SE467988B - Monoklonal antikropp med specificitet foer ett 110kd cellyteprotein vid icke smaacelligt humanlungkarcinom - Google Patents

Description

467 988 E de erhållna antikropparna kan förmedla antikroppberoende cellulär cytotoxicitet eller kan vara cytolytiska mot tumörceller i närvaro av kompletterande komponenter. 2. QPPFINNINGENS BQKGRUND 2.1. HUMQNLUNBKQRCINÜM Lungkarcinom är ansvariga för huvuddelen av dödsfallen i cancer bland män och håller på att överta rollen hos bröstkarcinom som den vanligaste orsaken till cancerdöd bland kvinnor. Denna sjukdom kan uppdelas i fyra histo- logiska huvudtyper: (1) epidermoid eller skvamös (30 %), (E) adenokarcinom (35 %), (3) storcellig odifferentierad (15 %) och (4) smàcellig (20 %). Uttrycket "icke-smà- celligt lungkarcinom" (NSCLC) innefattar följande cell- typer: epidermoida karcinomceller, adenokarcinomceller och stora odifferentierade karcinomceller.

De flesta fall av lungkarcinom kan ej botas med kemote- rapi och strålningsterapi. Smâcelliga lungkarcinom kan svara på kemoterapi och strâlningsterapi genom en minsk- ning i storlek men detta ger ej ett fullständigt botande.

Fullständigt kirurgiskt avlägsnande av tumören synes vara den enda effektiva terapin. Dlyckligtvis har emellertid färre än 30 % av lungcancerpatienterna tumörer, som full- ständigt kan resekteras vid diagnos. Qv dessa lever mindre än en tredjedel 5 är efter ett synbarligen full- ständigt kirurgiskt avlägsnande av tumören. Det finns därför ett stort behov av metoder, som skulle möjliggöra en tidigare diagnos av lungcancer, en bättre definition av graden av spridning av cancern och en mera effektiv terapi. [d 467 988 2.2. MÜNDKLDNQLR QNTIKRDPPQR Monoklonala antikroppar, som representerar homogena anti- kroppsmolekyler, vilka binder till ett enda molekylärt ställe (dvs. en epitop) på ett antigen med en specifik bindnings- eller affinitetskonstant, framställs medelst tre inom tekniken kända metoder.

Monoklonala antikroppar kan framställas medelst en hybri- dom-teknik som anvisas av Kohler och Milstein (1975, Nature gâå: 495; 1976, Eur. J. Immunol. Q: 511). Genom sammansmältning av antikropp-producerande celler (mjält- lymfocyter) med myelom-celler skapade Kohler och Milstein hybrid-celler, som gav upphov till oföränderliga cell- linjer med förmåga både att producera antikropp och att växa permanent i cellkultur. Hybridomen utsöndrar en enda typ av immunoglobulin med i förväg definierad antigenisk specificitet beroende på det antigen för vilket lymfo- cyterna tidigare har exponerats.

Qlternativt kan monoklonala antikroppar framställas genom transformation in vitro av B-lymfocyter från perifert däggdjursblod med exempelvis Epstein Harr-virus (EBV).

Viruset immortaliserar de antikropp-producerande lymfo- cyterna. Teknik för dylik transformation är känd (se exempelvis Steinmetz et al., 1977, Nature ëëâ: 420; Crawford et al., 1983, The Lancet, i: 386).

Slutligen kan monoklonala antikroppar framställas under användning av teknik, som kombinerar både EBV-immorta1i- sering och cellsammansmältning eller hybridomteknologi.

Cole et al., (1985, Monoclonal Qntibodies and Cancer Therapy, Qlan Liss, Inc., sid. 77-96) beskriver teknik för sammansmältning av en humanplasmacytom- eller lymfo- blastoid-cellinje-fusionspartner med EBV-transformerade donator-lymfocyter, som tidigare har etablerats som cell- 467 988 “ linje. I ett dylikt system är båda Föräldracellinjerna odödliga. Följaktligen måste fusionspartnern ha lämpliga läkemedelsmarkörer för att kontraselektera mot föräldra- linjerna när det sammansmälta hybridomet odlas. De er- hållna EBV-hybridomen producerar antikroppar med specifi- citeten hos den använda EBV-lymfocyt-cellinjen.

Monoklonala antikroppar kan framställas i stora mängder genom cellodling in vitro av speciella hybridom- eller transformerade cellinjer. Vidare resulterar inympning av en hybridom-cellinje i peritonealhàlan hos kompatibla däggdjur, såsom möss, i en tumör som utsöndrar höga koncentrationer (1-EQ mg/ml) av monoklonal antikropp i tumör-askitesvätskan. Genom att avlägsna askitesvätskan och rena den monoklonala antikroppen kan en enda mus till- handahålla tillräckligt med antikropp För användning i tusentals diagnostiska analyser. 2.3. MÜNDKLDNQLQ RNTIKRÜPDQR DCH QNTIGENER QSSÜCIERQDE MED LUNGCQNCER Monoklonala antikroppar mot humanlungcancer-antigener har beskrivits av Sikora et al., 1981, Brit. J. Cancer gå: 696; Cuttita et al., 1981, Drop. Nat'l Qcad. Sci. USQ IQ: 4591; Moody et al., 1981, Science Eli: 1346; Minna et al., 1991, Iv. vitm g: was; kefn-.ei E: al., 1981, cares» Res. gi: 3465; Chem. Qbst. 95(15):13085ÖE; Baylin et al., 1982, Proc. Natll Qcad. Sci. USQ 19: 465Ü; Carney et al., 1982, Dathobiology Qnnual IE: 115; Gazdar et al., 1983; Seminars in Dncology lg: 3; Hollinshead et al., 1983, Cancer Detect. Drevent 6: 185; Mulshine et al; 1983, J.

Immunol. låi: 497; Huang et al., 1983, Qrch. Hiochem.

Bíophys. Egg: 318; Saji et al., 1984,,Hybridoma §: 119; Bio. Qbst. 79005569; Bosslet et al., Behring. Inst. Mitt. li: E7; Chem. Qbst. QC101(9): 706686; Roset et al., 1984, Cancer Res. ii: EOEE; Bio. Qst. 79033605; Princler et f! LH 467 988 al., 1982, Cancer Res. gg: 843; Mazauric et al., 1988, Cancer Res. gg: 150; Braatz et al., 1983, Cancer Res. gg: 849; Sobel et al., 1982, Fed. Droc. 51: 409; Cole et al., 1985, Monoclonal Qntibodies and Cancer Therapy, Alan Liss, Inc., sid. 77-96; och Varke et al., 1985, Monoclonal Qntibodies and Cancer Therapy, Alan Liss, Inc., sid. 307.

De amerikanska patentansökningarna nr 667,5E1 av den E november 1984, 785,17? av den 7 oktober 1985, 684,759 av den 21 december 1984, 776,3E1 av den 18 oktober 1985 och 738,81E av den E8 maj 1985 avslöjar vissa monoklonala antikroppar mot icke-smàcelligt humanlungkarcinom.

