NO174719B - Fremgangsmaate for fremstilling av monoklonale antistoffer - Google Patents

Description

Foreliggende oppfinnelse angår en fremgangsmåte for fremstilling og anvendelse in vivo og in vitro av et hittil ukjent monoklonalt antistoff som er spesifikt for carcinoma-antigener. Nærmere bestemt bindes det monoklonale antistoff fremstilt ifølge oppfinnelsen til en determinantplass på et celleoverflate-glycoprotein-antigen fra humane, ikke-småcellede lungecarcinomaceller, humane brystcarcinomaceller eller humane tykktarmcarcinomaceller.

Det monoklonale antistoff fremstilt ifølge oppfinnelsen er reaktivt med en determinant av et glycoprotein-antigen assosiert med NSCLC-celler og også med andre carcinomer, herunder brystcarcinoma, tykktarmcarcinoma og småcellet lungecarcinoma. Det monoklonale antistoff fremstilt ifølge oppfinnelsen er i besittelse av karakteristiske egenskaper og evner som gjør et slikt antistoff egnet til kliniske diagnoseformål både in vivo og in vitro. Antistoffet kan videre f.eks. anvendes som mål-selektiv bærer av forskjellige midler som har anti-tumoreffekt, omfattende, men ikke begrenset til, kjemoterapeutiske legemidler, toksiner, immunologisk-reaksjonsmodi-fiserende midler og radioisotoper. Enn videre kan de hybridomer som produserer slike antistoffer, modifiseres under anvendelse av rekombinant-DNA-teknologi slik at de resulterende antistoffer kan formidle antistoff-avhengig cellulær cytotoksisitet, eller kan være cytolyttiske overfor tumorceller i nærvær av komplekskomponenter.

Lungecarcinomer er ansvarlige for størstedelen av dødsfall på grunn av cancer hos menn og er i ferd med å overstige brystcancer som den mest hyppige årsak til cancer-død blant kvinner. Denne sykdom kan oppdeles i fire histologiske hovedtyper: (1) epidermoid eller squamocellulær carcinoma (30%), (2) adenocarcinoma (35%), (3) udifferensi-ert storcellet carcinoma (15%) og (4) småcellet carcinoma (20%). Uttrykket ikke-småcellet lungecarcinoma ("NSCLC") omfatter følgende celletyper: epidermoide carcinomaceller, adenocarcinomaceller og udifferensierte store carcinomaceller.

De fleste tilfeller av lungecarcinomer kan ikke hel-bredes ved kjemoterapi og radioterapi. Småcellede lungecarcinomer kan reagere på kjemoterapi og radioterapi ved en reduksjon i størrelse, men dette gir ikke en fullstendig helbredelse. Fullstendig fjerning av tumoren ved operasjon synes å være den eneste virksomme behandling. Dessverre har mindre enn 30% av pasienter med lungecancer imidlertid tumorer som kan resekteres ved diagnose. Av disse overlever mindre enn 1/3 5 år etter tilsynelatende fullstendig fjerning av tumoren ved operasjon. Det er derfor et stort behov for metoder som kan muliggjøre en tidligere diagnose av lungecancer, en bedre bestemmelse av graden av spredning av cancer og en mer virksom behandling.

Monoklonale antistoffer som representerer homogene antistoffmolekyler som bindes til en enkelt molekylær plass (dvs. en epitop) på et antigen med en spesifikk bindings-eller affinitetskonstant, fremstilles ved hjelp av 3 metoder som er kjente innen teknikken.

Monoklonale antistoffer kan fremstilles ved hjelp av hybridomateknikk som beskrevet av Kohler & Milstein (1975, Nature 256: 495, 1976, Eur. J. Immunol. 6:511). Ved fusjon av antistoffproduserende celler (miltlymfocytter) med myelomaceller skapte Kohler og Milstein hybridceller, hvorved det oppsto udødelige cellelinjer som både var i besittelse av evnen til å produsere antistoff og evnen til å vokse permanent i cellekulturer. Hybridomene utskiller en enkelt type immunoglobulin med en på forhånd definert antigen-spesifisitet avhengig av det antigen overfor hvilket lymfo-cyttene tidligere er blitt eksponert.

Alternativt kan monoklonale antistoffer fremstilles ved in vitro-transformasjon av B-lymfocytter fra perifert blod fra pattedyr, f.eks. med Epstein Barr-virus (EBV). Nevnte virus udødeliggjør de antistoffproduserende lymfocytter. Metoder for en slik omdannelse er kjent innen teknikken (se f.eks. Steinmetz et al., 1977, Nature 269, 420, Crawford et al., 1983, The Lancet, i:386).

Endelig kan monoklonale antistoffer produseres

under anvendelse av teknikk som kombinerer både EBV-udødelig-gjørelsen og cellefusjon eller hybridomateknikk. Cole et al., (1985, i Monoclonal Antibodies and Cancer Therapy,

Alan Liss, Inc., side 77-96) beskriver metoder for fusjon

av en human plasmacytoma- eller lymfoblastoid-cellelinje-fusjonspartner med EBV-transformerte donorlymfocytter som

på forhånd er blitt etablert som en cellelinje. I et slikt system er begge foreldre-cellelinjer udødelige. Følgelig skal en fusjonspartner inneholde passende legemiddelmarkører til kontra-utvelgelse mot foreldrelinjene når de fusjonerte hybridomer dyrkes. De resulterende EBV-hybridomer produserer antistoffer med den anvendte EBV-lymfocyttcellelinjes spesifisitet.

Monoklonale antistoffer kan fremstilles i store mengder ved in vitro celledyrkning av særlige hybridomacellelinjer eller transformerte cellelinjer. Enn videre kan inokulering med en hybridomacellelinje i det peritoneale hulrom hos forenlige pattedyr slik som mus, resultere i en tumor som utskiller høye konsentrasjoner (1-20 mg/ml) av monoklonalt antistoff i tumor-ascitesvæsken. Ved fjerning av ascitesvæsken og rensing av det monoklonale antistoff kan en enkelt mus tilveiebringe tilstrekkelig antistoff for anvendelse ved tusenvis av diagnoseforsøk.

