-
Die vorliegende Erfindung betrifft einen monoclonalen
Antikörper gegen menschliches Lungencarcinom, der zur
pathologischen und serologischen Diagnose von Lungenkrebs nützlich
ist.
-
Kürzlich wurden monoclonale Antikörper beschrieben, die
befähigt sind, mit verschiedenen menschlichen Krebsarten,
einschließlich Lungenkrebs, spezifisch zu reagieren, vgl. z.B.
Cancer Res. 42 (1982), 150; Cancer Res. 42 (1982), 3187; J.
Surgical Res. 30 (1981), 403; Transplantation Proced. XIII (4)
(1981), 1942; J. Immunol. 131, (1), (1983), 497; Abstracts of
Papers, Japan Society of Immunology, S. 212 (Abstract Nr.
107), (1983); Cancer Res. 46 (1986), 4438, und Cancer Res. 47
(1987), 1267. Darüberhinaus sind monoclonale Antikörper
bekannt, die für mehr als einen Lungenkrebstyp spezifisch
sind, vgl. z.B. EP-A-0156578, worin monoclonale Antikörper
beschrieben werden, die befähigt sind, mit
Lungen-Plattenepithelcarcinom-Gewebe, Lungen-Adenocarcinom-Gewebe und
fetalen Lungenzellen zu reagieren, und EP-A-0232871
(veröffentlicht nach dem Prioritätstag der vorliegenden
Erfindung), worin monoclonale Antikörper beschrieben werden,
die befähigt sind, mit Lungen-Plattenepithelcarcinom, Lungen-
Adenocarcinom und großzelligem Lungencarcinom, nicht aber mit
kleinzelligem Lungencarcinom zu reagieren. Die relativen
Reaktivitäten sind jedoch in keinem Fall angegeben.
-
Die vorliegende Erfindung stellt dagegen monoclonale
Antikörper bereit, die mit kleinzelligem Carcinom nicht reaktiv
sind, die jedoch befähigt sind, gleichermaßen mit den drei
Gewebetypen des menschlichen Lungenkrebses zu reagieren, d.h.
dem Plattenepithelcarcinom, dem Adenocarcinom und dem
großzelligen Carcinom. Solche Antikörper sind für die Diagnose von
Lungenkrebs besonders nützlich.
-
Erfindungsgemäß wurde ein monoclonaler Antikörper gegen
menschlichen Lungenkrebs produziert, der befähigt ist, mit
menschlichem Plattenepithelcarcinom, Lungen-Adenocarcinom und
großzelligem Lungencarcinom mit hoher Frequenz zu reagieren,
der jedoch nicht-reaktiv ist mit menschlichem kleinzelligem
Lungencarcinom und normalen menschlichen Lungenzellen. Der
betreffende Antikörper ist befähigt, Glycoproteine all Antigen
zu erkennen, und zählt zur IgM-Klasse. Daher ist der
Antikörper zum Nachweis von Lungen-Plattenepithelcarcinom, Lungen-
Adenocarcinom und großzelligem Lungencarcinom nützlich und
kann für die pathologische, serologische und
Pleuraerguß-Diagnose solcher Erebstypen verwendet werden. Der Antikörper wird
durch die nachstehend beschriebene Hybridomzellinie SLC-454
produziert, die unter dem Budapester Vertrag bei der "European
Collection of Animal Cell Cultures", Großbritannien, am 3.
Juli 1986 unter der ECACC-Hinterlegungsnummer 86070306
hinterlegt worden ist.
-
Nachstehend wird ein ausführliches Protokoll zur
Produktion der erfindungsgemäßen Antikörper wiedergegeben:
(1) Immunisierung und Herstellung von
Antikörper-produzierenden Zellen
-
Mäuse im Alter von 3 bis 10 Wochen, vorzugsweise 8
Wochen, werden mit menschlichen Lungen-Plattenepithelcarcinom-
Zellen, -Gewebeproben oder Membranfraktionen immunisiert, um
die Erzeugung von Antikörper-produzierenden Zellen in der
Milz, in den Lymphknoten und im peripheren Blut von
immunisierten Mäusen zu induzieren. Vorzugsweise sollten Mäuse
verwendet werden, die infolge einer Vorbehandlung mit normalen
menschlichen Lungenzellen immunologisch tolerant gemacht
worden sind. Die Immunisierung wird im allgemeinen durchgeführt,
indem menschliche Lungen-Plattenepithelcarcinom-Zellen (10&sup6;
bis 10&sup7; Zellen pro Tier), menschliches
Lungen-Plattenepithelcarcinom-Gewebe oder aus einem solchen Gewebe stammende
Kernbranbruchstücke (10 bis 500 ug pro Tier) zusammen mit einem
geeigneten Adjuvans (z.B. vollständigem Freundschem Adjuvans
oder Aluminiumhydroxidgel plus B. pertussis-Impfstoff) den
Tieren subcutan, intravenös oder intraperitoneal verabreicht
wird. Danach wird die Antigenverabreichung ohne ein Adjuvans
zwei- bis fünfmal in ein- bis zweiwöchigen Abständen
wiederholt. Drei bis sieben Tage nach jeder Immunisierung
werden Blutproben aus dem Venengeflecht des Augenhintergrundes
genommen und das Serum jeder Probe beispielsweise mit dem
nachstehend dargestellten Enzym-Immuntest-Verfahren ["Enzyme-
linked Immunosorbent Assay" (ELISA), veröffentlicht von Igaku
Shoin, Tokyo, 1976] daraufhin getestet, ob es mit menschlichem
Lungen-Plattenepithelcarcinom reagiert.