Monoklonala antikroppar kan användas för metoder, som skulle möjliggöra en tidigare diagnos av lungcancer, en bättre definition av spridningen av cancern och effekti- vare metoder för terapi av lungcancer. En förutsättning är emellertid att finna antikroppar mot antigener, som är mera rikligt förekommande i lungcancer än i normal vävnad hos vuxna. Mot bakgrund av den kända heterogeneteten hos tumörcellpopulationer, närvaron av flera determinanter på samma antigenmolekyl, de förväntade skillnaderna mellan antigener med avseende pa deras stabilitet som diagnos- tiska markörer och terapeutiska målobjekt och de olika biologiska egenskaperna hos olika antikroppar mot samma antigen kan ett antal olika antikroppar mot ett antal olika antigener komma att krävas. 3. SQMMQNFQTTNINQ QV UPPFINNINGEN Föreliggande uppfinning avser en ny klass av monoklonal antikropp, som àskådliggöres av LEO och som är specifik för ett determinantställe på ett glykoprotein-antigen, som är associerat med icke-småcelligt humanlungkarcinom 467 988 6 (NSCLC)-celler. Uttrycket "NSCLC-celler" innefattar epi- dermoida karcinomceller, adenokarcinom-celler och stor- celliga och odifferentierade karcinomceller. Determinant- stället kan även återfinnas på antigener från några andra karcinom, exempelvis vissa karcinom i bröst och kolon och småcelligt lungkarcinom. Qntikroppen enligt uppfinningen binder således även till celler från andra karcinom och kan vara användbar för diagnos och terapi av alla andra tumörer, som avger det antigen som identifieras av anti- kroppen LEO. Föreliggande monoklonala antikropp binder i mycket mindre grad till normala vuxenceller än till tumör- celler. Uttrycket "binder till en mycket mindre grad" innebär att bindningen icke alls kan påvisas eller kan påvisas endast som en mycket svag färgning när immunohis- tologisk teknik utnyttjas. Qntikroppen har således en hög grad av specificitet för antigen, som är karakteristiskt för NSCLC och vissa andra karcinom.

Uppfinningen innefattar även det nya LEO-antigen som iden- tifieras av antikroppen LED och den klass av antikroppar som binder till, är immunospecifika för eller immunoreak- tiva med detta antigen. Vidare innefattas metoder för an- vändning av det renade eller klonade LEO-antigenet som vaccin för immunisering mot vissa karcinom.

Föreliggande uppfinning avser även vissa diagnostiska me- toder, som utnyttjar den monoklonala antikroppen enligt uppfinningen. Så exempelvis kan antikroppen användas vid metoder för bestämning av närvaron av det maligna till- ståndet i humanlungvävnad och annan humanvävnad. Metoden innefattar att man undersöker vävnaden med avseende på närvaron av ett antigen med egenskaperna hos ett 110.ÜOÜ dalton glykoprotein, som definieras av antikroppen LED.

Vävnaden kan exempelvis bringas i kontakt med en anti- kropp, som definierar ett determinantställe på ett cell- associerat antigen med egenskaperna hos det antigen som 7 467 988 definieras av antikroppen LEO, en funktionell ekvivalent eller ett fragment av denna antikropp och eventuella växelverkningar mellan antikroppen och antigeniska de- terminanter påvisas. En dylik metod innebär bestämning av närvaron av NSCLC-celler i ett prov, som man misstänker innehåller dylika celler. Drovet bringas i kontakt med den monoklonala antikroppen, som har förmåga att särskil- ja dylika celler från andra celltyper, som kan vara när- varande i provet. Kontakten utföres under sådana betingel- ser att antikroppen binder till dylika celler. Efter kon- takt bestämmas närvaron eller frånvaron av bindning av antikroppen till cellerna i provet. Denna bindning är re- laterad till närvaron eller frånvaron av NSCLC-celler i provet. I allmänhet bringas provet i kontakt med en märkt specifik bindningspartner till den monoklonala antikrop- pen. Denna markör har förmåga att alstra en påvisbar sig- hal.

En annan diagnostisk metod innefattar lokalisering in giyg av en tumör genom att man till en patient administ- rerar en renad antikropp eller antikroppfragment enligt föreliggande uppfinning, märkt med ett medel som ger en påvisbar signal. Lokaliseringen påvisas därefter under användning av yttre scintografi, emissionstomografi eller radionukleär svepteknik. Denna metod kan även tillhanda- hålla bättre sätt att kontrollera cancerpatienter med av- seende på sjukdomsgraden och att övervaka förändringar i svar på terapin.

Uppfinningen innefattar även terapeutiska applikationer, eftersom LED-antikroppen och liknande antikroppar kan rea- gera med det LEO-antigen som avges i höga koncentrationer på tumörcellytan. Qntikroppar kan därför användas som bä- rare av olika medel, som har antitumörverkan och vilka innefattar men ej är begränsade till kemoterapeutiska läkemedel, toxiner, immunsvarsmodifierande medel och 467 988 8 radioisotoper.

Vidare kan LEO-antikroppen modifieras så att den kan för- medla antikroppberoende cellulär cytotoxicitet (QDCC), dvs. att den kan döda NSCLC-celler i närvaro av human- lymfocyter eller makrofager eller att den blir cytolytisk mot tumörceller i närvaro av humankomplement. En dylik modifikation kan åstadkommas exempelvis genom den teknik som nyligen har utvecklats för framställning av "chimera antikroppar". Följaktligen splitsas gener, som kodar för den variabla regionen av LED-antikroppsmolekylen, till- sammans med humana gener, som kodar för Fc-regionen av en antikropp med lämplig biologisk aktivitet (såsom förmågan att aktivera humankomplement och förmedla QDCC). Nya anti- kroppar från mus eller av humant ursprung kan även fram- ställas mot LEO-antigenet med de lämpliga biologiska funk- tionerna. 4. BESKRIVNING GV UDPFINNINBEN Föreliggande uppfinning avser en ny monoklonal antikropp, som betecknas LEO och som är immunospecifik för och/eller immunoreaktiv med ett antigen på NSCLC-humanceller och celler från flera andra humankarcinom innefattande karci- nom i kolon och bröst och småcelligt lungkarcinom, meto- der för framställning av en dylik ny monoklonal antikropp och vissa diagnostiska och terapeutiska metoder, som ut- nyttjar antikroppen.

Uppfinningen innefattar vidare ett nytt cellyteantigen, som är karakteristiskt för humant NSCLC och vissa andra humankarcinom i bröst, kolon och lunga, och metoder för användning av ett dylikt nytt antigen. p 467 988 4.1. METDDER FÖR FRQMSTÄLLNINB QV MDNÜKLDNQL QNTIKRÜPP MOT NSCLC Monoklonala antikroppar mot humant NSCLC och vissa andra humankarcinom kan framställas medelst hybridomfusions- teknik, genom Eßv-transformation av antikropp-produce- rande humanlymfocyter eller medelst teknik som kombinerar cellfusion och EBV-immortaliseringsteknik. 4.1.1. Fusionsteknik Enligt en utföringsform av föreliggande uppfinning fram- ställes monoklonala antikroppar mot NSCLC under använd- ning av hybridomcell-fusionsteknik. Sá exempelvis används som immunogen humanlungkarcinomceller från pleurala ut- söndringar, odlade celler från explanterade NSCLC-human- tumörer eller celler från en normal fosterlunga eller lysat från dylika celler. Vid ett utföringsexempel användes explanterade celler från ett NSCLC-humanlung- adenokarcinom nr 3082 som immunogen (se avsnitt 5.1.).

