DE69011198T2

DE69011198T2 - Verfahren zur Differenzierung von Leukozyten mit Hilfe eines Durchflusszellmessgerätes.

Info

Publication number: DE69011198T2
Application number: DE69011198T
Authority: DE
Inventors: Paul N Marshall
Original assignee: Abbott Laboratories
Current assignee: Abbott Laboratories
Priority date: 1989-05-15
Filing date: 1990-05-15
Publication date: 1995-01-19
Anticipated expiration: 2010-05-16
Also published as: ES2060949T3; CA2016699C; DE69011198D1; EP0398652B1; AU636607B2; CA2016699A1; ATE109568T1; EP0398652A1; JPH0726956B2; US5510267A; JPH034171A; AU5503790A

Description

Die Erfindung betrifft im allgemeinen Verfahren, die zur Durchflußzytometriemessung von Erythrozyten- und Leukozytenpopulationen geeignet sind, und insbesondere und genauer ein Verfahren, das eine fünffache Subpopulationsdifferenzierung von Leukozyten in einem automatisierten Instrument ermöglicht, wobei das Verfahren ein Lysemittel verwendet, das ein aromatisches Oxyethanol enthält, das als Lysemittel für Erythrozyten und als Schutzschicht für Leukozyten und gleichzeitig als Bakteriostatikum wirkt.
Die Prüfung des peripheren Bluts ist bei der Bewertung der Gesundheit eines Individuums ein wichtiger Gesichtspunkt. Ein wichtiger Parameter bei dieser Prüfung ist die differentielle Zählung weißer Blutkörperchen (oder Leukozyten). Der Test wird derzeit auf einem von drei Wegen durchgeführt. Das traditionsreichste Verfahren umfaßt die Herstellung eines Blutabstriches, der dann durch das Romanowsky-Verfahren angefärbt wird. Diese Anfärbung färbt die verschiedenen Bestandteile von Vollblut unterschiedlich an. Ein Techniker kann die verschiedenen Leukozytenklassen identifizieren, typischerweise Neutrophile, Thrombozyten, Monozyten, Eosinophile und Basophile, indem der angefärbte Blutabstrich mikroskopisch überprüft wird. Da diese manuelle Differenzierung sehr arbeitsintensiv ist, wurde eine wesentliche Forschungs- und Entwicklungsarbeit darauf verwendet, ein automatisiertes Verfahren zur Prüfung von Blutproben zu erhalten.
Unlängst wurde eine differentielle Multisubpopulations-Leukozytenanalyse routinemäßig mit automatisierten Mikroskopen erreicht. Diese automatisierten Mikroskope umfassen die Hematrak-Reihen von Produkten, die von Geometric Data (Wayne, Pennsylvania) hergestellt werden und die Produkte Diff 350 und 400, die von Coulter Biomedical (Concord, Massachusetts) hergestellt werden. Werden diese Instrumente mit einem gemaß Romanowsky angefärbten Blutabstrich unter Verwendung eines Bildanalysecomputers eingesetzt, können diese Instrumente die weißen Blutkörperchen lokalisieren und klassifizieren, wobei visuelle Klassifikationskriterien ähnlich denen, die von technischem Personal verwendet wird, benutzt werden. Diese Kriterien umfassen typischerweise die optische Dichte von Kern und Zytoplasma, Farbe, Form und Textur.
Ein weiterer Weg zur Automatisierung der Leukozytendifferenzierung umfaßt die Anwendung der Durchflußzytometrie. Bei diesem Verfahren werden Blutkörperchen in Suspension durch einen Transducer geleitet und die Zellen auf der Grundlage eines meßbaren Parameters, wie der Lichtabsorption, Lichtstreuung oder der elektrischen Impedanz, klassifiziert. Die Vorteile dieser Durchflußzytometriesysteme im Vergleich mit den Systemen auf Mikroskopbasis beinhalten den relativ hohen Probenumsatz und die Fähigkeit, eine große Anzahl von Zellen pro Probe zu zählen, wodurch der Probelärm verringert wird. Die handelsüblichen klinischen Durchflußzytometer waren bisher auf die Differenzierung dreier Leukozytensubpopulationen beschränkt. Leukozyten werden in Subpopulationen klassifiziert, die Granulozyten, Monozyten und Lymphozyten genannt werden. Die derzeitigen Dreifach-Differenzierungsinstrumente basieren entweder auf der Messung der Lichtstreuung oder der elektrischen Impedanz. Lichtstreuungsinstrumente, wie ELT 1500 von Ortho Instruments (Westwood, Massachusetts), klassifizieren Leukozytensubpopulationen auf der Grundlage ihrer Lichtstreuungseigenschaften, die bei zwei verschiedenen Winkeln, die typischerweise als "niedrig" und "orthogonal" bezeichnet werden, gemessen werden. Meßinstrumente für die elektrische Impedanz, wie die S+-Reihe von Coulter Eletronics (Hialeah, Florida) und Cell Dyn 2000 von Sequoia-Turner Corporation (Moutain View, California), klassifizieren die Leukozyten auf der Grundlage ihres Volumens nach Exposition gegenüber einem Reagans zur Volumenmodifizierung.
Bis vor kurzem waren die einzigen kommerziellen klinischen Durchflußzytometrieinstrumente, die in der Lage waren, ein Leukozytendifferential von fünf Subpopulationen aufzustellen, H-6000 und H*1 von Technicon Instruments (Tarrytown, New York). Diese Instrumente klassifizieren die Leukozyten durch Messung der Lichtstreuung und Absorption nach einer aufwendigen zytochemischen Anfärbung der Blutkörperchen. Da dieses Anfärbeverfahren relativ langsam ist, stellt der Durchsatz dieser Instrumente einen Kompromiß dar.