-
Die normalen menschlichen Gewebe und die Tumorgewebe, die
zur Vorbehandlung und Immunisierung verwendet werden, können
aus Autopsien oder Operationen erhalten werden. Die
Gewebeproben werden sofort eingefroren und bei -80ºC gelagert. Zum
Erhalt einer Suspension von Bruchstücken dieser Gewebeproben
werden sie bei 4ºC in PBS, enthaltend 1 mM
Phenylmethylsulfonylfluorid, aufgetaut. Nach Zerkleinerung werden die
Gewebezellen mit einer Ultra-Dispergierapparatur (LK-21;
Yamato, Tokyo, Japan) aufgebrochen und mit einem Teflon-Glas-
Homogenisator (Teflon ist ein eingetragenes Warenzeichen)
homogenisiert. Das Homogenisat wird bei 100 000 x g
zentrifugiert und anschließend das Pellet mit 1 mg Protein in 1 ml PBS
resuspendiert und bei -80ºC gelagert.
Enzym-Immuntest (EIA)-Verfahren
-
Suspensionen, umfassend Membranbruchstücke von normalen
oder Tumor-Zellen oder -Geweben, die 10 bis 1 000 ug Protein
pro ml enthalten, werden zuerst in Vertiefungen einer EIA-
Platte mit 96 Vertiefungen (Produkt von Flow Laboratories)
verteilt (100 bis 200 ul pro Vertiefung). Nachdem die
Suspensionen in den Vertiefungen über Nacht bis zu zwei Nächte
bei 4ºC stehen gelassen wurden, wird der Uberstand aus jeder
Vertiefung entfernt und jede Vertiefung mit entionisiertem
Wasser oder Phosphat-gepufferter Kochsalzlösung (PBS; 1,83 g
Dinatriumphosphat, 0,21 g Monokaliumphosphat und 7,65 g
Natriumchlorid pro Liter destilliertem Wasser, pH 7,2)
gründlich gewaschen. Anschließend wird 1% BSA(Rinderserumalbumin)-
PBS in die Vertiefungen verteilt (100 bis 200 ul pro
Vertiefung), wodurch die auf der Platte verbliebenen
Proteinbindungsstellen blockiert werden, indem man die Kultur über
Nacht bis zu zwei Nächte bei 4ºC stehen läßt. Nach Abgießen
der BSA-PBS werden die Vertiefungen gründlich mit
entionisiertem Wasser oder PBS gewaschen. Sodann werden Proben (Maus-
Seren, Hybridomkultur-Überstände oder grob gereinigte
monoclonale Antikörper; jeweils als der erste Antikörper) mit BSA-
PBS verdünnt und die Verdünnungen in die Vertiefungen verteilt
(100 ul pro Verteifung), anschließend werden sie über Nacht
bei 4ºC stehengelassen. Nachdem die Vertiefungen einmal mit
entionisiertem Wasser und sodann sechsmal mit 2 M NaCl-Lösung
gewaschen wurden, wird eine 100-fache Verdünnung des
Kaninchen-Anti-Maus-Immunglobulin-IgG-Peroxidasekonjugats
(hergestellt von DAKO und vertrieben von Kyowa Medex;
verwendet als der zweite Antikörper) in die Vertiefungen verteilt
(100 ul pro Vertiefung). Sodann wird die Platte zwei Stunden
bei Raumtemperatur stehengelassen.
-
Nach gründlichem Waschen mit PBS wird eine
ABTS-Substratlösung [hergestellt durch Lösen von 550 mg des
Diammoniumsalzes der 2,2'-Azinobis(3-ethylbenzothiazolin-6-sulfonsäure)
in 1 Liter 0,1 M Citratpuffer (pH 4,2) und unmittelbar vor
Verwendung Zugabe von Wasserstoffperoxid bis zu einer
Konzentration von 1 ul/ml] hinzugefügt und die entwickelte Farbe
mittels der Absorbanz OD415nm gemessen. Diejenigen Mäuse,
deren Proben mit den Lungen-Plattenepithelcarcinom-Zellen,
-Geweben oder Membranpräparaten stark reagieren, werden als
die mit menschlichem Lungen-Plattenepithelcarcinom
immunisierten Mäuse, d.h. als Quelle für die Lieferung von
Antikörper-produzierenden Zellen zur Hybridomherstellung verwendet.
-
Wenn bei Durchführung des Enzym-Immuntests Zellen als
solche als Antigen verwendet werden, werden die Zielzellen auf
einer Falcon 3072-Platte gezüchtet, sodann wird 0,25%
Glutaraldehyd-PBS hinzugefügt und die Platte nach ein- bis
zweistündigem Stehenlassen bei Raumtemperatur gründlich mit PBS
gewaschen. Sodann werden 100 bis 200 ul 1% BSA-PBS pro Vertiefung
hinzugefügt und die Platte nach zweistündigem Stehenlassen mit
entionisiertem Wasser oder PBS gründlich gewaschen und einer
Antikörpertiter-Bestimmung unterworfen, die auf die gleiche
Art und Weise wie bei Verwendung einer gewöhnlichen, mit
Antigen beschichteten Platte durchgeführt wird.
-
Zur Durchführung der Zellfusion werden menschliche
Lungen-Plattenepithelcarcinom-Zellen, -Gewebeproben oder
Membranpräparate den immunisierten Mäusen in einer Dosis von 2 bis 5
x 10&sup6; Zellen pro Tier oder 20 bis 400 ug pro Tier drei bis
vier Tage vor der Fusionsbehandlung intraperitoneal
verabreicht. Die Milz wird entfernt, in MEM (Produkt von Nissui
Pharmaceuticals) in Stücke geschnitten, mit einer Pinzette
zerkleinert und fünf Minuten bei 1 200 UpM zentrifugiert. Der
Überstand wird verworfen und das Sediment ein bis zwei Minuten
mit Tris-Ammoniumchlorid-Puffer (pH 7,65) behandelt, um
vorliegende Erythrocyten zu entfernen. Die Erythrocyten-freien
Zellen werden sodann dreimal mit MEM gewaschen und sind danach
gebrauchsfertig für das Fusionsverfahren zur Erzeugung von
Hybridomen.