Cellerna injiceras exempelvis i en mus och efter till- räcklig tid avlivas musen och somatiska antikropp-pro- ducerande lymfocyter erhålls. Qntikropp-producerande celler kan erhållas från lymfknutarna, mjälten och peri- fert blod hos de behandlade djuren. Mjältceller föredra- ges. Muslymfocyter ger en högre procentuell andel stabi- la fusioner med nedan beskrivna musmyelom. Användningen av somatiska rått-, kanin- och grodceller är även möjlig.

De mjältcellkromosomer som kodar för önskade immunoglobu- liner immortaliseras genom fusionering av mjältcellerna med myelomceller, i allmänhet i närvaro av polyetylen- glykol. Flera myelomcellinjer kan användas för fram- ställning av fusionerade cellhybrider innefattande NSI-Qg4/1, X63-Qgß, MPC11-45.6TB1.7, XGE-Qg.6É3, SpE/O- Qgl4, Fo och S194/5XXO.Bu.1, som härrör från möss och 310.RCY3.Qgl.E.3, UEEGQR och BMISOOGTGQLE, som härrör 467 988 i” från råttor, (Hammerling, et al., 1981, "Monoclonal Qntibodies and T-cell hybridomas" i Research Monographs in Immunology, Vol. 3, J.L. Turk, red; Elsevier/North Holland Biomedical Press. New York). I ett utförings- exempel användes NS1-celler (se avsnitt 5.1.). De erhåll- na cellerna, som innefattar de fusionerade hybridomen, får växa i ett selektivt medium, såsom HQT-medium, och de överlevande cellerna får växa i ett dylikt medium under gränsspädningsbetingelser. Cellerna får växa i en lämplig behållare, exempelvis mikrotiterfack, och den överliggan- de vätskan underkastas screening med avseende på monoklo- nala antikroppar med den önskade specificiteten.

Olika konventionella metoder förekommer För isolering och rening av de monoklonala antikropparna för att befria den från andra proteiner och andra föroreningar. 4.1.2. EBV-transformationsteknik Enligt en alternativ utföringsform av föreliggande uppfin- ning framställes monoklonala antikroppar mot NSCLC under användning av EBV-transformationsteknik. Så exempelvis immortaliseras lymfocyter, som härrör från perifert blod, tumörutsöndrande lymfknutar, benmärgsaspirat, tumörer eller pleurala utsöndringar från patienter med NSCLC, under användning av EBV enligt de metoder som anvisas av Cole et al., 1984, Cancer Res. Qi: E750. Såsom anges av Cole et al., är B-lymfocyter, vilka är specifika för tu- mörantiger, sällsynta hos lungcancerpatienter. Det är således speciellt viktigt att utöka antalet lymfocyter, som producerar antikropp, genom att man preselekterar lymfocyter, som producerar antikropp mot det relevanta antigenet. Således innefattar EBV-transformationstekniken två steg: (1) anrikning av celler med receptorer för det givna antigenet, dvs. LEO-antigen som beskrivs i avsnitt 4.3., och (E immortalisering av dylika celler genom in- *1 467 988 fektion med EBV. 4.1.3. §§V-hygridom-teknik Enligt en annan alternativ utföringsform av föreliggande uppfinning framställes monoklonala antikroppar mot NSCLC under användning av en kombination av EBV-transformation och hybridomfusionsteknik, såsom beskrivs av Cole et al., 1985, Monoclonal Qntibodies and Cancer Therapy, Qlan R.

Liss, Inc; sid. 77-96. Så exempelvis fusioneras en myelom- cellinje med donatorlymfocyter från NSCLC-patienter, vilka tidigare har transformerats med EBV och etablerats som en cellinje med förmåga att växa och utvecklas under odlingsbetingelser. I syfte att kunna selektera de erhåll- na EBV-hybridomfusion-cellinjerna är det nödvändigt att fusionspartnern uppvisar dominerande lämpliga selekter- bara läkemedelsmarkörer, såsom ouabain- eller neomycin- resistens, så att föräldracellerna ej utvecklas när de fusionerade hybridomcellinjerna odlas. En lämplig linje är den tioguamin-resistenta GM-150, ouabain-resistenta lymfoblastoid-cellinje, KR-4, som beskrivs av Cole et al., §ggg_. Erhâllna hybridom klonas medelst konven- tionell teknik. 4.1.4. Cellförökning och antikrogg-groduktion Då de önskade fusionerade cellhybriderna eller transfor- merade cellinjerna har selekterats och klonats till indi- viduella antíkropp-producerande cellinjer, kan varje cell- linje förökas på endera av tvâ konventionella sätt. Den individuella cellinjen kan förökas in vitro, exempelvis i laboratorieodlingskärl, och odlingsmediumet, som innehål- ler höga koncentraitoner av en enda specifik monoklonal antikropp, kan skördas genom dekantering, filtrering eller centrifugering. Qlternativt kan utbytet av monoklo- nal antikropp ökas genom injicering av ett prov av hybri- TI) 467 988 1 domet i ett histokompatibelt djur av den typ som användes för att tillhandahålla de somatiska cellerna och myelom- cellerna för den ursprungliga fusionen. Tumörer, som ut- söndrar den specifika monoklonala antikropp som produce- ras av den fusionerade cellhybriden, utvecklas hos det injicerade djuret. Kroppsvätskorna hos djuret, såsom asci- tesvätska eller serum, tillhandahåller monoklonala anti- kroppar i höga koncentrationer. Såsom har diskuterats av Cole et al., ggggš, är det, då humanhybridom eller EBV- hybridom användes, nödvändigt att undvika avstötning av det främmande ympämne som injiceras i djuren såsom möss.

Möss med immunobrist eller nakna möss kan användas eller också kan hybridomet först få passera bestrålade nakna möss som en fast subkutan tumör, odlas in vitro och där- efter injiceras intraperitonealt i pristan-behandlade be- strålade nakna möss, som utvecklar ascitestumörer, vilka avsöndrar stora mängder av specifika monoklonala human- antikroppar (se Cole et al., sugra). 4.3. MDNÜKLÜNQLQ QNTIKRÜFPQR Qntikroppen enligt föreliggande uppfinning binder till ett nytt cellyte-glykoproteinantigen, som betecknas LEO- antigen och som är karakteristiskt för NSCLC-humanceller och celler fran vissa andra humankarcinom (se avsnitt 4.E.1.). Blykoproteinantigenet har en molekylvikt av cirka 110.000 dalton då det underkastas immunoprecipita- tion vid polyakrylamídgel-elektrofores (se avsnitt 5.3).

