CN87100927A - 人类非小细胞肺癌及其它几种癌症的单克隆抗和抗原 - Google Patents

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Abstract

本项发明涉及一类新的单克窿抗体，其能与某种蛋白质抗原强烈结合，该抗原与人类非小细胞肺癌(“NSCLC”)，小细胞肺癌及包括结肠癌、乳腺癌在内的其它癌症相关联。该抗体在诸如检测与NSCLC结合的恶性细胞的诊断方法方面以及在治疗带有NSCLC及其它几种癌症的治疗方面找到了用途。还公布了在人类非小细胞肺癌细胞表面及其它几种癌症细胞表面发现了分子量为110,000道尔顿的一种新的糖蛋白抗原。该抗原氨基末端氨基酸顺序为：
1 5 10 15
L-X-V-Q-V-P-E-X-P-V-V-A-L-V-G-
20
T-D-A-X-L
其中X代表一未确定的氨基酸。

Description

此项发明涉及一种新的单克隆抗体还涉及对于癌症抗原具专一性的新的单克隆抗体的生产和使用方法。更为特别的是，本项发明的单抗对于与人类非小细胞肺癌（NSCLC）及某些其它癌症包括某些乳腺癌、结肠癌等联合的蛋白质抗原是免疫学特异的和（或）具有免疫学活性的。
此项发明的单抗能与NSCLC细胞及其它癌细胞（包括乳腺癌、结肠癌和小细胞肺癌）的糖蛋白抗原决定簇反应。本发明的单抗具有突出的特性和反应能力，这使该抗体适合于体内、体外临床诊断之目的。此外，此单抗还适用于治疗服用。例如，它可以作为许多试剂的靶向选择载体，而这些试剂具有抗癌效应;这些试剂包括：化疗药物，毒素，免疫反应效应物，以及放射性同位素但并不限于此。而且，生产这种单克隆抗体的杂交瘤可用重组DNA技术进行修饰，以使所产生的抗体能介导依赖于抗体的细胞毒性，或者，可以在补体存在下溶解癌细胞。
2.
2.1人类肺癌
死于癌症的男性大部分是由于肺癌;在死于癌症的女性中肺癌正超过乳腺癌而成为最常见的死因。按组织学类型这种疾病可分为四类;（1）表皮状或鳞装（30%），（2）腺癌（35%），（3）未分化的大细胞（15%），（4）小细胞（20%）。非小细胞肺癌（NSCLC）包括下列细胞类型;表皮样癌细胞，腺癌细胞，大的未分化的癌细胞。
大多数肺癌不能用化疗和放射法治愈。小细胞肺癌在化疗和放疗下可能缩小尺寸，但不能完全治好。最有效的治疗可能只有手术切除瘤子。然而，不幸的是少于30%的肺癌病人的瘤子能在诊断后被完全切除。其中，在完全切除瘤子后，只有少于1/3的病人能存活五年。这种情形就要求有尽可能早期诊断肺癌的方法，确定癌症扩散程度的方法以及更有效的治疗方法。
2.2单克隆抗体
单克隆抗体是均一的抗体分子，它与具有特异性结合或亲合常数的抗原上的单一分子位点（即表面决定簇）相结合，在现有技术中有三种制备它们的方法。
单克隆抗体可以用Kohler和Milstein设计的杂交瘤技术制备（1975，Nature    256;495;1976，Eur.J.Immunol.6;511）。通过将产生抗体细胞（脾淋巴细胞）与骨髓瘤细胞融合，Kohler和Milstein创造了杂交细胞，从这种杂交细胞得到了具有产生抗体的能力和在细胞培养基中永久生长的能力的永久细胞系。杂交瘤分泌一种单一类型的免疫球蛋白，这种免疫球蛋白的抗原特异性取决于淋巴细胞所暴露的抗原。
此外，单克隆抗体可用体外转化哺乳类动物***血液B淋巴细胞而产生。例如，使用非洲淋巴瘤病毒（EBV）。该病毒使产生抗体的淋巴细胞不死。文献中可以见到这种转化技术（例如，见Steinmetz    et    al.1977，Nature    269;420;Crawford    et    al.，1983，The    Lancet，i：386）。
最后，可以使用结合了EBV-不灭技术和细胞融合或杂交技术生产单克隆抗体。科尔等人描述了将人类浆细胞瘤或淋巴细胞瘤细胞系与EBV转化的给体淋巴细胞相融合的技术，这种给体淋巴细胞已予先建立了细胞（1985年，《单克隆抗体与癌症治疗》，Alan    Liss，Inc.，第77-96页）。在这个体系中，两个亲本细胞系都不死。因此，融合的双方必须有适当的药物标记，以便在培养融合杂交瘤时对亲本细胞进行反选择。所得到的EBV杂交瘤将产生具有所使用的EBV-淋巴细胞系特异性的抗体。
单克隆抗体可通过体外培养特定杂交瘤或转化的细胞系的方法大量生产。此外，将一杂交瘤细胞系植入适合的哺乳动物和小鼠的腹腔，便会产生肿瘤，该肿瘤将高浓度（1～20mg/ml）单克隆抗体分泌到肿瘤腹水液中，移出腹水，纯化单克隆抗体，一只小鼠就可以提供足够上千次诊断检定所需要的抗体。
2.3与肺癌有关的单克隆抗体与抗原
抗人类肺癌抗原的单克隆抗体已由下列研究者描述过：Si    Rora及同事（1981），Brit.J.Cancer    43;696;Cuttita及同事（1981），Proc.Nat'l    Acad.Sci.USA    78：4591;Moody及同事（1981），Science    214：1246;Minna及同事，（1981），In    Vitro    17：1058;Kennel及同事（1981），Cancer    Res.41：3465;Chem.Abst.95（15）：1308502;Baylin及同事，（1982），Proc.Nat'l    Acad.Sci.USA79：4650;Carney及同事，（1982），Pathobiology    Annual    12：115;Gazdar及同事，（1983），Seminars    in    Oncology    10：3;Hollinshead及同事，（1983），Cancer    Detect.Prevent    6：185;Mulshine及同事，（1983），J.Immunol.131：497;Huang及同事（1983），Arch.Biochem.Biophys.220：318;Saji及同事（1984），Hybridoma    3：119;Bio.Abst.79005569;Bosslet及同事，Behring.Inst.Mitt.74：27;Chem.Abst.Ac101（9）：706680;Roset及同事（1984），Cancer    Res;44：2052;Bio.Ast.79023605;Princler及同事，（1982），Cancer    Res.42：843;Mazauric及同事（1982），Cancer    Res.42：150;Braatz及同事（1982），Cancer    Res.42：849;Sobel及同事（1982），Fed.Proc.41;409;Cole及同事（1985），《Monoclonal    Antibodies    and    Cancer    Therapy》，Alan    Liss，Inc.，PP.77-96;Varki及同事（1985），《Monoclonal    Antibodies    and    Cancer    Therapy》，Alan    Liss，Inc.，P.207。
1984年11月2日提交的美国专利申请第667，521号;1985年10月7日提交的785，177号;1984年11月21日申请的684，759号;1985年10月18日申请的776，321号;1985年5月28日申请的738，612号，上述文件公开了某些抗人类非小细胞肺癌的单克隆抗体。
单克隆抗体可用作尽早诊断肺癌和更好地确定癌症的扩散程度的方法，以及更有效地治疗肺癌之方法。但其先决条件是找到能对付在肺癌中比在其它正常组织中表达更强烈的抗原的抗体。考虑到已知的癌细胞种群的不均一性，同一抗原分子上存在着几个决定簇，在作为诊断标记和治疗目标的稳定性方面抗原所具有的先天区别，以及对应同一抗原的不同抗体的不同生物学特性，就需要能对付众多抗原的众多抗体。
3.
