DE3705276A1 - Monoklonale antikoerper und antigen fuer human-nicht-kleinzellen-lungenkarzinom und bestimmte andere human-karzinome - Google Patents
Monoklonale antikoerper und antigen fuer human-nicht-kleinzellen-lungenkarzinom und bestimmte andere human-karzinomeInfo
- Publication number
- DE3705276A1 DE3705276A1 DE19873705276 DE3705276A DE3705276A1 DE 3705276 A1 DE3705276 A1 DE 3705276A1 DE 19873705276 DE19873705276 DE 19873705276 DE 3705276 A DE3705276 A DE 3705276A DE 3705276 A1 DE3705276 A1 DE 3705276A1
- Authority
- DE
- Germany
- Prior art keywords
- monoclonal antibody
- antibody
- cells
- human
- cell
- Prior art date
- Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
- Ceased
Links
Classifications
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N5/00—Undifferentiated human, animal or plant cells, e.g. cell lines; Tissues; Cultivation or maintenance thereof; Culture media therefor
- C12N5/06—Animal cells or tissues; Human cells or tissues
- C12N5/0602—Vertebrate cells
- C12N5/0693—Tumour cells; Cancer cells
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07K—PEPTIDES
- C07K16/00—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies
- C07K16/18—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans
- C07K16/28—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans against receptors, cell surface antigens or cell surface determinants
- C07K16/30—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans against receptors, cell surface antigens or cell surface determinants from tumour cells
- C07K16/3023—Lung
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
- A61P35/00—Antineoplastic agents
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07K—PEPTIDES
- C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
- C07K14/435—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans
- C07K14/46—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans from vertebrates
- C07K14/47—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans from vertebrates from mammals
- C07K14/4701—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans from vertebrates from mammals not used
- C07K14/4748—Tumour specific antigens; Tumour rejection antigen precursors [TRAP], e.g. MAGE
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07K—PEPTIDES
- C07K16/00—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies
- C07K16/18—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07K—PEPTIDES
- C07K16/00—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies
- C07K16/18—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans
- C07K16/28—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans against receptors, cell surface antigens or cell surface determinants
- C07K16/30—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans against receptors, cell surface antigens or cell surface determinants from tumour cells
- C07K16/3015—Breast
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07K—PEPTIDES
- C07K16/00—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies
- C07K16/18—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans
- C07K16/28—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans against receptors, cell surface antigens or cell surface determinants
- C07K16/30—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans against receptors, cell surface antigens or cell surface determinants from tumour cells
- C07K16/3046—Stomach, Intestines
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N5/00—Undifferentiated human, animal or plant cells, e.g. cell lines; Tissues; Cultivation or maintenance thereof; Culture media therefor
- C12N5/10—Cells modified by introduction of foreign genetic material
- C12N5/12—Fused cells, e.g. hybridomas
- C12N5/16—Animal cells
- C12N5/163—Animal cells one of the fusion partners being a B or a T lymphocyte
-
- G—PHYSICS
- G01—MEASURING; TESTING
- G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
- G01N33/00—Investigating or analysing materials by specific methods not covered by groups G01N1/00 - G01N31/00
- G01N33/48—Biological material, e.g. blood, urine; Haemocytometers
- G01N33/50—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing
- G01N33/53—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor
- G01N33/574—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor for cancer
- G01N33/57407—Specifically defined cancers
- G01N33/57423—Specifically defined cancers of lung
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
- A61K38/00—Medicinal preparations containing peptides
Landscapes
- Health & Medical Sciences (AREA)
- Chemical & Material Sciences (AREA)
- Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
- Organic Chemistry (AREA)
- Immunology (AREA)
- Genetics & Genomics (AREA)
- Engineering & Computer Science (AREA)
- General Health & Medical Sciences (AREA)
- Biochemistry (AREA)
- Molecular Biology (AREA)
- Medicinal Chemistry (AREA)
- Biomedical Technology (AREA)
- Cell Biology (AREA)
- Biophysics (AREA)
- Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
- Zoology (AREA)
- Biotechnology (AREA)
- Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
- Wood Science & Technology (AREA)
- Microbiology (AREA)
- Hematology (AREA)
- Urology & Nephrology (AREA)
- General Engineering & Computer Science (AREA)
- Oncology (AREA)
- Analytical Chemistry (AREA)
- Physics & Mathematics (AREA)
- Gastroenterology & Hepatology (AREA)
- Toxicology (AREA)
- Pathology (AREA)
- General Physics & Mathematics (AREA)
- Hospice & Palliative Care (AREA)
- Food Science & Technology (AREA)
- Animal Behavior & Ethology (AREA)
- Pharmacology & Pharmacy (AREA)
- Public Health (AREA)
- Veterinary Medicine (AREA)
- Nuclear Medicine, Radiotherapy & Molecular Imaging (AREA)
- General Chemical & Material Sciences (AREA)
- Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
- Preparation Of Compounds By Using Micro-Organisms (AREA)
Description
Die Erfindung bezieht sich auf einen neuen monoklonalen
Antikörper und auf Verfahren zur Erzeugung und Verwendung
eines solchen neuen monoklonalen Antikörpers, der für
Karzinom-Antigene spezifisch ist. Genauer gesagt ist der
monoklonale Antikörper nach der Erfindung immunspezifisch
für und/oder immunreaktiv mit einem Proteinantigen, das
mit Human-Nicht-Kleinzellen-Lungenkarzinom (NSCLC) und
bestimmten anderen Humankarzinomen, einschließlich einigen
Karzinomen der Brust, des Dickdarms usw., assoziiert ist.
Der monoklonale Antikörper der vorliegenden Erfindung ist
mit einer Determinanten eines Glycoprotein-Antigens,
assoziiert mit NSCLC-Zellen und auch mit anderen Karzinomen,
einschließlich Brust-, Dickdarm- und Kleinzellen-Lungen-
Karzinomen reaktiv. Der monoklonale Antikörper nach der
Erfindung besitzt unterscheidende Charakteristiken und
Fähigkeiten, welche ihn für klinische diagnostische Zwecke
sowohl in vivo als auch in vitro geeignet machen. Außerdem
ist der Antikörper nach der Erfindung für therapeutische
Zwecke geeignet. So kann zum Beispiel der Antikörper als
ein targetselektiver Träger von verschiedenen Agentien
verwendet werden, die Antitumorwirkung haben, wie zum
Beispiel Chemotherapeutika, Toxine, immunologische Respons-
Modifizierer und Radioisotope. Darüber hinaus können die
Hybridome, die solchen Antikörper erzeugen, unter Verwendung
der Recombinant-DNA-Technologie modifiziert werden,
so daß die resultierenden Antikörper antikörperabhängige
Zellularcytotoxizität vermitteln können oder cytolytisch
zu Tumorzellen in Gegenwart von Komplementkomponenten sein
können.
Lungenkarzinome sind für die Mehrzahl der Karzinom-Todesfälle
beim Menschen verantwortlich und holen die Brustkarzinome
als die häufigste Ursache von Krebstod bei Frauen ein. Diese
Krankheit kann in vier histologische Haupttypen unterteilt
werden: (1) epidermoider oder schuppiger Typ (30%), (2)
Adenokarzonom-Typ (35%), (3) undifferenzierter Großzellen-
Typ (15%) und (4) Kleinzellen-Typ (20%). Der Ausdruck
Nicht-Kleinzellen-Lungenkarzinom ("NSCLC") schließt folgende
Zelltypen ein: epidermoide Karzinomzellen, Adenokarzinomzellen
und große undifferenzierte Karzinomzellen.
Die meisten Lungenkarzinom-Fälle sind durch Chemotherapie
und Strahltherapie nicht heilbar. Kleinzellen-Lungenkarzinome
können auf Chemotherapie und Strahltherapie
durch Verminderung in der Größe ansprechen, aber dies
bedeutet keine vollständige Heilung. Vollständige chirurgische
Entfernung des Tumors scheint die einzige wirksame
Therapie zu sein. Leider haben jedoch weniger als 30% der
Lungenkarzinompatienten Tumore, die nach Diagnose vollständig
durch Resektion entfernt werden können. Von diesen
überleben weniger als ein Drittel fünf Jahre nach der
scheinbar vollständigen chirurgischen Entfernung des Tumors.
Es besteht daher eine große Nachfrage nach Verfahren, die
eine frühzeitigere Diagnose des Lungenkarzinoms und eine
bessere Bestimmung des Grades der Karzinomausbreitung
möglich machen würden, und nach einer wirksameren Therapie.
Monoklonale Antikörper, dargestellt durch homogene Antikörpermoleküle,
welche sich eine einzige Molekülstelle
(d. h. ein Epitop) an einem Antigen mit einer spezifischen
Bildungs- oder Affinitätskonstanten binden, werden nach
drei bekannten Methoden hergestellt.
Monoklonale Antikörper können nach den Hybridom-Techniken
von Kohler und Milstein hergestellt werden (1975 Nature 256: 495;
1976, Eur. J. Immunol. 6: 511). Durch Verschmelzen von
Antikörper erzeugenden Zellen (Milzlymphocyten) mit Myelomzellen
erzeugten Kohler und Milstein Hybridzellen, die
immortale Zellstämme hervorrufen, die beides besitzen, die
Fähigkeit, Antikörper zu bilden und die Fähigkeit, in
Zellkulturen permanent zu wachsen. Die Hybridome scheiden
einen einzigen Immunglobulintyp von vorbestimmter Antigenspezifität
aus, abhängig von dem Antigen, welchem die
Lymphocyten vorher ausgesetzt gewesen sind.
Alternativ können monoklonale Antikörper durch in vitro
Transformation von peripherem Säugetierblut B-Lymphocyten,
zum Beispiel mit dem Epstein Barr-Virus (EBV) erzeugt werden.
Das Virus macht die Antikörper erzeugenden Lymphocyten
immortal. Techniken für solche Transformation sind Stand
der Technik (siehe zum Beispiel Steinmetz et al. 1977,
Nature 269: 420; Crawford et al., 1983, The Lancet, i: 386).
Schließlich können monoklonale Antikörper durch Anwendung
von Techniken erzeugt werden, welche die EBV-Immortalisation
und die Zellfusion- oder Hybridom-Technik kombinieren.
Cole et al. (1985, in Monoclonal Antibodies and Cancer
Therapy, Alan Liss, Inc., pp. 77-96) beschreiben Techniken
zum Verschmelzen eines Human-Plasmacytom- oder Lymphoblastoid-
Zellstammfusionspartners mit EBV-transformierten Donorlymphocyten,
die vorher als ein Zellstamm nachgewiesen worden sind.
In einem solchen System sind beide parenteralen Zellstämme
immortal. Deshalb muß der Fusionspartner eine geeignete
Kennzeichnung zum Zähl-Auswählen gegenüber den parenteralen
Stämmen haben, wenn das verschmolzene Hybridom kultiviert wird.
Die resultierenden EBV-Hybridome erzeugen Antikörper mit
der Spezifität des verwendeten EBV-Lymphocyten-Zellstammes.
Monoklonale Antikörper können in großen Mengen durch in
vitro Zellkultur von bestimmten Hybridom- oder transformierten
Zellstämmen gemacht werden. Außerdem resultiert
Inokulieren eines Hybridom-Zellstammes in den peritonealen
Hohlraum verträglicher Säugetiere, wie Mäuse, in einem
Tumor, der hohe Konzentrationen (2 bis 20 mg/ml) des monoklonalen
Antikörpers in die Tumoraszites-Flüssigkeit sekretiert.