Uppslutning av LEO-antigenet med glykanas har visar att det innehåller N-länkade oligosackaridkedjor.

Enligt ett utföringsexempel framställes LEO-antikroppen medelst det LED-murinhybridom som beskrivs i avsnitt 5 punkt l. LEO-antikroppen är av IgGl-isotyp och (se av- snitt 5.E.E.) har en aviditet av cirka 3 x 10“. Den bin- der icke påvisbart till normala celler såsom fibroblas- 13 467 988 ter, endotelialceller eller epiteliska celler i huvud- organen. Med "binder ej påvisbart" avses att endast en mycket svag färgning eller icke någon färgning alls er- hålls vid immunohistologi.

Inom ramen för uppfinningen faller även användbara bind- ningsfragment av ovan angivna monoklonala antikropp så- som Fab-, F(ab')=-, Fv-fragment etc. Qntikroppsfragmenten erhålls medelst konventionell teknik. Så exempelvis kan l användbara bindningsfragment framställas genom peptidas- digerering av antikroppen under användning av papain el- ler pepsin.

Liknande antikroppar, innefattande antikroppar av olika isotyper, olika affiniteter och nya biologiska funk- tioner, såsom förmågan att döda tumörceller i närvaro av komplement eller effektorceller såsom lymfocyter eller makrofager, faller även inom ramen för uppfinningen.

Ehuru ovan angivna specifika exempel på den nya anti- kroppen enligt uppfinningen avser en antikropp, som bin- der till ett specifikt determinantställe på respektive antigen och är av IgG1-underklass härrörande från en murinkälla, är detta icke avsett att vara en begränsning. Üvan angivna antikropp och sådana antikroppar med funk- tionell ekvivalens med ovan angivna antikropp faller inom ramen för denna uppfinning vare sig de härrör från en murinkälla, andra däggdjurskällor innefattande människa eller andra källor, liksom kombinationer därav och anti- kroppar av andra isotyper. Med uttrycket "funktionell ekvivalens" avses att antikroppen har förmåga att binda till ovan beskrivna determinantställe och kan konkurrera med en speciell antikropp enligt uppfinningen med avseen- de på ett dylikt ställe. Det vill säga, vid kombination av en dylik antikropp med ett prov, som innehåller en cell eller cellfragment med ett dylikt determinantställe, binder antikroppen till ett dylikt determinantställe och 467 988 1* kommer att hindra en antikropp enligt uppfinningen från att binda till ett dylikt ställe. Eftersom vidare anti- genet enligt uppfinningen kan uppvisa mer än ett determi- nantställe innefattar uppfinningen monoklonala antikrop- par, som definierar andra determinantställen än de deter- minantställen som definieras av ovannämnda monoklonala antikropp och som kan identifieras medelst inom tekniken kända sekvensimmunoprecipitations-analyser.

Uppfinningen avser även antikroppar framställda som svar på antigenbindningsställen eller idiotyper av LEO-anti- kroppen, eftersom dylika anti-idiotypiska antikroppar kan användas för att analysera immunsvaret mot tumörantigener för diagnostiska ändamål och för att inducera immunsvar för terapeutiska eller profylaktiska ändamål (Nepom et al., 1984. Proc. Nat'l Qcad. Sci. gl: 3664). 4.2.1. LEO-antigen som igenkänns av monoklonala anti- kroppar Det antigen som igenkänns av de monoklonala antikropparna enligt föreliggande uppfinning innefattar ett nytt cell- yte-glykoproteinantigen, som är karakteristiskt för NSCLC- celler och vissa andra karcinom innefattande bröst-, kolon- och smàcelligt lungkarcinom. Qntigenet har en mole- kylvikt av cirka 110,000 dalton.

Den aminoterminala aminosyrasekvensen hos det nya glyko- proteinantigenet är som följer: 1 5 10 15 L-X-V-Q-V-P-E-X-fi-V-V-Q-L-V-E-T-D-Q-X-L fü C) vari X representerar en aminosyra,-som.icke har identifie- rats ännu, och återstoden av bokstäverna representerar de konventionella enbokstavsförkortningarna för aminosyror.

En jämförelse av denna sekvens med de som är lagrade i 467 988 den aktuella proteindatabasen (PIR-version 6.0, November 1985) avslöjar icke någon signifikant sekvenshomologi med några andra kända sekvenser. 4.3. QNVÄNDNINGSÜMRÅDEN FÖR MÜNÜKLÜNQLQ QNTIKRÜDDQR ÜCH LED-QNTIGENET 4.3.1. Diagnostiska agglikationer De monoklonala antikropparna enligt denna uppfinning kan användas som provsonder för påvisande av enskilda anti- gener i NSCLC-humantumörer och andra humantumörer. En metod enligt uppfinningen innefattar bestämning av när- varon av ett malignt tillstånd i lungvävnad och andra humanvävnader genom undersökning av vävnaden med avseende på närvaron eller frånvaron av ett glykoproteinantigen med egenskaperna hos LEO-antigenet. Uttrycket "med egen- skaperna hos" innebär att antigenet är reaktivt med en antikropp, som känner igen LEO-antigenet. Närvaron eller frånvaron av detta antigen kan tillhandahålla kliniskt värdefull information, som ej är tillgänglig med histo- patologisk standardteknik.

Monok1onala_antikroppar enligt uppfinningen kan exempel- vis användas för att påvisa celler från icke-småcelligt lungkarcinom i histologiska och cytologiska prover. Vid användning av den immunoperoxidas-färgningsteknik som beskrivs i avsnitt 5.4. uppvisar exempelvis utskurna väv- nadsprover av adenokarcinom, epidermoidkarcinom och små- celligt karcinom i lunga en intensiv positiv färgning.

Normal lunga, mjälte, bröst, kolon, njure, lever, hjärna, hjärta, hud, tyroid, testikel, vagina och normala lymfo- cyter var negativa.

En annan viktig diagnostisk applikation in vitro av de monoklonala antikropparna enligt denna uppfinning är pà- 467 988 16 visandet av andra karcinom än NSCLC. Qntikroppen har an- vänts för att påvisa epitopen i karcinom från bröst, kolon och i småcelligt lungkarcinom. Normala prover av dessa vävnader uttryckte icke determinanten. Den monoklo- nala antikroppen är således användbar för påvisande av en antigenisk determinant i dessa karcinom, vilken determi- nant är tumörassocierad. Följaktligen kan den monoklonala antikroppen vara ett användbart diagnostiskt reagens för bröst- och kolonkarcinom och för småcelligt lungkarcinom.