此项发明涉及到一类新单克隆抗体，用L20表示，其对与人类非小细胞肺癌相关的一个糖蛋白抗原分子表面的一个决定簇具有特异性。“非小细胞”包括表皮样癌细胞，腺癌细胞和未分化癌细胞的大细胞。该决定簇也能在其它一些癌细胞抗原分子上发现，如乳腺癌、结肠癌和小细胞肺癌。因此，此项发明所生产的抗体也将结合于其它癌细胞上，可用于诊断和治疗所有能表达抗体L20所识别的抗原的其它癌症。这个单克隆抗体与正常成熟细胞的结合度远小于肿瘤细胞。“结合度极小”是说其结合几乎检测不出，或用免疫组织化学检测时只有非常弱的染色。因此，该抗体对于非小细胞癌及某些其它癌症的抗原具有高度特异性。
此项发明还包括被抗体L20识别的新L20抗原以及与该抗原结合的抗体类型。这些抗体对L20抗原是免疫特异或具免疫活性的。此外还包括使用纯化的或克隆化的L20抗原作为疫苗来免疫接种以使免患某些癌症的方法。
此项发明还涉及某些采用此项发明的单克隆抗体的诊断方法。例如，该抗体用来确定人类肺组织和其它组织的恶性情况。这个方法包括检查该组织是否出现被抗体L20识别的具有110，000道尔顿分子量的糖蛋白的一个抗原。例如，将组织与抗体接触，该抗体能确定细胞相关抗原上的一个决定簇，而此抗原具有能被抗体L20识别的那种抗原的特性。这样就可以检测此抗体的一个功能等效物或一个片段，以及该抗体与抗原决定簇之间的任何反应。一种办法是确定所怀疑的样品细胞中是否存在非小细胞肺癌细胞。将该样品与所述单克隆抗体接触，这样就能从存在于样品中的其它细胞种类中识别这种细胞。这种接触是在抗体与癌细胞结合的条件下进行的。接触以后就可以确定样品中有无癌细胞与抗体结合。这种结合关系到样品中有无非小细胞肺癌细胞存在。通常样品与单克隆抗体的标记的特异结合配体接触。这种标记能产生可检测的信号。
另一种诊断方法是体内定位肿瘤，由给病人服用本发明的纯化抗体或其片段，该抗体或其片段是用可给出检测信号的试剂标记的。然后用外部的闪烁照相术，X射线断层术或放射性核扫描技术定位癌。这种方法还能为根据病变程度将癌症患者分类、治疗反应中的变化提供更好的途径。
此项发明还可应用于治疗方面，因为L20抗体及其相似抗体可以与在癌细胞表面高浓度出现的L20抗原相反应。因而，抗体可以作为多种抗癌试剂的载体。抗癌试剂包括但不限于化疗药物，毒素，免疫反应效应物和放射性同位素。
此外，L20抗体可以被修饰，这样，它可成为能够介导抗体依赖的细胞毒性的抗体。（“抗体依赖的细胞毒性”简记为ADCC）也就是说，它能在人类淋巴细胞或巨噬细胞存在下杀死非小细胞肺癌细胞（即NSCLC细胞），或者在人类补体存在下可以溶解癌细胞。这种修饰可以用最近发展起来的产生“嵌合抗体”的技术来完成。依照这一技术，将编码L20抗体可变区的基因与人类编码具有适当生物学活性的抗体的Fc区的基因进行拼接（所谓“适当生物学活性”例如能激活人类补体和介导ADCC）。小鼠或人的新的抗体也可以做成对于L20抗原来说具有适当生物学功能。
此项发明为一新的单克隆抗体，命名为L20，对人类非小细胞肺癌细胞及人类某些其它癌症细胞表面抗原具有免疫特异性和（或）免疫反应活性。这些癌症包括结肠癌、乳腺癌和小细胞肺癌。此项发明还包括产生这种新单克隆抗体的方法以及采用该抗体的诊断和治疗方法。
此外，此项发明还与一种新的细胞表面抗原及其应用有关，该抗原具有人类非小细胞肺癌、结肠癌，乳腺癌和小细胞肺癌的抗原的特性。
4.1产生抗NSCLC单克隆抗体的方法
抗人类非小细胞肺癌和其它几种癌症的单克隆抗体可以通过杂交瘤融合技术、人类产生抗体的淋巴细胞的EBV转化技术或结合了上述两种技术的方法来生产。
4.1.1融合技术
根据此项发明的一个具体实施方案，用杂交瘤融合技术生产抗NSCLC的单克隆抗体。例如，从胸膜渗出物中得到的人类肺癌细胞，移植的人类非小细胞肺癌的培养细胞，正常胎儿肺细胞或这些细胞的溶胞产物都可以作为免疫原。在一个说明性的实施例中，从NSCLC中移植的细胞即人类肺腺癌＃3082作为免疫原（见5.1）。将该细胞注射给小鼠，在一段足够时间后，杀死小鼠，并得到产生抗体的淋巴体细胞。产生抗体的细胞可以从免疫好的动物的***、脾脏和外周血管得到。最好用脾细胞。小鼠的淋巴细胞与下面要叙述的小鼠的骨髓瘤细胞融合，具有高百分比的稳定的融合量。也能使用大鼠、兔子和青蛙的体细胞。通常在聚乙二醇的存在下融合，而使编码所需要免疫球蛋白的脾细胞染色体不因脾细胞与骨髓瘤细胞融合而致死。几种骨髓瘤细胞可用于生产融合的细胞杂种包括NSI-Ag4/1，X63-Ag8，MPC11-45.6TG1.7，X63-Ag.653，SP2/0-Ag14，Fo，S194/5    XXO.Bu.1，（以上为从小鼠系派生），210.RCY3.Ag1.2.3，U-226AR和GM1500GTGAL（从大鼠系派生）（Hammerling及同事，1981，“单克隆抗体和T细胞杂交瘤”，见《免疫学研究专论》Vol.3，J.L.Turk，ed;Elsevier/North    Holland    Biomedical    Press.New    York）.作为一个说明性的实施例中，使用NS1细胞（见5.1），得到的细胞，包括已融合的细胞，使其在选择性培养基如HAT-培养基中生长，用有限稀释法使活下来的杂交瘤细胞在这种培养基上生长。该细胞在适当的容器中如微孔板内生长，从上清液中筛选具有所需特性的单克隆抗体。
有很多常规方法用来分离纯化单克隆抗体，以便将它们与其它蛋白质和杂质和杂质分开。
4.1.2.EBV转化技术
按照此项发明的另一具体实施方案，是采用EBV转化技术生产抗NSCLC单克隆抗体。例如，按Cole及其同事1984年在Camcer    Res.44：2750所叙述的方法，使用EBV转化技术使带有NSCLC的病人的边缘血液，肿瘤排放的***，骨髓吸取液，癌渗出液或胸膜渗出液中所取得的淋巴细胞不死。正如Cole及其同事所述，肺癌病人缺少特异于癌症抗原的B淋巴细胞。因此，通过预先筛选产生抗相关抗原抗体的淋巴细胞来增殖产生抗体的淋巴细胞数目是十分重要的。EBV转化技术包括下列两个步骤：（1）用已知抗原（即4.2.1中所描述的L20抗原）的受体进行细胞富集;（2）用EBV感染这些细胞使它们不死。