CELL-DYN 3000 von Sequoia-Turner Corp. (Mountain View, California) führt eine herkömmliche Differenzierung nach fünf Subpopulationen ausschließlich auf der Basis der Lichtstreuungseigenschaften von nicht angefärbten Leukozytenzellen durch. Da das von Natur aus langsame zytochemische Anfärben nicht eingesetzt wird, wird der Probendurchsatz dieses Instruments extrem hoch gehalten. Die Vorteile, die mit CELL-DYN 3000 ermöglicht werden, sind großenteils das Ergebnis der Kombination zweier Neuerungen, nämlich der Messung der Streuung von depolarisiertem orthogonalem Licht und des erfindungsgemaßen Lysemittels, was eine bessere Auflösung der Thrombozyten und Monozyten ermöglicht, um eine differnetielle Leukozytenanalyse nach fünf Subpopulationen zu erhalten.
In käuflich erhältlichen automatisierten Instrumenten, die die Durchflußzytometrie anwenden, wird eine Leukozytenklassifzierung und -differenzierung entweder durch Lichtstreuung oder elektrische Impedanz in Bezug auf die Zellgröße erhalten. Bei beiden Instrumenttypen müssen die roten Blutkörperchen in der Vollblutprobe lysiert werden, um das Hämoglobin freizusetzen. In Systemen auf der Basis der elektrischen Impedanzmessung wurden Lysemittel auf quaternärer Ammoniumsalzbasis verwendet. Diese elektrischen Impedanzsysteme besitzen eine angemessene Reaktionszeit, die den Lyseeffekt des Lysemittels auf die Leukozyten im wesentlichen gegen Null gehen laßt. In Systemen auf der Grundlage einer Lichtstreuungsmessung ist die nachteilige Wirkung des Erythrozytenlysemittels auf die Lichtstreuungseigenschaften der Leukozyten gravierender und aus baulicher Sicht herausfordernder. Lysemittel (hier im Austausch mit "lysierenden" Mitteln verwendet) müssen rote Blutkörperchen schnell lysieren, während sie gleichzeitig ein Fenster bereitstellen, innerhalb dessen die Lichtstreuungseigenschaften von Leukozyten im wesentlichen unbeeinträchtigt sind.
Diese Kriterien werden typischerweise bei der Verwendung eines Lysemittels mit alkalischem pH-Wert erfüllt, da der Lysebereich sowohl von Erythrozyten als auch von Leukozyten mit dem pH-Wert zunimmt. Die weithin verwendete Lyselösung aus Ammoniumchlorid/Kaliumbicarbonat/DiNaEDTA besitzt einen pH-Wert von 7,2-7,4, benötigtjedoch typischerweise 5-10 Minuten, um die Eythrozyten vollständig zu lysieren. Lysemittel, wie "Lyse Right" von Ortho Instruments, besitzen einen pH-Wert von 8,5 und benötigen mehrere Sekunden, um eine vollständige Lyse der Leukozyten zu erreichen, beeinträchtigen jedoch die Lichtstreuungseigenschaften von Leukozyten innerhalb eines Zeitraums von etwa einer Minute nachteilig. Wenn der pH-Wert um sehr viel mehr angehoben oder unter etwa 3 abgesenkt wird, werden Lysemittel erhalten, die sowohl Leukozyten als auch Erythrozyten fast augenblicklich lysieren.
Der für die Erfindung relevante technische Hintergrund ist die US-A-4 1012 810, die die Verwendung von 2-Phenoxyethanol als bakteriostatisches und fungistatisches Mittel und von Natriumchlorid als Stabilisierungsmittel in einem Erythrozytenlysemittel verwendet, das zu hämatologischen Studien eingesetzt wird, wenn eine elektronische Apparatur zur Bestimmung der Teilchengröße vom Typ Coulter benutzt wird. Ebenfalls relevant als technischer Hintergrund für die Erfindung ist die US-A-4 268 963, die die Verwendung eines quaternären Ammoniumsalzes mit oberflächenaktiven Eigenschaften als Erythrozytenlysemittel zusammen mit 2-Phenoxyethanol in einer Lyse-Verdünnungsrezeptur für zweifache Populationsbestimmungen von Leukozyten zur Trennung von Zellabfällen, lymphoiden und myeloiden Peaks und zur Stabilisierung der Trennung beschreibt, wobei eine Apparatur des Coulter-Typs eingesetzt wird.
Aufgabe der Erfindung ist es, ein Verfahren bereitzustellen, um eine differentielle Fünfachbestimmung von Leukozytenzellen-Subpopulationen aus einer Vollblutprobe zu erhalten. Die Aufgabe der Erfindung wird dem Fachmann unter Bezugnahme auf die Beschreibung und die Figuren klar.
Das Durchflußzytometrie-Lysemittel, das bei dem erfindungsgemaßen Verfahren verwendet wird, lysiert Erythrozyten adäquat, während die Lichtstreuungseigenschaften von Leukozyten eine Zeitlang erhalten bleiben, die ausreicht, um eine Differenzierung nach Subpopulationen zu erhalten, und ermöglicht eine differentielle Fünffachauftrennung der Leukozyten in Subpopulationen, die als Neutrophile, Lymphozyten, Monozyten, Eosinophile und Basophile bezeichnet werden. Das Lysemittel besteht aus einem aromatischen Oxyethanol, einem organischen Puffer mit einem pK-Wert von oder um 8,5, das dazu dient, die pH-Pufferkapazität bereitzustellen und die elektrische Leitfahigkeit des Lysemittels zu verstärken, und aus einer nichtionischen Detergenskomponente. Das aromatische Oxyethanol ist vorzugsweise 2-Phenoxyethanol. Der organische Puffer wird ausgewählt aus der Gruppe, bestehend aus TRIS/HCl, Borsäure, Glycyl/Glycin und BICINE. Das nichtionische Detergens wird ausgewählt aus der Gruppe, bestehend aus TRITON X-100, TRlTON X-114, Polyoxyethylen oder aus Detergentien, die sich von einem Saccharid ableiten. Das bevorzugte Lysemittel besteht im wesentlichen aus 2-Phenoxyethanol in einer Konzentration zwischen 20 mM und 80 mM, TRIS/HCl-Puffer und TRITON X-100.