Monoklonale antistoffer mot humane lungecancer-antigener er blitt beskrevet av Sikora et al., 1981, Brit. J. Cancer 43: 696, Cuttita et al., 1981, Proe. Nat'l. Acad. Sei. USA 78:4591, Moody et al., 1981, Science 214, Minna et al., 1981, In vitro, 17:1058, Kennel et al., 1981, Cancer Res. 41:3465, Chem. Abstr. 95 (15):1308502, Baylin et al., 1982, Proe. Nat'l. Acad. Sei. USA 79:4650, Carney et al., 1982, Patho-biology Annual, 12:115, Gazdar et al., 1983, Seminars in Oncology 10:3, Hollinshead et al., 1983, Cancer Detect. Prevent 6:185, Mulshine et al., 1983, J. Immunol. 131:497, Huang et al., 1983, Arch. Biochem. Biophys. 220:318, Saji et al., 1984, Hybridoma 3:119, Bio. Abstr. 79005569, Bosslet et al., Behring Inst. Mitt. 74:27, Chem. Abstr., AC10K9): 706686, Roset et al., 1984, Cancer Res. 44:2052, Bio. Ast. 79023605, Princler et al., 1982, Cancer Res. 42:843,

Mazauric et al., 1982, Cancer Res. 42:150, Braatz et al., 1982, Cancer Res., 42:849, Sobel et al., 1982, Fed. Proe, 41:409, Cole et al., 1985, Monoclonal Antibodies and Cancer Therapy, Alan Liss, Inc., side 77-96 og Varki et al., 1985,

i Monoclonal Antibodies and Cancer Therapy, Alan Liss, Inc., side 207.

US-patentsøknad nr. 667.521, 785.177, 684.759, 776.321 og 738.612 beskriver visse monoklonale antistoffer overfor humant, ikke-småcellet lungecarcinoma.

Monoklonale antistoffer kan anvendes ved metoder som vil kunne muliggjøre en tidligere diagnose av lungecancer,

en bedre bestemmelse av spredningen av cancer og mer virksomme metoder for behandling av lungecancer. En forutset-ning er imidlertid å finne antistoffer mot antigener som er kraftigere uttrykt i lungecancervev enn i normalt vev fra voksne. I betraktning av den kjente heterogenitet hos tumorcellepopulasjoner, tilstedeværelsen av forskjellige determinanter på samme antigenmolekyl, de forventede forskjeller mellom antigener med hensyn til deres stabilitet som diagnosemarkører og terapeutiske mål, og de forskjellige biologiske karakteristika hos forskjellige antistoffer mot samme antigen, kan det være nødvendig med et antall forskjellige antistoffer mot et antall forskjellige antigener.

Foreliggende oppfinnelse angår en fremgangsmåte for fremstilling av en hittil ukjent klasse av monoklonalt antistoff, illustrert ved L20, som er spesifikt for et determi-nantsted på et glycoproteinantigen assosiert med humane, ikke-småcellede lungecarcinomaceller (NSCLC). Uttrykket "NSCLC-celler" omfatter epidermoide carcinomaceller, adenocarcinomaceller og udifferensierte, storcellede carcinomaceller. Determinant stedet kan også finnes på antigener av enkelte andre carcinomer, f.eks. enkelte bryst- og tykktarmscarcinomer og småcellet lungecarcinoma. Det her omhandlede antistoff vil således også bindes til celler fra andre carcinomer og være anvendelig til diagnose av alle andre tumorer som uttrykker det antigen som identifiseres med antistoff L20. Det her omhandlede monoklonale antistoff bindes i meget mindre grad til normale voksne celler enn til tumorceller. Uttrykket "bindes i meget mindre grad" betyr at bindingen overhodet ikke vil være påviselig, eller bare vil være påviselig som et meget svak farging når det anvendes immunohistologisk teknikk. Antistoffet har således en høy grad av spesifisitet overfor antigen som er karakteristisk for NSCLC og visse andre carcinomer.

Ved foreliggende oppfinnelse beskrives også det hittil ukjente L20-antigen identifisert ved antistoff L20, og den klasse av antistoffer som bindes hertil, er immunospesifikk for, eller immunoreaktiv med dette antigen. Fremgangsmåten ifølge foreliggende oppfinnelse er kjennetegnet ved at

a) en hybridoma med identifiserende karakteristika som ATCC nr. HB 8913, hvilken hybridoma er oppnådd ved fusjon

av (i) en antistoffproduserende celle som stammer fra milten av dyr immunisert med pleurale effusjoner, dyrkede celler eller lungevev fra en pasient med ikke-småcellet lungecarcinoma, og med (ii) en myeloma-celle, formeres og

b) de monoklonale antistoffer av IgG-klassen, under-klasse IgGl, hybridomen, som bindes til et antigen, høstes, hvilket antigen ved polyacrylamidgelelektroforese utviser følgende aminosyresekvens i aminoterminaldelen:

hvori X betegner en uidentifisert aminosyre.

Foreliggende oppfinnelse angår også anvendelse av et monoklonalt antistoff, fremstilt ved fremgangsmåten ifølge krav 1, til in vitro-påvisning av ondartede celler i en prøve som er mistenkt for å inneholde slike celler, hvori

a) prøven bringes i kontakt med det monoklonale antistoff under slike reaksjonsbetingelser at det monoklonale

antistoff bindes til determinantplassen,

b) ubundne monoklonale antistoffmolekyler fra prøven fjernes, og c) prøven undersøkes for nærvær av bundet monoklonalt antistoff, hvorved bindingen av det monoklonale antistoff ved immunhistologisk farging indikerer nærvær av ond artede celler omfatter ikke-småcellede lungecarcinomaceller i lungevev, brystcarcinomaceller eller tykktarmcarcinomaceller.

L20-antistoffet og tilsvarende antistoffer kan reagere med det L20-antigen som ved ekspresjon produseres i høye konsentrasjoner på overflaten av tumorcellene. Antistoffer kan derfor anvendes som bærere for forskjellige midler som har en antitumor virkning, herunder, men ikke begrenset til, kjemoterapeutiske midler, toksiner, immunologisk reak-sjonsmodifiserende midler og radioisotoper.

Enn videre kan L20-antistoffet modifiseres slik at det kan formidle antistoffavhengig cellulær cytotoksisitet (ADCC), dvs. at det kan drepe NSCLC-celler i nærvær av humanlymfocytter eller -makrofager, eller at det blir cyto-lyttisk overfor tumorceller i nærvær av humankomplement.

En slik modifikasjon kan f.eks. oppnås ved en teknikk som nylig er utviklet for produksjon av "kimære antistoffer". Følgelig spleises gener som koder for det variable området

av L20-antistoffmolekylet, sammen med humangener som koder for Fc-området av et antistoff med en passende biologisk aktivitet (slik som evnen til å aktivere humankomplement og formidle ADCC). Hittil ukjente antistoffer av museopprinn-else eller human opprinnelse med passende biologiske funksjoner kan også fremstilles mot L20-antigenet.