4.1.3.EBV-杂交瘤技术
根据此发明的另一实施方案，采用如Cole及同事（1985，《单克隆抗体与癌症治疗》，Alan    R.Liss，Inc;PP.77-96）所叙述的将EBV转化与杂交瘤融合的技术相结合的方法制备抗NSCLC单克隆抗体。例如，将一个骨髓瘤细胞系与NSCLC病人提供的供体淋巴细胞相融合，这种淋巴细胞已进行了EBV转化，建立了细胞系，能在培养条件下生长和繁殖。为了能够筛选到EBV一杂交瘤融合细胞系，必须使融合双方具有显性选择性药物标记，如乌本苷或新霉素抗性，以便在培养融合的杂交瘤细胞系时亲本细胞（即未融合细胞）不生长。一种合适的细胞系是由Cole及同事（上述）叙述的硫代鸟嘌呤抗性GM-150，乌本苷抗性淋巴母细胞系，KR-4。得到的杂交瘤用常规技术克隆。
4.1.4.细胞增殖及抗体产生
一旦所需的融合后的细胞杂交物或转化的细胞系已经被选择并被克隆成为个体抗体产生细胞系，那么每个细胞系就可采用两种常规方法进行增殖。个体细胞系可以在体外增殖，比如在实验室培养容器中，而含有高浓单一特异性单克隆抗体的培养基可通过倾析、过滤或离心而得到。也可以通过将杂交瘤注射入与提供原始融合所用体细胞和骨髓瘤细胞的动物具有组织相容性的动物体内而使单克隆抗体产量增加。分泌那种由融合细胞杂交瘤产生的特异性单克隆抗体的肿瘤将在被注射的动物体内生长。该动物的体液，例如腹水或血清，提供高浓度的单克隆抗体。如Cole及同事（上述）所述，当使用人的杂交瘤或EBV-杂交瘤时，必须避免给动物（比如小鼠）注射时产生异种移植排斥。可以使用免疫缺乏小鼠或裸鼠，或者首先将杂交瘤注射给照射过的裸鼠产生皮下实体瘤，这种实体瘤取出，体外培养然后腹腔注入照射过的，降植烷刺激过的裸属，该鼠将发育成分泌大量特异性的人的单克隆抗体的腹水瘤。（见Cole及同事，上述）
4.2.单克隆抗体
本发明的抗体与一类新的细胞表面糖蛋白抗原（称为L20抗原）结合，该抗原具有人类非小细胞肺癌细胞及其它几种人类癌症细胞的特性。（见4.2.1）该糖蛋白抗原在聚丙烯酰胺凝胶电泳进行免疫沉淀反应时测得分子量为110，000道尔顿（见5.3）.用聚糖酶消化L20抗原表明该抗原含有N-连接的寡糖链。
作为本发明的一个具体实施方案，L20抗体用5.1中叙述的L20鼠杂交瘤生产。L20抗体属于IgG1同型，亲合力约为3×108（见5.2.2）。检测不到它与正常细胞如成纤维细胞，内皮细胞或主要器官中的表皮细胞结合。“检测不到结合”意味着用免疫组织化学法检测时只有很弱的染色或根本没有染色。
本发明还包括极为有用的上述单克隆抗体的结合片段如Fab，F（ab′）2′，Fv等。抗体片段用常规技术即可得到。例如，用胃蛋白酶或木瓜蛋白酶等肽酶消化抗体得到有用的结合片段。
相似抗体（包括不同的同型、不同亲合力的抗体）和新的生物学功能（如在补体或如淋巴细胞、巨噬细胞等效应细胞存在下杀死癌细胞的能力）也属于本发明范围。上述本发明的新抗体的具体实例是指出与相关抗原上某一特定决定位点结合的来自小鼠的属于IgG1亚类的抗体，但这并不是限制范围。上述抗体以及与它具有功能等价的抗体，不论其源于小鼠，或包括人在内的哺乳类动物，或是其它来源，或是多种来源的综合，都属于本发明的范围，其它同型的抗体也不例外。“功能等价”指该抗体能结合于上述的抗原决定簇，并能与本发明的抗体在该区域进行竞争。也就是说，当该抗体与含有该抗原决定簇的细胞或细胞片段样品结合时，本发明的抗体与该决定簇的结合将受到阻断。此外，由于本项发明的抗原可有多个决定簇，此发明还包括那些能识别上述单克隆抗体所识别的抗原决定簇以外的决定簇的抗体，这些抗体可用本专业领域所知的顺序免疫沉淀方法检测。
本发明还包括对抗原决定簇起反应的抗体，或L20抗体的个体基因型，因为这些抗一个体基因型抗体可以用来分析对于癌抗原的免疫应答以便于诊断，并用以诱导免疫应答以便于治疗和预防癌症。（Nepom及同事，1984，Proc.Nat'l    Acad.Sci.81：2664）。
4.2.1为单克隆抗体识别的L20抗原
本发明的单克隆抗体所识别的抗原包括一类新的具有NSCLC细胞以及几种其它癌症细胞如乳腺癌，结肠癌和小细胞肺癌的抗原特性的细胞表面糖蛋白抗原。该抗原分子量为110，000道尔顿。
这种新的糖蛋白抗原的氨基末端氨基酸顺序为：
1    5    10    15
L-X-V-Q-V-P-E-X-P-V-V-A-L-V-G-
20
T-D-A-X-L
其中X代表一个尚不清楚的氨基酸，其它字母代表常规单字母缩写氨基酸。将此序列与贮存于当今蛋白质数据库中的那些序列比较（PIR    Release    6.0，November    1985），没有发现任何与之具有明显的序列同源性。
4.3.单克隆抗体与L20抗原的应用
4.3.1.诊断应用
本发明的单克隆抗体可用作检测人类NSCLC和其它人类癌症分泌抗原的探针。本发明的方法之一是通过检查人类肺组织或其它组织的具有L20抗原特性的糖蛋白抗原的有无表达情况来确定该组织中癌变恶性程度。“具有L20抗原特性”是指该抗原能与识别L20抗原的抗体进行反应。这种抗原的表达或不表达可以为临床提供常规组织病理学技术所不能提供的可用信息。
本发明的单克隆抗体可以用来例如检测组织样品和细胞样品的非小细胞肺癌。如，用5.4中叙述的免疫过氧化物酶染色技术可以使腺癌，表皮状和小细胞肺癌的切除的组织样品显示强烈正染色。而正常的肺，脾脏，结肠，肾脏，肝脏，脑，心脏，皮肤，胸腺，睾丸，***和正常淋巴细胞则为负染色。
本发明的单克隆抗体的另一重量的体外诊断应用是对NSCLC以外的其它癌症能作出估价。该抗体已用来检测乳腺癌，结肠癌和小细胞肺癌的表位。这些组织的正常样品不表达该因子。因此，本发明的单克隆抗体可用来检测这些癌细胞的抗原因子。这样，该单克隆抗体对于乳腺癌，结肠癌和小细胞肺癌可能是一种有用的诊断试剂。