Durch Entfernung der Aszitesflüssigkeit und Reinigen
des monoklonalen Antikörpers kann eine einzige Maus genügend
Antikörper für die Verwendung in Tausenden von diagnostischen
Essays liefern.
Monoklonale Antikörper für Human-Lungenkarzinom-Antigene
sind beschrieben worden von: Sikora et al., 1981, Brit. J.
Cancer 43: 696; Cuttita et al., 1981, Proc. Nat'1 Acad.
Sci. USA 78: 4591; Moody et al., 1981, Science 214: 1246;
Minna et al., 1981, In Vitro 17: 1058; Kennel et al., 1981,
Cancer Res. 41: 3465; Chem. Abst. 95(15): 1308502; Baylin
et al., 1982, Proc. Nat'1 Acad. Sci. USA 79: 4650; Carney et
al., 1982, Pathobiology Annual 12: 115; Gazdar et al., 1983,
Seminars in Oncology 10: 3; Hollinshead et al., 1983, Cancer
Detect. Prevent 6: 1985; Mulshine et al., 1983, J. Immunol.
131: 497; Huang et al., 1983, Arch. Biochem. Biophys. 220:
318; Saji et al., 1984, Hybridoma 3: 119; Bio. Abst. 79005569;
Bosslet et al., Behring. Inst. Mitt. 74: 27; Chem. Abst.
AC101(9): 706686; Roset et al., 1984, Cancer Res. 44: 2052;
Bio. Ast. 79023605; Princler et al., 1982, Cancer Res. 42:
843; Mazauric et al., 1982, Cancer Res. 42: 150; Braatz et al.,
1982, Cancer Res. 42: 849; Sobel et al., 1982, Fed. Proc. 41:
409; Cole et al., 1985 in Monoclonal Antibodies and Cancer
Therapy, Alan Liss, Inc., pp. 77-96; und Varki et al., 1985,
in Monoclonal Antibodies and Cancer Therapy, Alan Liss, Inc.
p. 207.
Die US-Patentanmeldungen Serial Nos. 667, 521 von 2. 11. 84,
785, 177 von 7. 10. 85, 684, 759 vom 21. 12. 84, 776, 321 vom
18. 10. 85, 738, 612 vom 28. 5. 85 offenbaren bestimmte monoklonale
Antikörper gegen Human-Nicht-Kleinzellen-Lungenkarzinom.
Monoklane Antikörper können für Verfahren verwendet werden,
die eine frühere Diagnose von Lungenkarzinom und eine bessere
Definition der Ausbreitung des Karzinoms möglich machen
würden und die auch wirksamere Methoden zur Therapie von
Lungenkarzinom ermöglichen würden. Ein Erfordernis ist
jedoch, Antikörper für Antigene zu finden, die sich in
Lungenkarzinomen schneller zu erkennen geben als in normal
reifen Geweben. Im Hinblick auf die bekannte Heterogenität
von Tumorzellenpopulationen, die Anwesenheit von verschiedenen
Determinanten in dem gleichen Antigenmolekül, die
erwarteten Unterschiede zwischen Antigenen mit Bezug auf
ihre Stabilität als diagnostische Anzeiger und therapeutische
Targets und die verschiedenen biologischen Charakteristiken
von verschiedenen Antikörpern zum gleichen
Antigen können eine Anzahl von verschiedenen Antikörpern
für eine Anzahl von verschiedenen Antigenen notwendig machen.
Die Erfindung bezieht sich auf eine neue Klasse von monoklonalen
Antikörpern, bezeichnet mit L20, die für eine
Determinantstelle an einem Glycoprotein-Antigen, assoziiert
mit Human-Nicht-Kleinzellen-Lungenkarzinom (NSCLC)-Zellen
spezifisch ist. Der Ausdruck "NSCLC-Zellen" umfaßt epidermoide
Karzinomzellen, Adenokarzinomzellen und undifferenzierte
Großzellen-Karzinomzellen. Die Determinantstelle kann auch
an Antigenen von anderen Karzinomen, zum Beispeil einigen
Karzinomen der Brust und des Dickdarms und Kleinzellen-
Lungenkarzinom gefunden werden. So wird sich der Antikörper
nach der Erfindung auch an Zellen von anderen Karzinomen
binden und für die Diagnose und Therapie von allen anderen
Tumoren geeignet sein, die das Antigen auspressen, das durch
den Antikörper L20 identifiziert wird. Der monoklonale Antikörper
bindet sich in einem viel geringeren Grade an normal
gereiften Zellen als an Tumorzellen. Der Ausdruck "bindet sich
in viel geringerem Grade" bedeutet, daß die Bindung überhaupt
nicht nachweisbar sein wird oder nur als eine sehr schwache
Färbung, wenn immunhistologische Techniken angewendet werden.
So hat der Antikörper einen hohen Spezifitätsgrad für Antigencharakteristik
von NSCLC und bestimmten anderen Karzinomen.
Die Erfindung umfaßt auch das durch den Antikörper L20 identifizierte
neue Antigen L20, und die Klasse von Antikörpern,
die daran binden, sind immunspezifisch für oder immunreaktiv
mit diesem Antigen. Ferner sind Verfahren zur Verwendung des
gereinigten oder geklonten Antigens L20 als eine Vakzine zur
Immunisierung gegen bestimmte Karzinome eingeschlossen.
Die Erfindung bezieht sich auch auf bestimmte Diagnoseverfahren,
die den monoklonalen Antikörper der Erfindung verwenden.
Der Antikörper kann zum Beispiel in Verfahren zur
Bestimmung des Vorliegens von dem bösartigen Zustand in
Human-Lungengewebe und anderen Humangeweben verwendet werden.
Die Verfahren schließen die Prüfung von Gewebe auf die Anwesenheit
eines Antigens ein, das die Charakteristiken eines
Glycoproteins, 110 000 Dalton, definiert durch den Antikörper
L20 hat. Zum Beispiel kann das Gewebe mit einem
Antikörper in Kontakt gebracht werden, der eine Determinantstelle
an einem zellassoziierten Antigen definiert, welches
die Charakteristiken des durch den Antikörper L20 bestimmten
Antigens, eine funktionale Äquivalenz oder ein Fragment dieses
Antikörpers hat und irgenwelche Zwischenwirkungen des Antikörpers
und der antigenen Determinanten werden nachgewiesen.
Ein solches Verfahren schließt die Bestimmung der Anwesenheit
von NSCLC-Zellen in einer Probe, bei der solche Zellen vermutet
werden, ein. Die Probe wird mit dem monoklonalen Antikörper
in Kontakt gebracht, der in der Lage ist, solche Zellen von
anderen Zelltypen, die in der Probe vorhanden sein können,
zu unterscheiden. Der Kontakt wird unter Bedingungen zur Bindung
des Antikörpers an solche Zellen ausgeführt. Nach dem
Kontakt wird die Anwesenheit oder Abwesenheit von Bindung des
Antikörpers an die Zellen in der Probe bestimmt. Diese Bindung
wird mit der Anwesenheit oder dem Fehlen von NSCLC-Zellen in
der Probe in Verbindung gebracht. Im allgemeinen wird die
Probe mit einem markierten spezifischen Bindungspartner des
monoklonalen Antikörpers in Kontakt gebracht. Diese Markierung
ist in der Lage, ein nachweisbares Signal zu erzeugen.
Ein anderes diagnostisches Verfahren schließt die in vivo
Lokalisation eines Tumors durch Verabreichen eines gereinigten
Antikörpers oder Antikörper-Bruchstücks nach der Erfindung,
markiert mit einem Agens, welches ein nachweisbares
Signal gibt, an einen Patienten ein. Die Lokalisation wird
dann unter Anwendung externer Szintographie, Emissionstomographie
oder Kernstrahlungsabtastung nachgewiesen. Dieses
Verfahren kann auch bessere Möglichkeiten bieten, Patienten
hinsichtlich des Ausmaßes der Krankheit einzustufen und
Änderungen in Erwiderung auf Therapie zu überwachen.
Die Erfindung schließt auch therapeutische Anwendungen ein,
da der Antikörper L20 und ähnliche Antikörper mit dem Antigen
L20, das in hohen Konzentrationen an der Tumorzelloberfläche
ausgepreßt wird, reagieren können. Die Antikörper können daher
als Träger verschiedener Agenzien verwendet werden, die Antitumorwirkung
haben, einschließlich, aber nicht darauf beschränkt,
Chemotherapeutika, Toxine, Immunantwort-Modifikatoren
und Radioisotope.
Darüber hinaus kann der Antikörper L20 so modifiziert werden,
daß er antikörperabhängige Zellularcytotoxizität (ADCC) vermitteln
kann, d. h., daß er NSCLC-Zellen in Gegenwart von
Human-Lymphocyten oder Makrophagen töten kann oder daß er
cytolytisch gegenüber Tumorzellen in Gegenwart des Human-
Komplements wird. Eine derartige Modifikation kann zum
Beispiel durch in neuerer Zeit entwickelte Techniken zur
Erzeugung von "schimärischen Antikörpern" durchgeführt
werden. Demgemäß werden Gencodierung für den variablen
Bereich des Antikörper-Moleküls L20 mit Humangencodierung
für den Fc-Bereich eines Antikörpers mit geeigneter biologischer
Aktivität (wie der Fähigkeit, das Humankomplement
zu aktivieren und ADCC zu vermitteln) zusammengefügt. Neue
Antikörper, deren Herkunft die Maus oder der Mensch ist,
können auch zu dem Antigen L20 mit den geeigneten biologischen
Funktionen gemacht werden.
Die Erfindung betrifft: einen neuen monoklonalen Antikörper,
mit L20 bezeichnet, der immunspezifisch für und/oder immunreaktiv
mit einem Antigen an Human-NSCLC-Zellen und Zellen
von mehreren anderen Humankarzinomen, einschließlich Dickdarm-,
Brust- und Kleinzellen-Lungenkarzinom, ist; Verfahren
zur Herstellung eines solchen neuen monoklonalen Antikörpers;
und bestimmte diagnostische und therapeutische Verfahren
unter Verwendung des Antikörpers.
Die Erfindung betrifft ferner ein neues Zellenoberflächen-
Antigen, das charakteristisch für Human-NSCLC und bestimmte
andere Human-Karzinome der Brust, des Dickdarms und der
Lunge ist, und Verfahren zur Verwendung des neuen Antigens.
Monoklonale Antikörper gegen Human-NSCLC und bestimmte andere
Humankarzinome können durch Hybridom-Fusionstechniken, durch
EBV-Transformation von Human-Antikörper produzierenden Lymphocyten
oder durch Techniken, die Zellfusion und EBV-Immortalisationstechnologien
vereinigen, hergestellt werden.
Nach einer Ausführungsform der Erfindung werden monoklonale
Antikörper gegen NSCLC unter Anwendung der Hybridom-Zellfusionstechnik
hergestellt. So werden zum Beispiel Human-
Lungenkarzinomzellen von in Kulturen gezüchteten Pleuraleffusionszellen
von explantierten Human-NSCLC-Tumoren oder
Zellen von einer normalen Fetallunge oder Lysate von solchen
Zellen als das Immunogen verwendet. In einem Erläuterungsbeispiel
wurden explantierte Zellen von einem NSCLC-Human-
Lungenadenokarzinom Nr. 3082 als das Immunogen verwendet
(siehe Abschnitt 5.1.). Die Zellen wurden zum Beispiel einer
Maus injiziert. Nach ausreichender Zeit wurde die Maus geopfert
und es wurden somatische Antikörper produzierende
Lymphozyten erhalten. Antikörper produzierende Zellen können
von Lymphknoten, Milz und peripherem Blut von vorbereiteten
Tieren stammen. Milzzellen werden bevorzugt. Mäuselymphocyten
geben einen höheren Prozentsatz an stabilen Fusionen mit dem
weiter unten beschriebenen Maus-Myelom. Es ist auch möglich,
somatische Zellen von Ratten, Kaninchen und Fröschen zu verwenden.