Das erfindungsgemäße Verfahren umfaßt das Lysemittel, wie es oben beschrieben wird, in Kombination mit einer verdünnten Vollblutprobe. Nach Zugabe des Lysemittels zu der verdünnten Vollblutprobe werden die roten und weißen Blutkörperchen von einem fokussierten Laserstrahl gekreuzt. Vier Lichtstreuungsparameter werden sodann bei 0 ºC, 10 ºC, 90 ºC und 90 ºC unter Depolarisation bestimmt. Diese gemessenen Parameter werden sodann aufgelöst, um ein fünffaches Subpopulationsdifferential zu erhalten, das die Neutrophilen, Lymphozyten, Monozyten, Eosinophilen und Basophilen identifiziert.
Die Erfindung wird nun unter Bezugnahme auf die begleitenden Figuren näher beschrieben, worin
Figur 1 eine perspektivische Ansicht eines automatischen hämatologischen Instruments, CELL-DYN 3000, zur Durchführung der Erfindung ist,
Figur 2 eine schematische Darstellung des Prinzips der Zell-Zählung und Zellgrößenbestimmung durch Impedanz ist,
Figur 3 eine schematische Querschnittsansicht des optischen Transducers des CELL-DYN-3000-Instruments ist,
Figur 4 eine schematische Darstellung der optischen Bank des CELL-DYN-3000- Instruments ist,
Figur 5 ein Leukozytenstreudiagramm für die in Beispiel 1 beschriebene Vollblutprobe ist,
Figur 6 ein Leukozytenstreudiagramm für die in Beispiel 2 beschriebene Vollblutprobe ist,
Figur 7 ein Leukozytenstreudiagramm für die in Beispiel 3 beschriebene Vollblutprobe ist,
Figur 8 ein Leukozytenstreudiagramm für die in Beispiel 4 beschriebene Vollblutprobe ist.
Gemaß der bevorzugten Ausführungsform umfaßt das Lysemittel eine waßrige Lösung aus TRITON X-100, 2-Phenoxyethanol und TRIS/HCl-Puffer. Vollblut wird mit einem Überschuß dieses Lysemittels, typischerweise einem 50fachen Überschuß, vermischt. Aufgrund der Kombination eines osmotischen Schocks, der Wirkung des nichtionischen Detergens und des pH-Wertes von etwa 8,5 tritt die Lyse der Erythrozyten sofort ein. 2-Phenoxyethanol in dem Lysemittel besitzt zwei Funktionen. Zunächst dient es als leukoprotektives Reagens, um die Lyse von Lymphozyten zu verzögern, was den Nachweis der Subpopulationen ermöglicht, bevor beträchtliche negative Auswirkungen auf die optischen Eigenschaften der Leukozyten auftreten, die durch das Lysemittel hervorgerufen werden. Zweitens dient 2-Phenoxyethanol in seiner üblicheren Rolle als antimikrobielles Mittel, was es ermöglicht, daß das Reagens wenigstens 1 Jahr lang nach der Herstellung von einer mikrobiellen Verunreinigung frei bleibt. TRIS/HCl, ein Puffer, der üblicherweise in biochemischen Lösungen verwendet wird, dient, abgesehen von der Bereitstellung von pH-Pufferkapazität, zur Vergrößerung der Leitfähigkeit der Lösung, so daß dessen Vorliegen in dem Reagens-Vorratsbehälter des Instruments leicht unter Verwendung eines Elektrodenpaares nachgewiesen werden kann. TRITON X-100 dient als Netzmittel, wodurch das Festsetzen von Luftblasen im Schlauchsystem des CELL-DYN-3000-Gerätes und des optischen Transducers verringert wird.
Die optimale Rezeptur für das Lysemittel ist nachstehend angegeben:
2-Phenoxyethanol (flüssig bei 25 ºC) 750 ml
TRIS/HCl-Puffer, pH 8,5 (500 mM TRIS, titriert auf pH 8,5 mit 1 M HCl) 1 500 ml
0,5 % (Vol./Vol.) waßriges TRITON X-100 100 ml
deionisiertes Wasser auf 100 l
In der optimalen Rezeptur ist 2-Phenoxyethanol in einer Konzentration von etwa 41 mM vorhanden, obwohl ein geeigneter Bereich der Konzentrationen zwischen 20 und 80 mM existiert. Der pH-Wert des TRIS-Puffers kann ohne deutliche Auswirkungen auf seine Leistung auf pH 8,1 gesenkt werden. Wird er über 9,0 angehoben, kann eine teilweise Zerstörung der Leukozyten auftreten. Das Vorliegen von Spurenmengen (bis zu etwa 5 % Vol./Vol.) TRITON X-100 oder eines gleichartigen nichtionischen Detergens verhindert Probleme, die durch eine unzureichende Lyse in Proben auftreten, die typischerweise als schwierig zu lysieren betrachtet werden. Diese umfassen Vollblutproben von Patienten mit Hämoglobinopathien und erhöhten Erythrozytenwerten.
Anstelle von TRIS/HCl können witere organische Puffer eingesetzt werden. Unter denjenigen mit einem pK-Wert bei oder in der Nähe von 8,5 können Borsäure, Glycyl/Glycin und BICINE (erhältlich von CalBiochem) für das erfindungsgemaße Lysemittel verwendet werden. Im Hinblick auf die nichtionische Detergenskomponente des Lysemittels kann TRITON X-114 verwendet werden. Weitere hydrophile Detergentien können aus denjenigen ausgewählt werden, die Polyoxyethylen- oder Saccharidkopfgruppen aufweisen.
Die optimierte Rezeptur ermöglicht, daß ein fünffaches Leukozytendifferential erhalten wird, wobei die Lichtstreuungseigenschaften dieser Zellen angewendet werden. CELL-DYN 3000 mißt die Lichtstreuungsparameter eines jeden Leukozyten, wenn er einen focussierten Laserstrahl kreuzt. Diese Parameter sind:
(1) "Lichtstreuung von 0 Grad", was tatsächlich eine Lichtstreuung bei etwa 1-3 Grad bezüglich des Laserstrahls bedeutet.
(2) "Lichtstreuung von 10 Grad", was tatsächlich Licht bedeutet, das bei etwa 3-10 Grad bezüglich des Laserstrahls gestreut wird.
(3) "Lichtstreuung von 90 Grad", was Licht bedeutet, das orthogonal zu dem Laserstrahl gestreut wird.
(4) "90-Grad-Streuung von depolarisiertem Licht" bedeutet Licht, das orthogonal zu dem Laserstrahl gestreut wird, der durch die Wechselwirkung mit den Leukozyten nicht mehr vertikal polarisiert ist.