Metoder for fremstilling av monoklonalt antistoff overfor

NSCLC

Monoklonale antistoffer mot humant NSCLC og

visse andre humane carcinomer kan fremstilles ved hybridomafusjonsteknikk, ved EBV-transformasjon av humane antistoffproduserende lymfocytter, eller ved teknikk som kombinerer cellefusjon og EBV-udødeliggjørelsesteknikk.

Fusjonsteknikk

Ifølge en utførelsesform av foreliggende oppfinnelse fremstilles monoklonale antistoffer mot NSCLC under anvendelse av hybridoma-cellefusjonsteknikk. Eksempelvis anvendes humane lungecarcinomaceller fra pleurale effusjoner, dyrkede celler fra eksplanterte humane NSCLC-tumorer eller celler fra en normal fosterlunge eller lysater fra slike celler som immunogen. I et illustrativt eksempel anvendes eksplanterte celler fra en NSCLC, humant lunge-adenocarcinoma nr. 3082 som immunogen (se under eksemplene). Cellene injiseres eksempelvis i en mus, og etter tilstrekkelig tid avlives musen, og det oppnås somatiske antistoffproduserende lymfocytter. Antistoffproduserende celler kan utledes fra lymfekjertler, milt og perifert blod fra disse behandlede dyr. Det foretrekkes miltceller. Muselymfocytter gir en høyere prosent av stabile fusjoner med de musemyelomer som beskrives i det etterfølgende. Anvendelse av somatiske celler fra rotter, kaniner og frosk, er også mulig. De milt-cellekromosomer som innkoder ønskede immunoglobuliner, gjøres udødelige ved fusjon av miltcellene med myelomaceller, vanligvis i nærvær av polyethylenglycol. Det kan anvendes flere myelomacellelinjer for fremstilling av fusjonerte cellehybrider, herunder NSI-Ag4/l, X63-Ag8, MPC11-45.6TG1.7, X63-Ag.653, Sp2/0-Agl4, Fo og S194/5XXO.BU.1 som stammer fra mus, og 210.RCY3.Agl.2.3, U-226AR og GM1500GTGAL2 som stammer fra rotter (Hammerling et al., 1981, Monoclonal Antibodies and T-Cell Hybridomas, i Research Monographs in Immunology, bind 3, J.L. Tucker, red., Elsevier/North Holland Biomedical Press, New York). I et illustrativt eksempel anvendes NSl-celler (se eksempler). De resulterende celler som omfatter fusjonerte hybridomer, får vokse i et selektivt medium, slik som et HAT-medium, og de overlevende celler dyrkes i et slikt medium med begrensede fortynnings-betingelser. Cellene dyrkes i en egnet beholder, f.eks. i mikrotiterbrønner, og supernatanten screenes for monoklonale

antistoffer med den ønskede spesifisitet.

Det foreligger forskjellige konvensjonelle metoder for isolering og rensing av de monoklonale antistoffer slik at de befris for andre proteiner og andre urenheter.

EBV- transformasjonsteknikk

Ifølge en alternativ utførelsesform av foreliggende oppfinnelse fremstilles antistoffer mot NSCLC under anvendelse av EBV-transformasjonsteknikk. Eksempelvis udødelig-gjøres lymfocytter som stammer fra perifert blod, tumor-drenerende lymfeknuter, benmargaspirater, tumorer eller pleuraleffusjoner fra pasienter med NSCLC under anvendelse av EBV ifølge de metoder som er beskrevet av Cole et al., 1984, Cancer Research, 44:2750. Som bemerket av Cole et al., er B-lymfocytter som er spesifikke for tumorantigener, sjeldne hos pasienter med lungecancer. Følgelig er det særlig viktig å øke antallet av lymfocytter som produserer antistoff ved på forhånd utvelgelse av lymfocytter som produserer antistoff mot det relevante antigen. EBV-trans-formasjoner omfatter således to trinn: (1) berikelse av celler med reseptorer for det gitte antigen, dvs. L20-antigen beskrevet i det etterfølgende, og (2) udødeliggjørelse av slike celler ved infeksjon med EBV.

EBV- hybridomateknikk

Ifølge en annen alternativ utførelsesform av oppfinnelsen fremstilles monoklonale antistoffer mot NSCLC under anvendelse av en kombinasjon av EBV-transformasjonsteknikk og hybridomafusjonsteknikk som beskrevet av Cole et al., 1985, i Monoclonal Antibodies and Cancer Therapy, Alan R. Liss, Inc., side 77-96. Eksempelvis fusjoneres en myeloma-cellelinje med donorlymfocytter fra NSCLC-pasienter som tidligere er blitt omdannet ved EBV og etablert som en cellelinje som er i stand til å gro og utvikle seg under dyrkningsbetingelser. Til utvelgelse av de resulterende EBV-hybridomafusjonscellelinjer er det nødvendig at fusjons-partneren er i besittelse av dominante, passende, valgbare legemiddelmarkører, slik som ouabain- eller neomycin-resistens, slik at foreldreceller ikke utvikles ved dyrkning av de fusjonerte hybridomacellelinjer. En egnet linje er den thioguamin-resistente GM-150, ouabain-resistente lymfoblastoid-cellelinje KR4, beskrevet av Cole et al.. De resulterende hybridomer klones ved konvensjonell teknikk.

Celleformering , og antistoffproduksjon

Når de ønskede fusjonerte cellehybrider eller transformerte cellelinjer er blitt utvalgt og klonet i individuelle antistoffproduserende cellelinjer, kan hver celle formeres på to konvensjonelle måter. Den individuelle cellelinje kan formeres in vitro, f.eks. i labora- torie-dyrkningsbeholdere, og kulturmediet inneholdende store konsentrasjoner av et enkelt spesifikt monoklonalt antistoff kan høstes ved dekantering, filtrering eller sentrifugering. Alternativt kan utbyttet av monoklonalt antistoff økes ved injeksjon av en prøve av angjeldende hybridoma i et histoforenlig dyr av den type som anvendes for tilveiebringelse av somatiske celler og myelomaceller ved den opprinnelige fusjon. Tumorer som utskiller det spesifikke antistoff som produseres av det fusjonerte cellehybrid, utvikles i det ved injeksjon behandlede dyr. Kroppsvæske fra dyret, slik som ascitesvæske eller serum, tilveiebringer monoklonale antistoffer i store konsentrasjoner. Som beskrevet ovenfor av Cole et al., er det ved anvendelse av humane hybridomer eller EBV-hybridomer, nødvendig å unngå avvisning av det i dyr, slik som mus, injiserte xenograft. Immunosvekkede eller nakne mus kan anvendes, eller hybridomer kan først overføres til bestrålte, nakne mus som en fast subkutan tumor dyrket in vitro, og deretter injiseres intraperitonealt i pristanbehandlede, bestrålte, nakne mus som utviklet ascitestumorer som utskiller store mengder spesifikke humane monoklonale antistoffer (se Cole et al., ovenfor).