Die Milzzellenchromosomen, die gewünschte Immunglobuline
codieren, werden durch Fusion der Milzzellen mit
Myelomzellen immortalisiert, im allgemeinen in Gegenwart von
Polyethylenglycol. Es können verschiedene Myelomzellstämme
zur Erzeugung von verschmolzenen oder vereinigten Zellhybriden
verwendet werden, einschließlich NSI-AG4/1, X63-Ag8, MPC11-45.
6TG1.7, X63-AG.653, Sp2/0-Ag14, Fo, und S194/5XXO.Bu.1, von
Mäusen stammend, und 210.RCY3.Ag1.2.3, U-226AR und GM1500GTGAL2
von Ratten stammend (Hammerling, et al., 1981, "Monoclonal
Antibodies and T-cell hybridomas" in Research Monographs in
Immunology, Vo. 3, J. L. turk, ed; Elsevier/North Holland
Biomedical Press. New York). In einem Erläuterungsbeispiel
wurden NS1-Zellen verwendet (siehe Abschnitt 5.1). Die resultierenden
Zellen, welche die vereinigten Hybridome einschließen,
werden in einem selektiven Medium, wie HAT-Medium,
gezüchtet und die überlebenden Zellen werden in solchem
Medium unter Anwendung begrenzender Verdünnungsbedingungen
gezüchtet. Die Zellen werden in einem geeigneten Behälter,
zum Beispiel in Mikroliter-Behältern, gezüchtet und der
Überstand wird abgesiebt für die Gewinnung monoklonaler
Antikörper der gewünschten Spezifität.
Es gibt verschiedene Methoden für die Isolierung und
Reinigung der monoklonalen Antikörper, um sie von anderen
Proteinen und anderen Verunreinigungen zu befreien.
Gemäß einer alternativen Ausführungsform der Erfindung werden
monoklonale Antikörper gegen NSCLC unter Anwendung von EBV-
Transformationstechniken hergestellt. So werden zum Beispiel
Lymphocyten von peripherem Blut, Tumor-dränierenden Lymphknoten,
Knochenmarkaspiraten, Tumoren oder Pleuraleffusionen
von Patienten mit NSCLC unter Anwendung von EBV immortalisiert
nach den Methoden von Cole et al., 1984, Cancer Rs. 44: 2759.
Wie von Cole et al. bemerkt, sind für Tumorantigene spezifische
B-Lymphocyten bei Lungenkarzinompatienten selten.
Daher ist es besonders wichtig, die Zahl der Antikörper
erzeugenden Lymphocyten durch vorselektierende Lymphocyten,
die Antikörper gegen das relevante Antigen erzeugen, zu
erhöhen. So schließen die EBV-Transformationstechniken zwei
Stufen ein: (1) Anreicherung von Zellen mit Rezeptoren für
das gegebene Antigen, d. h. das Antigen L20, beschrieben in
Abschnitt 4.2.; und (2) Immortalisation solcher Zellen durch
Infektion mit EBV.
Nach einer anderen alternativen Ausführungsform der Erfindung
werden monoklonale Antikörper gegen NSCLC durch Verwendung
einer Kombination von EBV-Transformation und Hybridom-Fusionstechnik
hergestellt, wie beschrieben bei Cole et al., 1985,
in Monoclonal Antibodies and Cancer Therapy, Alan R. Liss,
Inc.; pp. 77-96. Zum Beispiel wird ein Myelom-Zellstamm mit
Donorlymphocyten von NSCLC-Patienten, die vorher durch EBV
transformiert und als Zellstamm, der in Kultur gezüchtet
und entwickelt werden kann, nachgewiesen worden ist, vereinigt.
Um in der Lage zu sein, die resultierenden EBV-
Hybridom-Fusionszellstämme zu selektieren, ist es notwendig,
daß der Fusionspartner dominant geeignet selektierbare Markierungen
besitzt, wie Ouabain- oder Neomycin-Resistenz, so
daß sich Parentalzellen nicht entwickeln, wenn die vereinigten
Hybridomzellstämme gezüchtet werden. Geeignete Zellstämme
sind der Thioguamin-resistente GM-150, der Ouabain-resistente
Lymphoblastoide Zellstamm KR-4, beschrieben bei Cole et al.
weiter oben. Die resultierenden Hybridome werden nach üblichen
Techniken geklont.
Sobald die gewünschten verschmolzenen Zellhybride oder transformierten
Zellstämme selektiert und in individuelle Antikörper
erzeugende Zellstämme geklont worden sind, kann jeder
Zellstamm nach einer von zwei üblichen Methoden vermehrt
werden. Der einzelne Zellstamm kann in vitro vermehrt werden,
zum Beispiel in Laborkulturgefäßen, und das Kulturmedium,
das hohe Konzentrationen eines einzigen spezifischen monoklonalen
Antikörpers enthält, kann durch Dekantieren,
Filtrieren oder Zentrifugieren geerntet werden. Alternativ
kann die Ausbeute an monoklonalem Antikörper erhöht werden
durch Injizieren einer Probe des Hybridoms in ein gewebeverträgliches
Tier des Typs, der verwendet worden ist, um die
somatischen umd Myelomzellen für die ursprüngliche Fusion
zu liefern. Tumore, die den spezifischen monoklonalen
Antikörper sekretieren, der durch das vereinigte Zellhybrid
erzeugt worden ist, entwickelt sich in dem Tier.
Die Körperflüssigkeiten des Tieres, wie Aszitesflüssigkeit
oder Serum, liefern monoklonale Antikörper in hohen Konzentrationen.
Wie von Cole et al. in der weiter oben angegebenen
Literaturstelle diskutiert, ist es bei Verwendung von Humanhybridomen
oder EBV-Hybridomen nicht nötig, Rejektionen des in
die Tiere, wie Mäusen, injizierte Xenograft zu vermeiden.
Immundefiziente oder kahle Mäuse können verwendet werden
oder das Hybridom kann passiert werden zuerst durch bestrahlte
kahle Mäuse als ein fester subkutaner Tumor, in vitro gezüchtet
und dann intraperitoneal in pristane vorbereitete
bestrahlte kahle Mäuse injiziert, welche Aszitestumore entwickeln,
die große Mengen der spezifischen Human-monoklonalen
Antikörper sekretieren (siehe Cole et al. weiter oben).
Der erfindungsgemäße Antikörper verbindet sich mit einem
neuen Zelloberflächen-Glycoprotein-Antigen, bezeichnet mit
Antigen L20, charakteristisch für Human-NSCLC-Zellen und
Zellen von bestimmten anderen Humankarzinomen (siehe Abschnitt 4.2.1.).
Das Glycoprotein-Antigen hat ein Molekulargewicht
von etwa 110.000 Dalton, wenn es der Immunpräzipitation
bei der Elektrophorese an Polyacrylamidgel unterworfen wird
(siehe Abschnitt 5.3). Digerieren des Antigens L20 mit
Glycanase zeigte, daß es N-verknüpfte Oligosaccharidketten
enthält.
Als ein Erläuterungsbeispiel wird der Antikörper L20 durch
das murine (zu Mäusen gehörige) Hybridom erzeugt, wie in
Abschnitt 5.1. beschrieben. Der Antikörper L20 ist vom IgGl-
Isotyp und (siehe Abschnitt 5.2.2.) hat eine Avidität von
etwa 3 × 108. Es bindet sich nicht nachweisbar an normale
Zellen, wie Fibroblaste, Endothelzellen oder Ephithelzellen
in den wichtigsten Organen. Mit "bindet sich nicht nachweisbar"
ist gemeint, daß nur eine sehr schwache Färbung
oder überhaupt keine Färbung in immunhistologischen Tests
nachweisbar ist.
In den Rahmen der Erfindung fallen auch geeignete Bindungsfragmente
von dem vorstehenden monoklonalen Antikörper, wie
Fab, F(ab′)2, Fv-Fragmente usw. Die Antikörperfragmente
werden nach üblichen Techniken erhalten. So können zum
Beispiel geeignete Bindungsfragmente durch Peptidase-
Digestion des Antikörpers unter Verwendung von Papain oder
Pepsin hergestellt werden.
Ähnliche Antikörper, einschließlich Antikörper verschiedener
Isotypen, verschiedener Affinität und neuer biologischer
Funktionen, wie die Fähigkeit, Tumorzellen in
Gegenwart von Komplement- oder Effektorzellen, wie Lymphocyten
oder Makrophage, zu töten, liegen ebenfalls im Rahmen
der Erfindung. Während das weiter vorn gebrachte spezifische
Beispiel für den neuen Antikörper nach der Erfindung auf
einen Antikörper gerichtet ist, der an eine spezifische
Determinantstelle an dem jeweiligen Antigen bindet, und von
der Unterklasse IgGl einer murinen (murine = zu den Mäusen
gehörig) Quelle ist, ist dies nicht als eine Beschränkung
hierauf aufzufassen. Der vorstehend beschriebene Antikörper
und Antikörper mit funktionaler Äquivalenz mit dem oben beschriebenen
Antikörper sind in die Erfindung eingeschlossen,
gleichgültig, ob sie von einer murinen Quelle stammen oder
von anderen Säugetierquellen, einschließlich den Menschen
oder anderen Quellen oder Kombinationen davon sowie Antikörper
anderer Isotypen. Der Ausdruck "funktionale Äquivalenz"
bedeutet, daß der Antikörper in der Lage ist, sich an die
oben beschriebene Determinantstelle zu binden und in der Lage
ist, mit einem bestimmten Antikörper nach der Erfindung für
solche Stelle zu konkurrieren. Das heißt, wenn ein solcher
Antikörper mit einer Probe zusammengebracht wird, die eine
Zelle oder ein Zellfragment mit einer solchen Determinantstelle
enthält, wird er sich an die Determinantstelle binden
und einen Antikörper nach der Erfindung am Binden an der
Stelle hindern. Da ferner das Antigen nach der Erfindung mehr
als eine Determinantstelle haben kann, schließt die Erfindung
monoklonale Antikörper ein, die andere Determinantstellen
als die Determinantstelle, definiert durch den vorstehend
beschriebenen monoklonalen Antikörper definieren, und die
durch in der einschlägigen Technik bekannten aufeinanderfolgenden
Immunpräzipitations-Essays identifiziert werden
können.
Die Erfindung schließt auch Antikörper ein, die in Gegenwirkung
auf Antigen-Bindungsstellen hergestellt sind, oder
Idiotypen von dem Antikörper L20, weil solche anti-idiotypischen
Antikörper zum Analysieren der Immunantwort auf
Tumorantigene für Diagnosezwecke zum Einleiten von Immunantworten
für therapeutische oder profilaktische Zwecke
verwendet werden können (Nepom et al., 1984, Proc. Nat'1
Acad. Sci. 81: 2664).
Das Antigen, durch die monoklonalen Antikörper nach der
Erfindung erkannt, ist ein neues Zelloberflächen-Glycoprotein-
Antigen, charakteristisch für NSCLC-Zellen und
bestimmte andere Karzinome, einschließlich Brust-, Dickdarm-
und Kleinzellen-Lungen-Karzinome. Das Antigen hat ein
Molekulargewicht von etwa 110.000 Dalton.