此外，免疫荧光技术可用于检测带有本发明单克隆抗体的人类组织样品。典型的程序就是，将拥有恒冷箱装置的经冷冻未固定活体组织或离体癌样品或细胞学涂片的玻片经空气干燥并与该单克隆抗体室温培养于湿度控制小室内。细胞学涂片包括剥落的细胞样品。“剥落”一词是指该样品包括分离的细胞或刮洗组织表面而得到的细胞群，这些细胞可以被单独移去，或是鳞片般地剥落，或一层一层移去。剥落细胞样品要与离体组织（如活组织检查时得到的样品）区别开。这个方法在从剥落细胞样品中检测确定癌变情况时找到效用，这些剥落细胞来自肺部（如痰样品），支气管，胃肠道（包括口咽，嘴）以及颈涂片等。
干燥以后，载玻片上铺一层预备好的抗该单克隆抗体的抗体，一般如果该单克隆抗体是用小鼠的脾细胞和骨髓瘤细胞融合而产生的，则抗体采用某种类型的抗小鼠IgG的抗体。采用常规技术将此抗小鼠IgG抗体与某种化合物如碱性蕊香红或荧光素异硫氰酸盐结合，在特定波长发出荧光。样品内部染色的图形和强度用荧光显微镜检术来确定，并可随意照像记录。
上面叙述指出了本发明的抗体在免疫荧光技术方面的主要应用。然而，该抗体还可应用在大多数抗原一抗体反应的检测技术上。检测可以是均一或非均一的。均一检测中样品可以是溶胞后和澄清除去碎屑的组织。免疫反应通常包括特异性抗体，标记物和要检测的样品。基于抗体与标记物的结合，标记物所产生的信号直接或间接地得到修饰。免疫反应及其程度检测反应都在均一溶液中进行。所采用的免疫化学标记包括自由基，荧光染料，酶，噬菌体，辅酶等。
在非均一检测研究中，试剂通常就是样品，特异性抗体及产生可检测信号的工具。该单克隆抗体通常被覆盖于固态支持物或固相上。接着液相样品与固相上的单克隆抗体相接触。然后固相支持物与液相分开，采用产生可检测信号的工具对固相或液相进行检测。信号是与样品中待分析物的出现相关联的。产生可检测信号的方法包括使用放射活性标记物，荧光物质，酶等。非均一免疫检测的例子有放射免疫检测，免疫荧光方法，酶联检测等。
有关免疫检测技术的更为详细的讨论见《酶免疫检测》，Edward    T.Maggio，1980，CRC.Press，Ins，Boca    Raton，Florida。另外还可参阅：美国专利号3，690，834;3，791，932;3，817，837;3，850，578;3，853，987;3，867，517;3，901，654;3，935，074;3，984，533;3，996，345及4，098，896等，但并不局限于此。
本发明的抗体还可用于体内诊断应用。例如，抗体或由抗体制备的片段，即Fab和F（ab′）2片段可用来反映癌症现象，用与Larson及同事1983，J.Nucl.Mecl.24：123及1983，J.Clin.Invest，72：2101所述检测恶性黑素瘤相似的方法检查NSCLC病人代谢***物。纯化的抗体或抗体片段用一种给出可检测信号的试剂标记，例如放射性同位素131I，并以适当载体（如静脉注入）给病人。癌结合的抗体的位置可通过外部的闪烁照相、X射线断层照相或放射核扫描（如γ射线照相）技术来检测。
4.3.2.治疗应用
本发明的抗体还可用于治疗。该单克隆抗体可与广泛的药物或细胞毒性试剂结合使用。例如，抗体可与某种毒素结合形成免疫毒素（Jansen及同事，1982，Immunol.Rev.62：185）或与放射性活性物质结合如I，I等（Order，1984，Compr.Ther.10：9;Larson及同事，1983，J.Clin.Invest.72：2101;Carrasquillo及同事，1984，Cancer    Treatment    Reports，68：317）。还可与药物结合形成放射性药物或普通药物（Rowland及同事，1985，Cancer    Immunol.Immunother.19：1）。结合的抗体给病人服用，通过化疗药物的细胞毒性作用而达到加强抗癌效应，这些化疗药物是基于与其结合的抗体对癌细胞的亲合作用而释放到该肿瘤。
本发明的抗体的所谓“嵌合抗体”分子可被制备成含有与人类抗体不变区相结合的小鼠抗原一结合区（Morrison及同事，1984，Proc.Nat'l    Acad.Sci.U.S.A.81：6851;Takeda及同事，1985，Nature，314：452），这项研究可用于构建新的抗体分子，它具有合乎需要的效应基因的功能，如能激活人类补体并介导ADCC（Neuberger及同事，1984，Nature    312：604）。
该单克隆抗体另一治疗上的应用是采用L20抗体作为免疫原制备抗个体型抗体。（如见：Nepom及同事，1984，Proc.Nat'l    Acad.Sci.U.S.A.81：2864;Lee及同事，1985，Proc.Nat'l    Acad.Sci.82：6286）。
本项发明的吸引人的方面便是：该抗体能将别的抗体结合到NSCLC或其它肿瘤上，如在美国专利申请号667，521，1984年11月2日申请;684，759，1984年12月21日申请及738，612，1985年5月28日申请文件中所公布的那些抗体。这种结合对于检测上面提到的非小细胞肺癌的类型，即大细胞未分化肺癌，腺癌和表皮样肺癌是有效的。
本发明的单克隆抗体还确定与其它癌症如乳腺癌，结肠癌和小细胞肺癌相关的抗原的决定簇。（见第5节表1）。因此，该抗体可对于指向这些癌症的治疗方法及治疗产物方面找到用途。