Wir haben gefunden, daß 2-Phenoxyethanol, abgesehen von seiner üblicheren Verwendung als antimikrobielles Mittel, ein wirksames leukoprotektives Mittel ist. Ferner lieferte 2-Phenoxyethanol durch die durchflußcytometrischen Lichtstreuungsverfahren eine bessere Auflösung von Lymphozyten und Monozyten. Tatsächlich kann mit 2-Phenoxyethanol ein vierfaches Differential, d.h. die Lymphozyten, Basophilen, Monozyten, Neutrophilen und Eosinophilen, einfach auf der Grundlage der Lichtstreuung bei niedrigem und orthogonalem Streuwinkel erhalten werden. Zuvor erwies sich unter Verwendung dieser zwei Parameter nur das dreifache Leukozytendifferential als möglich. Dieses Phänomen kann mit bestimmten Instrumenten beobachtet werden, die von Ortho Diganostic Systems, Inc. hergestellt werden, wie ELT 1500.
Obwohl eine einfache waßrige Lösung von 2-Phenoxyethanol in Wasser ein wirksames Lysemittel ist, ist die elektrische Leitfähigkeit dieses Reagens zu gering, wenn die Gegenwart des Lysemittels in den Vorratsbehältern des Instruments elektrochemisch nachgewiesen werden soll. Darum haben wir in unser Lysemittel einen TRIS/HCl-Puffer eingearbeitet, um die Leitfähigkeit der Lysereagenslösung zu erhöhen und um den pH-Wert zu stabilisieren. Um Zwischenfäile mit Problemen aufgrund einer teilweisen Hydrolyse von Leukozyten auf ein Minimum zu beschränken, haben wir ferner Spurenmengen eines nichtionischen Puffers, TRITON X-100, in unsere Rezeptur eingearbeitet. Diese Chemika1ie verbessert außerdem die Netzeigenschaften des Lysemittels in den Reagensleitungen.
Es soll nun das CELL-DYN-3000-Instrument 10 selbst (siehe Figur 1) besprochen werden. Ein Transducerpaar wird für die Messungen der Blutkörperchen verwendet. Die Leukozyten werden durch Lichtstreuung gemessen. Für diesen Kanal erfolgt die Flüssigkeitsdosierung über eine Spritzenpumpe. Die Erythrozyten und Thrombozyten werden aufgrund ihrer elektrischen Impedanz gemessen. Bei diesem Kanal wird ein volumetrischer Dosierungsschlauch verwendet.
Die Vorgänge in CELL-DYN 3000 werden von drei Mikroprozessoren kontrolliert, die den Systemzustand aufzeichnen, Daten speichern, QC-Programme ablaufen lassen, ungewöhnliche Daten anzeigen und diagnostische Prüfungen durchführen.
Der Anwender kann unter Verwendung der Bildschirmmarklerungen 12 eine von acht Betriebsarten wählen. Irgendeine Betriebsart kann erhalten werden, indem entweder die Membrantastatur oder die komplette PC-Tastatur verwendet wird. Die Hauptbetriebsarten lauten wie folgt:
SETUP Start oder Wiederholung der Systemoperation
RUN Testen von Proben und Kontrollen
DATA LOG Überprüfen oder Ausdrucken von gespeicherten Daten
QC Überprüfen oder Ausdrucken von Daten in Kontroll- oder Duplikatfiles
CALIBRATION Wiederholung oder Start der Anwenderkalibrierung
DIAGNOSTICS Durchführung von Systemprüfungen zur Fehlersuche
HELP Hilfestellung für den Anwender beim Betreiben des Instruments
SPECIAL PROTOCOLS Ablauf von Spezialprozessen, wie Reinigung des Probenventils oder Vorbereitung der Probenschläuche
Zur Erleichterung des Transports wird CELL-DYN 3000 in zwei Module unterteilt. Hauptmodul 14 ist so gebaut, daß die Mischkammern, Ventile, Pumpen, die Hämoglobindurchflußzelle und der Impedanztransducer alle leicht von der Vorderseite des Instruments 10 zugänglich sind. Im hinteren Teil des Instruments befinden sich zwei Mikroprozessoren. Der obere Teil enthält eine optische Bank, auf der Linsen, ein Laser, Photodetektoren und eine Durchflußzelle aus Quarzglas aufgeschraubt sind. Siehe Figur 4. Das zweite Modul 16 umfaßt den Videomonitor, PC und die Tastatur.
CELL-DYN 3000 verwendet drei Transducer, um Daten über Blutkörperchen und über die Hämoglobinkonzentration zu sammeln. Diese werden als Impedanztransducer, optischer Transducer und Hämoglobintransducer bezeichnet.
CELL-DYN 3000 verwendet einen Impedanztransducer, um Erythrozyten und Thrombozyten zu zählen. Figur 2 erläutert das Prinzip der Zellzählung und Zellgrößenklassifizierung durch Impedanz. Das Prinzip beruht auf der Messung der Änderungen des elektrischen Widerstandes, die von einem Teilchen 18 erzeugt werden, wenn es eine kleine Öffnung 20 passiert. Da jede Zelle die Öffnung 20 in der Richtung passiert, die durch den Pfeil 21 angedeutet ist, nimmt der elektrische Widerstand des Weges zwischen den eingetauchten Elektroden 22 und 24 (in diesem Fall ist Elektrode 22 negativ und Elektrode 24 positiv geladen), die an einer Seite der Öffnung 20 angebracht sind, zu. Die Anzahl der Pulse ist für die Zellanzahl kennzeichnend, wahrend die Amplitude des Pulses mit dem Zellvolumen in Verbindung steht. Die Frequenzverteilungen der Pulsamplitude ergeben Volumenhistogramme. Diese Histogramme werden verwendet, um Erythrozyten- und Thrombozyten-Parameter, wie MCV (mittleres Zellvolumen) und RDW (Verteilungsbreite der Erythrozyten), zu erhalten.
In CELL-DYN 3000 beträgt die Impedanzöffnung 20-60 um im Durchmesser und 70 um in der Länge.
