FI88654C - Fluorescenshoejningsmetod - Google Patents

Description

, , 88654 fluoresenssinlisAysmenetelmA Keksinnön tausta

Keksintö kohdistuu fluoresenssiin, erityisesti aikaerotteiseen fluoresenssiin perustuvaan menetelmään bioaffiniteettireakti-oiden kvantitointiin, jossa yksi tai useampi reaktioon 5 osallistuvista bioaffiniteettikomponenteista on leimattu lantanidikelaatilla. Menetelmä parantaa lantanidikelaattien fluoresenssia, kun niitä käytetään merkkiaineina biologisesti aktiivisten aineiden fluorometrisessa määrityksessä.

Yleistä bioaffiniteettimäärityksistä 10 Spesifisissä bioaffiniteettiin perustuvissa määritysmenetelmissä mitataan yleensä analyyttejä hyvin pienissä pitoisuuksissa, jolloin on käytettävä merkkiaineita, jotka ovat detektoitavissa erittäin herkällä menetelmällä. Tällaisia bioaffiniteettimäärityksiä ovat mm. immunokemialliset määri-15 tykset, nukleiinihappohybridisaatiot, lektiinireaktiot sekä reseptorimääritykset. Kaikkien näiden reaktioiden analyyttisissä sovellutuksissa käytetään yleensä erilaisia merkki-ainemenetelmiä. Perinteisiä merkkiaineita ovat radioisotoopit, joita esimerkiksi käytetään radioimmunologisissa (RIA) ja 20 immunoradiometrisissä (IRMA) määrityksissä, jotka ovat herkimpiä käytössä olevia spesifisiä analyyttisiä menetelmiä. RIA-määritysten detektioherkkyys on noin 10“14 M ja IRMA-määritys-ten vastaava herkkyysraja on noin 10-16 M. Yleisestä käytöstä huolimatta on radioisotoopeilla merkkiaineina haittoja kuten 25 rajoitettu säilyvyys sekä käsittelyongelmat. Tästä syystä on hyvin aktiivisesti tutkittu mahdollisuuksia korvata radioaktiiviset merkkiaineet muilla vaihtoehdoilla.

Fluoresenssimenetelmät ovat yhä laajemmalti käytössä kemiallisessa, biokemiallisessa sekä lääketieteellisessä 30 analytiikassa. Fluoroimmunomääritykset ja immunofluorometriset määritykset, jotka perustuvat aikaerotteiseen fluorometriaan ja lantanidikelaatteihin merkkiaineina antavat ainakin saman tai jopa paremman herkkyyden kuin RIA- ja IRMA-menetelmät.

2 88654

Fluoresoivista merkkiaineista

Fluoresoivien merkkiaineiden herkkyys esimerkiksi imrouno-määrityksissä on teoriassa korkea, mutta käytännössä fluoresenssin tausta muodostaa herkkyyttä rajoittavan tekijän.

5 Taustaf luoresenssia tulee sekä näytteen sisältämistä komponenteista että mittaukseen käytettävistä tarvikkeista ja välineistä. Joissakin tapauksissa kun ei tarvita kovin suurta herkkyyttä, on fluoresoivia merkkiaineita voitu käyttää, mutta usein taustafluoresenssin intensiteetti aiheuttaa todellisen 10 ongelman. Esimerkiksi seerumin sisältämät eri komponentit aiheuttavat usein tällaisen ongelman. Näytteen aiheuttama sironta aiheuttaa myös interferenssiä erityisesti, kun käytetään merkkiaineita, joilla on pieni Stoken siirtymä (<50 nm) . Korkeasta taustasta ja sironnasta johtuen on merkkiaineiden 15 herkkyys seerumissa noin 50-100 kertaa alhaisempi verrattaessa saman merkkiaineen herkkyyteen puhtaassa puskuroidussa liuoksessa.