本发明的新抗原，称为L20的抗原也可用于治疗。该抗原可从癌中纯化，或通过重组DNA技术产生（Brown及同事，Copending    U.S.Patent    Application    Serial№827313，Attorney    Docket    №5624-008，1986年2月7日申请，包含于本文参考文献中。）编码L20抗原的基因可通过首先富集L20抗原的mRNA而克隆。通过这样的方法，多核糖体（包括mRNA，核糖体和新生多肽链）可以通过与识别新生肽链上L20抗原决定簇的抗体进行免疫亲和层析而纯化。mRNA通过与例如L20抗体进行免疫沉淀反应而分离，而cDNA则克隆到一适宜的表达载体中。此外，L20抗体或抗L20抗原的抗血清可用来采用一种表达载体筛选cDNA库。纯化的或克隆化的L20抗原可以单独作为免疫原或与合适的免疫佐剂一起施用。此外，编码该抗原的基因可以***一种病毒的基因中，如牛痘病毒，来产生作为免疫原的重组DNA产物。（Brown及同事，Copending    U.S.Patent    Application    Serial    №827313，Attorney    Docket    №5624-008    1986年2月7日申请）。
4.4诊断试剂盒
本发明还包括采用上述所揭示并实现的方法做成的诊断试剂盒。在一个实施方案中，该诊断试剂盒包括：（a）以上更为详细限定的单克隆抗体，（b）为该单克隆抗体所结合的一个特异性配偶体与能产生可检测信号的一种标记物的结合物。
试剂还包括一些辅助试剂如缓冲剂、蛋白质稳定剂，例如多糖等。需要时诊断试剂盒还包括信号产生***的其它组分，如消减背景干扰的试剂，对照试剂，完成一次检测所需的设备等。在另一具体实施方案中，诊断试剂盒包括本发明的单克隆抗体与一能产生可检测信号物质的结合物。上面提到的辅助试剂也包括于其中。
5.实例
本发明由下列并非限定的实例详细说明。
5.1单克隆抗体的制备
单克隆抗体用Yeh及同事1979，Int.J.Cancer 29：299先前叙述的杂交瘤融合技术产生。用从人类肺腺癌中移植的培养细胞作为免疫原（称为3082），免疫一只三月令的Balb/c小鼠。小鼠接受四次约107（细胞量的腹腔注射。最后一次免疫后三天，取出其脾脏，悬浮于培养基中，并与NS1小鼠骨髓瘤细胞融合（Kohler及Milstein，上述）。接种该混合物以形成来源于单个融合细胞（克隆）的低密度培养物。
用ELISA方法或自动射线照相间接125I标记蛋白质A方法筛选杂种细胞上清液，获得对肺癌细胞系直接亲合能力。（Brown及同事1979，J.Immunol.Meth.，31：201）。用Colcher及同事1981，Cancer Res.42：1451;Yeh及同事上述所述的修改的程序，制备用于免疫反应的癌细胞膜提取物。用PBS液冲洗组织，将从完整癌组织得来的细胞压过不锈钢筛而制得其悬浮液。此后加入含1mM苯甲基磺酰氟（Calbiochem-Behring Corp.，San Diego，CA）的1mM Na HCO3溶液，该物质在冰上用Dounce匀浆器匀浆，B研杆研磨50次。以27，000xg离心15分钟后，移去上清，片状沉淀物于PBS中悬浮，超声1分钟，贮于-70℃。
生产与细胞膜提取物结合的抗体的杂交瘤在体外克隆、增殖，并进一步检测抗体特异性。那些产生对人类肺癌具有明显特异性的抗体的杂交瘤再克隆。增殖并注射入降植烷激发的三月令的BALB/c小鼠，在那里，它们生长成腹水瘤。
在这程序之后，可得到杂交瘤细胞系L20，克隆，并注射到小鼠以产生腹水瘤。分泌入腹水的抗体于蛋白质A-琼脂糖上纯化（Ey及同事，1978，Immunochemistry，15：429）或于Sephaeryl    S-300上进行凝胶过滤而纯化。鉴定纯化抗体之特性。
5.2    L20单克隆抗体的特性
5.2.1.    L20与培养细胞检测与结合
测定抗体在非离子型去污剂渗透前或渗透后与细胞的结合来确定抗原的亚细胞位置。用125I标记抗体的直接结合实验（Brown及同事，1981，Proc.Nat'l Acad.Sci.U.S.A.，78：539）或用荧光激活细胞分类仪（FACS）Ⅱ荧光检测方法来识别与完整培养细胞的细胞表面结合的抗体。与细胞内抗原位置结合的抗体用下列技术确定：125I标记的抗体与细胞直接结合;用多聚甲醛固定;用非离子型去污剂NP-40渗透。
为用放射标记的抗体做结合实验（Brown及同事，上述），将所培养细胞（106）与106cpm的125I标记的抗体于100μl结合缓冲液中冰浴培养30分子。悬浮液按层取成0.2ml dinonylph alate：dibutylph alate（1：1v/v），并离心。以125I对片状测定物及水相计数。为测量非特异性结合，未标记抗体作为竞争试剂进行平行培养。（Brown及同事，上述）
表Ⅰ    放射性碘标记L20抗体与培养细胞的结合
细胞    特异性结合
Calu-1肺腺癌    45，400
H3082肺腺癌    50，100
H2981肺腺癌    64，100
H2984肺腺癌    119，300
MCF7乳腺癌    78，800
3017黑素瘤    2，200
正常T细胞    200
Jurkat    T白血病    200
Daudi    B淋巴瘤    200
5.2.2.    L20抗体同型确定
采用下述技术确定L20杂交瘤细胞系所产生免疫球蛋白类型：
（a）Ouchterlony免疫扩散
特定的杂交瘤细胞上清液的等分试样被加入到25%琼脂糖凝胶板中心孔。其它孔中加入单一特异性兔抗小鼠Ig同型抗体（Southern    Biotechnology，Birmingham，AL），该板室温培养2小时4℃过夜。
（b）ELISA同型
Dynatech    Immuolon    96孔板孔用抗血清浓度1μg/ml的PBS溶液50μl覆盖，留有覆盖的4℃过夜。该板用PBS/吐温20，0.05%冲洗，室温下每孔加100μl培养基予以封闭（1小时）。冲洗完毕，将L20杂交瘤上清液加入孔中，室温培养1小时。用PBS冲洗后，牛血清清蛋白板与过氧化物酶偶联的单一特异性兔抗鼠Ig同型抗体在37℃下温浴2小时。冲洗后，板与含1mg/ml邻苯二胺及0.03%H2O2的pH4.5的0.1M柠檬酸缓冲液培育。630nm处光密度可在Dynatec ELISA酶标板读出器上确定。
L20单克隆抗体属于IgG1同型。
5.3.    L20抗体所识别的抗原