CELL-DYN 3000 verwendet einen optischen Transducer, um die Lichtstreuungseigenschaften von Leukozyten zu messen. Transmitter 26 ist schematisch in Figur 3 gezeigt. Eine Suspension aus Blut, in der Erythrozyten lysiert worden sind, wird mit niedriger Geschwindigkeit von der Probendüse 28 (etwa 160 um Durchmesser) ausgestoßen, wobei sie mit einem sich schnell bewegenden laminaren Fluß (Schutzstrom) 30 in Kontakt kommt. Gemaß einem Verfahren, das als hydrodynamische Focussierung bekannt ist, wird der Probenstrom bis auf einen zentralen Kern 23 verschmälert. In der Durchflußzelle aus Quarzglas beträgt dieser Kern 25 bis 30 um im Durchmesser. Diese Anordnung gewährleistet, daß sich im allgemeinen jederzeit nur ein einziger Leukozyt in der Sensorregion aufhält und darum Zufallsprobleme so gering wie möglich gehalten werden. Da die physikalische Öffnung groß ist (250 um²), ist es ferner unwahrscheinlich, daß die Durchflußzelle 34 verstopft wird, sie ergibt jedoch trotzdem die Auflösung eines viel kleineren Transmitters.
Eine kurze Beschreibung der optischen Bank von CELL-DYN 3000 wird hier zum leichteren Verständnis des Ablaufs des Leukozyten-Meßverfahrens gegeben. Ein schematischer Plan der optischen Bank von CELL-DYN 3000 ist in Figur 4 gezeigt. Eine solche Apparatur wird in der DE-A-3 712 862 beschrieben. Die Lichtquelle 40 ist ein polarisierter 5-mW-Helium-Neon-Laser mit einer Wellenlänge von 632,8 nm. Der Laserkopf ist so orientiert, daß die Polarisationsebene vertikal verläuft. Der Laserstrahl wird durch den Vorderflächenspiegel 42, die zylindrische Linse 44, den Vorderflächenspiegel 46, den vertikalen Schlitz 48 (125 um Breite) und die Laserfocussierungslinse 50 focussiert, so daß in der Region des zentralen Kerns 52 (Durchflußzelle aus Quarzglas mit einem Kanal von 250 um²) des Probenstrom das Strahlungsintensitätsprofil in den vertikalen Ebenen gaussartig ist, mit einem Durchmesser von (1/e²) von etwa 70 um. In der horizontalen Ebene zeigt das Profil das Aussehen eines "Zylinders", wobei die abgeflachte Spitze etwa 80 um beträgt. Diese Anordnung gewährleistet, daß das Instrument fortgesetzt zuverlässige Daten liefert, auch wenn der Probenkern von seiner normalen Position leicht abweicht.
Ein Leukozyt, der in den focussierten Laserstrahl eintritt, streut das Licht in alle Richtungen. Da die Wellenlänge des Lichtes im Vergleich zur Zellengröße klein ist, wird dieses Streuphänomen durch die Mie-Theorie beschrieben. Nur ein Teil des gestreuten Lichts wird von den vier Photodetektoren gesammelt. Zwei Siliciumphotodioden, 54 und 56, messen das Licht, das in Halbwinkeln von 1-3 Grad und von etwa 3-10 Grad bezüglich des Laserstrahls gestreut worden ist. Diese Photodioden 54 und 56 werden als "0-Grad"- bzw. "10-Grad"-Detektoren bezeichnet. Das direkte Laserlicht wird mit Hilfe der Beobachtungsschranke 58 abgeblockt. Die Lichtstreuung bei diesen niedrigen Winkeln ist eine komplexe Funktion der Zellgröße. Licht, das im Winkel von 90 Grad zu dem Laserstrahl gestreut wird, wird ebenfalls unter Verwendung von zwei Photomultipliern 60 und 62 (PMTs) gesammelt. PMTs, keine Photodioden, werden in dem 90-Grad-Kanal verwendet, da bei hohen Winkeln relativ wenig Licht gestreut wird. Einer der PMTs 62 zeigt einen horizontalen Polarisator 61 vor ihm. Da dies vertikal polarisiertes Licht von einem Einfall auf die Photokathode abhält, ist jedes Licht, das von dem "90-Grad"-depolarisierten PMT 62 nachgewiesen wird, Licht, das aufgrund seiner Wechselwirkung mit dem Leukozyt depolarisiert worden ist. Der zweite Photomultiplier 60, der als "90-Grad"-PMT bezeichnet wird, empfängt Licht, das von einem Uhrglas-Strahlspalter 63 in einem Winkel von 45 Grad reflektiert worden ist. Der Hauptanteil dieses Lichts ist nicht vertikal polarisiert.
Objektivlinse 64 und Streustopper 66 vervollständigen die orthogonalen Streukanäle. Die Streukanäle bei niedrigem Winkel umfassen ferner einen perforierten Spiegel 70.
Die Daten der vier Photodetektoren werden verwendet, um ein Paar von Streudiagrammen zu konstruieren, wobei eine beispielhafte Probe in den Figuren 5-8 gezeigt ist. Leukozyten können somit allein auf der Grundlage der Lichtstreuung in fünf Subpopulationen aufgetrennt werden.
Zur Analyse von Erythrozyten wird Hämoglobin in einen Hämcyanidkomplex umgewandelt und zur Bestimmung der Absorption bei 550 nm in einer Durchflußzelle von 1 cm Weglänge vermessen.
In CELL-DYN 3000 wird Vollblut (120 ul offener Schlauch, 250 ul geschlossener Schlauch) über die Probensonde oder eine Diaphragma-Durchstoßvorrichtung in ein Scherventil eingespritzt, das drei exakte Aliquote abteilt. Diese Aliquote werden mit den geeigneten Verdünnungsreagentien verdünnt und in Richtung der Transducer bewegt. Derzeit verwenden wir ein Verdünnungsmittel der folgenden Zusammensetzung in einer waßrigen Lösung: NaCl 7,9 g/l, KCl 0,4 g/l, NaH&sub2;PO&sub4; 0,2 g/l, Na&sub2;HPO&sub4; 1,9 g/l, Na&sub2;EDTA 0,3 g/l, NaF 0,4 g/l, 2-Phenoxyethanol 3 ml/l und Wasser, so daß sich 1 Liter ergibt. Das Verdünnungsmittel besitzt einen pH-Wert von 7,4 ± 0 05 und eine Osmolalität von 340 ± 3 mohs. Ein Bruchteil von 32 ul wird abgeteilt und 250fach mit dem erfindungsgemäßen Lysemittel verdünnt und zu dem optischen Transducer transportiert, um die Anzahl von Leukozyten und das Leukozytendifferential