie im Beispiel gemäß Fig. 1 gezeigt ist, überschreiten beide Trennwerte für FL 1 und FL 2 den zugehörigen Mindesttrennwert, so daß die Bedienungsperson in einfacher Weise darauf schließen kann, daß das Instrument für diese zwei Signale in geeigneter Weise kalibriert ist. Die Software für das oben beschriebene Kalibrierverfahren berechnet ein Signal/Rausch-Verhältnis im logarithmischen Maßstab, drückt jedoch dieses Verhältnis in linearisierter Form aus, wodurch die Scheitel auf dem Bildschirm in Abstand voneinander erscheinen und damit zweckmäßig zu interpretieren sind. Falls irgendeines oder jedes der mit Licht in Zusammenhang stehenden Signale für Streuung und Fluoreszenz unterhalb des vorbestimmten Minimums liegende Meßwerte für die Trennung ergeben, sollten weitere Einstellungen des Instruments für ein richtiges Kalibrieren in Betracht gezogen werden. Die Fig. 2, 3 und 4 erläutern die Anzeigen am Bildschirm des FACS-Analysators bei Durchführung dieser Kalibriereinstellungen zwecks Ausrichtung optischer Elemente zum Optimieren des Betriebsverhaltens des Instruments, beim Vornehmen von Einstellungen an Photovervielfacherröhren und beim Kompensieren eines spektralen Übersprechens oder einer Überlappung bei einer Zweifarbenfluoreszenzanalyse von Teilchen.
Beim Einstellen des Instruments zwecks Sicherstellung einer für optimales Betriebs verhalten angemessenen Ausrichtung optischer Elemente kann das Kalibrieren unter Verwendung von mit FITC markierten Perlen aus dem ersten Behälter des oben beschriebenen Reagenssatzes vorgenommen werden. Ein Proberohr mit einer Suspension aus mit FITC markierten Perlen kann dadurch beigestellt werden, daß ein Tropfen des Reagens aus mit FITC markierten Perlen zu 1 ml steriler phosphatgepufferter Kochsalzlösung zugesetzt wird. Dieses Proberohr wird dann in den FACS-Analysator eingesetzt, wodurch zusammen mit der Software für das Kalibrieren am Bildschirm die Punktpopulation in der in Fig. 2 dargestellten Weise angezeigt wird. Fig. 2(a) erläutert FL 2 vs FL 1, wogegen Fig. 2(b) die Seitenstreuung (SSC) vs FL 1 zeigt. Unterhalb der Darstellungen für die Punktpopulationen findet sich digitale Information, welche sich auf die Kanaldurchschnitte für die Signale für FL 1, FL 2 und SSC bezieht. Bezieht man sich zunächst auf Fig. 2(a), zeigt sich, daß eine Kalibrierung dann erreicht ist, wenn die Punktpopulation für die grünen Perlen (mit FITC markiert) nahe der Mitte der Anzeige liegt. Am Instrument können die für Fluoreszenz zuständigen Spannungen an der Photovervielfacherröhre so eingestellt werden, daß die Punktpolulation an diese Stelle bewegt wird. Im Zusammenhang mit den unterhalb der Punktpopulationen ausgedruckten Durchschnittswerte der Signale für FL 1 und FL 2 kann die Bedienungsperson eine Kalibrierung zum Maximieren dieser Signale sicherstellen. Optische Elemente des Instruments, z. B. Einstellglieder für die Kondensatorlinse, werden so verdreht oder eingestellt, daß diese Signaldurchschnittswerte maximiert werden, welche etwa zur gleichen Zeit maximiert werden sollten. Die in Fig. 2(a) gezeigte Punktpopulation wird von der Bedienungsperson in Nähe des Maximums so weitgehend als möglich verdichtet. Im Zusammenhang mit der Fig. 2(b) und dem unter den Punktpopulationen angegebenen Durchschnittssignal für SSC ist ein normalerweise vorbestimmter Zielwert für das Kalibrieren angestrebt. Beispielsweise ist für den FACS- -Analysator des Instruments der Zielwert für - den Kanaldurchschnittswert des SSC-Werts bei etwa 190 gelegen. Um diesen Zielwert zu erreichen, kann die Bedienungsperson an der Photovervielfacherröhre des Instruments die Spannung für Seitenstreuung (SSC) so lange einstellen bis der Durchschnittswert des SSC-Signals etwa 190 erreicht. Um den Zielpegel für den Durchschnittswert des SSC-Signals zu erreichen, kann es erforderlich sein andere Einstellungen an den optischen Elementen oder an den Photovervielfacherröhren vorzunehmen. Sowohl die Darstellung der Punktpopulationen als auch die digital angezeigten Zahlen unterstützen die Bedienungsperson beim Kalibrieren des Instruments hinsichtlich geeigneter optischer Ausrichtung.