为了鉴定蛋白质抗原，肺癌细胞可进行细胞表面放射性碘标记或用S-蛋氨酸进行代谢标记。将溶胞产物与单克隆抗体培养，加入山羊抗小鼠IgG，吸附于金黄葡萄球菌，从中即可分离抗原。冲洗免疫沉淀物，进行十二烷基磺酸钠聚丙烯酰胺电泳（SDS-PAGE），凝胶浓度10～20%。电泳后凝胶用考马斯亮蓝染色（重量百分比0.5%～10%乙酸和30%异丙醇），于乙酸（5%，v/v）和甲醇（17%，v/v）溶液中脱色。染过的L20抗原条带用剃刀片切下，迅速用电洗脱机/浓缩机ECU-040进行电洗脱（C.B.S.Scientific    Co.，San    Diego，CA），方法如Hunkapiller及同事，1983，Methods    in    Enzymol.91：227-236所述。
用约23皮摩尔L20抗原（取决于已鉴定的L-1的产量）于一气相序列仪（470A型，Applied    Biosystems，Inc.，Foster    City，CA）上进行自动Edman降解。乙内酰苯硫脲氨基酸衍生物用反相高分辨率液相色谱（HPLC）技术分析，所用为120A型HPLC单元（Applied    Biosystems，Inc.）及PTH-C18柱（2.1×220mm，Applied    Biosystems，Inc.），用醋酸钠/四氢呋喃/乙腈梯度洗脱。
氨基末端氨基酸顺序如下：
1    5    10    15
L-X-V-Q-V-P-E-X-P-V-V-A-L-V-G-
20
T-D-A-X-L
其中X代表一个尚未鉴定出来的氨基酸。
与已贮存于蛋白质数据库中的顺序相比，（PIR    Release    6.0，Nov.1985），没有揭示出与其它任何已知序列有任何明显的同源性。
被L20抗体识别的抗原是一分子量为110，000道尔顿的糖蛋白分子。
5.4体外免疫组织化学应用
用Garrigues及同事，1982，Int.J.Cancer    29：511修改过的Sternberger，1979，Immunochemistry，John    wiley    &    Sons，New    York，PP：104-169所叙述的未标抗体技术已用于对冰冻切片进行免疫组织化学研究。手术得到用于这些试验的靶向组织，转移到预冷在液氮中的异戊烷中冰冻4小时。然后组织被贮存于液氮中或零下70℃直到用时。兔抗鼠IgG使用时稀释至1/50。（Sternberger-Meyer    Immunochemicals，Inc.，Jarettsville，MD）。含有2mg/ml经纯化的PAP小鼠过氧化物酶-抗过氧化物酶复合物（PAP，Sternberger-Meyer    Immunochemicals，Inc.）用时稀释至1/80。冰冻切片制备，干燥，用丙酮处理，并干燥（Garrigues及同事，上述）。用于组织学评价的切片用苏木精染色。为降低非特异性背景，切片预先与稀释至1/5的正常人血清培养（Garrigues及同事，上述）。小鼠抗体，山羊抗小鼠IgG，以及小鼠PAP均于10%正常人血清和3%兔血清溶液中稀释。
染色程序包括用特异的或对照抗体处理序列切片2.5小时，与稀释至1/50的兔抗小鼠IgG培养30分钟，暴露于稀释至1/80的小鼠PAP复合物30分钟。每次用抗体处理后，载玻片用PBS洗两次。用新鲜制备的0.5%3，3′-二氨基联苯胺四盐酸盐（该药品为Sigma，St.Louis，Mo）和含0.01%H2O2的0.05M Tris缓冲液pH7.6开始免疫组织化学反应8分钟。于1%O3O4蒸馏水溶液浸泡20分钟可以加强染色。切片浸入水，用乙醇脱水，用二甲苯洗净，固定载玻片上。
载玻片在编号情况下，对每个均检查确定，编有号码的样品由单独的研究者检验。典型的载玻片用干涉反差显微镜照相（Zeiss-Nomarski）。抗体染色程度记作0（无活性），+（有几个弱阳性细胞），++（至少有1/3细胞为阳性），+++（大多数细胞阳性），++++几乎所有细胞显示很强阳性）。因为+和0之间差别比+和++染色差别显得更不清楚，所以具有++或高于++的级别就认为是“阳性”。赘生细胞和基质细胞均可在癌样品中观察到。而记录下的染色是癌细胞的，因为基质细胞几乎不被染色，或染色程度比癌细胞弱得多。
表Ⅱ.癌细胞和正常组织样品与L20单克隆抗体进行免疫过氧化物酶染色
组织类型    阳性数/试验数
肺癌
腺癌    18/20
表皮样癌    3/3
支气管    0/1
小细胞    4/4
肺癌细胞系    3/3
乳腺癌    4/7
结肠癌    5/8
黑素瘤    5/8
肾癌    1/1
脂肉瘤    0/1
正常肺    3个样品中有1个弱染色
正常脾    阴性
正常乳腺    阴性
正常结肠    阴性
正常肾    阴性
正常肝    阴性
正常脑    阴性
正常心脏    阴性
正常皮肤    阴性
正常胸腺    阴性
正常睾丸    阴性
正常***    阴性
正常淋巴球    阴性
所有检查的样品均为手术得到的组织冰冻切片。免疫组织学方法的详细说明见正文。两个+号染色（代表至少1/3细胞阳性）就认为为是阳性。
显然，如上述所阐明的那样，对于本发明作多处修正和改变将不会超出本发明的基本思想和范围。仅以实例给出了特别的具体描述，本发明仅限于由附加权限条款所限定的那些。
这里所描述的L20细胞系已存入American    Type    Tissue    Culture    Collection，Rockville，Maryland，登记号为ATCC    NoHB8913。此处描述和要求的发明并不限于所存入的细胞系，因为所存入的具体实例仅为本发明一个方面的描述，而任何能产生功能等价单克隆抗体的等价活细胞都在本发明范围之内。事实上，除了这里描述的以外的对于本发明的各种修改显然将属于前文所述的范围。这些修改都在所要求权项范围之内。

Claims (31)

1、一种生产与人的非小细胞肺癌细胞的细胞表面糖蛋白抗原上的决定簇位点结合的单克隆抗体的方法，包括：
a)增殖具有A.T.C.C.