Qlternativt kan immunofluorescensteknik användas för att undersöka humanvävnadsprover med de monoklonala anti- kropparna enligt föreliggande uppfinning. Enligt ett typiskt protokoll lufttorkas objektglas innehållande kryostatsektioner av fryst, icke-fixerad vävnadsbiopsi eller utskurna tumörprover eller cytologiska utstryk och inkuberas med den monoklonala antikroppen i en fuktig kammare vid rumstemperatur. De cytologiska utstryken inne- fattar exfoliativa cellprover. Med uttrycket "exfoliativ" avses att provet innefattar isolerade celler eller klum- par av celler, som har erhållits genom skrapning eller tvättning av vävnadsytan och vilka celler avlägsnas indi- viduellt eller i skal eller laminat. Det exfoliativa cell- provet skall skiljas från utskuren vävnad, såsom den som erhålls vid biopsi. Metoden kan finna användning vid på- visande av ett'malignt tillstånd i ekfoliativa cellprover från lunga såsom ett sputumprov, från bronkerna, mag-tarm- kanalen innefattande oral farynx, munnen, ett cervikal- utstryk etc.

Efter torkning skiktas objektglasen med en preparation av antikropp mot den monoklonala antikroppen, vanligen någon typ av antimusimmunoglobulin om den monoklonala antikropp som användes härrör från fusion av en musmjältlymfocyt och en musmyelomlinje. Detta antimusimmunoglobulin konju- geras under användning av känd teknik med en förening så- 17 467 988 som rodamin eller fluorescein-isotiocyanat, som fluoresce- rar vid en speciell våglängd. Färgningsmönstret och -in- tensiteterna i provet bestämmes därefter medelst fluore- scensljusmikroskopi och registreras eventuellt fotogra- fiskt.

Beskrivningen ovan är primärt inriktad på användningen av antikropparna enligt uppfinningen vid immunofluorescens- teknik. Emellertid kan antikropparna enligt uppfinningen användas vid de flesta analysmetoder innefattande antigen- antikropp-reaktioner. Qnalysmetoderna kan vara homogena eller heterogena. Vid en homogen analys kan provet vara en vävnad, som har underkastats lys och klarats-för av- lägsnande av debris. Den immunologiska reaktionen inne- fattar vanligen den specifika antikroppen, en märkt ana- lyt och provet av intresse. Den signal som härrör från markören modifieras, direkt eller indirekt, vid bindning av antikroppen till den märkta analyten. Både den immuno- logiska reaktionen och pàvisandet av graden därav utförs i en homogen lösning. Immunokemiska markörer, som kan an- vändas, innefattar fria radikaler, fluorescens-färgämnen, enzymer, bakteriofager, coenzymer, osv.

Vid en heterogen analysmetod är reagensen vanligen pro- vet, den specifika antikroppen och ett medel för att fram- kalla en påvisbar signal. Den monoklonala antikroppen är vanligen applicerad på en fast bärare eller en fast fas.

Drovet i vätskefas bringas därefter i kontakt med anti- kroppen i fast fas. Fastfasbäraren separeras därefter från den flytande fasen och antingen den fasta fasen eller den flytande fasen undersöks med avseende på en pàvisbar signal under utnyttjande av ett medel för att framkalla en dylik signal. Signalen är relaterad till när- varon av analyten i provet. Medel för att alstra en påvis- bar signal innefattar användningen av radioaktiva markö- rer, fluorescensmedel, enzymer, osv. Exempel på hetero- 467 988 *B gena immunoanalysmetoder är radioimmunoanalys, immuno- fluorescens-metoder, enzymlänkade immunoanalyser och lik- fiahdë.

För en mera detaljerad diskussion av ovan angivna immuno- analysteknik hänvisas till “Enzyme-Immunoassay", av * Edward T. Maggio, 1960, CRC Press, Inc., Boca Raton, Florida. Se exempelvis även de amerikanska patentskrif- terna 3,690,834; 3,791,93E; 3,8l7,837; 3,B5Q,578; 3,853,987; 3,B67,517; E,90l,654; 3,935,074; 3,984,533; 3,996,345; och 4,098,876, vilken förteckning icke skall anses vara uttömmande.

Qntikropparna enligt uppfinningen kan även användas för diagnostiska applikationer in vivo. Så exempelvis kan antikroppar eller fragment framställda av antikropparna, exempelvis Fab- och F(ab')E-fragment, användas för att visualisera tumörer innefattande metastatiska avsätt- ningar hos humanpatienter med NSCLC, på ett sätt som är analogt med det som har beskrivits för malignt melanom av Larson et al., 1983, J. Nucl. Med. Qi: 123 och av Larson et al., 1983, J. Clin. Invest., 7E: Elül. Den renade anti- kroppen eller fragment därav märks med ett medel, som ger en påvisbar signal, exempelvis en radioisotop såsom *3*I, och administreras i en lämplig bärare, exempelvis intra- venöst, till en patient. Lokaliseringen av den tumörbund- na antikroppen påvisas genom yttre scintografi, emissions- tomografi eller radionukleär svepteknik under användning av exempelvis en gamma-kamera. 4.3.2. Terapeutiska applicationgg n; Qntikropparna enligt uppfinningen kan även användas tera- peutiskt. De monoklonala antikropparna kan användas till- sammans med ett brett spektrum av farmaceutiska eller cytotoxiska medel. Så exempelvis kan en antikropp bindas 19 467 988 till ett toxin för bildning av ett immunotoxin (Jansen et al., 1982, Immunol. Rev. §§: 185) eller till ett radioak- tivt material, exempelvis **=I, *=*I, etc. (Order, 1984, Compr. Ther. LQ: 9; Larson et al., 1983, J. Clin. Invest. lg: 2101; Carrasquillo et al., 1984, Cancer Treatment Reports, gå: 317) eller till ett läkemedel (Rowland et al., 1985, Cancer Immunol. Immunother. 12: 1) för bild- ning av ett radiofarmaceutiskt material eller farmaceu- tiskt material. Konjugerade antikroppar kan administreras till patienter för att uppnå förstärkt tumoricidisk verkan genom den cytotoxiska verkan av det kemoterapeutiska medel som transporteras till tumören baserat på bindnings- affiniteten hos antikroppdelen.

Så kallade "chimeriska antikropp"-molekyler av antikrop- pen enligt föreliggande uppfinning kan framställas inne- hållande ett musantigen-bindningsområde med humankonstant- regionområden (Morrison et al., 1984, Froc. Nat'l Qcad.

Sci. U.S.Q. gl: 6851; Takeda et al., 1985, Nature, §¿í: 452) och denna teknik kan användas för att framställa nya antikroppmolekyler med önskade effektorfunktioner såsom förmågan att aktivera humankomplement och förmedla QDCC (Neuberger et al., 1984, Nature 3 E: 604).

En annan terapeutisk användning av de monoklonala anti-' kropparna enligt föreliggande uppfinning är att framstäl- la anti-idiotypisk antikropp under användning av LEO-anti- kroppen som immunogen (se exempelvis Nepom et al., 1984, Droc. Nat'l Qcad. Sci. U.S.Q., gl: 2864; Lee et al., 1985, Proc. Nat'l Qcad. Sci. Qg: GEBG).

En attraktiv aspekt av föreliggande uppfinning är att föreliggande antikroppar kan kombineras med andra anti- kroppar mot NSCLC eller andra tumörer, såsom de som av- slöjas i de amerikanska patentansökningarna 667,5E1 av den E november 1984, 684,759 av den El december 1984 och 467 988 EC' 73B,61E av den EB maj 1985. Kombinationen är effektiv för att påvisa de ovannämnda typerna av icke-smàcelliga lung- karcinom, nämligen storcelligt odifferentierat lungkarci- nom, adenokarcinom och epidermoidkarcinom.