Die aminoterminale Aminosäuresequenz des neuen Glycoprotein-
Antigens ist wie folgt:
in welcher X für eine Aminosäure steht, die bis jetzt noch
nicht identifiziert ist, und die übrigen Buchstaben die für
die Aminosäure gebräuchlichen Abkürzungen sind. Ein Vergleich
dieser Sequenz mit denen, die in der gegenwärtigen
Proteindatenbank (PIR Release 6.0, November 1985) gespeichert
sind, zeigt keine signifikante Sequenzübereinstimmung mit
irgendwelchen anderen bekannten Sequenzen.
Die monoklonalen Antikörper nach der Erfindung können als
Sonden zum Nachweis diskreter Antigene in Human-NSCLC und
anderen Tumoren verwendet werden. Ein Verfahren nach der Erfindung
umfaßt die Bestimmung der Anwesenheit einer bösartigen
Kondition in Lungengewebe und anderen Humangeweben durch
Prüfung des Gewebes auf das Auspressen oder das Fehlen des
Auspressens eines Glycoprotein-Antigens mit den Charakteristiken
von dem Antigen L20. Der Ausdruck "mit den Charakteristiken
von" bedeutet, daß das Antigen mit einem Antikörper
reaktiv ist, welcher das Antigen L20 erkennt. Das
Auspressen oder das Fehlen des Auspressens dieses Antigens
kann eine klinisch ausnutzbare Information geben, die mit
Standard histopathologischen Techniken nicht verfügbar ist.
Die monoklonalen Antikörper nach der Erfindung können zum
Beispiel verwendet werden zum Nachweis von Kleinzellen-
Lungenkarzinomzellen in histologischen und cytologischen
Proben. Bei Verwendung der Immunperoxidase-Färbetechnik,
beschrieben in Abschnitt 5.4, zeigen herausgeschnittene
Gewebsproben von Adenokarzinom, Epidermoid- und Kleinzellenkarzinom
der Lunge intensive positive Färbung. Normale Lunge,
Milz, Brust, Dickdarm, Niere, Leber, Gehirn, Herz, Haut,
Schilddrüse, Hoden, Vagina und normale Lymphocyten waren
negativ.
Eine andere wichtige diagnostische in vitro Anwendung der
erfindungsgemäßen monoklonalen Antikörper ist die Bewertung
von anderen Karzinomen als dem NSCLC. Der Antikörper ist
zum Nachweisen des Epitops in Karzinomen der Brust, des
Dickdarms und in Kleinzellen-Lungenkarzinomen verwendet
worden. Normale Proben dieser Gewebe preßten die Determinante
nicht aus. So ist der monoklonale Antikörper zum Nachweis
einer antigenen Determinante in diesen Karzinomen, welche
tumor-assoziiert ist, geeignet. Daher ist der monoklonale
Antikörper ein geeignetes diagnostisches Reagens für Brust-
und Dickdarm-Karzinome und für Kleinzellen-Lungenkarzinom.
Alternativ können Immunfluoreszenztechniken zur Prüfung von
Humangewebsproben mit den monoklonalen Antikörpern nach der
Erfindung verwendet werden. Objektträger mit kryostatischen
Sektionen von gefrorenen unfixierten Biopsie-Geweben oder
herausgeschnittenen Tumorproben oder cytologischen Abstrichen
werden an der Luft getrocknet und mit dem monoklonalen
Antikörper in einer befeuchteten Kammer von Raumtemperatur
bebrütet. Die cytologischen Abstriche schließen abblätternde
Zellproben ein. Der Ausdruck "abblätternd" bedeutet,
daß die Probe isolierte Zellen oder Zellklumpen, die durch
Abschaben oder Abwaschen der Gewebsoberfläche erhalten worden
sind, einschließt, wobei die Zellen einzeln oder in Schuppen
oder Schichten entfernt werden. Die abblätternde Zellprobe
ist von herausgeschnittenen Geweben und durch Biopsie erhaltenen
zu unterscheiden. Das Verfahren kann zum Nachweis
einer bösartigen Kondition in abblätternden Zellproben der
Lunge, wie Sputumproben, der Bronchien, dem Gastrointestinaltrakt,
einschließlich oraler Pharynx, Mund, einem Halsabstrich
usw. Verwendung finden.
Nach dem Trocknen werden die Objektträger mit einer Zubereitung
von Antikörper gegen den monoklonalen Antikörper
beschichtet, gewöhnlich mit irgendeinem Typ von Antimaus-
Immunglobulin, wenn der verwendete monoklonale Antikörper
von der Fusion von Mausmilz-Lymphocyten und einem Maus-
Myelomstamm stammt. Dieses Antimaus-Immunglobulin wird
unter Anwendung bekannter Techniken mit einer Verbindung,
wie Rhodamin oder Fluorescein-Isothiocyanat, die bei einer
bestimmten Wellenlänge fluoresziert, konjugiert. Das Farbmuster
und die Intensität der Probe werden dann durch
Fluoreszenzlichtmikroskopie bestimmt und wenn gewünscht,
fotografisch festgehalten.
Die vorstehende Beschreibung ist in erster Linie auf die
Verwendung der Antikörper nach der Erfindung bei Immunofluoreszenztechniken
gerichtet. Die Antikörper nach der
Erfindung können jedoch in den meisten Essays verwendet
werden, die Antigen-Antikörper-Reaktionen einschließen.
Die Essays können homogen oder heterogen sein. In einem
homogenen Essay kann die Probe ein gelystes und zur Entfernung
von Resten geklärtes Gewebe sein. Die immunologische
Reaktion umfaßt gewöhnlich den spezifischen Antikörper, eine
markierte Analysierkomponente und die interessierende Probe.
Das Signal, das von der Markierung kommt, wird nach der
Bindung des Antikörpers an die markierte Analysierkomponente
(analyte) direkt oder indirekt modifiziert. Beides, die
immunologische Reaktion und der Nachweis des Grades derselben
werden in einer homogenen Lösung vorgenommen. Immunochemische
Markierungen, die verwendet werden können, schließen
freie Radikale, Fluoreszenzfarbstoffe, Enzyme, Bakteriophage,
Coenzyme und dergleichen ein.
Bei einem heterogenen Essay-Versuch sind die Reagenzien
gewöhnlich die Probe, der spezifische Antikörper und ein
Mittel zur Erzeugung eines nachweisbaren Signals. Der monoklonale
Antikörper ist gewöhnlich als eine Schicht auf einen
festen Träger oder einer festen Phase aufgebracht. Die in
flüssiger Phase befindliche Probe wird dann mit dem Antikörper
in der festen Phase in Kontakt gebracht. Der Festphasen-
Träger wird dann von der flüssigen Phase getrennt und
entweder die feste Phase oder die flüssige Phase auf ein
nachweisbares Signal hin geprüft, wobei Mittel zur Erzeugung
eines solchen Signals verwendet werden. Das Signal zeigt
die Anwesenheit der analytischen Komponente in der Probe an.
Mittel zur Erzeugung eines nachweisbaren Signals sind zum
Beispiel die Verwendung von radioaktiven Markierungen,
fluoreszierende Verbindungen, Enzymen usw. Beispiele für
heterogene Immunessays sind der Radioimmunessay, Immunfluoreszenzverfahren,
enzymverknüpfte Immungessays und
dergleichen.
Über eine detaillierte Besprechung der vorstehenden Immunassaytechniken
siehe: "Enzyme-Immunoassay" von Edward T.
Maggio, 1980, CRC Press, Inc., Boca Raton, Florida; US
36 90 834, 37 91 932, 38 17 837, 38 50 578, 38 53 987,
38 67 517, 39 01 654, 39 35 074, 39 84 533, 39 96 345 und
40 98 876. Diese Liste ist nicht vollständig.
Die Antikörper nach der Erfindung können auch für in vivo
diagnostische Anwendungen herangezogen werden. Zum Beispiel
können Antikörper oder Fragmente, hergestellt aus Antikörpern,
wie Fab und F(ab′)2-Fragmente zur Darstellung von Tumoren
verwendet werden, einschließlich metastabiler Abscheidungen
in Humanpatienten mit NSCLC analog der Art und Weise wie es
Larson et al. für bösartiges Melanom beschrieben hat: 1983,
J. Nucl. med. 24: 123, und 1983, J. Clin. Invest. 72: 2101.
Der gereinigte Antikörper oder die Fragmente davon werden
mit einem Agens markiert, das ein nachweisbares Signal gibt,
zum Beispiel mit einem Radioisotop, wie 131I und in einem
geeigneten Träger, zum Beispiel intravenös einem Patienten
eingegeben. Die Lokalisierung des tumorgebundenen Antikörpers
wird nachgewiesen durch externe Szintographie, Emissionstomographie
oder Kernstrahlen-Scannen unter Verwendung von
zum Beispiel einer Gamma-Kamera.
Die Antikörper nach der Erfindung können auch therapeutisch
verwendet werden. Die monoklonalen Antikörper können in Verbindung
mit einem breiten Spektrum von pharmazeutischen und
cytotoxischen Mitteln verwendet werden. Zum Beispiel kann ein
Antikörper gebunden werden an ein Toxin zur Bildung eines
Immuntoxins (Jansen et al, 1982, Immunol. Rev. 62: 185)
oder an ein radioaktives Material, z. B. 125J, 131J usw.
(Order, 1984, Compr. Ther. 10: 9; Larson et al., 1983,
J. Clin Invest. 72: 2101; Carrasquillo et al., 1984, Cancer
Treatment Reports, 68: 317) oder an ein Arzneimittel (Rowland
et al., 1985, Cancer Immunol. Immunother. 19: 1), um ein
Radiopharmazeutikum oder Pharmazeutikum zu bilden. Konjugierte
Antikörper können Patienten verabreicht werden, um
die tumoriziden Effekte durch die cytotoxische Wirkung des
chemotherapeutischen Mittels, das an den Tumor abgegeben wird
und auf der Bindungsaffinität des Antikörperteils basiert,
zu erhöhen.
Sogenannte "schimärische Antikörper"-Moleküle des Antikörpers
nach der Erfindung können hergestellt werden, die eine Maus-
Antigen-Bindungsdomäne mit Humandomänen mit konstantem Teil
(mouse antigen-binding domain with human constant region domains)
enthalten (Morrison et al., 1984, Proc. Nat'1 Acad. Sci.
USA 81: 6851; Takeda et al., 1985, Nature, 314: 452). Dieser
Versuch kann benutzt werden, um neue Antikörpermoleküle mit
den gewünschten Wirkfunktionen aufzubauen, wie mit der
Fähigkeit, das Humankomplement zu aktivieren und ADCC zu
vermitteln (Neuberger et al., 1984, Nature 312: 604).
Eine andere therapeutische Anwendung der monoklonalen Antikörper
der Erfindung ist die Herstellung von anti-idiotypischen
Antikörpern unter Verwendung des Antikörpers L20 als dem
Immunogen (siehe zum Beispiel Nepom et al., 1984, Proc.
Nat'1 Acad. Sci. USA, 81: 2864; Lee et al:, 1985, Proc.
Nat'1 Acad. Sci 82: 6286).
Ein attraktiver Aspekt der Erfindung ist, daß die Antikörper
mit anderen Antikörpern auf NSCLC und andere Tumore
kombiniert werden kann, wie offenbart in den US-Patentanmeldungen
Serial No. 667, 521 vom 2. 11. 84; Serial No. 684, 759
vom 21. 12. 1984 und Serial No. 737, 612 vom 28. 5. 85. Die Kombination
ist zum Nachweis der oben erwähnten Typen von Nichtkleinzellen-
Lungenkarzinomen, nämlich undifferenziertem
Großzellen-Lungenkarzinom, Adenokarzinom und Epidermoidkarzinom
geeignet.