Analog zur optischen Ausrichtung können während der Kalibrierschritte auch die Photovervielfacherröhren (PMT's) eingestellt werden. Fig. 3 zeigt typische Darstellungen von Punktpopulationen im Zusammenhang mit der Einstellung von Photovervielfacherröhren. Fig. 3(a) ist eine Punktpopulation von FL 2 vs FL 1, wogegen Fig. 3(b) eine Punktpopulation der Seitenstreuung (SSC) vs Volumen ist. Um festzustellen ob eine Einstellung an Photovervielfacherröhren vorgenommen werden soll, verwendet die Bedienungsperson ein vom oben beschriebenen Kalibrierteilchenverfahren verschiedenes Verfahren. In diesem Falle wird für die Einstellung der Photovervielfacherröhre von der Bedienungsperson vorzugsweise ein Proberohr mit einer Suspension von nicht markierten Perlen dadurch vorbereitet, daß ein Tropfen nicht markierter Perlen aus dem oben beschriebenen Behälter für nicht markierte Perlen des Reagenssatzes zu 1 ml steriler, phosphatgepufferter Kochsalzlösung zugesetzt wird. Dieses Proberohr mit nicht markierten Perlen wird sodann in den FACS-Analysator eingesetzt, womit am Bildschirm im Zusammenhang mit der Software für das Kalibrieren die in Fig. 3 gezeigten Punktpopulationen dargestellt werden. Zusätzlich zu den Darstellungen der Punktpopulationen sind in Fig. 3 auch drei Zahlen angegeben, welche die Kanaldurchschnittswerte für die Populationen der drei Parameter FL 1, FL 2 und SSC darstellen. Während die Kalibrierteilchen das Instrument mit gesteuerter, bekannter Geschwindigkeit durchströmen, strebt die Bedienungsperson für den Durchschnitt von FL 1, den Durchschnitt von FL 2 und den Durchschnitt von SSC bei einem vorbestimmten Ziel liegende Werte an. Für die Durchschnitte von FL 1 und FL 2 kann der Zielwert beispielsweise in der Größe von 30 liegen, wobei, falls dieser Wert nicht erreicht wird, die Bedienungsperson am Instrument die Einstellglieder für die Photovervielfacherspannungen für Fluoreszenz 1 oder Fluoreszenz 2 einstellen kann bis die am Bildschirm angezeigte Kanalmitte FL1 oder FL 2 so nahe als möglich bei 30 liegt. In ähnlicher Weise kann beispielsweise der Zielwert für den SSC-Durchschnitt auf 190 eingestellt werden. Falls dieser Wert zuerst nicht angezeigt wird, kann die Bedienungsperson am Instrument die Einstellung der Photovervielfacherspannung für Lichtstreuung verändern bis der am Bildschirm angezeigte Mittelkanal so nahe als möglich bei 190 liegt. Selbstverständlich ist einzusehen, daß diese Durchschnittswerte lediglich als Beispiele gedacht sind und je nach Aufbau des Instruments, je nach durchzuführenden Prüfungen oder je nach anderen Faktoren veränderlich sind. Falls annehmbare Werte für den Mittelkanal nicht erzielt werden, muß die Bedienungsperson unter Umständen auf die im Zusammenhang mit Fig. 2 beschriebenen Abgleichschritte für das Instrument zurückkommen.
Nachdem die Photovervielfacherröhren eingestellt und die optischen Elemente des Instruments ausgerichtet worden sind, kann im Zuge des Kalibrierens des Instruments eine andere Einstellung vorgenommen werden. Diese zusätzliche Einstellung bezieht sich auf das Kompensieren eines spektralen Übersprechens oder des Überlappens im Falle einer durchzuführenden Zweifarbenfluoreszenzanalyse. Diese Maßnahme erleichtert die Einstellung für die Fluoreszenzkompensation, so daß von der roten (mit PE angefärbten) Population das unerwünschte Grünsignal und von der grünen (mit FITC angefärbten) Population das unerwünschte Rotsignal abgesondert wird.
Bei Durchführung der Maßnahmen für Fluoreszenzkompensation beginnt die Bedienungsperson vorzugsweise mit einem Proberohr von Kalibrierteilchen, welches ähnlich dem Proberohr ist, welches für die oben beschriebene Empfindlichkeitsprüfung verwendet worden ist. Dieses Proberohr wird dadurch mit einem im Verhältnis von 1:1:1 bestehenden Gemisch aus FITC-Perlen, PE-Perlen und unmarkierten Perlen gefüllt, daß ein Tropfen eines jeden der drei Reagenzien aus den oben beschriebenen Behältern zu 3 ml phosphatgepufferter steriler Kochsalzlösung gegeben wird. Wenn dieses Rohr in das Analysegerät eingesetzt wird, wird am Bildschirm im Zusammenhang mit dem Kalibrierprogramm der Software in Abhängigkeit von der tatsächlich verstrichenen Zeit eine Punktpopulation angezeigt, welche, wie in Fig. 4(a) ersichtlich ist, die unkompensierte Fluoreszenz veranschaulicht. Die in Fig. 4(a) getrennt ersichtlichen drei Punktpopulationen stellen die nicht markierten, die grün markierten und die rot markierten