Monoklonale antistoffer

Antistoffet fremstilt ifølge foreliggende oppfinnelse bindes til et hittil ukjent celleoverflate-glycoprotein-antigen som betegnes L20-antigen, og som er karakteristisk for humane NSCLC-celler og celler fra visse andre humane carcinomer (se ovenfor). Glycoprotein-antigenet har en molekylvekt på ca. 110.000 dalton når det underkastes immunoutfelling og polyacrylamidgel-elektroforese (se nedenfor). Nedbrytning av L20-antigenet med glycanase viser at det inneholder N-bundne oligosaccharidkjeder.

Som et illustrativt eksempel på foreliggende oppfinnelse produseres L20-antistoffet ved hjelp av den nedenfor beskrevne L20-musehybridoma. L20-antistoffet er av IgGl-isotypen og (se nedenfor) har en aviditet på ca. 3 x 10 . Det bindes ikke i påviselig grad til normale celler slik

som fibroblastceller, endotelceller eller epitelceller i

hovedorganer. Ved "bindes ikke i påviselig grad" menes at det bare kan påvises en meget svak farving eller over hodet ingen farving ved immunhistologi.

Innenfor foreliggende oppfinnelses ramme faller også fremstilling av anvendelige bindingsfragmenter av ovenfor angitte monoklonale antistoff, slik som Fab-, F(ab')2-, Fv-fragmenter, etc. Antistoff-fragmentene oppnås ved konvensjonell teknikk. Anvendbare bindingsfragmenter kan eksempelvis fremstilles ved peptidasenedbrytning av antistoffet under anvendelse av papain eller pepsin.

Lignende antistoffer, herunder antistoffer av forskjellige isotyper, med forskjellig affinitet og hittil ukjente biologiske funksjoner, slik som evnen til å destruere tumorceller i nærvær av komplementceller eller effektor-celler, slik som lymfocytter eller makrofager, faller også innenfor rammen av foreliggende oppfinnelse. Selv om det ovenfor angitte spesifikke eksempel på et hittil ukjent antistoff ifølge oppfinnelsen angår et antistoff som bindes til en spesifikk determinantplass på det respektive antigen, og er av IgGl-underklassen fra en musekilde, skal dette ikke oppfattes som en begrensning av oppfinnelsens ramme. Ovenfor angitte antistoff og de antistoffer som har funksjonell likhet med det ovennevnte antistoff, enten fra en musekilde, annen pattedyrkilde, herunder human, eller andre kilder eller kombinasjoner derav, er omfattet av oppfinnelsens ramme, slik som også antistoffer av andre isotyper. Ved uttrykket "funksjonell likhet" menes at antistoffet kan bindes til ovenfor angitte determinantplass og er i stand til å konkurrere med et særlig antistoff ifølge oppfinnelsen om en slik plass. Det vil si at et slikt antistoff, hvis det kombineres med en prøve inneholdende en celle eller et cellefragment med en slik determinantplass, vil bindes til en slik determinantplass og vil forhindre at et antistoff ifølge oppfinnelsen bindes til en slik plass. Da antigenet ifølge oppfinnelsen kan ha mer enn én determinantplass, omfatter oppfinnelsen enn videre monoklonale antistoffer som bestemmer determinantplasser som er forskjellige fra deter-minantplassene bestemt av ovennevnte monoklonale antistoff, og som kan identifiseres ved sekvens-immunoutfellings-

analyser som er kjent innen faget.

Foreliggende oppfinnelse omfatter også fremstilling av antistoffer som reaksjon på antigenbindingsplasser eller idiotyper av L20-antistoffet, idet slike anti-idiotype antistoffer for diagnoseformål kan anvendes for analyse av immunreaksjonen med tumorantigener, og til fremkallelse av immunreaksjoner med terapeutiske eller profylaktiske formål (Nepom et al., 1984, Proe. Nat'l. Acad. Sei. 81:2664).

L20- antigen gjenkjent av monoklonale antistoffer

Det antigen som gjenkjennes av de her omhandlede monoklonale antistoffer, omfatter et hittil ukjent celleoverflate-glycoproteinantigen som er karakteristisk for NSCLC-celler, og visse andre carcinomer, herunder bryst- og tykktarmscarcinoma samt småcellet lungecarcinoma. Antigenet har en molekylvekt på ca. 110.000 dalton.

Aminosyresekvensen i aminoterminaldelen av det hittil ukjente glycoprotein-antigen er som følger:

hvori X betegner en aminosyre som ennå ikke er blitt identifisert, og resten av bokstavene representerer de konvensjonelle, enkeltbokstavsforkortelser for aminosyrer. En sammenligning av denne sekvens med sekvenser oppbevart i en proteindatabase (PIR Release 6,0, november 1985), avslører ingen signifikant sekvenshomologi med andre kjente sekvenser.

Anvendelse av monoklonale antistoffer og L20- antigenet Diagnostisk anvendelse

De monoklonale antistoffer fremstilt ifølge oppfinnelsen kan anvendes som prober til påvisning av adskilte antigener i humane NSCLC-tumorer og andre humane tumorer. En anvendelse ifølge oppfinnelsen omfatter bestemmelse av nærvær av en ondartet tilstand i lungevev og andre humane vev, ved undersøkelse av vevet for ekspresjon av eller mangel på ekspresjon av et glycoprotein-antigen med karakteristika som L20-antigenet. Uttrykket "med karakteristika som" betyr at antigenet er reaktivt med et antistoff som gjenkjenner L20-antigenet. Ekspresjon eller mangel på ekspresjon av dette antigen kan tilveiebringe klinisk nyttig informasjon som ikke er tilgjengelig med standardhistopatologisk teknikk.

Monoklonale antistoffer fremstilt ifølge oppfinnelsen kan eksempelvis anvendes til påvisning av ikke-småcellede lungecarcinomaceller i histologiske eller cytologiske prøver. Ved anvendelse av den immunoperoxydase-fargningsteknikk som beskrives i det etterfølgende, gir f.eks. uttatte vevs-prøver av adenocarcinoma, epidermoidcarcinoma og småcellet lungecarcinoma, intens positiv farging. Normal lunge, milt, bryst, tykktarm, nyrer, lever, hjerne, hjerte, hud, skjold-bruskkjertel, testis, vagina og normale lymfocytter er negative.