Die monoklonalen Antikörper nach der Erfindung definieren
auch Determinantstellen an einem Antigen, das mit anderen
Karzinomen assoziiert ist, wie Brustkarzinom, Dickdarmkarzinomen
und Kleinzellen-Lungenkarzinom (siehe Abschnitt 5.
Tabelle 1). Folglich können die Antikörper nach der Erfindung
in therapeutischen Verfahren und therapeutischen Produkten,
die auf solche Karzinome gerichtet sind, Verwendung
finden.
Das neue Antigen nach der Erfindung, mit Antigen L20 bezeichnet,
kann auch therapeutisch verwendet werden. Das
Antigen kann aus Tumoren herausgewaschen oder nach der
DNA-Rekombinant-Technologie erzeugt werden (schwebende US-
Patentanmeldung Serial No. 827, 313 der Anmelderin, eingereicht
am 7. 2. 86 und hier durch den Hinweis eingearbeitet).
Die Gencodierung für das Antigen L20 kann nach Verfahren
kloniert werden, bei welchen zuerst das mRNA des Antigens
L20 angereichert wird. Bei einem solchen Verfahren können
Polysome (bestehend aus mRNA, Ribosome und naszierenden
Polypeptidketten) gereinigt werden durch Immunaffinitätschromatographie
mit einem Antikörper, der die antigenische
Determinante von L20 an der naszierenden Kette erkennt. Das
mRNA wird durch Immunpräzipitation mit zum Beispiel dem
Antikörper L20 isoliert und das cDNA wird in einem geeigneten
Expressionsvektor geklont.
Alternativ kann der Antikörper L20 oder das Antiserum zum
Antigen L20 verwendet werden "to screen a cDNA library"
unter Verwendung eines Expressionsvektors. Das gereinigte
oder geklonte Antigen L20 kann allein als ein Immunogen
oder zusammen mit einem geeigneten immunologischen Adjuvant
verabreicht werden. Alternativ kann die Gencodierung für
das Antigen in das Gen eines Virus eingesetzt werden, zum
Beispiel in das Vakzinevirus, um ein Rekombinant-DNA-Produkt
zu erzeugen, das als Immunogen verwendet werden kann
(schwebende US-Patentanmeldung Serial No. 827, 313 der Anmelderin,
eingereicht am 7. Februar 1986).
Die Erfindung umfaßt auch Diagnostik-Kits zur Ausführung
der vorstehend offenbarten Verfahren. Nach einer Ausführungsform
enthält das Diagnostik-Kit (a) einen monoklonalen Antikörper,
der vorstehend genauer beschrieben ist, und (b) ein
Konjugat eines spezifischen Bindungspartners für den monoklonalen
Antikörper und eine Markierung, die in der Lage ist,
ein nachweisbares Signal zu erzeugen. Die Reagenzien können
auch Hilfsagenzien einschließen, wie Puffer und Proteinstabilisierungsmittel,
zum Beispiel Polysaccharide und dergleichen.
Das Diagnostik-Kit kann ferner, wenn nötig, andere
Komponenten des signalerzeugenden Systems enthalten, einschließlich
Mittel zur Herabsetzung der Hintergrundinterferenz,
Kontrollreagenzien, ein Gerät zur Durchführung eines
Tests usw. Bei einer anderen Ausführungsform enthält das
Diagnostik-Kit ein Konjugat eines monoklonalen Antikörpers
nach der Erfindung und eine Markierung für die Erzeugung
eines nachweisbaren Signals. Hilfsmittel, wie vorstehend
angegeben, können ebenfalls vorliegen.
Die Erfindung wird nun an Beispielen näher beschrieben, auf
die die Erfindung jedoch nicht beschränkt ist.
Monoklonale Antikörper wurden unter Anwendung der Hybridom-
Fusionstechniken, beschrieben von Yeh et al., 1979, Int. J.
Cancer 29: 299, hergestellt. Eine drei Monate alte Balb/c-
Maus wurde unter Verwendung explantierter gezüchteter Zellen
von einem Human-Adenokarzinom der Lunge, bezeichnet mit
3082, als dem Immunogen immunisiert. Die Maus erhielt vier
intraperitoneale Injektionen von etwa 107 Zellen. Drei Tage
nach der letzten Immunisierung wurde ihr die Milz entfernt,
in Kulturmedium suspendiert und mit NS1-Maus-Myelomzellen
durch Fusion vereinigt (Kohler und Milstein, o. a.). Die
Mischung wurde geimpft, um Kulturen niedriger Dichte zu
bilden, die aus einzelnen durch Fusion vereinigten Zellen
entstanden sind (Klone).
Überstände von Hybridzellen wurden gesichtet auf (screened
for) direkte Bindungsaktivität an Lungenkarzinom-Zellstämmen
unter Anwendung sowohl eines Elisa-Essays, als auch eines
autoradiographischen Essays mit 125J-markiertem Protein A
(Brown et al., 1979, J. Immunol, Meth., 31: 201). Extrakte
von Zellmembranen von dem Tumor, verwendet für Immunisierung,
wurden hergestellt unter Anwendung eines Verfahrens, modifiziert
von Colcher et al., 1981, Cancer Res. 42: 1451; Yeh
et al., o. a. Gewebe wurden mit PBS gewaschen und Zellen von
intakten Tumoren wurden durch Pressen durch ein Sieb aus rostfreiem
Stahl suspendiert. Danach wurde 1 mM NaHCO3, 1 mM
Phenylmethylsulfonylfluorid enthaltend (Calbiochem-Behring
Corp., San Diego, CA) zugegeben und das Material auf Eis
mit 50 Schlägen des Stößels B eines Dounce-Homogenisators
homogenisiert. Nach 15 Minuten langem Zentrifugieren bei
27.000 × g wurde der Überstand entfernt, das Pellet in PBS
resuspendiert, 1 Minute beschallt und bei -70°C gelagert.
Hybridome, die Antikörper erzeugen, welche an die Zellmembranextrakte
binden, wurden geklont, in vitro expandiert
und auf Antikörper-Spezifität getestet. Die Hybridome, die
Antikörper von ersichtlicher Spezifität auf Human-Lungenkarzinom
erzeugen, wurden reklont, expandiert und in mit
Pristan vorbehandelte, drei Monate alte Balb/c-Mäuse injiziert,
wo sie als Aszitestumore wuchsen.
Nach diesem Verfahren wurde der Hybridom-Zellstamm L20
erhalten, geklont und Mäusen injiziert, um einen Aszites-
Tumor zu entwickeln. Antikörper, in den Aszites-Tumor
sekretiert, wurde an Protein A Separose (Ey et al., 1978,
Immunochemistry, 15: 429) oder durch Gelfiltration in
Sephacryl S-300 gereinigt. Der gereinigte Antikörper wurde
für eine weitere Charakterisierung verwendet.
Die subzellulare Lokalisation von Antigen wurde bestimmt durch
Messung der Antikörperbindung an Zellen vor und nach der
Permeabilisation mit nicht-ionischem Detergens. Die Antikörperbindungen
an die Zelloberfläche von intakten gezüchteten
Zellen wurde identifiziert entweder durch direkte
Bindungsessays mit 125J-markiertem Antikörper (Brown et al.,
1981, Proc. Nat'1 Acad. Sci. USA, 78: 539) oder durch indirekte Fluoreszenz unter Verwendung des fluoreszenz-aktivierten
Zellsortierers (FACS) II. Antikörperbindungen an
intrazellulare Lagen wurden bestimmt durch direkte Bindung
von mit 125J-markiertem Antikörper an Zellen, Fixierung mit
Paraformaldehyd und anschließender Permeabilisierung mit dem
nicht-ionischen Detergens NP-40.
Für die Bindungsessays, die unter Verwendung von mit radioisotopen
markierten Antikörpern (Brown et al., o. a.) durchgeführt
wurden, wurden gezüchtete Zellen (106) 30 Minuten
auf Eis mit 106 cpm von 125J-markiertem Antikörper in 100 µl
Bindungspuffer bebrütet. Die Suspension wurde als Schicht
auf 0,2 ml Dinonylphthalat : Dibutylphthalat (1 : 1 v/v) aufgetragen
und zentrifugiert. Das Pellet und die wäßrige Phase
wurden auf 125J gezählt. Zum Bestimmen von nicht-spezifischen
Bindungen wurden parallel dazu Bebrütungen von unmarkiertem
Antikörper als Vergleich durchgeführt (Brown et. al., o. a.).
ZellenSpezifische Bindungen
ZellenSpezifische Bindungen
Calu-1-Lungen-Adenokarzinom 45400
H3082 Lungen-Adonokarzinom 50100
H2981 Lungen-Adonokarzinom 64100
H2984 Lungen-Adenokarzinom119300
MCF7 Brustkarzinom 78800
3017 Melanom 2200
Normal T Zellen 200
Jurkat T Leukemia 200
Daudi B Lymphoma 200
Um die Klasse der Immunglobuline, die durch den Hybridomzellstamm L20
erzeugt werden, zu bestimmen, wurden folgende
Techniken angewendet:
- a) Ouchterlony Immundiffusion
Ein Aliquotüberstand von partikulären Hybridomzellen wurde in den im mittleren Behälter einer 25%igen Agarplatte eingebracht. Monospezifische Kaninchen-Antimaus-Ig-Isotype Antikörper (Southern Biotechnology, Birmingham, AL) wurden in die äußeren Behälter eingebracht und die Platte zwei Stunden bei Raumtemperatur und über Nacht bei 4°C bebrütet. - b) ELISA-Isotyping
Dynatech Immuolon-Platten mit 96 Behältern wurden mit jedem Antiserum einer Konzentration von 1 µg/ml in PBS, 50 µl pro Behälter, beschichtet und über Nacht bei 4°C zugedeckt stehen gelassen. Die Platten wurden mit PBS/Tween 20, 0,05%ig, gewaschen und mit Nährboden (medium) 100 µl pro Behälter eine Stunde bei Raumtemperatur eingeschlossen. Nach dem Waschen der Platten wurden die Überstände von dem Hybridom L20 zugefügt und bei Raumtemperatur eine Stunde bebrütet. Nach dem Waschen mit PBS wurden Rinderserumalbumin (BSA)-Platten bei 37°C zwei Stunden mit monospezifischen Kaninchen-Antimaus- Ig-Isotyp-Antikörpern an Peroxidase (Zymed) gekuppelt. Nach dem Waschen wurden die Platten mit 1 mg/ml o-Phenyldiamin und 0,03%igem H2O2 in 0,1 M Citratpuffer von ph 4,5 bebrütet. Die optische Dichte bei 630 nm wurde an einem Dynatec-ELISA- Plattenableser bestimmt.
Der monoklonale Antikörper L20 ist von dem IgG1-Isotyp.
Um Protein-Antigene zu identifizieren, wurden Lungenkarzinomzellen
an der Oberfläche mit radioaktivem Jod oder metabolisch
mit 35S-Methionin markiert. Antigene wurden aus Zellysaten
isoliert durch Bebrüten mit monoklonalem Antikörper, Zugeben
von Ziegen-Antimaus-IgG und Adsorption an Staphylococcus
aureus. Die Immunpräzipitate wurden gewaschen und der präparativen
Natriumdodecylsulfat-Polyacrylamidgel-Elektrophorese
(SDS-PAGE) an einem 10 bis 20%igem Acrylamidgel ausgesetzt.
Nach der Elektrophorese wurde das Gel mit Coomassie Brillant
Blau (0,5 Gew.-% zu 10% Essigsäure und 30% Isopropanol)
gefärbt und in einer Lösung von Essigsäure (5%, v : v) und
Methanol (17%, v : v) entfärbt. Das gefärbte Antigen L20-Band
wurde mit einer Rasierklinge beaufschlagt und unmittelbar
einer Elektroelution mit einem ECU-040-Elektroeluter/Konzentrator
(C.B.S. Scientific Co., San Diego, CA) nach den
Methoden von Hunkapiller et al., 1983, Methods in Enyzmol.