Aikaerotteinen fluorometria ja lantanidifluoresenssi

Aikaerotteinen fluoresenssi (katso Soini, E., Hemmilä, I., 20 Clin. Chem. 1979, 25, 353-361) antaa mahdollisuuden erottaa merkkiaineen spesifinen fluoresenssi häiritsevästä taustan epäspesifisestä fluoresenssistä. Aikaerotteisen fluoresenssin käytöstä bioaffiniteettireaktioihin perustuvissa määrityksissä on kerrottu Yhdysvaltain patenteissa nro 4.058.732 ja nro 25 4.374.120. Aikaerotteisessa fluoresenssissa fluoresoiva merkkiaine viritetään lyhytikäisellä valopulssilla ja fluoresenssi mitataan tietyn ajan kuluttua viritystapahtuman jälkeen. Viritys- ja mittaustapahtuman välisenä aikana häiritsevien komponenttien fluoresenssi sammuu niin, että ainoastaan 30 merkkiaineesta lähtöisin oleva fluoresenssi mitataan. Tällaisella merkkiaineella pitäisi olla korkea fluoresenssi-intensiteetti, suhteellisen pitkä emissioaallonpituus, pitkä Stoken siirtymä, tarpeeksi pitkä fluoresenssin puoliintumisaika ja lisäksi merkkiaineen pitäisi olla kovalenttisesti sidottavissa 3 88654 vasta-aineeseen tai antigeeniin niin, että tällä ei ole vaikutusta kyseisten immunokomponenttien ominaisuuksiin.

Eräillä lantanidikelaateilla kuten tietyillä europium-, samarium- ja terbiumkelaateilla on pitkä fluoresenssin puo-5 liintumisaika ja ne ovat täten hyvin sopivia merkkiaineita aikaerotteisessa fluorometriässä. Emissioaallonpituus on suhteellisen pitkä (terbium 544 nm, europium 613 nm, samarium 643 nm) ja Stoken siirtymä on hyvin laaja (230-300 nm) . Tärkein ominaisuus on kuitenkin fluoresenssin pitkä puoliin-10 tumisaika, noin 50-100 mikrosekuntia, mikä mahdollistaa aikaerotustekniikan käytön. Merkkiaineen fluoresenssi voidaan mitata, kun merkkiaine on joko sitoutuneena antigeeniin tai vasta-aineeseen, tai sitten lantanidi voidaan oikein valituissa olosuhteissa irrottaa näistä dissosioimalla lantanidin ja 15 kelaatin välinen sidos. Dissosiaation jälkeen lantanidin fluoresenssi mitataan liuoksessa beeta-diketonin, synergis-tisen aineen ja detergentin läsnäollessa, jotka lantanidin kanssa muodostavat misellirakenteen, jossa lantanidin fluoresenssi-intensiteetti on erittäin korkea (Yhdysvaltain patentti 20 nro 4.565.790). Liuosta, joka sisältää beeta-diketonia, synergistisen aineen ja detergentin alhaisessa pH:ssa, kutsutaan fluoresenssin kehitysliuokseksi.

Yhteenveto keksinnöstä

Keksinnölle on tunnusomaista se, että lantanidi ennen 25 fluoresenssimittausta saatetaan voimakkaasti fluoresoivaan muotoon sisällyttämällä lantanidi aggregoituun partikkeliin, joka sisältää määritettävän lantanidikelaatin, fluoresenssia lisäävän ionin kelaatin, vapaata beeta-diketonia ja synergis-tisen aineen sekä tarvittaessa detergentin ja vesiliukoisen 30 orgaanisen liuottimen, jolloin syntyy kofluoresenssia. Tällä menetelmällä voidaan lisätä lantanidikelaattien fluoresenssi-intensiteettiä mitattaessa biologisesti aktiivisia aineita ja käytettäessä merkkiaineina europiumia, terbiumia, samariumia tai dysprosiumia.