Perlen dar. Nicht markierte Perlen sind typischerweise innerhalb des Quadrats in der unteren linken Ecke der Anzeige gelegen, wie dies durch den Bereich 28 veranschaulicht ist. Rote (mit PE angefärbte) Perlen sind typischerweise oberhalb der nicht angefärbten Population, also im Bereich 30, erkennbar. Die grüne Population ist an der rechten Seite der nicht angefärbten Population, also im Bereich 32, erkennbar. So lange am Instrument eine Fluoreszenzkompensation vorgenommen wird, ist die Lage der Bereiche 28, 30 und 32 lediglich angenähert. Unterhalb der Darstellung gemäß Fig. 4(a) findet sich eine digitale Angabe für (FL 1)-Kompensation und für (FL 2)-Kompensation. Falls diese Digitalwerte nicht bei oder nahe um Null schwanken, sollten Einstellungen für die Fluoreszenzkompensation getroffen werden.
Eine Kompensation für Zweifarbenfluoreszenzanalyse wird durch Einstellen der Einstellglieder für (FL 1)-Kompensation und für (FL 2)-Kompensation am Instrument so lange vorgenommen bis die am Bildschirm angezeigten Kompensationswerte so nahe als möglich bei Null liegen. Nach durchgeführter Einstellung sollte der Kompensationswert ebenfalls oberhalb und unterhalb Null schwanken und variieren. Im Zusammenhang mit der (FL 1)-Kompensation stellt der kompensierte Wert die Differenz zwischen dem durchschnittlichen Horizontalkanal für die nicht angefärbte Population und dem durchschnittlichen Horizontalkanal für die grün angefärbte Population dar. Während das Einstellglied für die (FL 1)-Kompensation eingestellt wird und sich der Wert am Bildschirm dem Wert Null nähert, bewegt sich die grüne Population 32 in der Anzeige nach unten bis sie auf einer zur Horizontalachse parallelen horizontalen Linie auf gleicher Ebene wie die nicht angefärbte Population 28 liegt, wie dies in Fig. 4(b) ersichtlich ist.
In ähnlicher Weise bedeutet die anschließend bei der (FL 2)-Kompensation ermittelte mittlere Kanaldifferenz die Differenz zwischen dem mittleren Vertikalkanal für die nicht angefärbte Population und für die rot angefärbte Population. Wenn das Einstellglied für die (FL 2)-Kompensation am Instrument eingestellt wird und sich der Wert am Bildschirm dem Wert Null nähert, soll sich die rote Pupolation 30 in der Anzeige horizontal bewegen bis sie in der in Fig. 4(b) gezeigten Weise auf einer zur Vertikalachse parallelen Vertikallinie auf einer Linie mit der nicht angefärbten Population 28 liegt. Diese Einstellungen an den Einstellgliedern für FL 1 und FL 2 bewirkt eine Fluoreszenzkompensation durch elektrische Subtrahiert eines Teils des unerwünschten Grünsignals von der roten Population und durch elektrisches Subtrahieren eines Teils des unerwünschten Rotsignals von der grünen Population. Eine Kompensation ist dann erreicht, wenn die durch das Computerprogramm auf Null eingestellten vorbestimmten Werte auf dem Bildschirm erreicht sind. Falls eine annehmbare Einstellung der angestrebten Werte nicht erreicht werden kann, ist die Bedienungsperson unter Umständen genötigt erneut auf die oben erläuterten Ausrichtmaßnahmen und Einstellmaßnahmen für Photovervielfacherröhren zurückzukommen.
Sobald die Ausrichtmaßnahmen, die Einstellungen für Photovervielfacherröhren und die Fluoreszenzkompensation abgeschlossen worden sind, kann die Bedienungsperson auf die oben im Zusammenhang mit Fig. 1 beschriebene Empfindlichkeitsprüfung zurückkommen. Falls die Mindestwerte für Trennung für jeden der kalibrierten Parameter erreicht worden sind, kann die Bedienungsperson in weiterer Folge das Instrument benützen und sich voll darauf verlassen, daß das Instrument für die durchzuführenden Prüfungen einwandfrei kalibriert ist.
Im Zusammenhang mit den für die beschriebenen Kalibriermaßnahmen zu verwendenden Kalibrierteilchen ist darauf hinzuweisen, daß verschiedenste Teilchen als Normen verwendet werden können. Beispielsweise können biologische Proben wie Teilchen oder Zellen dann verwendet werden, wenn diese Proben den tatsächlich zu analysierenden Teilchen ähnliche Eigenschaften besitzen oder so behandelt werden können, daß sie derartige Eigenschaften annehmen. Diesen Richtlinien entsprechend können rote Blutkörperchen aus Hühnerblut bei entsprechender Auswahl verwendet werden. Als Normteilchen können modifizierte Formen von roten Blutkörperchen aus Hühnerblut