zu bestimmen. Ein Bruchteil von 12 ul wird abgeteilt, mit Hämoglobinreagens 250fach verdünnt und zu dem Hämoglobin-Transducer transportiert. Das Hämoglobinreagens ist ein Gemisch eines quaternären Ammoniumsalzes/KCN-Lösung mit dem oben angegebenen Verdünnungsmittel. Gemaß der besten Art besteht die quaternäre Ammoniumsalzlösung aus Tetradecyltrimethylammoniumbromid 90 g/l und Kaliumcyanid 0,75 g/l, vermischt mit 1 Liter deionisiertem Wasser. Anschließend wird 1 Liter quaternäre Ammoniumsalzlösung mit 11 l des oben beschriebenen Verdünnungsmittels vermischt. Schließlich wird TRITON X-114 bei einer Konzentration von 0,25 ml/l zugegeben. Ein Bruchteil von 0,8 ul wird mit einem Verdünnungsmittel für Erythrozyten 12 500fach verdünnt und zu dem Impedanztransducer transportiert, um Erythrozyten und Thrombozyten zu messen.
Jeder Puls, der von einem Teilchen erzeugt wird, das die Sensorzone passiert, wird vergrößert und mit internen Referenzspannungen verglichen. Auf diese Weise werden Leukozyten von Erythrozyten-Stroma und Thrombozyten in dem Leukozytenkanal unterschieden. Auf ähnliche Weise werden Erythrozyten und Thrombozyten in dem Erythrozyten/Thrombozyten-Kanal unterschieden.
Um die absolute Anzahl der Blutzellen zu bestimmen, muß das Volumen des verdünnten Bluts, das den Transmitter während der Datenaquisition durchläuft, bekannt sein. Für den Erythrozyten/Thrombozytenkanal wird dies durch Verwendung eines Dosierungsschlauches erreicht. Während jedes Zählcyclus, wenn Zellen durch die Impedanzöffnung gezogen werden, wird Flüssigkeit durch den Dosierungsschlauch gezogen. Wenn der Meniskus des Reagens einen optischen Detektor passiert, wird der Zählcyclus gestartet. Der Zählcyclus wird gestoppt, wenn der Meniskus einen zweiten optischen Detektor passiert, nachdem genau 200 ul des verdünnten Blutes den Transducer passiert haben. Die Zählzeit kann verwendet werden, um in der Öffnung Zellabfälle nachzuweisen, da ein solches Material die effektive Öffnung verkleinert und die Zählzeit vergrößert. Diese Zellabfälle können die Datennahme beeinträchtigen.
In dem Leukozytenkanal erfolgt die Flüssigkeitsdosierung unter Verwendung einer Spritzenpumpe. Da die engsten Passagen des Kanals für die Leukozyten relativ groß sind (Probendüse 160 um Durchmesser, Durchflußzelle aus Quarzglas 250 um²) tritt eine Akkumulation von Zellabfällen viel unwahrscheinlicher ein.
Es ist möglich, daß während des Zählens mehr als ein Zellteilchen gleichzeitig in der Sensorzone vorhanden sein kann. Wird dieser Zufall ignoriert, so verringert er künstlich die Zählrate der Zellen. Der Zufall ist direkt mit dem effektiven Volumen der Öffnung verknüpft, und die Zellkonzentration kann darum mathematisch korrigiert werden. Dies wird automatisch für jede Leukozyten-, Erythrozyten- und Thrombozytenzählung durchgeführt.
CELL-DYN 3000 zeigt alle numerischen und graphischen Daten nach jedem Meßcyclus automatisch an. Die Probenmessungen werden durchgeführt, indem der Modus "run" gewählt wird. Die Probe kann als einer von fünf Typen identifiziert werden, nämlich als Patient, Kontrolle niedrig, Kontrolle normal, Kontrolle hoch, Wiederholungsprobe. Die Identität des Operators, die Daten, Zeit etc. können über die Tastatur eingegeben werden. Angezeigte Daten können auf Endlospapier (8,5" x 11") über einen Grafikdrucker, jeweils ein Protokoll pro Seite, ausgedruckt werden. Eine Etikettenliste in mehrfacher Ausführung kann ebenfalls über einen frei wählbaren Etikettendrucker ausgedruckt werden.
Die numerischen Daten für die ablaufenden 1000 Cyclen werden automatisch auf der PC-Festplatte gespeichert. Diese Datenerfassung kann überarbeitet oder, falls erforderlich, ausgedruckt werden. Jeder Datenfile umfaßt eine Sequenznummer, den Probentyp, die Probenidentifikationsnummer, falls verwendet, die numerischen Daten für alle ausgewählten Parameter, das Datum, die Zeit und die Kennung des Operators.
Unter Anwendung des Setup-Modus kann der Anwender Grenzen für numerische Daten setzen. Alle Daten, die außerhalb dieser Grenzen fallen, werden in umgekehrter Reihenfolge auf dem Videoschirm dargestellt und fett ausgedruckt. Wenn die Histogrammdaten für die Thrombozyten oder die Daten für das Streudiagramm für die Leukozyten bestimmte Kriterien nicht erfüllen, wird jede betroffene Fläche mit einer Bereichswarnung signalisiert.
Nach Beendigung eines jeden Meßcyclus werden die Ergebnisse auf dem Monitor abgebildet. Die Daten für die Lichtstreuung von Leukozyten (WBC) werden als Paar von Streudiagrammen abgebildet. Die absolute Anzahl der Leukozyten wird in Einheiten von 1000 ul Vollblut abgebildet. Die Erythrozyten-(RBC)-Daten werden als Histogramm der Volumenhäufigkeits-verteilung abgebildet, wobei die Abszisse in Femtolitern geeicht ist. Die absolute Anzahl der Erythrozyten wird in Einheiten von Millionen/al Vollblut abgebildet. Die Thrombozyten-(PLT)-Daten werden als Histogramm der Volumenhäufigkeitsverteilung abgebildet, wobei die Abszisse in Femtolitern geeicht ist. Die absolute Anzahl der Thrombozyten wird in Einheiten von 1000/ul Vollblut angegeben.