4 & 8 654

Keksintöön johtaneet taustatiedot

Vuonna 1967 on osoitettu, että europium (tai samarium)-TTA-kollidiini -kompleksin fluoresenssi lisääntyy erittäin voimakkaasti, kun lisätään Gd3+ tai Tb3+ (Melanteva et ai. (1967), 5 Zh. Anal. Khim. 22, 187). Ilmiötä ei kuitenkaan tarkemmin tutkittu. Viime vuosina kun on tutkittu europium- ja samarium-kelaatteja TTA:n ja synergistisen ligandin läsnäollessa, on osoitettu että fluoresenssin voimakas lisäys perustuu sisäiseen fluoresenssiefektiin, jota kutsutaan kofluoresenssiksi. 10 Aiheesta on viime aikoina julkaistu useita tutkimuksia (Yang Jinghe et ai. (1987) Anal. Chim. Acta, 198, 287; Ci Yunxiang et ai. (1988), Analyst (London), 113, 1453; Ci Yunxiang et ai. (1988) Anal. Lett., 21, 1499; Ci Yunxiang et ai. (1989), Anal. Chem., 61, 1063; Yang Jinghe (1989), Analyst (London), 114, 15 1417) . Kaikissa tähänastisissa tutkimuksissa on käytetty ainoastaan yhtä beeta-diketonia (TTA), kahta fluoresoivaa lan-tanidia (Eu3+ ja Sm3+), ja määritykset on tehty yttriumoksidin läsnäollessa.

Keksinnön yksityiskohdat 20 Tässä keksinnössä on osoitettu, että taulukossa I esitetyt beeta-diketonit antavat hyvän kof luoresenssiefektin. Taulukko I:ssä esitetyt aromaattiset beeta-diketonit soveltuvat hyvin europiumin ja samariumin mittaamiseen kofluoresenssimenetel-mällä, kun taas taulukon alifaattiset beeta-diketonit 25 soveltuvat europiumin, terbiumin, samariumin ja dysprosiumin mittaamiseen toisella kofluoresenssiin perustuvalla menetelmällä. Keksinnössä on osoitettu, että europiumin ja samariumin sekä lisäksi terbiumin ja dysprosiumin fluoresenssi-intensiteetti lisääntyy voimakkaasti käytettäessä kof luoresenssissa 30 muita lantanideja ja yttriumia. Mainittakoon, että terbiumia, jolla on epätavallinen kof luoresenssivaikutus, voidaan käyttää fuoresenssiä lisäävänä ionina, kun halutaan lisätä europiumin ja samariumin kof luoresenssia käytettäessä aromaattista beeta-diketonia. Sitä voidaan käyttää myös fluoresoivana ionina, 35 jonka fluoresenssia lisätään toisella lantanidi-ionilla tai 5 fe 8 6 5 4 yttriumilla, kun kofluoresenssissa käytetään alifaattista beeta-diketonia.

Taulukon I beeta-diketonit muodostavat keksinnön mukaisesti niitä käytettäessä kelaatit sekä fluoresoivan lantanidi-ionin 5 että fluoresenssia lisäävän ionin kanssa.

Jotta fluoresenssia voitaisiin edelleen lisätä, on kofluore-senssimenetelmässä käytettävä myös synergistisiä aineita. Tällaisia aineita ovat 1,10-fenantroliini (Phen), 10 4,7-dimetyyli-l,10-fenantroliini (4,7-DMphen), 4,7-difenyyli-l,10-fenantroliini (4,7-DPphen), 5.6- dimetyyli-l,10-fenantroliini (5,6-DMphen), 2,9-dimetyyli-4,7-difenyyli-l,10-fenantroliini (DMDPphen), 2,21-dipyridyyli (DP), 15 2,21—dipyridyyliamiini (DPA), 2.4.6- trimetyylipyridiini (TMP), 2,21:61,211-terpyridiini (TP), 1,3-difenyyliguanidiini (DPG).

Synergistiset aineet muodostavat lantanidikelaattien ke-20 laattirakennetta täydentävän rakenteen ollen samalla hydrofobisia, jolloin ne estävät fluoresenssia sammuttavan veden vaikutuksen.