verwendet werden. Im einzelnen können als Teilchenstandard fluoreszierend markierte und auf Osmiumtetroxid fixierte rote Blutkörperchen aus Hühnerblut verwendet werden, da diese die Größe und die Streueigenschaften biologischer Zellen besitzen. Darüber hinaus wird durch das Fixieren an Osmiumtetroxid die Autofluoreszenz der Zellen unterdrückt. Diese Zellen können biotiniliert werden und anschließend in bekannter Weise mit einem dem Avidin konjugierten Fluorophor umgesetzt werden. Die Fluoreszenz des an die Zellen gebundenen Avidinkomplexes wird durch das Osmiumtetroxid auf den Zellen nicht unterdrückt. Der dem Avidin konjugierte spezifische Fluorophor besitzt für das Anfärben der Zelloberfläche geeignete Spektraleigenschaften. In den Konjugaten können außer den unten zu beschreibenden Fluorophoren zahlreiche verschiedene Fluorophore verwendet werden.
Der am stärksten bevorzugte Typ von Kalibrierteilchen des erfindungsgemäßen Reagenssatzes sind aus Kunststoff gefertigte Mikrokugeln. Solche Kugeln können mit im wesentlichen einheitlichem Durchmesser hergestellt werden und besitzen Oberflächeneigenschaften, welche für das Behandeln von Fluorophoren oder anderen kolorimetrischen Markierungsmitteln an der Oberfläche geeignet sind. Es können im wesentlichen kugelförmige Perlen mit einem Durchmesser zwischen 0,5 und 20 um und insbesondere zwischen 2 und 8 um hergestellt werden, so daß diese Kalibrierteilchen eine Größe besitzen, welche in der Größenordnung der Größe von Leucocyten liegt. Obzwar diese Perlen in der Regel in kompakter Form hergestellt werden, können sie doch im Inneren hohl sein und, wie Liposomen oder andere Mikroträger, Blasen darstellen. Darüber hinaus müssen die Perlen nicht einwandfreie Kugeln sein, um im Sinne der vorliegenden Erfindung fungieren zu können. Zum Herstellen der Kugeln können Kunststoffe wie Polystyrol, Polyacrylamid und andere Latexmaterialien, aber auch andere Kunststoffe wie Polyvinylchlorid, Polypropylen u. dgl. verwendet werden. Außer den oben beschriebenen Markierungsmitteln Fluorescein und Phycoerythrin für die Perlen können auch andere fluoreszierende Markierungsmittel wie Allophycocyamn, Texas-Rot, Rhodamin, Verbindungen vom Rhodamintyp und andere Anfärbstoffe als fluoreszierende Markierungsmittel für die Zwecke der vorliegenden Erfindung verwendet werden. Die Perlen werden, gleichgültig ob sie markiert oder nicht markiert sind, vorzugsweise in einer wässerigen Lösung in solcher Weise beigestellt, daß die Perlen in Konzentrationen im Bereiche von 10&sup5; bis 10&sup8; Teilchen je Milliliter und vorzugsweise in einer Konzentration von zumindest 10&sup6; Teilchen je Milliliter vorliegen.
Obzwar der erfindungsgemäße Reagenssatz bei Kalibrierverfahren verwendet werden kann, welche oben im speziellen Zusammenhang mit einem Durchflußzytometrieinstrument beschrieben worden sind, ist eine derartige Beschränkung für die Erfindung nicht beabsichtigt. Tatsächlich kann der erfindungsgemäße Reagenssatz zum Kalibrieren von Instrumenten verwendet werden, in welchen nicht bewegliche Teilchen aber auch bewegliche Teilchen analysiert werden. Im Sinne der vorliegenden Erfindung können verschiedene Mikroskope, z. B. Fluoreszenzmikroskope, automatisierte Mikroskope und quantitative Mikroskope, aber auch Bildanalysatoren kalibriert werden.
Die vorliegende Erfindung schafft somit einen Reagenssatz zum Kalibrieren eines Instruments vor Verwendung dieses Instruments zum Ableiten zumindest eines mit Licht im Zusammenhang stehenden Signals von der Analyse unterworfenen Teilchen. Der beanspruchte Reagenssatz kann zusammen mit geeigneter Software dazu verwendet werden Mindestwerte für Signal/Rausch-Verhältnisse anzuzeigen, welchen entsprochen werden soll, um festzustellen, daß das Instrument für einen spezifischen, mit Licht im Zusammenhang stehenden Parameter kalibriert ist. Dadurch, daß das Signal/ /Rausch-Verhältnis als ein Differential im linearen Maßstab angegeben wird, wird nicht nur die Arbeit der Bedienungsperson erleichtert, sondern auch die Notwendigkeit Vermutungen anzustellen und das Augenmaß einzusetzen wesentlich verringert oder entbehrlich, wobei auch Irrtümer weitgehend vermieden werden. Der erfindungsgemäße Reagenssatz bietet auch eine Qualitätsgarantie bei der Anwendung zur klinischen Diagnose.