91: 227-236 unterworfen.
Der automatisierte Edman-Abbau wurde mit etwa 23 pMol Antigen
L20 (basiert auf der Ausbeute von identifiziertem L-1) in
einem Gasphasen-Sequenzer (Modell 470A, Applied Biosystems,
Inc., Foster City, CA) durchgeführt. Die Phenylthiohydantoin-
Aminosäure-Derivate wurden analysiert mittels Hochleistungsflüssigkeitschromatographie
(HPLC) unter Verwendung einer
Model 120A on-line HPLC-Einheit (Applied Biosystems, Inc.)
mit einer PTH-C18-Säule (2,1 × 220 mm, Applied Biosystems,
Inc.) und einem Natriumacetat/Tetrahydrofuran/Acetonitril-
Gradient für die Elution.
Die aminoterminale Aminosäuresequenz ist wie folgt:
in der X eine Aminosäure bedeutet, die nicht identifiziert
worden ist.
Ein Vergleich dieser Sequenz mit denen, die in der Protein-
Datenbank (PIR Release 6.0, November 1985) gespeichert sind,
zeigte keine signifikante Ähnlichkeit mit irgendeiner anderen
bekannten Sequenz.
Das Antigen, das von dem Antikörper L20 erkannt wurde, ist
ein Glycoprotein-Antigen eines Molekulargewichts von etwa
110.000 Dalton.
Die Techniken mit unmarkiertem Antikörper von Sternberger,
1979, Immunochemistry, John Wiley + Sons, New York, pp:
104-169, modifiziert von Garrigues et al., 1982, Int. J.
Cancer 29: 511 wurde für immunhistologische Studien an eingefrorenen
Gewebsschnitten (frozen sections) herangezogen. Die
Target-Gewebe für diese Tests wurden bei chirurgischer Behandlung
erhalten und innerhalb von vier Stunden nach Entnahme in
in flüssigem Stickstoff vorgekühltem Isopentan eingefroren.
Die Gewebe wurden dann in flüssigem Stickstoff oder bei -70°C
bis zu ihrem Gebrauch gelagert. Kaninchen-Antimaus-IgG (Sternberger-
Meyer, Immunochemicals, Inc., Jarettsville, MD) wurde
bei einer Verdünnung von 1/50 verwendet. Maus-Peroxidase-
Antiperoxidase-Komplexe (PAP, Sternberger-Meyer, Immunochemicals,
Inc.), die 2 mg/ml von speziell gereinigtem PAP
enthielten, wurden bei einer Verdünnung von 1/80 verwendet.
Die eingefrorenen Schnitte wurden präpariert, getrocknet,
mit Aceton behandelt und getrocknet (Garrigues et al., o. a.).
Die für die histologische Bewertung verwendeten Schnitte wurden
mit Hämatoxylin gefärbt. Um die nicht-spezifischen Hintergründe
zu vermindern, wurden die Schnitte mit Normalhumanserum,
1/5 verdünnt, vorbebrütet (Garrigues et al., o. a.).
Maus-Antikörper, Ziegen-Antimaus-IgG und Maus-PAP wurden in
einer Lösung von 10%igem Normalhumanserum und 3%igem Kaninchenserum
verdünnt.
Das Färbeverfahren bestand aus 2,5 Stunden langem Behandeln
von Reihenschnitten mit entweder spezifischem oder Kontroll-
Antikörper, 30 Minuten langem Bebrüten mit Kaninchen-Antimaus-
IgG, 1/50 verdünnt, und 30 Minuten langem Aussetzen dem PAP-
Komplex, 1/80 verdünnt. Nach jeder Behandlung mit Antikörper
wurden die Objektträger zweimal in PBS gewaschen. Die immunhistochemische
Reaktion wurde mit frisch bereitetem 0,5%igem
3,3′-Diamanobenzidin-Tetrahydrochlorid (Sigma, St. Louis, MO)
und 0,01%igem H2O2 in 0,05 M Tris-Puffer, pH 7,6, 8 Minuten
entwickelt. Weiteres Aussetzen einer 1%igen OsO4-Lösung in
destilliertem Wasser 20 Minuten lang verstärkte die Färbung.
Die Schnitte wurden mit Wasser gespült, in Alkohol entwässert,
in Xylol gereinigt und auf Objektträger aufgebracht.
Jeder der Objektträger wurde unter einem Code bewertet und die
codierten Proben wurden durch einen unabhängigen Wissenschaftler
geprüft. Typische Objektträger wurden unter Benutzung
von Differential-Interferenz-Kontrast-Optiken
(Zeiss-Nomarski) fotografiert. Der Grad der Antikörperfärbung
wurde wie folgt bewertet: ○ keine Reaktivität, + ganz
schwach positive Zellen, ++ mindestens ein Drittel der
Zellen positiv, +++ fast alle Zellen positiv, ++++ nahezu
alle Zellen stark positiv. Da die Unterschiede zwischen + und
○-Färbung weniger deutlich waren als zwischen + und ++-Färbung,
wurde eine Färbung mit ++ und mehr als "positiv" angesehen.
Sowohl neoplastische als Stromazellen wurden in Tumorproben
beobachtet. Die registrierte Färbung ist die der Tumorzellen,
da die Stromazellen überhaupt nicht gefärbt wurden oder wenn
gefärbt, dann sehr viel schwächer als die Tumorzellen.
GewebetypZahl positiv/Zahl getestet*
GewebetypZahl positiv/Zahl getestet*
Lungenkarzinom:
Adenokarzinom,618/20 Epidermoid,6 3/3 Bronchial,6 0/1 Kleinzellen,6 4/4 Lungenkarzinom:
Zellstämme,6 3/3 Brustkarzinom,6 4/7 Dickdarmkarzinom,6 5/8 Melanom,6 5/8 Rückenmarkskarzinom,6 1/1 Liposarcom,6 0/1 Normale Lunge,61 von 3 getesteten Proben schwach gefärbt Normale Milz,6negativ Normale Brust,6negativ Normaler Dickdarm,6negativ Normale Niere,6negativ Normale Leber,6negativ Normales Gehirn,6negativ Normales Herz,6negativ Normale Haut,6negativ Normale Schilddrüse,6negativ Normaler Hoden,6negativ Normale Vagina,6negativ Normales Lymphocyten-Pellet,6negativ
Adenokarzinom,618/20 Epidermoid,6 3/3 Bronchial,6 0/1 Kleinzellen,6 4/4 Lungenkarzinom:
Zellstämme,6 3/3 Brustkarzinom,6 4/7 Dickdarmkarzinom,6 5/8 Melanom,6 5/8 Rückenmarkskarzinom,6 1/1 Liposarcom,6 0/1 Normale Lunge,61 von 3 getesteten Proben schwach gefärbt Normale Milz,6negativ Normale Brust,6negativ Normaler Dickdarm,6negativ Normale Niere,6negativ Normale Leber,6negativ Normales Gehirn,6negativ Normales Herz,6negativ Normale Haut,6negativ Normale Schilddrüse,6negativ Normaler Hoden,6negativ Normale Vagina,6negativ Normales Lymphocyten-Pellet,6negativ
*Alle geprüften Proben waren eingefrorene Gewebsschnitte,
die chirurgisch erhalten worden sind. Siehe Text der detaillierten
Beschreibung von immunhistologischen Methoden.
Eine Färbung von 2+ (was bedeutet, daß mindestens ein Drittel
aller Zellen positiv waren) wurde als positiv angesehen.
Für den Fachmann liegt es auf der Hand, daß viele Modifikationen
und Änderungen an der vorstehend beschriebenen Erfindung möglich
sind, ohne den Rahmen der Erfindung zu verlassen. Die
speziellen beschriebenen Ausführungsformen sind nur Beispiele,
auf die die Erfindung nicht begrenzt ist.
Ein Zellstamm L20, wie hier beschrieben ist, ist hinterlegt
worden bei "The American Type Tissue Culture Collection,
Rockville, Maryland" und hat die ATCC-Hinterlegungsnummer
HB8913 erhalten. Die hier beschriebene und beanspruchte Erfindung
ist nicht auf den hinterlegten Zellstamm beschränkt, da
die hinterlegte Ausführungsform als nur eine Veranschaulichung
eines Aspekts der Erfindung bestimmt ist und
irgendwelche äquivalenten Zellstämme, die einen funktionell
äquivalenten monoklonalen Antikörper erzeugen, im Rahmen
dieser Erfindung liegen. Tatsächlich ergeben sich für den
Fachmann verschiedene Modifikationen der Erfindung zusätzlich
zu den gezeigten und beschriebenen. Diese Modifkationen
fallen mit unter die Ansprüche.
Claims (31)
1. Verfahren zur Erzeugung eines monoklonalen Antikörpers,
der sich an eine Determinantstelle an einem Zelloberflächen-
Glycoprotein-Antigen von Human-Nicht-Kleinzellen-
Lungenkarzinomzellen bindet, gekennzeichnet durch
- a) Vermehren eines Hybridoms, das die identifizierenden Charakteristiken von A.T.C.C. Nr. HB 8913 hat, und erhalten wurde durch Fusion von (i) einer Antikörper erzeugenden Zelle, die von der Milz eines Tieres stammt, das mit in Kulturen gezüchteten Pleuraleffusionszellen immunisiert worden ist, oder Lungengewebe eines Patienten mit Nicht-Kleinzellen-Lungenkarzinom mit (ii) einer Myelomzelle; und
- b) Ernten der von dem Hybridom erzeugten monoklonalen Antikörper.
2. Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet,
daß das Hybridom in vivo vermehrt wird.
3. Verfahren nach Anspruch 2, dadurch gekennzeichnet,
daß das Hybridom durch Injizieren einer pristanevorbereiteten
BALB/c-Maus und Wachsenlassen eines
Aszites-Tumors vermehrt wird und die monoklonalen
Antikörper, sekretiert in die Aszites, durch Adsorption
an Protein A-Sepharose oder durch Gelfiltration
gereinigt werden.
4. Verfahren nach Anspruch 1, bei welchem sich der erzeugte
monoklonale Antikörpr an eine Determinantstelle
an einem Zelloberflächen-Glycoprotein-Antigen
von Human-Nicht-Kleinzellen-Lungenkarzinomzellen
bindet, dadurch gekennzeichnet, daß das Antigen ein
Molekulargewicht von etwa 110 000 Dalton, bestimmt
mittels Polyacrylamidgel-Elektrophorese, aufweist
und eine aminoterminale Aminosäuresequenz wie folgt
hat:
in welcher X eine nicht identifizierte Aminosäure
bedeutet.
5. Verfahren nach Anspruch 4, dadurch gekennzeichnet,
daß das Hybridom der Hybridomzellstamm L20,
A.T.C.C. Nr. HB 8913 ist.
6. Verfahren nach Anspruch 5, dadurch gekennzeichnet,
daß der erzeugte monoklonale Antikörper von der
Klasse IgG ist.
7. Verfahren nach Anspruch 6, dadurch gekennzeichnet,
daß der erzeugte monoklonale Antikörper von der Unterklasse
IgGl ist.
8. Verfahren zur Erzeugung eines monoklonalen Antikörpers,
der sich an eine Determinantstelle an einem
Zelloberflächen-Glycoprotein-Antigen von Human-
Nicht-Kleinzellen-Lungenkarzinomzellen bindet, gekennzeichnet
durch
- a) Vermehren eines transformierten B Zellstamms, erhalten durch Immortalisieren einer Antikörper erzeugenden Zelle von einem Patienten mit Nicht- Kleinzellen-Lungenkarzinom; und
- b) Ernten der von dem transformierten B Zellstamms erzeugten monoklonalen Antikörper.