(2) Herstellung von Myelomzellen
-
Eine von der Maus stammende, bestehende Myelomzellinie
wird verwendet. Beispiele solcher Zellinien, die verwendet
werden können, umfassen die 8-Azaguanin-resistenten Maus (von
Balb/c stammenden)-Myelomzellinien P3-X63Ag8-U1 (P3-U1)
[Current Topics in Microbiology and Immunology-1], P3-NSI/ 1-
Ag4.1 (NS-1) [European J. Immunology 6 (1976), 511-519],
SP2/0-Ag14 (SP-2) [Nature 276 (1978), 269-270], P3-X63-Ag8 653
(653) [J. Immunology 123 (1979), 1548-1550] und P3-X63-Ag8
(X63) [Nature 256 (1975), 495-497]. Diese Zellinien werden in
8-Azaguanin-Medium gezüchtet [normales Medium, hergestellt,
indem RPMI-1640-Medium mit Glutamin (1,5 mM),
2-Mercaptoethanol (5 x 10&supmin;&sup5; M), Gentamycin (10 ug/ml), und fetalem
Kälberserum (FCS; hergestellt von CSL) (10%) versetzt und außerdem
mit 8-Azaguanin (15 ug/ml) angereichert wird). Die Zellinie
für die Zellfusion sollte drei bis vier Tage vor der Fusion
auf normales Medium überführt werden, um zur Zeit der
Zellfusion eine Zellzahl von nicht weniger als 2 x 10&sup7;
sicherzustellen.
(3) Zellfusion
-
Die wie in (1) erhaltenen immunisierten Splenocyten und
die in (2) erhaltenen Myelomzellen werden mit MEM oder PBS
gewaschen und in einem Zellzahlverhältnis von Splenocyten :
Myelomzellen im Bereich von 5:1 bis 10:1 gemischt, sodann wird
das Gemisch zentrifugiert (1200 UpM, 5 minuten). Der Überstand
wird verworfen und das Zellsediment aufgebrochen. Unter Rühren
wird bei 37ºC ein Gemisch aus 2 g Polyethylenglycol 1000 (PEG-
1000), 2 ml MEM und 0,7 ml Dimethylsulfoxid in einer Menge 0,2
bis 1 ml pro 10³ Splenocyten hinzugefügt, sodann wird nach
mehreren Zugaben von 1 bis 2 ml MEM in Abständen von 1 bis 2
Minuten MEM bis zum Erhalt eines Volumens von insgesamt 50 ml
zugefügt. Nach Zentrifugation (900 UpM, 5 Minuten) wird der
Überstand verworfen und das Zellsediment vorsichtig
aufgebrochen. Die Zellen werden mit 100 ml normalem Medium
(RPMI-1640 mit 10% FCS) versetzt und im Medium durch leichtes
Rühren suspendiert.
-
Die erhaltene Suspension wird in Portionen zu je 1 ml in
die Vertiefungen einer Inkubationsplatte mit 24 Vertiefungen
verteilt. Die Inkubation wird 24 Stunden bei 37ºC in einem 5%
CO&sub2;-Inkubator durchgeführt. HAT-Medium [normales Medium,
angereichert mit Hypoxanthin (10&supmin;&sup4; M), Thymidin (1,5 x 10&supmin;&sup5; M) und
Aminopterin (4 x 10&supmin;&sup7; M)) wird zur Inkubationsplatte zugefügt
(1 ml pro Vertiefung) und die Inkubation weitere 24 Stunden
durchgeführt. Danach wird zwei Tage lang im Abstand von 24
Stunden 1 ml des Kulturüberstandes verworfen und das gleiche
Volumen frisches HAT-Medium hinzugefügt. Die Inkubation im
CO&sub2;-Inkubator bei 37ºC wird 10 bis 14 Tage fortgesetzt.
-
In denjenigen Vertiefungen, in denen gewachsene
fusionierte koloniebildende Zellen gefunden werden, wird 1 ml des
Überstandes verworfen und das gleiche Volumen HT-Medium (HAT-
Medium minus Aminopterin) zugefügt, sodann wird zwei Tage lang
im Abstand von 2 Stunden das Medium durch frische Portionen
HT-Medium ersetzt.
-
Nach drei bis vier Tagen Züchtung in HT-Medium wird eine
Portion Kulturüberstand abgenommen und mit dem vorstehend
erwähnten Enzym-Immuntest-Verfahren auf Antikörpertiter gegen
menschliches Lungencarcinom getestet. Gleichzeitig werden auch
die Reaktivitäten mit normalen menschlichen Zellen oder
Geweben und Membranpräparaten davon u.a. durch ein ähnliches
Verfahren bestimmt und diejenigen Vertiefungen ausgewählt, bei
denen eine selektive Reaktivität mit menschlichen
Lungencarcinom-Zellen oder -Geweben oder Membranpräparaten davon
beobachtet
wird. Bei Vertiefungen, die eine starke Reaktivität mit
menschlichen Lungencarcinom-Zellen oder -Geweben oder
Membranpräparaten davon, jedoch keine Reaktivität mit normalen
menschlichen Zellen oder Geweben oder Membranpräparationen
davon u.a. zeigen, wird die Clonierung mittels limitierendem
Verdünnungsverfahren zweimal wiederholt. Auf diese Weise
werden diejenigen Clone, für die hohe Antikörpertiterwerte gegen
menschliche Lungencarcinom-Zellen oder -Gewebe oder
Membranpräparate davon stabil erhältlich sind, als diejenigen
Hybridomzellinien ausgewählt, welche monoclonale Antikörper gegen
menschliches Lungencarcinom produzieren.