En annen viktig in vitro-diagnoseanvendelse av de monoklonale antistoffer fremstilt ifølge oppfinnelsen er vurdering av andre carcinomer enn NSCLC. Antistoffet er blitt anvendt til påvisning av epitopen ved carcinomer i bryst og tykktarm og ved småcellet lungecarcinoma. Normale prøver av dette vev uttrykker ikke determinanten. Det monoklonale antistoff er således anvendelig for påvisning av en antigendeter-minant som er tumorassosiert ved disse carcinomer. Det monoklonale antistoff kan således være et anvendbart diagnose-reagens for bryst- og tykktarmscarcinoma og småcellet lungecarcinoma .

Alternativt kan immunofluorescensteknikk anvendes for undersøkelse av humane vevsprøver med de monoklonale antistoffer. Ved en typisk undersøkelse lufttørkes preparatglass inneholdende cryostatseksjoner av frosset, ikke-fikserte vevsbiopsiprøver eller uttatte tumorprøver eller cytologiske utstrykningspreparater, og inkuberes med det monoklonale antistoff i et fuktighetskammer ved romtemperatur. De cytologiske utstrykningspreparater omfatter exfoliative celleprøver. Med uttrykket "exfoliativ" menes at prøven inneholder isolerte celler eller klumper av celler oppnådd ved skraping eller vasking av overflaten av vev, hvilke celler fjernes individu-elt i skjell eller tynne plater. Denne exfoliative celleprøve må skjelnes fra det uttatte vev, slik som det som oppnås ved biopsi. Metoden kan finne anvendelse ved påvisning av en ond artet tilstand i exfoliative celleprøver fra lungen, slik som en spyttprøve, fra bronkier, den gastrointestinale traktus, herunder oral farynx, munn, et cervikalt utstrykningspreparat etc.

Etter tørking belegges preparatglasset med et preparat av antistoff mot det monoklonale antistoff, vanligvis en type antimus-immunoglobulin, hvis det anvendte, monoklonale antistoff stammer fra en fusjon av en musemiltlymfocytt og en musemyelomalinje. Dette antimus-immunoglobulin konjugeres under anvendelse av kjent teknikk med en forbindelse slik som rhodamin eller fluorescein-isothiocyanat, som fluores-cerer ved en bestemt bølgelengde. Deretter bestemmes farg-ingsmønsteret og intensitetene innenfor prøven ved fluor-escent lysmikroskopi og opptas eventuelt fotografisk.

Ovennevnte beskrivelse angår primært anvendelse av de her omhandlede antistoffer ved immunofluorescensteknikk. Antistoffene kan imidlertid anvendes ved de fleste undersøk-elser som omfatter antigen-antistoffreaskjoner. Prøvene kan være homogene eller heterogene. Ved en homogen prøve kan prøven være et vev som er lysert og renset for fjerning av rester. Til den immunologiske reaksjon anvendes vanligvis det spesifikke antistoff, et merket analysemiddel og angjeldende prøve. Det signal som kommer fra merket, modifiseres, direkte eller indirekte ved binding av antistoffet til det merkede analysemiddel. Både den immunologiske reaksjon og påvisningen av utstrekningen derav, utføres i en homogen oppløsning. Immunokjemiske merker som kan anvendes, omfatter frie radi-kaler, fluorescente fargestoffer, enzymer, bakteriofager, co-enzymer og lignende.

Ved en heterogen prøve er reagensene vanligvis prøven, det spesifikke antistoff og en anordning til produksjon av et påviselig signal. Det monoklonale antistoff er vanligvis belagt på et fast underlag eller en fast fase. Prøven i en flytende fase bringes deretter i kontakt med antistoffet i den faste fase. Den faste fase separeres deretter fra den flytende fase, og enten den faste fase eller den flytende fase undersøkes for et påviselig signal under anvendelse av anordninger til produksjon av slike signaler. Sig-nalet har forbindelse med tilstedeværelsen av analysemidlet i prøven. Anordninger for produksjon av et påviselig signal omfatter anvendelse av radioaktive merker, fluorescerende merker, enzymer og lignende. Eksempler på heterogene immuno-prøver er radioimmunoprøver, immunofluorescensmetoder, enzym-bundne immunoprøver og lignende.

For en mer detaljert beskrivelse av ovennevnte immuno-prøveteknikk henvises det til "Enzyme-Immunoassay", av Edward T. Maggio, 1980, CRC Press, Inc., Boca Raton,

Florida. Se også f.eks. US patentskrifter 3 690 834,

3 791 932, 3 817 837, 3 850 578, 3 853 987, 3 867 517, 3 901 654, 3 935 074, 3 984 533, 3 996 345 og 4 098 876, hvilken liste ikke skal oppfattes som uttømmende.

Antistoffene fremstilt ifølge oppfinnelsen kan også anvendes til in vivo-diagnoseanvendelser. Eksempelvis kan antistoffer eller fragmenter fremstilt fra antistoffer, f.eks. Fab- og F(ab<1>)2-fragmenter, anvendes til avbildning av tumorer, herunder metastatiske avleiringer i humane pasienter med NSCLC, på en måte som er analog med den som er beskrevet for ondartet melanoma av Larson et al., 1983,

J. Nucl. Med. 24:123, og Larson et al., 1983, J. Clin. Invest., 72:2101. Det rensede antistoff eller fragmenter derav merkes med et middel som gir påviselig signal, f.eks.

131

en radioisotop slik som I, og administreres i en egnet bærer, f.eks. intravenøst, til en pasient. Lokaliseringen av det tumorbundne antistoff påvises ved ekstern scinto-grafi, emisjonstomografi eller radionukleær scanning under anvendelse av f.eks. et7-kamera.

Terapeutisk anvendelse

Antistoffene fremstilt ifølge foreliggende oppfinnelse kan også anvendes terapeutisk. De monoklonale antistoffer kan anvendes i forbindelse med et bredt spekter av farmasøyt-iske eller cytotoksiske midler. Et antistoff kan f.eks. være bundet til et toksin under dannelse av et immunotoksin

(Jansen et al., 1982, Immunol. Rev. 62:185), eller til et radioaktivt materiale, f.eks.<125>I, 131I, etc. (Order, 1984, Compr. Ther. 10:9, Larson et al., 1983, J. Clin. Invest.