9. Verfahren nach Anspruch 8, dadurch gekennzeichnet,
daß die Immortalisation mittels EBV-Infektion durchgeführt
wird.
10. Verfahren zur Erzeugung eines monoklonalen Antikörpers,
der sich an eine Determinantstelle an
einem Zelloberflächen-Glycoprotein-Antigen von
Human-Nicht-Kleinzellen-Lungenkarzinomzellen bindet,
gekennzeichnet durch
- a) Vermehren eines Hybridoms, das erhalten wurde durch Fusion von (i) einem transformierten B Zellstamm, der durch Immortalisieren einer von einem Patienten mit Nicht-Kleinzellen-Lungenkarzonom erhaltenen, Antikörper erzeugenden Zelle erhalten worden ist, mit (ii) einer Myelomzelle; und
- b) Ernten der von dem Hybridom erzeugten monoklonalen Antikörper.
11. Verfahren nach Anspruch 10, dadurch gekennzeichnet,
daß die Immortalisation mittels EBV-Infektion durchgeführt
wird.
12. Verfahren nach Anspruch 8, in welchem sich der monoklonale
Antikörper an eine Determinantstelle an einem
Zelloberflächen-Glycoprotein-Antigen von Human-
Nicht-Kleinzellen-Lungenkarzinomzellen bindet, dadurch
gekennzeichnet, daß das Antigen ein Molekulargewicht
von etwa 110 000 Dalton, bestimmt mittels
Polyacrylamidgel-Elektrophorese, aufweist und eine
aminoterminale Aminosäuresequenz hat wie folgt:
in der X eine nicht identifizierte Aminosäure
bedeutet.
13. Verfahren nach Anspruch 10, in welchem sich der erzeugte
monoklonale Antikörper an eine Determinantstelle
an einem Zelloberflächen-Glycoprotein-Antigen
von Human-Nicht-Kleinzellen-Lungenkarzinomzellen
bindet, dadurch gekennzeichnet, daß das Antigen ein
Molekulargewicht von etwa 110 000 Dalton, bestimmt
mittels Polyacrylamidgel-Elektrophorese, aufweist,
und eine aminoterminale Aminosäuresequenz hat wie
folgt:
in welcher X eine nicht identifizierte Aminosäure
bedeutet.
14. Verfahren nach Anspruch 4, dadurch gekennzeichnet,
daß der erzeugte monoklonale Antikörper von der
Klasse IgG ist.
15. Verfahren nach Anspruch 12, dadurch gekennzeichnet,
daß der erzeugte monoklonale Antikörper von der
Klasse IgG ist.
16. Verfahren nach Anspruch 13, dadurch gekennzeichnet,
daß der monoklonale Antikörper von der Klasse IgG
ist.
17. Verfahren nach einem der Ansprüche 14, 15 und 16,
dadurch gekennzeichnet, daß der erzeugte monoklonale
Antikörper von der Unterklasse IgGl ist.
18. Verfahren zur Erzeugung eines monoklonalen Antikörpers,
der sich an eine Determinantstelle an
einem Zelloberflächen-Glycoprotein-Antigen von
Human-Nicht-Kleinzellen-Lungenkarzinomzellen bindet,
ein Molekulargewicht von etwa 110 000 Dalton, bestimmt
mittels Polyacrylamidgel-Elektrophorese, aufweist
und eine aminoterminale Aminosäuresequenz wie
folgt hat:
in der X eine nicht identifizierte Aminosäure bedeutet,
gekennzeichnet durch,
- a) Vermehren des Hybridom-Zellstamms L20, A.T.C.C. Nr. HB 8913, der erhalten worden ist durch Fusion von (i) einer Antikörper erzeugenden Zelle, stammend von der Milz einer BALB/c-Maus, immunisiert mit Human-Lungenkarzinomzellen 3082, mit (ii) einer NS1-Maus-Myelomzelle; und
- b) Ernten der von dem Hybridom erzeugten monoklonalen Antikörper.
19. Verfahren nach einem der Ansprüche 1, 8 und 10,
dadurch gekennzeichnet, daß sich der monoklonale
Antikörper an eine Determinantstelle an einem Zelloberflächen-
Glycoprotein-Antigen von Human-Brustkarzinomzellen
bindet.
20. Verfahren nach einem der Ansprüche 1, 8 und 10,
dadurch gekennzeichnet, daß sich der monoklonale
Antikörper an eine Determinantstelle an einem Zelloberflächen-
Glycoprotein-Antigen von Human-Dickdarm-
Karzinomzellen bindet.
21. Verfahren zur Erzeugung eines monoklonalen Antikörpers,
der sich an eine Determinantstelle an
einem Zelloberflächen-Glycoprotein-Antigen von
Human-Brust-Karzinomzellen bindet, gekennzeichnet
durch
- a) Vermehren eines Hybridoms, das die identifizierenden Charakteristiken von A.T.C.C. Nr. HB 8913 hat, und erhalten wurde durch Fusion von (i) einer Antikörper erzeugenden Zelle, die von der Milz eines Tieres stammt, das mit in Kultur gezüchteten Pleuraleffusionszellen immunisiert worden ist, oder Lungengewebe eines Patienten mit Nicht-Kleinzellen- Lungenkarzinom, mit (ii) einer Myelomzelle; und
- b) Ernten der durch das Hybridom erzeugten monoklonalen Antikörper.
22. Verfahren zur Erzeugung eines monoklonalen Antikörpers,
der sich an eine Determinantstelle eines
Zelloberflächen-Glycoprotein-Antigens von Human-
Dickdarm-Karzinomzellen bindet, gekennzeichnet durch
- a) Vermehren eines Hybridoms, das die identifizierenden Charakteristiken von A.T.C.C. Nr. HB 8913 hat, und erhalten ist durch Fusion von (i) einer Antikörper erzeugenden Zelle, die von der Milz eines Tieres stammt, das mit in Kulturen gezüchteten Pleuraleffusionszellen immunisiert worden ist, oder Lugengewebe eines Patienten mit Nicht-Kleinzellen- Lungenkarzinom, mit (ii) einer Myelomzelle; und
- b) Ernten der durch das Hybridom erzeugten monoklonalen Antikörper.
23. Verfahren zum Nachweisen von malignen Zellen in
einer Probe, bei der Verdacht auf das Vorliegen
solcher Zellen besteht, gekennzeichnet durch
- a) Inkontaktbringen der Probe mit einem monoklonalen Antikörper, der nach dem Verfahren einer der Ansprüche 1, 4, 5, 8 und 10 erhalten worden ist, unter Reaktionsbedingunge, die dem monoklonalen Antikörper gestatten, sich an die Determinantstelle zu binden;
- b) Entfernen nicht gebundener monoklonaler Antikörper- Moleküle aus der Probe; und
- c) Prüfen der Probe auf die Anwesenheit von gebundenem monoklonalem Antikörper, wobei Bindung des monoklonalen Antikörpers die Anwesenheit maligner Zellen in der Probe anzeigt.
24. Verfahren nach Anspruch 23, dadurch gekennzeichnet,
daß die malignen Zellen Nicht-Kleinzellen-Lungenkarzinomzellen
sind.
25. Verfahren nach Anspruch 24, dadurch gekennzeichnet,
daß als Probe Lungengewebe verwendet wird.
26. Verfahren nach Anspruch 23, dadurch gekennzeichnet,
daß die malignen Zellen Brustkarzinomzellen sind.
27. Verfahren nach Anspruch 23, dadurch gekennzeichnet,
daß die malignen Zellen Dickdarmkarzinomzellen sind.
28. Verfahren nach Anspruch 23 oder 24, dadurch gekennzeichnet,
daß die Bindung mittels immunhistologischer
Färbung nachgewiesen wird.
29. Verfahren zum Lokalisieren von Human-Nicht-Kleinzellen-
Lungenkarzinomen in vivo, gekennzeichnet
durch
- a) Reinigen des monoklonalen Antikörpers, der nach einem der Ansprüche 1, 4, 5, 8 und 10 erhalten worden ist;
- b) Radiomarkieren des monoklonalen Antikörpers;
- c) Verabreichen des monoklonalen Antikörpers in einem geeigneten Träger an einen Humanpatienten; und
- d) Lokalisieren des monoklonalen Antikörpers durch externe Scintographie, Emissionstomographie oder Kernstrahlungsabtastung.
30. Immuntherapeutisches Verfahren zur Behandlung von
Nicht-Kleinzellen-Lungenkarzinom, gekennzeichnet
durch
- a) Reinigen des monoklonalen Antikörpers, der nach dem Verfahren eines der Ansprüche 1, 4, 5, 8 oder 10 erzeugt worden ist;
- b) Konjugieren des monoklonalen Antikörpers an ein cytotoxisches Agens, ein Toxin oder ein Radiopharmazeutikum; und
- c) Verabreichen des konjugierten monoklonalen Antikörpers in einem geeigneten Träger an einen Human- Lungenkarzinom-Patienten.
31. Immuntherapeutisches Verfahren zur Behandlung von
Tumoren, die das Antigen, definiert durch den Antikörper
L20 auspressen, gekennzeichnet durch,
- a) Reinigen des monoklonalen Antikörpers, der nach dem Verfahren eines der Ansprüche 1, 4, 5, 8 und 10 erzeugten worden ist;
- b) Herstellen von Anti-Idiotypenantikörpern zu dem monoklonalen Antikörper; und
- c) Verabreichen der Anti-Idiotypenantikörper in einem geeigneten Träger an einen Human-Lungenkarzinom- Patienten.