De monoklonala antikropparna enligt uppfinningen definie- rar även determinantställen på ett antigen, som är asso- cierat med andra karcinom såsom bröstkarcinom, kolonkarci- nom och smâcelligt lungkarcinom (se avsnitt 5, tabell 1).

Följaktligen kan föreliggande antikroppar finna använd- ning vid terapeutiska metoder och terapeutiska produkter riktade mot dylika karcinom.

Det nya antigenet enligt föreliggande uppfinning, som be- tecknas som antigen LEÜ, kan även användas för terapeutis- ka applikationer. Qntigenet kan renas från tumörer eller framställas medelst rekombinerande DNQ-teknologi (se den samtidigt anhängiga amerikanska patentansökan 8E7,313 av den 7 februari 1986, vars innehåll införlivas härmed genom hänvisning därtill). Den gen som kodar för LED- antigenet kan klonas medelst metoder, som först anrikar mRNQ hos LEO-antigenet. Medelst en dylik metod kan poly- somer (som består av mRNQ, ribosomer och nascerande poly- peptidkedjor) renas medelst immunoaffinitets-kromatografi med antikropp, som känner igen den LEO-antigeniska deter- minanten på den nascerande kedjan. mRNQ isoleras medelst immunoprecipitation med exempelvis LEO-antikropp och cDNQ klonas i en lämplig expressionsvektor. Qlternativt skulle LEO-antikropp eller -antiserum mot LEÜ-antigen kunna an- vändas för screening av ett QDNQ-bibliotek under använd- ning av en expressionsvektor. Det renade eller klonade LED-antigenet kan administreras separat som en immunogen eller tillsammans med ett lämpligt immunologiskt adju- vans. Qlternativt kan den gen som kodar för antigenet in- föras i genen för ett virus, såsom vaccinia-virus, för framställning av en rekombinerande DNQ-produkt, som kan fi' H- 467 988 användas som immunogen (se den samtidigt anhängiga ameri- kanska patentansökningen 8E7,313 av den 7 februari 1986). 4.4. DIQGNÜSTISKQ TESTSQTSER Uppfinningen innefattar även diagnostiska testsatser för utförande av ovan avslöjade metoder. Enligt en utförings- form innefattar den diagnostiska testsatsen (a) en mono- klonal antikropp som har definíerats närmare ovan och (b) ett konjugat av en specifik bindningspartner för den monoklonala antikroppen och en markör med förmåga att alstra en påvisbar signal. Reagensen kan även innefatta hjälpmedel såsom buffertämnen och proteinstabiliserings- medel, exempelvis polysackarider och liknande. Den diag- nostiska testsatsen kan vidare innefatta, om så erford- ras, andra komponenter av det signalproducerande systemet innefattande medel för att reducera bakgrundsstörningar, kontrollreagens, en apparat för utförande av ett test, etc. Enligt en annan utföringsform innefattar den diag- nostiska testsatsen ett konjugat.av en monoklonal anti- kropp enligt uppfinningen och en markör med förmåga att alstra en påvisbar signal. Hjälpmedel såsom nämnts ovan kan även vara närvarande.

. UTFÖRINGSEXEMDEL Uppfinningen åskådliggöres närmare medelst följande icke- begränsande utföringsexempel. .1. FRQMSTÄLLNINB GV MÜNÜKLÜNQLQ QNTIKRÜFPQR Monoklonala antikroppar framställdes under användning av den hybridomfusionsteknik som tidigare har beskrivits av Yeh et al., 1979, Int. J. Cancer šg: E99. En tre månader gammal Balb/c-mus immuniserades under användning av ex- n; I I 467 988 planterade odlade celler från ett humanadenokarcinom i lunga med beteckningen EOBE som immunogen. Musen erhöll fyra intraperioneala injektioner om cirka 107 celler. Tre dagar efter den sista immuniseringen avlägsnades mjälten, suspenderas i odlingsmedium och fusionerades med N51~mus- myelomceller (Kohler och Milstein, ggggai. Blandningen försattes med groddar för bildning av lågdensitetskultu- rer härrörande från enstaka fusionerade celler (kloner). överliggande vätskor frân hybridceller underkastades screening med avseende på direkt bindningsaktivitet på lungcancercellinjer under användning av både en ELISQ- analys och en autoradiografisk indirekt 1251-märkt pro- tein Q-analys (Brown et al., 1979, J. Immunol. Meth., Qi: E01). Extrakt av cellmembran från den tumör som an- vändes för immuniseringen framställdes under användning av ett modifierat förfarande enligt Colcher et al., 1981, Cancer Res. gg: 1451; Yeh et al., gggga. vävnaderna tvät- tades med PBS och celler från intakta tumörer suspendera- des genom pressning genom en sikt av rostfritt stål. Där- efter tillsattes 1 mM NaHCDe innehållande 1 nM fenylmetyl- sulfonylflourid (Calbiochem-Behring Corp., San Diego, CG) och materialet homogeniserades därefter på is, med 50 slag av B-stampen i en Dounce-homogenisator. Efter centri- fugering under 15 minuter vid š7,000 x g avlägsnades den överliggande vätskan och tabletten återsuspenderades i DES, underkastades ultraljudbehandling under 1 minut och lagrades vid -70°C.

Hybridom, som producerade antikroppar, vilka binder till cellmembranextrakten, klonades, expanderades in vitro, och testades ytterligare med avseende på antikropp- specificitet. De hybridom som producerade antikropp med uppenbar specificitet för humanlungcancer âterklonades, expanderades och injicerades i pristan-behandlade 3 månader gamla Balb/c~möss där de tillväxte som ascites- \Y»'* | '| fal 467 988 tumörer.

Genom att följa detta förfarande erhölls hybridomcell- linjen LEO, som klonades och injicerades på möss för att utvecklas som en ascitestumör. Qntikropp som utsöndrades i ascites renades på protein Q-Separose (Ey et al., 1978, Immunochemistry, lä: 439) eller genom gelfiltrering i Sephacryl S-300. Renad antikropp användes för ytterligare karakterisering. .3. KQRQKTERISERING AV DEN MUNDKLDNQLQ QNTIKRODPEN LEO .2.1. Detektering och bindning av LEO till odlade celler Den subcellulära lokaliseringen av antigen bestämdes ge- nom uppmätning av antikroppsbindningen till celler före eller efter permeabilisering med icke-jonisk detergent.

Qntikroppar, som band till cellytan hos intakta odlade celler, identifierades antingen medelst direktbindnings- analyser med *E51-märkt antikropp (Brown et al., 1981, Droc. Nat'l Qcad. Sci. U.S.Q., Zå: 539) eller medelst in- direkt fluorescens under användning av den fluorescens- aktiverade cellsorteraren (FQCS) II. Qntikroppar, som band till intracellulära'lokalisationer, bestämdes genom direktbindning av-**=I-märkt antikropp till celler efter fixering med paraformaldehyd och efterföljande permeabili- sering med den icke-joniska detergenten NP-40.