Lantanidikelaattien vahva fluoresenssi perustuu siihen, että ligandi absorboi viritysenergian, jonka jälkeen energia 25 siirtyy ligandin triplettitasolta lantanidin resonanssi- tasolle. Seurauksena on hyvin kapea emissiohuippu, jonka aallonpituus on lantanidi-ionille ominainen. Lisäksi emissiolla on pitkä puoliintumisaika. Kofluoresenssi perustuu molekyylinsisäiselle energiasiirrolle, joka tapahtuu fluore-30 senssiä lisäävän ionin kelaatista, energian luovuttaja, fluoresoivan ionin kelaattiin, energian vastaanottaja, : edellyttäen että kofluoresenssikompleksi on liuoksessa suspensiona tai kiinteässä muodossa aggregoituneina hiukkasina ja että liuoksessa on suuri ylimäärä fluoresenssia lisäävää 6 88654 ionia sisältävää kelaattia. Aggregoiduissa hiukkasissa fluoresoivan lantanidi-ionin sisältävä kelaatti on kiinteässä kontaktissa useisiin fluoresenssia lisääviin lantanidikelaat-tikomplekseihin, jotta energia voi siirtyä tehokkaasti jälkim-5 mäisestä edelliseen.

Kofluoresenssiin sopivia fluoresenssia lisääviä ioneja ovat Gd3+, Tb3+, Lu3+, La3+ ja Y3+. Ionia on aina käytettävä suuri ylimäärä, jolloin fluoresenssia lisäävä ioni vaikuttaa fluoresoivaan ioniin (Eu3+, Tb3+, Sm3+ tai Dy3+) niin, että sen inten-10 siteetti kasvaa 10-1000 -kertaiseksi. Joissakin tapauksissa ei fluoresenssia ollut lainkaan havaittavissa ilman fluoresenssia lisäävää kofluoresenssikompleksia, mutta kyseisen kompleksin läsnäolo aikaansai fluoresoivan ionin voimakkaan fuoresenssin.

15 Useimmissa kofluoresenssikomplekseissa detergentin, kuten Triton X-100, Tritontm X-100, Triton N-101 ja Triton X-405, läsnäolo vaikuttaa fluoresenssi-intensiteettiin ja sen stabii-lisuuteen. Muodostuvat misellit suojaavat fluoresoivia kelaat-teja veden sammuttavalta vaikutukselta ja pitävät samalla 20 kofluoresenssikompleksin suspensiossa.

Vesiliukoiset orgaaniset liuottimet kuten etanoli, propanoli, dimetyylisulfoksidi, 2-metoksietanoli tai etyleeniglykoli lisäävät usein fluoresoivan ionin fluoresenssia kofluore-soivassa kompleksissa.

7 88654

Kof luoresenssiin perustuvaa määritystä voidaan käyttää useilla ei tavoilla mitattaessa biologisia aineita. Biologinen aine voidaan merkitä lantanidikelaatilla käyttäen kelaatin muodostavaa yhdistettä kuten jotain EDTA-analogia. Immuno-5 kemiallisen määrityksen jälkeen lantanidi-ioni dissosioidaan merkitystä biologisesta aineesta liuokseen, jonka jälkeen muodostetaan erittäin voimakkaasti fluoresoiva aggregoitu partikkeli (kof luoresoiva kompleksi) koostuen lantanidikelaa-tista ja fluoresenssia lisäävän ionin kelaatista. Biologinen 10 aine voidaan myös suoraan merkitä erittäin voimakkaasti fluoresoivilla partikkeleilla käyttäen kemiallista sidosta tai adsorbtiota. Immunokemiallisen reaktion jälkeen partikkeleiden fluoresenssi mitataan joko liuossuspensiossa tai suoraan kiintokantajan pinnalta. Vaihtoehtoisesti biologinen aine 15 voidaan merkitä ainoastaan beeta-diketonijohdannaisella tai synergistisellä aineella, joissa on ryhmä joka mahdollistaa niiden kytkemisen immunokomponenttiin kuten proteiiniin. Immunokemiallisen määrityksen jälkeen muodostetaan voimakkaasti fluoresoiva aggregoitu partikkeli, joka sisältää 20 lantanidikelaatin sekä ylimäärän fluoresenssia lisäävän ionin kelaattia. Tässä tapauksessa käytetään myös ylimäärä fluoresoivan ionin kelaattia, jolloin esimerkiksi lantanidikonta-minaatio ei häiritse ja fluoresenssi voidaan vaikka mitata suoraan kiintokantajan pinnalta. Tekijöitä, jotka vaikuttavat 25 kofluoresenssiin esimerkiksi intensiteettiä lisäävästi tai sammuttavasti, voidaan käyttää homogeenisissa määrityksissä, joissa ei käytetä erotusvaihetta. Tällaisia tekijöitä ovat esimerkiksi antigeeni-vasta-ainereaktiot ja energian siirtoon vaikuttavat aineet. Kofluoresenssiin perustuvaa määritystä 30 voidaan käyttää yleisesti bioaff initeettireaktioihin perustuvissa menetelmissä kuten immunokemialliset määritykset, nukleiinihappohybridisaatiomääritykset, reseptorimääritykset sekä lektiinireaktiot, joissa kaikissa käytetään lantanidike-laatteja tai kof luoresenssikompleksin muodostavia komponentte-35 ja merkkiaineina.