Applications Claiming Priority (1)
Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
---|---|---|---|
US06/834,172 US5185432A (en) | 1986-02-26 | 1986-02-26 | Monoclonal antibodies and antigen for human non-small cell lung carcinoma and other certain human carcinomas |
Publications (1)
Publication Number | Publication Date |
---|---|
DE3705276A1 true DE3705276A1 (de) | 1987-08-27 |
Family
ID=25266276
Family Applications (1)
Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
---|---|---|---|
DE19873705276 Ceased DE3705276A1 (de) | 1986-02-26 | 1987-02-19 | Monoklonale antikoerper und antigen fuer human-nicht-kleinzellen-lungenkarzinom und bestimmte andere human-karzinome |
Country Status (28)
Country | Link |
---|---|
US (1) | US5185432A (de) |
JP (1) | JPS62220197A (de) |
KR (2) | KR900006338B1 (de) |
CN (1) | CN87100927A (de) |
AT (1) | AT400577B (de) |
AU (1) | AU612967B2 (de) |
BE (1) | BE1000611A5 (de) |
CA (1) | CA1312025C (de) |
CH (1) | CH675880A5 (de) |
DD (2) | DD266028A5 (de) |
DE (1) | DE3705276A1 (de) |
DK (1) | DK98187A (de) |
ES (1) | ES2004245A6 (de) |
FI (1) | FI870764A (de) |
FR (1) | FR2596062B1 (de) |
GB (1) | GB2186885B (de) |
GR (1) | GR870294B (de) |
IE (1) | IE60286B1 (de) |
IT (1) | IT1203511B (de) |
LU (1) | LU86786A1 (de) |
NL (1) | NL8700415A (de) |
NO (1) | NO174719C (de) |
NZ (1) | NZ219338A (de) |
OA (1) | OA08485A (de) |
PT (1) | PT84370B (de) |
SE (2) | SE467988B (de) |
YU (1) | YU46189B (de) |
ZA (1) | ZA869494B (de) |
Cited By (1)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
DE19725133A1 (de) * | 1997-06-13 | 1998-12-17 | Micromet Ges Fuer Biomedizinis | Nachweis von seltenen Zellen |
Families Citing this family (21)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
DE3531301A1 (de) * | 1985-09-02 | 1987-03-05 | Behringwerke Ag | Monoklonale antikoerper gegen tumorassoziierte glykoproteine, verfahren zu ihrer herstellung sowie ihre verwendung |
JPH0813840B2 (ja) * | 1987-03-31 | 1996-02-14 | 協和醗酵工業株式会社 | 抗ヒト肺腺癌単クロ−ン性抗体 |
US5134075A (en) * | 1989-02-17 | 1992-07-28 | Oncogen Limited Partnership | Monoclonal antibody to novel antigen associated with human tumors |
US5171665A (en) * | 1989-04-17 | 1992-12-15 | Oncogen | Monoclonal antibody to novel antigen associated with human tumors |
US5342774A (en) * | 1991-05-23 | 1994-08-30 | Ludwig Institute For Cancer Research | Nucleotide sequence encoding the tumor rejection antigen precursor, MAGE-1 |
US5589579A (en) * | 1994-07-19 | 1996-12-31 | Cytoclonal Pharmaceutics, Inc. | Gene sequence and probe for a marker of non-small cell lung carinoma |
DE69831522T2 (de) | 1997-03-03 | 2006-06-14 | Amersham Biosciences Uk Ltd | In-situ Zellextraktion und Assay-Verfahren |
US20050089918A1 (en) * | 1998-02-23 | 2005-04-28 | Amersham Biosciences Uk Limited | In-situ cell extraction and assay method |
US6117981A (en) * | 1999-06-03 | 2000-09-12 | Cytoclonal Pharmaceutics, Inc. | Hybridomas for lung cancer marker and monoclonal antibodies thereof |
AU7337400A (en) * | 1999-09-03 | 2001-04-10 | Human Genome Sciences, Inc. | B7-like polynucleotides, polypeptides, and antibodies |
WO2001094413A2 (en) | 2000-06-06 | 2001-12-13 | Bristol-Myers Squibb Company | B7-related nucleic acids and polypeptides and their uses for immunomodulation |
TWI317285B (en) * | 2000-07-28 | 2009-11-21 | Dainippon Sumitomo Pharma Co | New use and kit for remedies for cancer |
CN101724072B (zh) * | 2008-10-27 | 2013-10-09 | 谷为岳 | 一种抗肿瘤的单克隆抗体的序列及应用 |
GB0916686D0 (en) * | 2009-09-23 | 2009-11-04 | Univ Manchester Metropolitan | Treatment of cancer |
US8802091B2 (en) | 2010-03-04 | 2014-08-12 | Macrogenics, Inc. | Antibodies reactive with B7-H3 and uses thereof |
SG183847A1 (en) | 2010-03-04 | 2012-10-30 | Macrogenics Inc | Antibodies reactive with b7-h3, immunologically active fragments thereof and uses thereof |
CN105424942B (zh) * | 2010-09-17 | 2017-07-18 | 国立研究开发法人产业技术综合研究所 | 肺癌鉴定标志物 |
CN102391992B (zh) * | 2011-11-03 | 2012-08-29 | 潘世扬 | 抗人非小细胞肺癌单克隆抗体及其应用 |
EP3442574A4 (de) | 2016-04-15 | 2019-12-11 | MacroGenics, Inc. | Neuartige b7-h3-bindende moleküle, antikörper-wirkstoff-konjugate davon und verfahren zur verwendung davon |
CN111662371B (zh) * | 2020-04-30 | 2023-07-04 | 美康生物科技股份有限公司 | 细胞角蛋白19片段抗原及其制备方法和应用 |
CN112300284B (zh) * | 2020-12-29 | 2021-04-06 | 慈达(广州)生物技术有限公司 | 核酸筛选结合抗体检测用于癌症检测中的用途及其制备的试剂盒 |
Citations (1)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
EP0125928A2 (de) * | 1983-05-18 | 1984-11-21 | THE UNITED STATES OF AMERICA as represented by the Secretary United States Department of Commerce | Monoklonale Antikörper gegen Lungenkrebs des "nicht-kleine-Zellen"-Typs |
Family Cites Families (2)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
ZA858371B (en) * | 1984-11-02 | 1987-03-25 | Oncogen | Monoclonal antibodies for human non-small cell lung carcinomas |
IL76877A (en) * | 1984-11-02 | 1991-11-21 | Oncogen | Diagnostic method for the determination of human non-small cell lung carcinomas employing novel monoclonal antibodies and compositions containing said antibodies |
-
1986
- 1986-02-26 US US06/834,172 patent/US5185432A/en not_active Expired - Fee Related
- 1986-12-18 ZA ZA869494A patent/ZA869494B/xx unknown
-
1987
- 1987-02-18 GB GB8703700A patent/GB2186885B/en not_active Expired - Fee Related
- 1987-02-19 DE DE19873705276 patent/DE3705276A1/de not_active Ceased
- 1987-02-19 NL NL8700415A patent/NL8700415A/nl not_active Application Discontinuation
- 1987-02-19 NZ NZ219338A patent/NZ219338A/xx unknown
- 1987-02-20 YU YU25787A patent/YU46189B/sh unknown
- 1987-02-23 FR FR878702304A patent/FR2596062B1/fr not_active Expired - Fee Related
- 1987-02-23 GR GR870294A patent/GR870294B/el unknown
- 1987-02-23 FI FI870764A patent/FI870764A/fi not_active Application Discontinuation
- 1987-02-24 LU LU86786A patent/LU86786A1/fr unknown
- 1987-02-24 BE BE8700172A patent/BE1000611A5/fr not_active IP Right Cessation
- 1987-02-25 ES ES8700501A patent/ES2004245A6/es not_active Expired
- 1987-02-25 CH CH714/87A patent/CH675880A5/de not_active IP Right Cessation
- 1987-02-25 JP JP62042467A patent/JPS62220197A/ja active Pending
- 1987-02-25 OA OA59076A patent/OA08485A/xx unknown
- 1987-02-25 DK DK098187A patent/DK98187A/da not_active Application Discontinuation
- 1987-02-25 SE SE8700805A patent/SE467988B/sv not_active Application Discontinuation
- 1987-02-25 IE IE48787A patent/IE60286B1/en not_active IP Right Cessation
- 1987-02-25 IT IT19491/87A patent/IT1203511B/it active
- 1987-02-25 KR KR1019870001623A patent/KR900006338B1/ko not_active Application Discontinuation
- 1987-02-25 DD DD30018987A patent/DD266028A5/de not_active IP Right Cessation
- 1987-02-25 KR KR870001623A patent/KR870008026A/ko not_active IP Right Cessation
- 1987-02-25 NO NO870770A patent/NO174719C/no unknown
- 1987-02-25 DD DD87322420A patent/DD276165A5/de not_active IP Right Cessation
- 1987-02-26 AT AT0043587A patent/AT400577B/de not_active IP Right Cessation
- 1987-02-26 CA CA000530728A patent/CA1312025C/en not_active Expired - Fee Related
- 1987-02-26 AU AU69272/87A patent/AU612967B2/en not_active Ceased
- 1987-02-26 PT PT84370A patent/PT84370B/pt not_active IP Right Cessation
- 1987-03-14 CN CN198787100927A patent/CN87100927A/zh active Pending
-
1992
- 1992-05-14 SE SE9201529A patent/SE9201529D0/xx not_active Application Discontinuation
Patent Citations (1)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
EP0125928A2 (de) * | 1983-05-18 | 1984-11-21 | THE UNITED STATES OF AMERICA as represented by the Secretary United States Department of Commerce | Monoklonale Antikörper gegen Lungenkrebs des "nicht-kleine-Zellen"-Typs |
Cited By (1)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
DE19725133A1 (de) * | 1997-06-13 | 1998-12-17 | Micromet Ges Fuer Biomedizinis | Nachweis von seltenen Zellen |
Also Published As
Similar Documents
Publication | Publication Date | Title |
---|---|---|
AT400577B (de) | Verfahren zur herstellung eines monoklonalen antikörpers und verfahren zum nachweisen von malignen zellen | |
DE3751585T2 (de) | Hybridome, die monoklonale Antikörper gegen neue Mucin-Epitope produzieren. | |
DE3586440T2 (de) | Zur diagnose von menschlichem magen- oder brustkrebs zu verwendender monoklonaler antikoerper. | |
DE3586262T2 (de) | Monoklonale antikoerper und antigen fuer menschliche lungenkarzinome vom nichtkleinen zellentyp. | |
DE3687736T2 (de) | Monoklonale antikoerper gegen humanen brustkrebs, korrespondierende hybridome, deren herstellung und verwendung. | |
DE3888224T2 (de) | Bestimmung vom Tumornekrosefaktor; monoklonaler Antikörper und Zusammensetzung. | |
DE69432926T2 (de) | Humanes carcinoma-antigen (hca), hca antikörper, hca immunoassays, aufzeichnungsmethoden und therapy | |
DE3887675T2 (de) | Antikörper. | |
DE3883803T2 (de) | Monoklonale Antikörper gegen melanoma-assoziierte Antigene, Hybridzellinien, die diese Antikörper produzieren, und ihre Verwendung. | |
DE3686187T2 (de) | Monoklonale choriokarzinom-antikoerper und antikoerpergarnitur. | |
DE3783277T2 (de) | Monoklonaler antikoerper gegen humanes lungenkarzinom. | |
DE69306803T2 (de) | Kleinzelliger lungenkarzinom-spezifischer antikörper und antigenen | |
EP0480440B1 (de) | Monoklonale Antikörper gegen Melanom | |
DE3855201T2 (de) | Monokonaler antikörper, spezifisch für ein neues epitop des lfa-1-antigens aus menschlichen t-lymphozyten | |
DE3587976T2 (de) | Monoklonale antikörper und antigene für menschliche lungenkarzinome vom typ der nichtkleinen zellen. | |
DE69031313T2 (de) | Monoklonaler antikörper, der zwischen helfer-inducer- und supressor-inducer-cd4+lymphozyten unterscheidet | |
DE3789781T2 (de) | Antigene, Antikörper und Verfahren zur Identifizierung humaner metastatischer Tumoren und Zellinien zur Herstellung dieser Antikörper. | |
DE3687014T2 (de) | Zum erkennen von tumoren faehige klonierte t-zelle und ein t-zellen-antigenrezeptor. | |
DE3780480T2 (de) | Test fuer menschlichen brustkrebs. | |
DE3689948T2 (de) | Monoklonale antikörper und testverfahren. | |
DE3688638T2 (de) | Monoklonale Antikörper für humane Lungenkarzinome des "Nicht-kleine-Zellen"-Typs. | |
DE69633976T2 (de) | Monoklonale antikörper und antigene mit bezug zum menschlichen lungenadenokarzinom und immunoassay-verfahren unter verwendung desselben | |
DE69434024T2 (de) | Auf humanen cortikalen thymozyten exprimierte oberflächenproteine und ihre verwendung | |
DE3785795T2 (de) | Monoklonale anti-menschliche magenkrebs-antikoerper. | |
DE3850993T2 (de) | Monoklonaler Antikörper spezifisch gegen humane Pankreas-Phospholipase-A2. |
Legal Events
Date | Code | Title | Description |
---|---|---|---|
8110 | Request for examination paragraph 44 | ||
8125 | Change of the main classification |
Ipc: C12N 5/12 |
|
8125 | Change of the main classification |
Ipc: C12N 5/12 |
|
8131 | Rejection |