72:2101, Carrasquillo et al., 1984, Cancer Treatment Reports, 68:317), eller til et legemiddel (Rowland et al.,

1985, Cancer Immunol. Immunother. 19:1) under dannelse av et radiofarmasøytisk eller farmasøytisk preparat. Konju-gerte antistoffer kan administreres til pasienter under opp-nåelse av øket tumoricid virkning via den cytotoksiske virkning av det kjemoterapeutiske middel som avgis til tumoren, som følge av antistoffets bindingsaffinitet.

Såkalte "kimære antistoff"-molekyler av antistoffet inneholdende et muse-antigen-bindingsområde med konstant humant områdedomene (Morrison et al., 1984, Proe. Nat'l. Acad. Sei. USA, 81:6851, Takeda et al., 1985, Nature, 314:452), kan fremstilles, og denne metode kan anvendes til konstruksjon av hittil ukjente antistoffmolekyler med ønskelige effektorfunk-sjoner, slik som evnen til aktivering av humant komplement og formidling av ADCC (Neuberger et al., 1984, Nature, 312:604).

En annen terapeutisk anvendelse av de monoklonale antistoffer er fremstilling av et antiidiotypt antistoff under anvendelse av L20-antistoffet som immunogen (se f.eks. Nepom et al., 1984, Proe. Nat'l. Acad. Sei., USA, 81:2865, Lee et al., 1985, Proe. Nat'l. Acad. Sei., 82:6286).

Et attraktivt aspekt er at de her omhandlede antistoffer kan kombineres med andre antistoffer mot NSCLC eller andre tumorer, slik som de som er beskrevet i US patent-søknader nr. 667 521, 684 759 og 738 612. Kombinasjonen er virksom for påvisning av de typer av ikke-småcellede lungecarcinomer som er nevnt ovenfor, nemlig storcellede, udifferensierte lungecarcinomer, adenocarcinorner og epidermoid carcinoma.

De monoklonale antistoffer fremstilt ifølge oppfinnelsen bestemmer også determinantplasser på et antigen assosiert med andre carcinomaer slik som brystcarcinoma, tykktarmscarcinoma og småcellet lungecarcinoma (se tabell I). Følgelig kan antistoffene finne anvendelse ved terapeutisk metoder og terapeutiske produkter som er rettet mot slike carcinomer.

Det hittil ukjente antigen betegnet som antigen L20, kan også anvendes til terapeutiske formål. Antigenet kan renses fra tumorer eller fremstilles ved rekombinant DNA-teknologi (se US patentsøknad 827 313). Det gen som koder for L20-antigenet, kan klones ved metoder som først beriker mRNA av L20-antigenet. Ved en slik metode kan polysomer (bestående av mRNA, ribosomer og dannende polypeptidkjeder) renses ved immunoaffinitetskromatografi med antistoff som gjenkjenner L20-antigendeterminanten med den dannede kjede. mRNA isoleres ved immunoutfelling med f.eks. L20-antistoffet, og cDNA klones i en passende ekspresjonsvektor. Alternativt kan L20-antistoff eller antiserum til L20-antigenet anvendes til screening av et cDNA-bibliotek under anvendelse av en ekspresjonsvektor. Det rensede eller klonede L20-antigen kan administreres alene som et immunogen eller sammen med en egnet immunologisk adjuvans. Alternativt kan det gen som koder for antigenet, innsettes i genet for et virus, slik som vacciniavirus, for produksjon av et rekombinant DNA-produkt som kan anvendes som immunogen (se US patentsøknad 827 313)..

Diagnoseutstyr

Antistoffet fremstilt ifølge foreliggende oppfinnelse kan også anvendes i diagnoseutstyr for utførelse av de ovenfor angitte metoder. I en utførelsesform omfatter diagnoseutstyret (a) et monoklonalt antistoff av den ovenfor angitte art, og (b) et konjugat av en spesifikk bindingspartner for det monoklonale antistoff, og et merke som er i stand til å produsere et påviselig signal. Reagensene kan også omfatte hjelpemidler slik som puffere og proteinstabilisereingsmidler, f.eks. poly-saccharider og lignende. Diagnoseutstyret kan enn videre, om nødvendig, omfatte andre komponenter av det signalproduserende system, herunder midler til reduksjon av bakgrunnsforstyrr-elser, kontrollreagenser, et apparat til testutførelse, etc. I en annen utførelsesform omfatter diagnoseutstyret et konjugat av et monoklonalt antistoff ifølge oppfinnelsen og et merke som er i stand til å produsere et påviselig signal. Hjelpemidler som nevnt ovenfor, kan også være til stede.

Eksempler

Foreliggende oppfinnelse belyses nærmere i de etter-følgende eksempler.

Fremstilling av monoklonale antistoffer

Monoklonale antistoffer ble fremstilt under anvendelse av hybridomafusjonsteknikken som tidligere beskrevet av Yeh et al., 1979, Int. J. Cancer, 29:299. En 3 måneder gammel Balb/c-mus ble immunisert under anvendelse av eksplanterte, dyrkede celler fra et humant lungeadenocarcinoma, betegnet 3082, som immunogen. Musen fikk 4 intraperiton-eale injeksjoner bestående av ca. 10<7>celler. 3 dager etter siste immunisering ble musens milt fjernet, suspendert i et dyrkningsmedium og fusjonert med NSl-musemyelomaceller (se Kohler&Milstein, ovenfor). Blandingen ble podet under dannelse av kulturer med lav tetthet stammende fra enkelte fusjonerte celler (kloner).

Supernatanter fra hybridceller ble screenet for direkte bindingsaktivitet på lungecancercellelinjer under anvendelse av både en "ELISA-prøvning og en autoradiografisk, 125

indirekte I-merket protein A-prøvning (Brown et al.,

1979, J. Immunol. Meth. 31:201). Ekstrakter av cellemem-braner fra den tumor som ble anvendt til immunisering, ble fremstilt under anvendelse av en metode modifisert i forhold til Colcher et al., 1981, Cancer Res., 42:1451, Yeh et al., ovenfor. Vev ble vasket med PBS, og celler fra intakte tumorer ble suspendert ved pressing gjennom en sikt av rust-fritt stål. Deretter ble 1 mM NaHC02inneholdende ImM fenylmethylsulfonylfluorid (Calbiochem-Behring Corp.,

San Diego, CA) tilsatt, og materialet ble homogenisert deretter på is med 50 støt av en B-pistil i en Dounce-homogeni-sator. Etter sentrifugering i 15 minutter ved 27.000 G ble supernatanten fjernet, og pelleten ble resuspendert i PBS, ble sonikert i 1 minutt og oppbevart ved -70°C.