Claims

1. Reagenssatz für die Verwendung zum Kalibrieren eines Instruments zum Durchführen einer Zweifarbenfluoreszenzanalyse von Teilchen, umfassend

einen ersten Behälter mit darin enthaltenen Kalibrierteilchen, welche befähigt sind bei einer ersten Wellenlänge Fluoreszenzstrahlung auszusenden,

einen zweiten Behälter mit darin enthaltenen Kalibrierteilchen, welche befähigt sind bei einer zweiten Wellenlänge Fluoreszenzstrahlung auszusenden, und

einen dritten Behälter mit darin enthaltenen Kalibrierteilchen, welche im wesentlichen unfähig sind Fluoreszenzstrahlung auszusenden.

2. Reagenssatz nach Anspruch 1, in welchem sämtliche Kalibrierteilchen im wesentlichen kugelförmige Perlen mit einem Durchmesser zwischen 0,5 und 20 um sind.

3. Reagenssatz nach Anspruch 2, in welchem die Perlen aus Kunststoff gefertigt sind.

4. Reagenssatz nach irgendeinem der vorhergehenden Ansprüche, in welchem die im ersten Behälter enthaltenen Teilchen mit einem oberflächengebundenen fluorochromatischen Mittel markiert sind.

5. Reagenssatz nach Anspruch 4, in welchem das fluorochromatische Mittel Fluorescein ist.

6. Reagenssatz nach irgendeinem der vorhergehenden Ansprüche, in welchem die im zweiten Behälter enthaltenen Teilchen mit einem oberflächengebundenen fluorochromatischen Mittel markiert sind.

7. Reagenssatz nach Anspruch 6, in welchem das fluorochromatische Mittel Phycoerythrin ist.

8. Reagenssatz nach irgendeinem der vorhergehenden Ansprüche, in welchem die in jedem der drei Behälter enthaltenen Teilchen in einer wässerigen Lösung mit einer Konzentration von zumindest 10&sup5; Teilchen je Milliliter vorliegen.

9. Reagenssatz für die Verwendung zum Kalibrieren eines Instruments zum Durchführen einer Zweifarbenfluoreszenzanalyse von Teilchen, umfassend

einen ersten Behälter mit darin enthaltenen und mit Fluorescein markierten, im wesentlichen kugelförmigen Perlen,

einen zweiten Behälter mit darin enthaltenen und mit Phycoerythrin markierten, im wesentlichen kugelförmigen Perlen und

einen dritten Behälter mit darin enthaltenen unmarkierten, im wesentlichen kugelförmigen Perlen,

wobei die Perlen aller Behälter aus Kunststoff gefertigt sind und einen Durchmesser zwischen 0,5 und 20 um besitzen und im Behälter in einer wässerigen Lösung mit einer Konzentration von zumindest 10&sup5; Perlen je Milliliter vorliegen.