(4) Herstellung von monoclonalen Antikörpern
-
Weibliche, nackte Balb/c-Mäuse im Alter von acht bis zehn
Wochen, die mit Pristan behandelt wurden [intraperitoneale
Verabreichung von 0,5 ml 2,6,10,14-Tetramethylpentadecan
(Pristan) und ein bis zwei Wochen Fütterung], erhalten
intraperitoneale Injektionen mit den im vorstehenden Verfahren (3)
erhaltenen Hybridomzellen, die monoclonale Antikörper gegen
menschliches Lungencarcinom produzieren, in einer Dosierung
von 2 bis 4 x 10&sup6; Zellen pro Tier. Innerhalb von 10 bis 21
Tagen erzeugen die Hybridomzellen in den Mäusen
Ascitescarcinome. Die Ascitesflüssigkeit wird gesammelt, zur
Entfernung von Feststoffen zentrifugiert (3000 UpM, 5
Minuten), dem Aussalzen mit 50% Ammoniumsulfat unterworfen,
gegen einen mit NaCl (0,5 M) angereicherten Phosphatpuffer
dialysiert und mit einer Durchflußgeschwindigkeit von 15
ml/Stunde durch eine mit Sephacryl S-300 (Produkt von
Pharmacia Fine Chemical) gefüllte Säule (Bettvolumen 750 ml)
geleitet. Eine IgM-Fraktion wird gesammelt und als gereinigter
monoclonaler Antikörper verwendet.
-
Der Antikörper-Isotyp wird nach dem Ouchterlony-Verfahren
bestimmt (doppelte Immundiffusion) [Seibutsukagaku Jikkenho
(Methods in Experimental Biochemistry), Bd. 15, Introduction
to Experimental Immunology, S. 74, Gakkai Shuppan Center,
1981].
-
Die Proteinmenge wird nach dem Folin-Verfahren bestimmt
und anschließend aufgrund der Absorption bei 280 nm berechnet
[1,4 (OD&sub2;&sub8;&sub0;) entspricht etwa 1 mg Immunglobulin pro ml].
-
Die auf diese Weise erhaltenen monoclonalen Antikörper
werden auf Kennzeichen der Spezifität untersucht, wobei (1)
die Reaktivität mit normalen oder Tumorgeweben und
Membranfraktionen davon, die aus verschiedenen menschlichen Organen
stammen, welche von einer Vielzahl von Patienten erhalten
wurden, (2) die Reaktivität mit verschiedenen normalen
menschlichen oder Tumor-Zellinien oder menschlichen fetalen
Zellinien und daraus stammenden Membranpräparaten, (3) die
Reaktivität mit dem bis jetzt bekannten carcinoembryonalen Antigen
(z.B., CEA) und (4) die Reaktivität mit Seren, die von
normalen Individuen und von Patienten stammen, und dgl., durch ein
geeignetes Testverfahren bestimmt wird, z.B. durch das Enzym-
Immuntest-Verfahren, das Fluoreszenz-Antikörper-Verfahren, das
immunhistochemische Färbeverfahren (ABC-Verfahren) usw..
Diejenigen monoclonalen Antikörper werden ausgewählt, die nur mit
menschlichem Lungencarcinom reagieren und in den vorstehend
angegebenen Tests keine Reaktivität zeigen.
-
Man nimmt an, daß die auf diese Weise erhaltenen
monoclonalen Antikörper, die mit menschlichem Lungencarcinom
spezifisch reagieren, bei der Diagnose von Lungencarcinom durch
serologische Untersuchung, histologische Untersuchung,
bildliches Darstellen usw., oder bei der Behandlung von
Lungencarcinom nützlich sind, umfassend die Verabreichung der Antikörper
wie sie sind oder in Form der sogenannten Immuntoxine, d.h.
Konjugate mit Antikrebsmitteln oder Toxinen, an
Krebspatienten. Man vermutet ferner, daß diese tumorspezifischen
monoclonalen Antikörper, wenn sie in Affinitätssäulen eingesetzt
werden, zur Reinigung von tumorspezifischen Antigenen, zur
Analyse solcher Antigene und außerdem zur Entwicklung von
Impfstoffen gegen Lungencarcinom verwendet werden könnten.
(5) Immunhistochemisches Färbeverfahren (ABC-Verfahren)
-
Das folgende Verfahren wird gemäß dem nachstehend
beschriebenen Immuno-Peroxidase-Test durchgeführt, wobei ein
Vectastain ABC-Kit (Produkt von Vector Laboratories,
Burlingame, California) verwendet wird.
-
Die mit Formalin fixierten und in Paraffin eingebetteten,
unter Verwendung eines Mikrotoms auf eine Dicke von 5 um
geschnittenen Gewebeschnitte werden auf einen mit Eiweißalbumin
beschichteten Glasobjektträger aufgebracht, in Xylol entwachst
und nach und nach mit Alkohol/Wasser hydratisiert.
-
Nach fünfminütigem Waschen mit entionisiertem Wasser wird
die endogene Peroxidase durch dreißigminütiges Eintauchen in
0,3% (Gew./Vol.) Wasserstoffperoxid in absolutem Methanol bei
Raumtemperatur blockiert. Die Schnitte werden 20 Minuten mit
einem Phosphatpuffer gewaschen und 20 Minuten bei
Raumtemperatur mit verdünntem normalem Pferdeserum inkubiert. Das
überschüssige Serum wird abgesaugt und SLC-454 (20 ug/ml) als der
erste Antikörper zugefügt. Der Glasobjektträger wird 30
Minuten bei Raumtemperatur stehengelassen und sodann mit PBS
gewaschen. Ein biotinylierter Anti-Maus-Immunglobulin-Antikörper
vom Pferd wird zu den Schnitten hinzugefügt und der
Glasobjektträger 30 Minuten stehengelassen und anschließend
mit PBS gewaschen.
-
Sodann wird eine Avidin-Biotin-Peroxidase (ABC-Reagens)
zu den Schnitten zugegeben und das Ganze 30 Minuten
stehengelassen und anschließend mit PBS gewaschen. Danach werden die
Schnitte 2 Minuten in einer Peroxidase-Substratlösung (Gemisch
aus 0,02% Wasserstoffperoxid und 0,1%
Diaminobenzidin-Tetrahydrochlorid in 0,1 M Tris-HCl-Puffer, pH 7,2) inkubiert, die
Reaktion wird gestoppt, indem der Glasobjektträger in
eiskaltes Wasser getaucht wird. Die Schnitte werden mit Hämatoxylin
kontrastgefärbt, in wässerigem Alkohol und Xylol entwässert
und in Canada-Balsam eingebettet [Rinshokensa 28 (1984), 353].