De hybridomer som produserte antistoffer som ble bundet til cellemembranekstraktene, ble klonet, ekspandert in vitro og testet ytterligere med hensyn til antistoff-spesifisitet. De hybridomer som produserte antistoffer med tydelig spesifisitet for human lungecancer, ble reklonet, ekspandert og injisert til pristan-behandlede, 3 måneder gamle Balb/c-mus hvor de vokste som ascites-tumorer.

Ved å følge denne metode ble hybridomacellelinje L20 erholdt, denne ble klonet og injisert i mus til utvikling som en ascitestumor. Antistoffet som ble utskilt i ascites, ble renset på protein A-Sepharose<®>(Ey et al., 1978, Immunochemistry, 15:429) eller ved gelfiltrering i Sephacryl<®>S-300. Renset antistoff ble anvendt til ytterligere karakterisering.

Karakterisering av det monoklonale antistoff L20

Påvisning og binding av L20 til dyrkede celler

Den subcellulære lokalisering av antigen ble bestemt ved måling av antistoffbinding til celler før eller etter permeabilisering med en ikke-ionisk detergent. Antistoffer som ble bundet til celleoverflaten av intakte, dyrkede celler, ble identifisert enten ved direkte bindingsprøvning

125

med I-merket antistoff (Brown et al., 1981, Proe. Nat'l. Acad. Sei., USA, 78:539), eller ved indirekte fluorescens under anvendelse av fluorescensaktivert cellesortering II (FACS). Antistoffer som ble bundet til intracellulære

125

plasser, ble bestemt ved direkte binding av I-merket antistoff til celler etter fiksering med paraformaldehyd og etterfølgende permeabilisering med den ikke-ioniske detergent NP-40.

Til bindingsprøvninger som ble utført under anvendelse av radiomerkede antistoffer (Brown et al., ovenfor), ble dyrkede celler (10^) inkubert på is i 30 minutter med 10 cpm av I-merket antistoff i 100 ul bindingspuffer. Suspensjonen ble anbragt som lag på 0,2 ml dinonylfthal-at:dibutylfthalat (1:1 vol/vol) og ble sentrifugert.

125 Pelleten og den vandige fase ble tellet med hensyn til I. For måling av ikke-spesifikk binding ble parallellinkuber-inger utført med ikke-merket antistoff som konkurrent (Brown et al., ovenfor).

Isotypebestemmelse av L20- antistoff

For bestemmelse av klassen av immunoglobuliner som produseres ved hjelp av L20-hybridomacellelinjen, ble følgende teknikk anvendt:

(a) " Ouchterlony"- immunodiffusjon

En del av supernatanten av bestemte hybridomaceller ble anbragt i midtbrønnen på en 25% agarplate. Monospesifikke kanin-antimus-Ig-isotype-antistoffer (Southern Biotechnology, Birmingham, AL) ble anbragt i de ytre brønner, og platen ble inkubert i 2 timer ved romtemperatur og natten over ved 4°C.

(b) " ELISA"- isotypebestemmelse

Dynatech<®>Immunolon-plater med 96 brønner ble belagt med hvert antiserum i en konsentrasjon på 1 ug/ml,

50 ul/brønn i PBS, og fikk stå tildekket over natten ved 4°C. Platene ble vasket med PBS/Tween<®>20, 0,05%, og ble blokkert med medium i en mengde på 100 ul/brønn i 1 time ved romtemperatur. Etter vasking av platene ble supernatanter fra L20-hybridomer tilsatt og inkubert ved romtemperatur i 1 time. Etter vasking med PBS ble okseserumalbumin-(BSA) platene inkubert ved 3 7°C i 2 timer med monospesifikke, kanin-antimus-Ig-isotype-antistoffer koblet til peroxydase føymed"). Etter vasking ble platene inkubert med 1 mg/ml orthofenylendiamin og 0,03% # 2^ 2 i 0,1 M citratpuffer ved en pH-verdi på 4,5. Den optiske tetthet ved 630 nm ble bestemt på et Dynatech<®>ELISA-plateavlesningsapparat.

Det monoklonale antistoff L20 er av IgG^-isotypen.

Antigen- gjenkjennelse ved hjelp av L20- antistoff

Til identifisering av proteinantigener ble lungecarcinomaceller radiojodert på overflaten eller merket meta-35

bolisk med S-methionin.Antigenene ble isolert fra cellelysater ved inkubering med monoklonalt antistoff, til-setning av geite-antimus-IgG og adsorpsjon til Staphylo-coccus aureus. Immunutfellinger ble vasket og underkastet preparativ natriumdodecylsulfat-polyacrylamid-gelelektro-forese (SDS-PAGE) på en 10-20% acrylamidgel. Etter elektroforese ble gelen farget med Coomassie Brilliant Blue (0,5 vekt% til 10% eddiksyre og 30% isopropanol) og ble avfarget i en oppløsning av eddiksyre (5 vol%) og methanol (17 vol%). Det fargede L20-antigenbånd ble fjernet med et barberblad og underkastet omgående elektroeluering med en "ECU-040 Electroelutor/Concentrator" (C.B.S. Scientific Co., San Diego, CA) ifølge metoder beskrevet av Hunkapiller et al., 1983, Methods in Enzymol., 91:227-236.

Automatisert Edman-nedbrytning ble utført med ca.

23 pmol L20-antigen (basert på utbyttet av identifisert L-l) i et gassfase-sekvensoppdelingsapparat (Model "470A", Applied Biosystems, Inc., Foster City, CA). Fenylthio-hydantoinaminosyrederivatene ble analysert ved revers-fase HPLC under anvendelse av et "Model 120A on-line HPLC"-apparat (Applied Biosystems, Inc.) med en "PTH-C18"-kolonne (2,1 x 220 mm, Applied Biosystems, Inc.), og en natrium-acetat/tetrahydrofuran/acetonitril-gradient til eluering.

Aminosyresekvensen i aminoterminaldelen er som

følger:

hvori X er en aminosyre som ikke er blitt identifisert.

Sammenligning av denne s_ekvens med sekvenser som finnes i den aktuelle proteindatabase (PIR Release 6.0, nov. 1985) avslørte ikke noen signifikant sekvenshomologi med noen annen kjent sekvens.

Det antigen som ble gjenkjent av L20-antistoffet, er et glycoprotein-antigen med en molekylvekt på ca. 110.000 dalton.