För bindningsanalyser utförda genom användning av radio- aktivt märkta antikroppar (Brown et al., äggra), inkube- rades odlade celler (lO“) på is under 30 minuter med 105 cpm av *2=I-märkt antikropp i 100 pl bindningsbuffert.

Suspensionen skiktades på 0,2 ml dinonylftalat: dibutyl~ ftalat i volymförhållandet 1:1 och centrifugerades. Puls- talet med avseende på *É=I räknades för tabletten och 467 988 *“ vattenfasen. För att uppmäta icke-specifik bindning ut- fördes parallella inkubatiüner med omärkt antikrüpp som konkurrent (Brown et al., sugra).

TQEELL I BINDNING QV RQDIDJODERQD LEÜ-QNTIKRÜPP TILL ÜDLQDE CELLER Celler Sgecifik bindning Calu-1 lung-adenükarcinem 45400 HEOBE lung-adenokarcinom 50100 HE9B1 lung-adenpkarcinüm 64100 HE9B4 lung-adenakarcincm 119300 MCF7 bröstkarcinpm 78800 3017 melanom EEOO Normala T-celler *OG Jurkat T-leukemi E00 Daudi B lymfnm E00 .¿.: l_Qtvphg§§§mninn av Lëüïantikrepp För att bestämma den klass av immuncglobuliner som pro- duceras av LED-hybridomcellinjen utnyttjades följande teknik: (a) Üuchtgrlüny-immunüdifjugidn _ En alikvet av överliggande vätska från speciella hybriddm~ celler placerades i centrumfacket hos en ES % agarplatta.

Moncspecifika kanin-anti-mus-Ig-isdtyp-antikrnppar (Southern Biotechnmldgy, Birmingham, QL) placerades i de yttre facken och plattan inkuberades under E timmar vid II! rumstemperatur och över natten vid 4°C. (b) ELISQ-isütvgning Dynatech Immuülen-plattor med 96 fack beströks med varje antiserum i en koncentration av 1 pg/ml, SG pl/fack i IJ fl) UI 467 988 EBS, och plattorna fick stå täckta över natten vid 4°C. De tvättades med PBS/Tween 20, 0,05 %, och blockerades med medium 100 pl/fack under 1 timme vid rumstemperatur. Efter tvättning av plattorna tillsattes överliggande vätskor från L20-hybridom och inkuberades 1 timme vid rumstempera- tur. Efter tvättning med DES inkuberades bovinserumalbumin (BBQ)-plattor vid 37°C under E timmar med monospecifika kanin-anti-mus-Ig-isotyp-antikroppar kopplade till peroxi- das (Zymed). Efter tvättning inkuberades plattorna med 1 pg/ml ortofenylendiamin och 0,03 % HQÜQ i 0,1 M citrat- buffert pH 4,5. Den optiska densiteten vid 630 nm bestäm- des med en Dynatec ELISQ-plattläsare.

Den monoklonala antikroppen LEO är av IgG1-ísotypen. .3. QNTIGEN IGENKÄNT QV LEO-QNTIHRDPP I syfte att identifiera proteinantigener radiojoderades lungkarcinomceller pa ytan eller märktes metaboliskt med 355-metionin. Qntigener isolerades från cellysat genom inkubation med monoklonal antikropp, tillsats av get-anti- mus-IgG och adsorption på Staghvlococcus aureus. Immunpre- cipitaten tvättades och underkastades preparativ natrium- dodecylsulfat-polyakrylamid-gelelektrofores (SDS-PQBE) på en 10-E0 % akrylamidgel. Efter elektrofores färgades gelen med Coomassie Brillant Blue (0,5 vikt-% till 10 % ättik- syra och 30 % isopropanol) och avfärgades i en lösning av ättiksyra (5 volym-%) och metanol (17 volym-%). Det färga- de LEO-antigenbandet utskars med ett rakblad och underkas- tades omedelbart elektroeluering med en ECU-040 elektro- eluator/koncentrator (C.B.S. Scientific_Co., San Diego, CR) enligt de metoder som har beskrivits av Hunkapiller et al., 1953, Methods in Enzymol. 21: EE?-E36.

Qutomatiserad Edman-nedbrytning utfördes med cirka E3 pmol av LEO-antigen (baserat på utbytet av identifierat L-1) i en gasfas-sekvensiator (Model 4709, Qpplied Biosystems, Inc., Foster City, CQ). Fenyltiohydantoin-aminosyraderiva- ten analyserades medelst högprestandavätskekromatografi 467 988 i (HDLC) i omvänd fas under användning av en Model 1209 on- line HDLC-enhet (Qpplied Biosystems, Inc.) med en PTH-C1B- kolonn (2,1 x E20 mm, Applied Biosystems, Inc.) och en natriumacetat/tetrahytdrofuran/acetonitril-gradient för eluering. ö Den aminoterminala aminosyrasekvensen är som följer: K 1 5 10 15 20 L-X-V-Q-V-D-E-X-D-V-V-Q-L-V-G-T-D-R-X-L där X representerar en aminosyra som ej har identifierats.

Jämförelse av denna sekvens med de som är lagrade i den aktuella proteindatabasen (DIR-version 6.0, november 1985) avslöjade icke någon signifikant sekvenshomologi med någon annan känd sekvens.

Det antigen som igenkänns av LEO-antikroppen är ett glyko- proteinantigen med en molekylvikt av cirka 110.000 dalton. .4. IMMUNÜHISTÜLÜBISK QPPLICQTIÜN IN VITRÜ Tekniken med omärkt antikropp enligt Sternberger, 1979, in Immunochemistry, John Wiley & Sons, New York, sid. 104- 169, modifierad av Garrigues et al., 1983, Int. J. Cancer E9: 511, användes för immunohistologiska studier på frysta sektioner. Màlvävnaderna för dessa provningar erhölls vid kirurgi och frystes inom 4 timmar efter avlägsnandet i iso- pentan, som hade för-kylts i flytande kväve. vävnaderna förvarades därefter i flytande kväve eller vid -70°C fram till användningen. Kanin-anti-mus-IgB (Sternberger-Meyer Immunochemicals, Inc., Jarettsville, MD) användes i en :nå spädning av 1/50. Mus-peroxidas-antiperoxidas-komplex (PQP, Sternberger-Meyer Immunochemicals, Inc.) innehål- lande E mg/ml av specifikt renat PQF användes i en späd- ning av 1/80. Frysta sektioner preparerades, torkades, behandlades med aceton och torkades (Barrigues et al., âgggg). Sektioner, som skulle användas för histologisk utvärdering, färgades med hematoxylin. För att minska icke- specifik bakgrund förinkuberades sektioner med normalt 467 988 humanserum i spädningen 1/5 (Garrigues et al., sugra). Mus- antikroppar, get-anti-mus-Igß och mus-PHP späddes i en lös- ning av 10 K normalt humanserum och 3 X kaninserum.