(6) Serumdiagnose von Lungencarcinom
-
Die Serumdiagnose wird folgendermaßen durchgeführt:
-
Ein erstes Antikörperpräparat (10 bis 100 ug/ml) wird in
die Vertiefungen einer EIA-Platte mit 96 Vertiefungen verteilt
(50 bis 200 ul pro Vertiefung). Die Platte wird bei 4ºC über
Nacht bis zu zwei Nächte oder bei Raumtemperatur zwei bis vier
Stunden stehengelassen. Nach Waschen mit PBS werden in jede
Vertiefung 200 ul BSA-PBS hinzugefügt, anschließend wird die
Platte über Nacht bei 4ºC oder zwei bis drei Stunden bei
Raumtemperatur stehengelassen. Sodann wird die Platte gründlich
mit PBS gewaschen und in jede Vertiefung 50 bis 100 ul einer
1- bis 100-fachen Verdünnung einer Serumprobe hinzugefügt.
Nach Stehenlassen der Platte über Nacht bei 4ºC oder zwei
Stunden bei Raumtemperatur wird sie gründlich mit PBS
gewaschen. Anschließend wird in die Vertiefungen ein mit Biotin
oder Peroxidase markierter zweiter Antikörper (10 bis 100
ug/ul) zugegeben (50 bis 100 ul pro Vertiefung) und die Platte
wiederum über Nacht bei 4ºC oder zwei bis vier Stunden bei
Raumtemperatur stehengelassen. Wenn ein Biotin-markierter
Antikörper als der zweite Antikörper verwendet wird, wird die
Platte gründlich mit PBS gewaschen, sodann
Avidin-Blotin-Peroxidase (10 ug/ul) in die Vertiefungen hinzugefügt (50 bis 100
ul pro Vertiefung) und die Platte 30 Minuten bei
Raumtemperatur stehengelassen und anschließend gründlich mit PBS
gewaschen. Sodann wird als Substratlösung eine ABTS-Substratlösung
in einer Menge von 50 bis 100 ul pro Vertiefung zugefügt. Nach
zehn- bis zwanzigminütigem Stehenlassen bei Raumtemperatur
wird die Reaktion beendet, indem eine 5% SDS-Lösung in einer
Menge von 50 bis 100 ul pro Vertiefung zugegeben wird. Der
OD&sub4;&sub1;&sub5;-Wert wird für jede Vertiefung gemessen und die
Antigenmenge in der Serumprobe aufgrund der Intensität der
entwickelten Farbe berechnet. Durch Vergleichen der Antigenspiegel in
den Seren von gesunden Individuen und derjenigen in den Seren
von Patienten mit Lungencarcinom wird ein Normalbereich des
Spiegels definiert. Wenn der betreffende Spiegel einen solchen
vorher bestimmten Bereich übersteigt, wird der Test auf
Lungencarcinom als positiv eingestuft.
(7) Antigenanalyse
-
Bei Durchführung des Immuntests, der immunhistochemischen
Färbung oder Serumdiagnose, die vorstehend erwähnt sind,
werden die Antigene
(Lungen-Plattenepithelcarcinom-Membranpräparate, gezüchtete Lungencarcinom-Zellinien, Lungenkrebs-Gewebe)
mit Reagentien, wie z.B. Enzymen (z.B. Neuraminidase,
Protease) und Natriumperjodat, vorbehandelt und sodann mit den
monoclonalen Antikörpern umgesetzt. Wenn man anschließend die
unterschiedlichen Reaktivitäten vergleicht, welche die
Originalantigene ohne eine solche Vorbehandlung und die in der
vorstehenden Art und Weise vorbehandelten Antigene mit den
monoclonalen Antikörpern aufweisen, kann man die chemische
Beschaffenheit der antigenen Stellen zeigen, welche von den
monoclonalen Antikörpern erkannt werden. Das heißt, falls die
Antigenität bei Behandlung mit Neuraminidase verschwindet,
kann man annehmen, daß Sialinsäuren mit den antigenen
Determinanten in Zusammenhang stehen. Falls die Antigenität bei
Behandlung mit Protease verschwindet, kann man annehmen, daß
Proteine mit den antigenen Determinanten in Zusammenhang
stehen. Falls die Antigenität bei Behandlung mit Natriumperjodat
verschwindet, stehen vermutlich Zuckerketten mit den antigenen
Determinanten in Zusammenhang.
(8) Beurteilung mittels kompetetivem Bindungs-Hemmungs-Test,
ob SLC-454 sich von den bekannten Krebsmarkern
unterscheidet oder nicht
-
Die auf eine EIA-Platte beschichteten
Lungencarcinom-Membranpräparate werden mit 1% BSA-Lösung blockiert und mit
seriellen Verdünnungen von SLC-454, Kaninchen-Anti-CEA-Antikörper,
Kaninchen-Anti-AFP-Antikörper und
Kaninchen-Anti-β&sub2;-Microglobulin-Antikörper versetzt. Nach Stehenlassen über Nacht bei
4ºC wird die Platte gründlich mit PBS gewaschen. Sodann wird
Biotin-markierter SLC-454 hinzugefügt und die Platte drei bis
vier Stunden bei Raumtemperatur stehengelassen. Nach Waschen
wird Avidin-Biotin-Peroxidase (Vectastain ABC Immunoperoxidase
Staining Kit; Produkt von Vector) zugegeben und die Platte
eine Stunde bei Raumtemperatur stehengelassen. Anschließend
wird eine ABTS-Substratlösung zugefügt und für jede Vertiefung
die Absorption bei 415 nm gemessen.