In vitro immunohistologisk anvendelse

Teknikken med umerket antistoff ifølge Sternberger, 1979, i Immunochemistry, John Wiley&Sons, New York,

side 104-169, som modifisert av Garrigues et al., 1982,

Int. J. Cancer, 29:511, ble anvendt til immunohistologiske undersøkelser på frosne seksjoner. Målevevene for disse forsøk ble oppnådd ved operasjon og ble etter fjerning i løpet av 4 timer nedfrosset i isopentan som var på forhånd avkjølt i flytende nitrogen. Vevene ble deretter oppbevart i flytende nitrogen eller ved -70°C inntil anvendelse. Kanin-antimus-IgG (Sternberger-Meyer Immunochemicals, Inc., Jarettesville, MD) ble anvendt i en fortynning på 1/50. Muse-peroxydase-antiperoxydase-komplekser (PAP, Sternberger-Meyer Immunochemicals, Inc.) inneholdende 2 mg/ml spesifikt renset PAP, ble anvendt i en fortynning på 1:80. Frosne seksjoner ble fremstilt, tørket, behandlet med aceton og tørket (Garrigues et al., ovenfor). Seksjoner som skulle anvendes til histologisk vurdering, ble farget med hemato-xylin. For reduksjon av ikke-spesifikk bakgrunn ble seksjoner preinkubert med normalt humant serum som var fortynnet 1/5 (Garrigues et al., ovenfor). Muse-antistoffer, geite-antimus-IgG og muse-PAP ble fortynnet i en oppløsning av 10% normalt humant serum og 3% kaninserum.

Fargemetoden besto av behandling av serieseksjoner med enten spesifikt antistoff eller kontrollantistoff i 2,5 timer, idet det ble inkubert i 30 minutter med kanin-antimuse-IgG fortynnet 1:50 og eksponert overfor muse-PAP-kompleks fortynnet 1:80 i 30 minutter. Etter hver behandling med antistoff ble stykkene vasket to ganger i PAP. Den immunohistokjemiske reaksjon ble utviklet med friskt fremstilt 0,5% 3,3<1->diaminobenzidin, tetrahydroklorid (Sigma, St. Louis, MO) og 0,01% H2°2i 0,05 M tris_Puffer/pH-verdi 7,6, i 8 minutter. Ytterligere eksponering overfor en 1% Os04~oppløsning i destillert vann i 20 minutter for-sterket fargingen. Seksjonene ble renset med vann, dehyd-ratisert i alkohol, klaret i xylen og anbragt på preparatglass.

Preparatene ble vurdert hvert især under kode, og kodede prøver ble undersøkt av en uavhengig person.

Typiske preparater ble fotografert ved hjelp av differensial-interferenskontrast-optikk (Zeiss-Nomarski). Graden av antistoff-farging ble vurdert som 0 (ingen reaktivitet),

+ (noen få svakt positive celler), ++ (minst 1/3 av cellene positive), +++ (de fleste celler positive) og +++++ (omtrent alle celler meget positive). Da forskjeller mellom + og 0 farging var mindre tydelige enn mellom + og ++ farging,

ble fargingsgraden ++ eller derover, betraktet som "positiv". Både neoplastiske celler og stromaceller ble iakttatt i tumorprøver. Den registrerte farging var fargingen av tumorceller, idet stromaceller overhodet ikke ble farget, eller var meget svakere farget enn tumorcellene.

Alle undersøkte prøver var fryste seksjoner av vev erholdt ved operasjon. Se teksten for detaljert beskrivelse av immunohistologiske metoder. En fargingsgrad på ++ (dvs. hvor minst 1/3 av cellene var positive) ble betraktet som positiv.

En cellelinje, L20, som beskrevet i det foregående, er blitt deponert ved American Type Tissue Culture Collection, Rockville, Maryland, og har fått deponeringsnr. ATCC HB8 913. Foreliggende oppfinnelse skal ikke begrenses i omfang til

den deponerte cellelinje, idet den deponerte cellelinje bare er angitt med henblikk på belysning av et aspekt ifølge foreliggende oppfinnelse, og en hvilken som helst ekvivalent cellelinje som produserer et funksjonelt, ekvivalent, monoklonalt antistoff, er omfattet av oppfinnelsens ramme. Forskjellige modifikasjoner av foreliggende oppfinnelse utover de viste, vil være åpenbare for fagmannen. Slike modifikasjoner faller inn under oppfinnelsens ramme.

Claims (4)

1. Fremgangsmåte for fremstilling av et monoklonalt antistoff som bindes til en determinantplass på et celleoverflate-glycoprotein-antigen fra humane, ikke-småcellede lungecarcinomaceller, humane brystcarcinomaceller eller humane tykktarmcarcinomaceller, for anvendelse in vivo og in vitro,karakterisert vedat a) en hybridoma med identifiserende karakteristika som ATCC nr. HB 8913, hvilken hybridoma er oppnådd ved fusjon av (i) en antistoffproduserende celle som stammer fra milten av dyr immunisert med pleurale effusjoner, dyrkede celler eller lungevev fra en pasient med ikke-småcellet lungecarcinoma, og med (ii) en myeloma-celle, formeres og b) de monoklonale antistoffer av IgG-klassen, under-klasse IgGl, hybridomen, som bindes til et antigen, høstes, hvilket antigen ved polyacrylamidgelelektroforese utviser føl-gende aminosyresekvens i aminoterminaldelen:

hvori X betegner en uidentifisert aminosyre.

2. Fremgangsmåte ifølge krav 1,karakterisert vedat hybridomen formeres in vivo i dyr.

3. Fremgangsmåte ifølge krav 2,karakterisert vedat hybridomen formeres ved injeksjon i en prisant-behandlet Balb/c-mus til dyrkning av en ascites-tumor, og at de monoklonale antistoffer som utskilles i ascites, renses ved adsorpsjon på protein A-Sepharose<R>eller ved gelfiltrering.

4. Anvendelse av et monoklonalt antistoff, fremstilt ved fremgangsmåten ifølge krav 1, til in vitro-påvisning av ondartede celler i en prøve som er mistenkt for å inneholde slike celler, hvori a) prøven bringes i kontakt med det monoklonale antistoff under slike reaksjonsbetingelser at det monoklonale antistoff bindes til determinantplassen, b) ubundne monoklonale antistoffmolekyler fra prøven fjernes, og c) prøven undersøkes for nærvær av bundet monoklonalt antistoff, hvorved bindingen av det monoklonale antistoff ved immunhistologisk farging indikerer nærvær av ondartede celler omfatter ikke-småcellede lungecarcinomaceller i lungevev, brystcarcinomaceller eller tykktarmcarcinomaceller.