8 88654

Koska kofluoresenssikompleksiin perustuvat lantanidimääri-tykset ovat erittäin herkkiä, voidaan näitä komplekseja käyttää myös useiden lantanidien samanaikaiseen määritykseen, jolloin analyyttisissä sovellutuksissa voidaan määrittää 5 useita analyyttejä yhdessä näyteinkubaatiossa.

Yleensä kofluoresenssissa käytettävä kehitysliuos tehdään ennen käyttöä. Se koostuu kahdesta eri liuoksesta, Ea ja Eb, jotka säilytetään erillään. Kun määrityksessä on tarpeen dissosioida lantanidi-ioni merkitystä biologisesta aineesta, 10 sisältää Ea A) fluoresoivan ionin ja fluoresenssia lisäävän ionin kelatoivan beeta-diketonin, jota on ylimäärä kelatoita-viin ioneihin verrattuna, B) fluoresenssia lisäävän ionin ja C) detergentin, kaikki vesiliuoksessa, jonka pH säädetään <4 etikka- tai suolahapolla, kun taas Eb sisältää D) synergis-15 tisen aineen ja E) puskurin, jonka pH on >6. Kun kehitysliuok-sia käytetään, lisätään ensin liuos Ea, jonka jälkeen sekoitetaan 1-5 minuuttia, jolloin lantanidi-ioni dis-sosioituu. Sitten lisätään Eb ja sekoitusta jatketaan 1-15 minuuttia. Toisen sekoitusvaiheen aikana muodostuu suspensio, 20 joka sisältää aggregoidut erittäin fluoresoivat partikkelit. Fluoresenssi mitataan käyttäen aikaerotteista fluorometriaa.

Keksintöä havainnollistetaan seuraavin esimerkein:

Esimerkki 1

Kofluoresenssikehitysliuos Eu3+ ja Sm3+ määritystä varten 25 sisältäen TTA:ta, fenantroliinia, Y3+:a ja Triton X-100:aa.

Kehitysliuos koostuu kahdesta osasta, Ea, joka sisältää 60 μΜ TTA, 7,5 μΜ Y3+, 0.06 % (w/v) Triton X-100 vesiliuoksessa, jonka pH on säädetty 3.2:een etikkahapolla, sekä Eb, joka sisältää 1,75 mM fenantroliinia 0.21 M Tris-puskurissa.

9 88654

Kehitysliuoksia Ea ja Eb käytettiin suhteessa 10:1. Kuva l esittää Eu3+ ja Sm3+ standardikäyriä, kun on käytetty kofluore-senssia. Referenssinä on käytetty kaupallista DELFIAR kehitys-liuosta (En). Kofluoresenssilla saavutetaan selkeästi parempi 5 tulos kuin DELFIAR-menetelmä 11 ä.

Esimerkki 2

Kofluoresenssiin perustuva kehitysliuos Eu3+ ja Sm3* määrittämiseksi sisältäen BTA:ta, fenantroliinia, Y3*:a ja Tritontm X-i00:aa.