-
Wenn der erste Antikörper das gleiche Antigen (Epitop)
erkennt, das SLC-454 erkennt, dann ist die Bindungsstelle des
als zweiter Antikörper eingesetzten Biotin-markierten SLC-454
durch den ersten Antikörper besetzt, aus diesem Grund kann der
zweite Antikörper nicht an das Antigen gebunden werden und die
Entwicklung der Farbe wird verhindert. Wenn dagegen im
vorstehenden Verfahren die Bindung des zweiten Antikörpers
(Biotin-markierter SLC-454) nicht durch den ersten Antikörper
verhindert wird, kann man demgemäß vermuten, daß SLC-454 ein
anderes Antigen als der erste Antikörper erkennt.
-
Die Herstellung und die Eigenschaften des
erfindungsgemäßen monoclonalen Antikörpers werden in den nachstehenden
Beispielen und den begleitenden Zeichungen ausführlicher
beschrieben und erläutert, wobei:
-
in Figur 1 ein Streuungsbild dargestellt ist, das die
Ergebnisse von Serumdiagnosen auf Lungencarcinom unter
Verwendung des monoclonalen Antikörpers SLC-454 zeigt;
-
in Figur 2 die Analysenergebnisse der Antigene graphisch
dargestellt sind, die vom monoclonalen Antikörper SLC-454
erkannt werden.
-
In Figur 2 werden die Symbole folgendermaßen verwendet:
-
für Behandlung mit 0,1 E/ml Neuraminidase,
-
Δ für Behandlung mit 0,1 E/ml α-L-Fucosidase,
-
für Behandlung mit 0,25% Trypsin,
-
für Behandlung mit 10 E/ml Protease,
-
für Behandlung mit 50 nM NaIO&sub4; und
-
× für keine Behandlung.
-
Figur 3 ist eine graphische Darstellung, die zeigt, ob
die Bindungsaktivität des monoclonalen Antikörpers SLC-454
durch bekannte Tumormarker gehemmt wird oder nicht.
-
In Figur 3 werden die Symbole folgendermaßen verwendet:
-
Δ für SLC-454,
-
für Kaninchen-Anti-CEA-Antikörper,
-
für Kaninchen-Anti-AFP-Antikörper und
-
für Kaninchen-Anti-Beta&sub2;-Microglobulin-Antikörper.
Beispiel 1
(1) Herstellung von Antikörper-produzierenden Zellen
-
Membranpräparate von normalem menschlichem Lungengewebe
wurden neugeborenen (Balb/c x C57BL/6)F&sub1;-Mäusen innerhalb von
24 Stunden nach der Geburt in einer Dosierung von 100 ug
Protein pro Tier intravenös verabreicht. Nach einem Zeitraum von
8 Wochen erhielten die Mäuse intraperitoneale Verabreichungen
von Membranpräparaten von menschlichem
Lungen-Plattenepithelcarcinom (100 ug Protein pro Tier) zusammen mit
Aluminiumhydroxidgel (2 mg pro Tier) und abgetötetem B.
pertussis-Impfstoff (1 x 10&sup9; pro Tier), darauf folgten 3 bis 5
Immunisierungen mit dem gleichen Antigen aber ohne Adjuvans in einer
Dosierung von 100 ug pro Tier, bezogen auf Protein, in Abständen
von ein bis zwei Wochen. Von diesen immunisierten Mäusen
wurden diejenigen Mäuse als immunisierte Mäuse ausgewählt, deren
Antisera mit menschlichen Lungencarcinom-Zellen oder -Geweben
oder davon hergeleiteten Membranpräparaten stark reagierten,
sodann wurden Milzzellen dieser Mäuse präpariert und der
Zellfusion unterworfen.
(2) Herstellung von Myelomzellen
-
Die 8-Azaguanin-resistente Mausmyelom-Zellinie P3-U1
wurde in normalem Medium entsprechend gezüchtet, daß zur Zeit
der Zellfusion nicht weniger als 2 x 10&sup7; Zellen vorlagen, und
als ein Elterstamm der Zellfusion unterworfen.
(3) Hybridom-Herstellung
-
Die in (1) bzw. (2) erhaltenen Milzzellen und
Myelomzellen wurden in einem Verhältnis von 5:1 verwendet und der
Fusion unterworfen, wobei das vorstehend erwähnte Verfahren
angewendet wurde. Nach 14-tägiger Züchtung in HAT-Medium bei
37ºC unter 5% CO&sub2; wurden die fusionierten Zellen in HAT-Medium
selektiert und nach Wechsel des Mediums auf HT-Medium weiter
gezüchtet. Aufgrund der Ergebnisse der Bestimmung der
Antikörpertiter gegen menschliches Lungencarcinom wurden aktive
Vertiefungen ausgewählt und nach Wechsel des Mediums auf normales
Medium die Clonierung zweimal wiederholt. Auf diese Weise
wurde die Hybridomzellinie SLC-454 ausgewählt, die keine
Reaktivität mit normalen menschlichen Zellen oder Geweben oder
anderen Krebstypen aufweist, die aber eine spezifische
Reaktivität mit menschlichem Lungencarcinom aufweist, was durch
verschiedene Testverfahren bestimmt wurde.
(4) Reinigung der monoclonalen Antikörper
-
Mit Pristan behandelte, nackte, weibliche Balb/c-Mäuse im
Alter von 8 Wochen erhielten intraperitoneale Injektionen der
in (3) erhaltenen Hybridomzellinie SLC-454 in einer Dosierung
von 4 x 10&sup6; Zellen pro Tier. Innerhalb von 10 bis 21 Tagen
erzeugten die Hybridome Ascitescarcinome. Ascitesflüssigkeit
wurde von den die Ascitesflüssigkeit enthaltenden Mäusen (5
bis 10 ml pro Tier) gesammelt, durch Zentrifugation (3000 UpM,
5 Minuten) von Feststoffen gereinigt, einem Aussalzen mit 50%
Ammoniumsulfat unterworfen, gegen PBS, angereichert mit NaCl
(0,5 M), dialysiert und mit einer Durchflußgeschwindigkeit von
15 ml pro Stunde durch eine mit Sephacryl S-300 (Produkt von
Pharmacia Fine Chermcal) gefüllte Säule (Bettvolumen 750 ml)
geleitet. Eine IgM-Fraktion wurde gesammelt und als
gereinigter Antikörper verwendet.