Figure 87100927_IMG1
H B8913性状的杂交瘤，通过使(i)来自用胸膜渗出液免疫的动物脾的抗体产生细胞，即人工培养细胞，或非小细胞肺癌患者的肺组织与(ii)骨髓瘤细胞融合得到杂交瘤；和
b)收集由杂交瘤细胞产生的单克隆抗体。
2、按照权利要求1的方法，其中杂交瘤在活体内增殖。
3、按照权利要求2的方法，其中通过给BALB/C鼠注射准备好的姥鲛烷并使腹水肿瘤生长来增殖杂交瘤，分泌到腹水中的单克隆抗体通过在蛋白A琼脂糖上的吸附或凝胶过滤得到纯化。
4、按照权利要求1的方法，其中产生的单克隆抗体与人的非小细胞肺癌细胞的细胞表面糖蛋白抗原上的决定簇位点结合，通过聚丙烯酰胺凝胶电泳测得抗原的分子量约为110，000道尔顿并且具有下列氨基末端的氨基酸顺序：
1  5  10  15
L-X-V-Q-V-P-E-X-P-V-V-A-L-V-G-
20
T-D-A-X-L
其中X代表未鉴定出的氨基酸。
5、按照权利要求4的方法，其中杂交瘤包括杂交瘤细胞株L20，A.T.C.C.HB8913号。
6、按照权利要求5的方法，其中产生的单克隆抗体属于IgG类。
7、按照权利要求6的方法，其中产生的单克隆抗体属于IgG1亚类。
8、一种生产与人的非小细胞肺癌细胞的细胞表面糖蛋白抗原上的决定簇位点结合的单克隆抗体的方法，包括：
a）增殖通过使得自非小细胞肺癌患者的抗体产生细胞不灭而获得的转化B细胞系;和
b）收集由转化B细胞系产生的单克隆抗体。
9、按照权利要求8的方法，其中通过爱泼斯坦-巴氏病毒（EBV）感染使抗体产生细胞不灭。
10、一种生产与人的非小细胞肺癌细胞的细胞表面糖蛋白抗原上的决定簇位点结合的单克隆抗体的方法，包括：
a）增殖通过使（ⅰ）转化的B细胞株与（ⅱ）骨髓瘤细胞融合而获得的杂交瘤，转化的B细胞株是通过使得自非小细胞肺癌患者的抗体产生细胞不灭而获得的;和
b）收集由杂交瘤细胞产生的单克隆抗体。
11、按照权利要求10的方法，其中通过EBV感染使抗体产生细胞不灭。
12、按照权利要求8的方法，其中产生的单克隆抗体与人的非小细胞肺癌细胞的细胞表面糖蛋白抗原上的决定簇位点结合，通过聚丙烯酰胺凝胶电泳测得抗原的分子量约为110，000道尔顿并且氨基末端的氨基酸顺序如下：
1  5  10  15
L-X-V-Q-V-P-E-X-P-V-V-A-L-V-G-
20T-D-A-X-L
其中X代表未鉴定出的氨基酸。
13、按照权利要求10的方法，其中产生的单克隆抗体与人的非小细胞肺癌细胞的细胞表面糖蛋白抗原上的决定簇位点结合，通过聚丙烯酰胺凝胶电泳测得抗原的分子量约为110，000道尔顿并且氨基末端的氨基酸顺序如下：
1  5  10  15
L-X-V-Q-V-P-E-X-P-V-V-A-L-V-G-
20T-D-A-X-L
其中X代表未鉴定出的氨基酸。
14、按照权利要求4的方法，其中产生的单克隆抗体属于IgG类。
15、按照权利要求12的方法，其中产生的单克隆抗体属于IgG类。
16、按照权利要求13的方法，其中产生的单克隆抗体属于IgG类。
17、按照权利要求14，15或16的方法，其中产生的单克隆抗体属于IgG1亚类。
18、一种生产与人的非小细胞肺癌细胞的细胞表面糖蛋白抗原上的决定簇位点结合的单克隆抗体的方法，通过聚丙烯酰胺凝胶电泳测得抗原的分子量约为110，000道尔顿并且氨基末端的顺序如下：
1  5  10  15
L-X-V-Q-V-P-E-X-P-V-V-A-L-V-G-
20
T-D-A-X-L
其中X代表未鉴定出的氨基酸，该方法包括：
a）增殖杂交瘤细胞株L20，A.T.C.C.HB8913号，该杂交瘤细胞株是通过使（ⅰ）得自用人的肺癌3082细胞免疫的BALB/C鼠的脾脏的抗体产生细胞与（ⅱ）NS1鼠骨髓瘤细胞融合而获得的;和
b）收集由杂交瘤产生的单克隆抗体。
19、按照权利要求1，8或10的方法，其中单克隆抗体与人的乳癌细胞的细胞表面糖蛋白抗原上的决定簇位点结合。
20、按照权利要求1，8或10的方法，其中单克隆抗体与人的结肠癌细胞的细胞表面糖蛋白抗原上的决定簇位点结合。
21、一种生产与人的胸癌细胞的细胞表面糖蛋白抗原上的决定簇位点结合的单克隆抗体的方法，包括：
a）增殖具有A.T.C.C.HB8913号性状的杂交瘤，该杂交瘤是通过使（ⅰ）来自用胸膜渗出液免疫的动物脾的抗体产生细胞，即人工培养细胞，或非小细胞肺癌患者的肺组织与（ⅱ）骨髓瘤细胞融合而获得的;和
b）收集由杂交瘤产生的单克隆抗体。
22、一种生产与人的结肠癌细胞的细胞表面糖蛋白抗原上的决定簇位点结合的单克隆抗体的方法，包括：
a）增殖具有A.T.C.C.HB8913号性状的杂交瘤，该杂交瘤是通过使（ⅰ）来自用胸膜渗出液免疫的动物脾的抗体产生细胞，即人工培养细胞，或非小细胞肺癌患者的肺组织与（ⅱ）骨髓瘤细胞融合而获得的;和
b）收集由杂交瘤产生的单克隆抗体。
23、一种检测可能含有恶性细胞的样品中的恶性细胞的方法，包括：
a）在使单克隆抗体与决定簇位点结合的反应条件下使样品与按照权利要求1，4，5，8或10的方法生产的单克隆抗体接触;
b）从样品中除去未结合的单克隆抗体分子;和
c）检验样品中结合的单克隆抗体的存在，其中单克隆抗体的结合表明样品中恶性细胞的存在。
24、按照权利要求23的方法，其中恶性细胞包括非小细胞肺癌细胞。
25、按照权利要求24的方法，其中样品包括肺组织。
26、按照权利要求23的方法，其中恶性细胞包括胸癌细胞。
27、按照权利要求23的方法，其中恶性细胞包括结肠癌细胞。
28、按照权利要求23或24的方法，其中通过免疫组织学染色检测结合。
29、一种在活体内确定人的非小细胞肺癌的位置的方法，包括：
a）提纯按照权利要求1，4，5，8或10的方法生产的单克隆抗体;
b）放射标记单克隆抗体;
c）用合适的载体供给患者这种单克隆抗体;和
d）通过外闪烁法，放射X线断层术或放射性核扫描确定单克隆抗体的位置。
30、非小细胞癌的免疫治疗方法，包括：
a）提纯按照权利要求1，4，5，8或10的方法生产的单克隆抗体;
b）使单克隆抗体与细胞毒素剂，即一种毒素，或放射性药物结合;和
c）用合适的载体供给肺癌患者这种结合的单克隆抗体。
31、一种治疗表达由L20抗体所限定的抗原的肿瘤的免疫治疗方法，包括：
a）提纯按照权利要求1，4，5，8或10的方法生产的单克隆抗体;
b）制备对单克隆抗体的抗个体基团型抗体;和
c）用合适的载体供给肺癌患者这种抗个体基因型抗体。
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Cited By (4)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN101732333B (zh) * 2000-07-28 2012-08-15 大日本住友制药株式会社 癌症治疗药
CN102791736A (zh) * 2009-09-23 2012-11-21 艾斯可勒皮恩有限公司 用于癌症治疗的dsg2拮抗剂
WO2013063874A1 (zh) * 2011-11-03 2013-05-10 Pan Shiyang 抗人非小细胞肺癌单克隆抗体及其应用
CN103221419A (zh) * 2010-09-17 2013-07-24 独立行政法人产业技术综合研究所 肺癌鉴定标志物

Families Citing this family (18)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