10 Kehitysliuos koostuu kahdesta osasta, liuos Ea, joka sisältää 50 μΜ BTA, 7.5 μΜ Y3+ ja 0.02 % (w/v) Tritontm X-100 vesiliuoksessa, jonka pH on säädetty etikkahapolla 3.2reen, sekä liuos Eb, joka sisältää 500 μΜ fenantroliinia 0.2 M Tris-puskurissa. Liuoksia Ea ja Eb käytetään suhteessa 10:1. Kehitysliuoksella 15 saavutettavat fluoresenssitulokset on esitetty taulukossa II.

Esimerkki 3

Kof luoresenssiin perustuva kehitysliuos Eu3*, Tb3*, Sm3* ja Dy3+ samanaikaiseen määritykseen liuoksessa, joka sisältää PTA:ta, Y3*:a, Triton X-100:aa ja etanolia.

20 Kehitysliuos koostuu kahdesta osasta, Ea, joka sisältää 50 μΜ PTA, 7.5 μΜ Y3*, 0.06 % (W/v) Triton X-100 ja 25 % (v/v) etanolia vesiliuoksessa, jonka pH on etikkahapolla säädetty 3.45:een ja Eb, joka sisältää 500 μΜ fenantroliinia 0.2 M Tris-puskurissa. Liuoksia Ea ja Eb käytetään suhteessa 10:1. 25 Kehitysliuoksella saavutettavat fluoresenssitulokset on esitetty taulukossa III.

ίο 88654

Esimerkki 4

Kofluoresenssiin perustuva kehitysliuos Eu3*, Tb3+, Sm3+ ja Dy3+ samanaikaiseen määritykseen liuoksessa, joka sisältää PTA:ta, DP:tä, Y3* ja Triton X-100.

5 Kehitysliuos koostuu kahdesta osasta, liuos Ea sisältää 100 μΜ PTA, 3 μΜ Y3* ja 0.0006 % (w/v) Triton X-100 vesiliuoksessa, jonka pH on etikkahapolla säädetty 3.0:aan, sekä liuos Eb, joka sisältää 5 mM DP ja 80 % (v/v) etanolia 0.375 M Tris-puskurissa. Liuoksia Ea ja Eb käytetään suhteessa 10:1. 10 Kehitysliuoksella saavutettavat fluoresenssitulokset on esitetty taulukossa IV.

Esimerkki 5 FSH:n määritys aikaerotteiseen fluoresenssiin perustuvalla immunofluorometrisella menetelmällä käyttäen kofluoresenssi-15 kehitystä (liuokset Ea ja Eb).

Monoklonaalinen anti-alfa-FSH vasta-aine leimattiin käyttäen merkkiaineena N1-(p-isotiosynaattibensyyli)-dietyleenitriamiini-N1, N2, N3, N*-tetraetikkahappoa. Leimaus tehtiin pH:ssa 9.5 käyttäen 50-kertaista molaarista ylimäärää 20 Eu-kelaattia. Vapaa merkkiaine erotettiin leimatusta vasta-aineesta geelisuodatuksella (Sepharose 6B + Sephadex G 50). Leimaussuhteeksi tuli 17 Eu3+/IgG. Mikrotiitterilevyjen kuopat pinnoitettiin monoklonaalisella anti-beeta-FSH vasta-aineella. Pinnoitus tehtiin 0.1 M NaH?P04 puskurissa pH 4.5 yli yön 25 huoneenlämmössä käyttäen 1 μg vasta-ainetta kuoppaa kohti. Kuopat pestiin ja saturoitiin 0.1 % BSA:lla ja säilytettiin kosteina +4°C.

Immunomääritys tehtiin 0.05 M Tris-HCl puskurissa pH 7.7, joka sisälsi 9 g/1 NaCl, 0.05 % NaN3, 0.5 % BSA, 0.05 % naudan 30 globuliinia ja 0.01 % Tween 40. Ensimmäinen inkubaatio (1 tunti huoneenlämmössä) tehtiin eri FSH-pitoisuuksilla ja 11 88654 toinen inkubaatio (l tunti huoneenlämmössä) tehtiin käyttäen 5 ng Eu-kelaatilla leimattua anti-alfa-FSH vasta-ainetta kuoppaa kohti, jonka jälkeen kuopat pestiin kuusi kertaa.