(5) Spezifität von SLC-454
-
Die Reaktionsspezifität des auf diese Weise erhaltenen,
gegen Lungencarcinom spezifischen, monoclonalen Antikörpers
SLC-454 ist in Tabelle 1 dargestellt.
Tabelle 1
Ziel
Antikörper SLC-454 Anzahl der positiven
Ergebnisse zu Testproben insgesamt
Affinitätsanalyse (ELISA)
Gewebe-Membrankomponente
Lungen-Plattenepithelcarcinom
Lungen-Adenocarcinom
Großzelliges Lungencarcinom
Normale Lunge
Normales anderes Gewebe als Lunge*
gereinigtes Antigen
gezüchtete Zellinien
Kleinzelliges Lungencarcinom
Fetale Lunge
Andere Krebsarten als Lungenkrebs**
Normale Lungenzelle
*Magen, Leber, Niere, Pankreas, Gallenblase, Herz,
Dickdarm, Dünndarm
** Eine von zwei Pankreaskrebs-Zellinien und eine von drei
Magenkrebs-Zellinien wurden gefärbt.
Beispiel 2
-
Verschiedene Krebsgewebe wurden immunhistochemisch
angefärbt, wobei der in Beispiel 1 erhaltene monoclonale
Antikörper SLC-454 verwendet wurde. Auf diese Weise wurden in
Paraffin eingebettete Blockschnitte gefärbt, die von sieben
Patienten mit Lungen-Plattenepithelcarcinom, sieben Patienten mit
Lungen-Adenocarcinom, fünf Patienten mit großzelligern
Lungencarcinom, drei Patienten mit kleinzelligem Lungencarcinom,
vier Patienten mit Magenkrebs, drei Patienten mit Hepatorn,
einem Patienten mit Pankreaskrebs, einem Patienten mit
Rectumkrebs, einem Patienten mit Leukämie, einem Patienten mit
Gallengangkrebs, einem Patienten mit Harnblasenkrebs, einem
Patienten mit Neuroblastom, einer Patientin mit Uteruskrebs und
einem Patienten mit Gaumenkrebs stammten. Außerdem wurden
verschiedene normale Gewebetypen von Erwachsenen oder fetale
Gewebetypen immunhistochemisch angefärbt. Die Ergebnisse sind in
Tabelle 2 dargestellt.
Tabelle 2
Tumortyp
SLC-454 Anzahl der positive Testergebnisse zu Testproben insgesamt
Lungen-Plattenepithelcarcinom
Lungen-Adenocarcinom
Großzelliges Lungencarcinom
Kleinzelliges Lungencarcinom
Magenkrebs
Hepatom
Pankreaskrebs
Rectumkrebs
Leukämie
Gallengangkrebs
Blasenkrebs
Neuroblastom
Uteruskrebs
Gaumenkrebs
-
Normale Gewebetypen von Erwachsenen und fetale
Gewebetypen (Lungen, Milz, Magen, Dickdarm, Dünndarm, Herz, Leber,
Niere, Knochenmark, Schilddrüse, Gehirn, Pankreas) ergaben
negative Ergebnisse.
Beispiel 3
-
Eine Suspension von SLC-454 (10 ug/ml) wurde in Portionen
zu je 50 ul in die Vertiefungen einer EIA-Platte mit 96
Vertiefungen (Produkt von Flow Laboratories) verteilt. Nach
Stehenlassen über Nacht bei 4ºC wurde die Platte mit PBS
gewaschen. Sodann wurde 1% BSA-PBS hinzugefügt (200 ul pro
Vertiefung). Nach Stehenlassen über Nacht wurde die Platte gründlich
mit PBS gewaschen. Anschließend wurden 20-fache Verdünnungen
von Seren in einer Menge von 100 ul pro Vertiefung zugegeben,
die zum einen von normalen Individuen (65 Proben), zum anderen
von Lungenkrebs-Patienten stammten (210 Proben). Nach
Stehenlassen über Nacht bei 4ºC wurde die Platte gründlich mit PBS
gewaschen. Anschließend wurde der Biotin-markierte monoclonale
Anti-Lungenkrebs-Antikörper SLC-454 (5 ug/ml) als der zweite
Antikörper zugegeben (100 ul pro Vertiefung). Die Platte wurde
über Nacht bei 4ºC stehengelassen und sodann gründlich mit PBS
gewaschen. Avidin-Biotin-Peroxidase (Produkt von Vector), (10
ug/ul), wurde in Portionen zu je 100 ul in die Vertiefungen
verteilt und die Platte eine Stunde bei Raumtemperatur
stehengelassen und sodann mit PBS gewaschen. Danach wurde eine ABTS-
Substratlösung in einer Menge von 100 l pro Vertiefung
zugegeben und die Reaktion 30 Minuten bei Raumtemperatur ablaufen
gelassen und sodann durch Zusatz von 5% SDS-Lösung
(Natriumdodecylsulfat), (100 ul pro Vertiefung), beendet. Die
Farbentwicklung wurde für jede Vertiefung unter Verwendung eines
Absorptionsmeßgerätes (OD&sub4;&sub1;&sub5;) gemessen. Wie in Figur 1
dargestellt, wurde bei 65 Serumproben von gesunden Individuen kein
positives Ergebnis erhalten (OD&sub4;&sub1;&sub5; > 0,70), wohingegen bei den
Serumproben von Patienten mit Lungen-Adenocarcinom 21 von 69
Proben, bei den Serumproben von Patienten mit
Lungen-Plattenepithelcarcinom 19 von 69 Proben und bei den Serumproben von
Patienten mit großzelligem Lungencarcinom 6 von 27 Proben
positive Ergebnisse zeigten. Jedoch ergaben bei Serumproben von
Patienten mit kleinzelligem Lungencarcinom 7 von 45 Proben in
dem vorstehenden Serumdiagnosesystem positive Ergebnisse. Bei
den serumproben von Patienten mit gutartigen
Lungenerkrankungen zeigten 3 von 16 Proben positive Ergebnisse und bei den
serumproben von Magenkrebs-Patienten zeigte keiner von 28
Fällen ein positives Ergebnis. Diese Ergebnisse machen deutlich,
daß die Serumdiagnose unter Verwendung von SLC-454 ein
wirksarnes Verfahren zur Diagnose von Lungenkrebs darstellt.