DE3531301A1 (de) * 1985-09-02 1987-03-05 Behringwerke Ag Monoklonale antikoerper gegen tumorassoziierte glykoproteine, verfahren zu ihrer herstellung sowie ihre verwendung
JPH0813840B2 (ja) * 1987-03-31 1996-02-14 協和醗酵工業株式会社 抗ヒト肺腺癌単クロ−ン性抗体
US5134075A (en) * 1989-02-17 1992-07-28 Oncogen Limited Partnership Monoclonal antibody to novel antigen associated with human tumors
US5171665A (en) * 1989-04-17 1992-12-15 Oncogen Monoclonal antibody to novel antigen associated with human tumors
US5342774A (en) * 1991-05-23 1994-08-30 Ludwig Institute For Cancer Research Nucleotide sequence encoding the tumor rejection antigen precursor, MAGE-1
US5589579A (en) * 1994-07-19 1996-12-31 Cytoclonal Pharmaceutics, Inc. Gene sequence and probe for a marker of non-small cell lung carinoma
DE69831522T2 (de) 1997-03-03 2006-06-14 Amersham Biosciences Uk Ltd In-situ Zellextraktion und Assay-Verfahren
DE19725133A1 (de) * 1997-06-13 1998-12-17 Micromet Ges Fuer Biomedizinis Nachweis von seltenen Zellen
US20050089918A1 (en) * 1998-02-23 2005-04-28 Amersham Biosciences Uk Limited In-situ cell extraction and assay method
US6117981A (en) * 1999-06-03 2000-09-12 Cytoclonal Pharmaceutics, Inc. Hybridomas for lung cancer marker and monoclonal antibodies thereof
AU7337400A (en) * 1999-09-03 2001-04-10 Human Genome Sciences, Inc. B7-like polynucleotides, polypeptides, and antibodies
WO2001094413A2 (en) 2000-06-06 2001-12-13 Bristol-Myers Squibb Company B7-related nucleic acids and polypeptides and their uses for immunomodulation
CN101724072B (zh) * 2008-10-27 2013-10-09 谷为岳 一种抗肿瘤的单克隆抗体的序列及应用
US8802091B2 (en) 2010-03-04 2014-08-12 Macrogenics, Inc. Antibodies reactive with B7-H3 and uses thereof
SG183847A1 (en) 2010-03-04 2012-10-30 Macrogenics Inc Antibodies reactive with b7-h3, immunologically active fragments thereof and uses thereof
EP3442574A4 (en) 2016-04-15 2019-12-11 MacroGenics, Inc. NOVEL B7-H3 BINDING MOLECULES, THEIR ANTIBODY-MEDICINAL CONJUGATES AND METHODS OF USE
CN111662371B (zh) * 2020-04-30 2023-07-04 美康生物科技股份有限公司 细胞角蛋白19片段抗原及其制备方法和应用
CN112300284B (zh) * 2020-12-29 2021-04-06 慈达(广州)生物技术有限公司 核酸筛选结合抗体检测用于癌症检测中的用途及其制备的试剂盒

Family Cites Families (3)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US4569788A (en) * 1983-05-18 1986-02-11 The United States Of America As Represented By The Department Of Health And Human Services Monoclonal antibodies against non small cell lung cancer
ZA858371B (en) * 1984-11-02 1987-03-25 Oncogen Monoclonal antibodies for human non-small cell lung carcinomas
IL76877A (en) * 1984-11-02 1991-11-21 Oncogen Diagnostic method for the determination of human non-small cell lung carcinomas employing novel monoclonal antibodies and compositions containing said antibodies

Cited By (5)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN101732333B (zh) * 2000-07-28 2012-08-15 大日本住友制药株式会社 癌症治疗药
CN102791736A (zh) * 2009-09-23 2012-11-21 艾斯可勒皮恩有限公司 用于癌症治疗的dsg2拮抗剂
CN103221419A (zh) * 2010-09-17 2013-07-24 独立行政法人产业技术综合研究所 肺癌鉴定标志物
CN103221419B (zh) * 2010-09-17 2015-12-09 独立行政法人产业技术综合研究所 肺癌鉴定标志物
WO2013063874A1 (zh) * 2011-11-03 2013-05-10 Pan Shiyang 抗人非小细胞肺癌单克隆抗体及其应用

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Publication number Publication date
YU25787A (en) 1990-12-31
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