Färgningsförfarandet utgjordes av behandling av serie- sektioner med antingen specifik eller kontroll-antikropp under E,5 timmar, inkubation under 30 minuter med kanin- anti-mus-IgG i spädningen 1/50 och exponering för mus-UQP- komplex i spädningen 1/BO under 30 minuter. Efter varje behandling med antikropp tvättades objektglasen två gånger i DES. Den immunohistokemiska reaktionen framkallades med nyframställd 0,5 % 3,3'-diaminobensidin-tetrahydroklorid (Sigma, St. Louis, M0) och 0,01 % H20; i 0,05 M Tris- buffert, pH 7,6, under B minuter. Ytterligare exponering för en 1-procentig Üsüq-lösning i destillerat vatten under ED minuter intensifierade färgen. Sektionerna sköljdes med vatten, torkades i alkohol, klarades i xylen och montera- des på objektglas. Übjektglasen utvärderades vart och ett under kod och koda- de prover kontrollerades av en oberoende operatör. Typiska objektglas fotograferades under användning av differential- interferens-kontrastoptik (Zeiss-Nomarskif. Graden av antikroppsfärgning utvärderades som O (ingen reaktivitet), + (ett fåtal svagt positiva celler), ++ (minst en tredje- del av cellerna positiva), +++ (de flesta celler positi- va), ++++ (så gott som alla celler är kraftigt positiva).

Eftersom skillnaderna mellan +- och O-färgningen var mindre distinkt än mellan +- och ++-färgningarna betrakta- des en färgning graderad som ++ eller däröver som "posi- tiv". Både neoplastiska celler och stromaceller observera- des i tumörprover. Den registrerade färgningen var färg- ningen hos tumörcellerna, eftersom stromacellerna icke färgades alls eller färgades mycket svagare än tumör- cellerna. 467 988 TQBELL II IMMUNÜFERÜXIDQSFÄRBNINB RV TUMÖRER DCH NDRMQLQ VÄVNQDS- ÜRÜVER MED MÜNÜKLONQL QNTIKRÜPP LEO Vävnadstyp Qntal positiva/ antal testade * Lung-karcinom: adenokarcinom 18/EQ epidermoidkarcinom 3/3 bronkialkarcinom O/1 smàcelligt karcinom 4/4 Lung-karcinom: cellinjer 3/3 Bröstkarcinom 4/7 Kolonkarcinom 5/8 Melanom 5/8 Renalkarcinom 1/1 Liposarkom O/1 Normal lunga svag färgning hos 1 av 3 testade prover Normal mjälte negativ Normalt bröst negativ Normal kolon negativ Normal njure negatin Normal lever negativ Normal hjärna negativ Normalt hjärta negativt Normal hud negativ Normal tyroid negativ Normal testikel negativ Normal vagina negativ Normal lymfocyttablett negativ * Qlla undersökta prover var frysta sektioner av vävnader som hade erhållits vid kirurgi. Hänvisning sker till texten för en detaljerad beskrivning av immunohistolo- giska metoder. En färgning av E+ (representerar minst en tredjedel positiva celler) betraktades som positiv.

O* fIJ u] 467 988 Det är uppenbart att många modifikationer och variationer av denna uppfinning, såsom den anges ovan, kan göras utan att man avviker från andemeningen och omfånget. De speci- fika utföringsformer som har beskrivits har endast givits i exemplifierande syfte och uppfinningen begränsas endast av lydelsen av de bifogade patentkraven.

En cellinje, LED, enligt ovan har deponerats hos The Qmerican Type Tissue Culture Collection, Rockville, Mary- land och har erhållit depositionsnumret Q.T.C.C. nr HB 8913. Uppfinningen såsom den har beskrivits häri och med det begärda skyddsomfånget är ej begränsad till omfånget av den deponerade cellinjen, eftersom den deponerade utfö- ringsformen är avsedd som en enkel illustration på en aspekt av uppfinningen och vilka som helst ekvivalenta cellinjer som producerar en funktionellt ekvivalent monoklonal antikropp faller inom ramen för denna upp- finning. I själva verket är olika modifikationer av upp- finningen, förutom de som ovan har visats och beskrivits, uppenbara för fackmannen med ledning av föregående be- skrivning. Dylika modifikationer är avsedda att falla inom ramen för de bifogade patentkraven.

Claims (1)

1. 0 15 20 25 30 35 467 988 so PATENTKRÄV 1. Monoklonal antikropp, kännetecknad av att dess antigenbindande ställe binder till ett protein med en molekylvikt på omkring 110.000 dalton, och att det har en aminoterminal aminosyrasekvens som mi» följer: n 1 5 10 15 20 L-x-v-Q-v-P-E-x-P-v-v-A-L-v-G-tr-D-A-x-L i vilken X betecknar en oidentifierad aminosyra, vilket proteinantigen är en cellytedeterminant för icke småcelligt humanlungkarcinom. Monoklonal antikropp enligt patentkrav 1, kännetecknad av att den är konjugerad till en markör med förmåga att avge en detekterbar signal. Monokonal antikropp enligt patentkrav 2, kännetecknad av att markören innefattar ett fluorescerande medel, en radiomarkör, en kromofor eller ett enzym. Monoklonal antikropp enligt patentkrav 1, kännetecknad av att den innefattar en IgG-isotyp. Monoklonal antikropp enligt patentkrav 1, kännetecknad av att den innefattar en IgG1-isotyp. Monoklonal antikropp enligt patentkrav 1, kännetecknad av att den framställts av en cellinje från murinhybridom. Wi f! 10 15 20 25 30 35 10. 11. 467 988 3/ Monoklonal antikropp enligt patentkrav 6, kännetecknad av att murinhybridomet innefattar ett hybridom som har särdragen hos HB8913 såsom den deponerats hos ATCC. Monoklonal antikropp enligt patentkrav 6, eller ett Fab-, F(ab')2- eller Fv-fragment därav, vilken antikropp eller fragment kännetecknas av att hybridomet HB8913 är bildat genom fusion av en myelomcell från NS1-mus med en splenocyt från mus erhållen från en Balb/c-mus immuniserad med celler innehållande ett proteinantigen på 100 kilodalton, som bestämt genom polyakrylamidgel-elektrofores, varvid proteinantigenet har en aminoterminal aminosyrasekvens som följer: 1 5 10 15 20 L-X-V-Q-V-P-E-X-P-V-V-A-L-V-G-T-D-A-X-L i vilken X representerar en oidentifierad aminosyra, vilket proteinantigen är en cellytedeterminant av icke-småcelligt humanlungkarcinom. Ett Fab-, (Fab')2- eller Fv-fragment av den mono- klonala antikroppen enligt patentkrav 1. Fragment av monoklonal antikropp enligt patentkrav 9, kännetecknad av att den är konjugerad till en markör till en förmåga att producera en detekterbar signal. Fragment av monoklonal antikropp enligt patentkrav 10, kännetecknad av att markören innefattar ett fluorescerande medel, en radiomarkör, en kromofor eller ett enzym. 467 988 33 12. Hybridomcellinjen HB8913 såsom deponerad hos ATCC. 4.1