CELL-DYN 3000 mißt Hämoglobin in Form eines Hämcyanidkomplexes. Das Hämoglobinreagens ist eine alkalische Lösung von einem kationischen Detergens und Kaliumcyanid. Das Detergens lysiert die Erythrozyten, wodurch es zur Freisetzung von Hämoglobin kommt. Bei einem hohen pH-Wert setzt das Hämoglobin Hämchromophore frei, die mit dem vorhandenen Cyanid unter Bildung eines stabilen Komplexes reagieren. Dieser wird anhand seiner Absorption bei 540 nm gegen das Reagans als Kontrolle gemessen. Das Hämoglobin-(HBG)-Ergebnis wird durch seine Konzentration in Vollblut angegeben. Der Anwender kann eine der folgenden Einheiten wählen: g/dl, g/l, mmol/l.
CELL-DYN 3000 bestimmt das mittlere Zellvolumen (MCV) aus der Größenverteilung der Erythrozyten. Das Ergebnis wird direkt in Femtolitern angegeben. Der Hämatokrit (HCT) wird aus der Anzahl der Erythrozyten und aus dem MVC wie folgt berechnet:
HCT = (RBC-Anzahl x MCV)/10
Das Ergebnis wird als Prozent gepackte Erythrozyten oder als Anteil an gepackten Erythrozyten pro Einheitsvolumen Vollblut angegeben: 1/1.
Die Erythrozyten-Verteilungsbreite (RDW) wird aus der Erythrozyten-Volumenverteilung bestimmt. Es ist einfach cv des Peaks, ausgedrückt in %
[cv = (sd/Mittelwert) x 100]. Dieser Parameter ist ein Index für die Erythrozytenheterogenität. RDW nimmt mit dem Grad der Anisozytose, die auf dem Blutabstrich auftritt, zu. Eine diagnostisch nützliche Information kann durch Überarbeitung von sowohl MCV als auch RDW erhalten werden.
Das fünffache Leukozytendifferential wird allein auf der Grundlage der Lichtstreuung bestimmt. Da kein zytochemisches Anfärben erforderlich ist, verwirklicht CELL-DYN 3000 einen sehr hohen Durchsatz (RBC/PLTs/WBC diff bei einer Geschwindigkeit von 109/Stunde). Das erfindungsgemäße Lysemittel lysiert die Erythrozyten sofort, beeinträchtigt jedoch innerhalb der relevanten Meßzeit nicht die Lichtstreuungseigenschaften von Leukozyten. Die Daten der Streuungseigenschaften eines jeden Leukozyten werden aus vier Photodetektoren erhalten. Der "0-Grad"-Detektor sammelt Licht, das bei einem Halbwinkel von etwa 1-3 Grad zu dem Laserstrahl gestreut wird. Der "10-Grad"-Detektor sammelt Licht, das bei einem Halbwinkel von etwa 3-10 Grad gestreut wird. Die Streuung bei niedrigen Winkeln, wie bei diesen, ist eine Funktion des Zellvolumens. Die Streuung bei großen Winkeln, wie senkrecht zu dem Laserstrahl, ist eine Funktion der Gesamtmenge der Struktur in der Zelle, ihrer "Strukturiertheit". Sind alle anderen Parameter gleich, so nimmt der hohe Streuwinkel einer Zelle zu, wenn beispielsweise die Lobulation des Kerns zunimmt oder wenn die zytoplasmatische Granulation zunimmt. CELL-DYN 3000 verwendet zwei Photomultiplier-Röhren, um die "90-Grad"-Streuung und die "90-Grad-depolarisierte" Lichtstreuung zu sammeln. Bei unserer Anwendung ergibt sich wenigstens ein Depolarisationssignal aus einem Mehrfachstreuphänomen innerhalb der Leukozyten. Es ist kein Artefakt einer Kreuzdepolarisation oder Autofluoreszenz.
Die klinische Nützlichkeit dieser neuen Parameter - des mittleren Thrombozytenvolumens (MPV), der Thrombozyten-Verteilungsbreite (PDW) und der Thrombokrit (PCT) - hat sich noch nicht erwiesen. Über die veröffentlichten Ergebnisse existiert eine kontroverse Meinung. Derzeit verbieten in den USA die Vorschriften der FDA die Aufzeichnung dieser Parameter, bis die klinische Nützlichkeit erwiesen ist. Anderswo können diese Ergebnisse, falls erforderlich, aufgezeichnet werden. Sind MPV-Daten erforderlich, so wird es sehr empfohlen, daß die Proben wenigstens 1 Stunde nach dem Sammeln genommen werden, wonach sich der MPV-Wert stabilisiert hat. Im allgemeinen nimmt MPV etwa während der ersten Stunde nach der Sammlung in EDTA zu.
CELL-DYN 3000 berechnet MPV aus dem Thrombozytenhistogramm, das sich an eine Log-Normalkurve anpaßt. Dieser Parameter wird direkt in Femtolitern angegeben. PCT wird aus der Anzahl der Thrombozyten und aus MPV wie folgt berechnet:
PCT = (PLT x MPV)/10
Das Ergebnis wird in Prozent oder ml/l angegeben. PDW ist die geometrische Standardabweichung der Größenverteilung der Thrombozyten. Sie leitet sich aus den Daten des Thrombozytenhistogramms ab und wird als 10 (GSD) angegeben.
Diese Erythrozytenkennungen sind nützliche Hinweise für die Morphologie der Erythrozyten und sind bei der Klassifizierung von Anämien nützlich. Ferner sind die Kennungsdaten für eine bestimmte Probe oder für eine Sammlung von Proben sehr stabil und sollten sich während langer Zeit nicht wesentlich ändern, auch wenn die Werte, die zur Berechnung verwendet werden, sich jeweils deutlich geändert haben. Aufgrund dieser Stabilität können die Erythrozytenkennungen zur Qualitätskontrolle der Instrumentleistung verwendet werden. Das QC-Programm mit beweglichem Durchschnitt von Bull verwendet dieses Prinzip.
Der Mittelwert von Hämoglobin in der Zelle (MCH) und die mittlere Hämoglobinkonzentration in der Zelle(MCHC) sind Parameter, die gemessen werden, wann immer es geeignet erscheint. Es gelten die folgenden Gleichungen:
MCH = (HGB/RBC-Anzahl) x 10
MCHC = -(HGB/HCT) x 10
MCH wird in Picogramm oder Femtomol angegeben. MCHC wird als g/l, g/dl oder mM/l angegeben.
Die folgende Information gilt für die folgenden Beispiele:

Streudiagramme 5a, 6a, 7a, 8a

y-Achse: 0-Grad-Streuung
x-Achse: 10-Grad-Streuung

Streudiagramme 5b, 6c, 7c, 8c

y-Achse: 90-Grad-Streuung
x-Achse: 90-Grad-depolarisierte Streuung

Subpopulationen

1 = Lymphozyten (LYM), 2 = Basophile (BASO),
3 = Monozyten (MONO), 4 = Neutrophile (NEU) und Eosinophile (EOS),
5 = Neutrophile (NEU), 6 = Eosinophile (EOS).

BEISPIEL 1

Unter Bezugnahme auf Figur 5 sind Streudiagramme gezeigt, die die Streuungseigenschaften von Laserlicht mit Vollblut von einem gesunden Spender nach Vermischen mit dem hier beschriebenen Lysemittel zeigen.

BEISPIEL 2

Diese Patientenprobe wurde ausgewählt, da sie erhöhte Werte an Monozyten und Eosinophilen zeigte. Bisher wurden diese Proben nicht leicht in fünf Subpopulationen differenziert, da es zu schwierig war, die Lymphozyten und Monozyten zu trennen und zu identifizieren. Unter Verwendung derselben Achseninformation, wie oben beschrieben, zeigt Figur 6c die Identifizierung der Neutrophilen und Eosinophilen auf dieselbe Weise wie die Regionen 5 und 6 der Figur B.

BEISPIEL 3

Diese Patientenprobe wurde ebenfalls entnommen, da sie erhöhte Werte an Monozyten und Eosinophilen aufwies. Unter Verwendung derselben Achseninformation, wie oben beschrieben, zeigt Figur 7c die Identifizierung von Neutrophilen und Eosinophilen auf dieselbe Weise wie die Regionen 5 und 6 der Figur 5b.

BEISPIEL 4

Diese Probe wurde ebenfalls entnommen, da sie erhöhte Werte an Monozyten und Eosinophilen zeigte. Unter Verwendung derselben Achseninformation, wie oben beschrieben, zeigt Figur 8c die Identifizierung von Neutrophilen und Eosinophilen auf dieselbe Weise wie die Regionen 5 und 6 der Figur 5b.
Während bestimmte erläuternde Ausführungsformen und genaue Angaben zum Zwecke der Erläuterung der Erfindung angegeben wurden, können hier verschiedene Veränderungen und Modifikationen durchgeführt werden, ohne vom Umfang der Erfindung, wie er in den angefügten Ansprüchen definiert ist, abzuweichen. Technische Daten für Figur 6 Proben-ID: Type: File 3 Open Sample Mode unreifer Granulocyt: unvollständige Lyse %: Gran CV in 10D parm: RBC upr menis Zeit: RBC-Zählzeit: Achsen Figur Technische Daten für Figur 7 Proben-ID: Type: PATIENT Open Sample Mode unreifer Granulocyt: unvollständige Lyse %: Gran Cb in 10D parm: RBC upr menis Zeit: RBC-Zählzeit: Achsen Figur Technische Daten für Figur 8 Proben-ID: Type: File 1 Open Sample Mode unreifer Granulocyt: unvollständige Lyse %: Gran CV in 10D parm: RBC upr menis Zeit: RBC-Zählzeit: Achsen Figur

Claims

1. Verfahren, um eine differentielle Fünfteile-Bestimmung von Leukozytenzellen- Subpopulationen aus einer Vollblut-probe zu erhalten, welches die folgenden Stufen umfaßt:

a) Zusammenbringen einer Vollblutprobe, die Erythrocyten und Leukozytenzellen enthält, mit einem Verdünnungsmittel;

b) Lyse der genannten Erythrocyten und Überschichten der genannten Leukozyten-zellen durch Zugabe eines durchflußzytometrischen Lysemittels zu der genannten verdünnten Vollblutprobe, wobei das genannte durchflußzytometrische Lysemittel im wesentlichen aus dem Folgenden besteht:

1) einem aromatischen Oxyethanol, das dazu dient, dem durchflußzytometrischen Lysemittel Leukozyten-schutzeigenschaften zu verleihen;

2) einem organischen Puffer mit einem pK-Wert bei 8,5 oder in der Nähe davon, der dazu dient, um eine pH-Pufferkapazität bereitzustellen und um die elektrische Leitfähigkeit des Lysemittels zu vergrößern; und

3) einer nichtionischen Detergenskomponente.

c) Schneiden der genannten lysierten Erythrozyten und der genannten überschichteten Leukozyten mit einem fokussierten Laserstrahl;

d) Messen von vier Lichtstreuungsparametern, die aus dem genannten Schnitt bei

1) einer Lichtstreuung von 0 º;

2) einer Lichtstreuung von 10 º;

3) einer Lichtstreuung von 90 º; und

4) einer 90 º-depolarisierten Lichtstreuung ergeben; und

e) Auflösen der gemessenen Lichtstreuungsparameter, um ein Differential aus fünf Subpopulationen zu erhalten, das die Neutrophilen, Leukozyten, Monozyten, Eosinophilen und Basophilen spezifizert.

2. Differentielles Fünfteile-Bestimmungsverfahren nach Anspruch 1, bei dem das genannte aromatische Oxyethanol 2-Phenoxyethanol ist.

3. Differentielles Fünfteile-Bestimmungsverfahren nach Anspruch 1, bei dem der genannte organische Puffer ausgewählt wird aus der Gruppe, bestehend aus TRIS/HCl, Borsäure Glycyl/Glycin und BICIN.

4. Differentielles Fünfteile-Bestimmungsverfahren nach Anspruch 1, bei dem das genannte nichtionische Detergens ausgewählt wird aus der Gruppe, bestehend aus

TRITON X-100, TRITON X-114 und hydrophilen Detergentien mit Polyoxyethylen- oder Saccharid-Kopfgruppen.

5. Differentielles Fünfteile-Bestimmungsverfahren nach Anspruch 1, bei dem das genannte durchflußzytometrische Lysemittel im wesentlichen aus einer waßrigen Lösung von 2-Phenoxyethanol, TRIS/HCl-Puffer und TRITON X-100 besteht.

6. Differentielles Fünfteile-Bestimmungsverfahren nach Anspruch 5, bei dem das genannte 2-Phenoxyethanol in einer Konzentration zwischen 20 mM und 80 mM vorhanden ist.