Beispiel 4
-
Zur Analyse der Antigene, die vom monoclonalen Antikörper
SLC-454 erkannt werden, wurden aus
Lungen-Plattenepithelcarcinom-Gewebe stammende Membranpräparate mit nachstehend
beschriebenen Enzymen und Reagens behandelt und sodann auf
Reaktivität mit SLC-454 untersucht.
-
Enzyme und Reagens
-
Trypsin (2,5% Lösung; Produkt von Gibco)
0,25% in PBS
-
Neuraminidase (Produkt von Boehringer Mannheim)
0,1 E/ml in 0,1 M Acetatpuffer (pH 4,5),
3 mM CaCl&sub2;
-
α-L-Fucosidase (Produkt von Boehringer Mannheim)
0,1 E/ml in 0,1 M Phosphatpuffer (pH 6,3)
-
Protease (Produkt von Sigma)
10 E/ml in 0,1 M Phosphatpuffer (pH 7,2)
-
NaIO&sub4; (Produkt von Wako Pure Chemical)
50 mM in PBS
-
Die Membranpräparate von Lungen-Plattenepithelcarcinom-
Gewebe (100 ug Protein pro ml) wurden in Portionen zu je 50 l
in die Vertiefungen einer EIA-Platte (Produkt von Linbro)
verteilt. Nach Stehenlassen über Nacht bei 4ºC wurde die Platte
dreimal mit PBS gewaschen. Sodann wurde 1% BSA-PBS in die
Vertiefungen verteilt (200 ul pro Vertiefung). Die Platte wurde
30 Minuten bis 2 Stunden bei Raumtemperatur stehengelassen und
sodann dreimal mit PBS gewaschen. Eines der vorstehenden
Enzyme und Reagens wurden in die Vertiefungen verteilt (50 ul pro
Vertiefung) und die Reaktion eine Stunde bei 37ºC
durchgeführt. Anschließend wurde die Platte fünfmal mit PBS gewaschen
und der monoclonale Antikörper SLC-454 (10 ug/ml) in die
Vertiefungen
verteilt (50 l pro Vertiefung), danach wurde die
Platte über Nacht bei 4ºC stehengelassen.
-
Nach fünfmaligem Waschen mit Tween 20 (Produkt von Wako
Pure Chemical) -PBS wurde Peroxidase-markiertes Anti-Maus-IgG
(400-fache Verdünnung) zugegeben (50 ul pro Vertiefung) und
die Reaktion zwei Stunden bei Raumtemperatur durchgeführt. Die
Platte wurde fünfmal mit Tween 20-PBS gewaschen, eine ABTS-
Substratlösung zugegeben (100 ul), die Reaktion 30 Minuten
durchgeführt und die Absorption bei 415 nm gemessen.
-
Wie in Figur 2 dargestellt, verschwand die Antigenität
bei Behandlung mit Perjodat (NaIO&sub4;), Trypsin oder Protease
vollständig. Aufgrund dieses Ergebnisses wurde gefolgert, daß
der monoclonale Antikörper SLC-454 Glycoproteine erkennt.
Beispiel 5
-
Lungenkrebs-Membranpräparate, beschichtet auf eine EIA-
Platte, wurden mit 1% BSA-PBS-Lösung blockiert. Serielle
Verdünnungen von SLC-454, Kaninchen-Anti-CEA-Antikörper,
Kaninchen-Anti-AFP-Antikörper und Kaninchen-Anti-β&sub2;-Microglobulin-
Antikörper (alle hergestellt von DAKO) wurden in die
Vertiefungen gegeben. Nach Stehenlassen über Nacht bei 4ºC wurde die
Platte gründlich mit PBS gewaschen. Anschließend wurde
Biotinmarkierter SLC-454 hinzugefügt und die Platte drei bis vier
Stunden bei Raumtemperatur stehengelassen. Nach Waschen wurde
Avidin-Biotin-Peroxidase (Vectastain ABC Immunoperoxidase
Staining Kit; Produkt von Vector) zugegeben und die Platte
eine Stunde bei Raumtemperatur stehengelassen. Danach wurde
eine ABTS-Substratlösung zugegeben und für jede Vertiefung die
Absporption bei 415 nm gemessen.
-
Die Ergebnisse sind in Figur 3 dargestellt. Die
Bindungsaktivität von SLC-454 wurde durch SLC-454 selbst gehemmt,
überhaupt nicht jedoch durch Anti-CEA-Antikörper, Anti-AFP-
Antikörper und Anti-β&sub2;-Microglobulin. Aufgrund dieses
Ergebnisses wird gefolgert, daß SLC-454 ganz andere Antigene
erkennt als diese Antikörper.
-
Die Erfindung ist ausführlich und mit Bezug auf die
spezifische Ausführungsform beschrieben worden, dem Fachmann wird
jedoch klar sein, daß verschiedene Änderungen und
Modifikationen durchgeführt werden können, ohne daß der in den
beiliegenden Patentansprüchen dargelegte Umfang der Erfindung verlassen
wird.