Pesun jälkeen europium-ioni dissosioitiin lisäämällä 200 μΐ 5 liuos Ea:tä kuoppaa kohti, jonka jälkeen ravistettiin 1-2 minuuttia. Käytetyn merkkiaineen (Eu3+) fluoresenssi kehitettiin lisäämällä 20 μΐ liuosta Eb kuoppaa kohti, jonka jälkeen ravistettiin 8-10 minuuttia. Fluoresenssi mitattiin käyttäen aikaerotteista fluorometria, jolloin syklien väli oli 2 ms, 10 virityksen ja mittauksen välinen viive 0.5 ms ja mittausaika 1.5 ms. Tulokset on esitetty kuvassa 2A. Kuva 2B esittää saman immunomäärityksen tulokset, kun mittaukseen on käytetty kaupallista DELFIAR-kehitysliuosta. Kofluoresenssia käyttäen saadaan alhaisissa FSH-pitoisuuksissa paljon parempi tulos 15 kuin DELFIAR:lla.

Esimerkki 6 FSH:n määritys aikaerotteiseen fluoresenssiin perustuvalla immunofluorometrisella menetelmällä käyttäen kofluoresenssi-kehityksessä liuoksia Ea ja Eb.

20 Immunomäärityksessä käytettävät komponentit ja menetelmät olivat samat kuin esimerkissä 5. Eu3* dissosiaatio ja fluoresenssin kehitys immunomäärityksen jälkeen tapahtui seuraavasti. Dissosiaatio tehtiin lisäämällä 200 μΐ liuosta Ea kuoppaa kohti, jonka jälkeen ravistettiin 1-2 minuuttia. Merkkiaineen 25 (Eu3*) fluoresenssi kehitettiin lisäämällä 20 μΐ liuosta Eb kuoppaa kohti, jonka jälkeen ravistettiin 1 minuutti. Fluoresenssi mitattiin kuten esimerkissä 5. Määrityksen standardikuvaa ja esitetään kuvassa 3.

12 8 8 654

Taulukko I

Beeta-diketoni R1-CO-CH2-CO-R2 R1 R2

Thenoylitrifluoroasetoni (TTA) -CF3

Pivaloylitrifluoroasetoni (PTA) (CH3)3C- -CF3 1,1,1-trifluoro-6-metyyli-2,4- heptanidioni (TFMH) (CH3)2CHCH2- -CF3

Dipivaloylimetaani (DPM) (CH3)C- -C(CH3)3

Bentsoylitrifluoroasetoni (BTA) C6H5- -CF3 1.1.1.2.2- pentafluoro-5-fenyyli- 3.5- pentanidioni (PFPP) C6H5- -CF2CF3 2-furoylitrifluoroasetoni (FTA) -CF3 p-fluorobentsoylitrifluoroasetoni (FBTA) F“\ö/~ “CF3 1.1.1.2.2- pentafluoro-6,6-dime- tyyli-3,5-heptanidioni (PFDMH) (CH3)3C- -CF2CF3 1,1,1,2,2,3,3-heptafluoro-7,7- dimetyyli-4,6-oktanidioni (HFDMO) (CF3)3C— cf3 1.1.1.5.5.5- heksafluoroasetyyli- asetoni (HFAcA) F3C- -CF3 1.1.1.2.2- pentafluoro-3,5-heksani- dioni (PFH) CH3- -CF2CF3 p-isotiosyanaattibentsoylitri- fluoro-asetoni (1CBTF) S=C=N-CH2~ o - -CF3

Di-p-fluorobentsoyli-metaani (DpFBM) F<ö)" ·\£/"Γ

Dibentsoyylimetääni (DBM) C6H5- -C6H5 13 88654

Taulukko II

Fluore-Viri- Emissio Viive Vahvis- Fluoresenssi Tausta Herkk

soiva tys (max) tus- 1 nM ionille sykäys/ pM

ion (max) kerroin* sykäys/ sekunti nm nm us sekunti

Eu3* 333 612 764 208 4194x10- 1860 0.0043

Sm3* 337 647 79 358 231xl03 204 0.11 * Fluoresenssin lisäyskerroin lasketaan mittauslukemista Y3':n läsnäollessa ja ilman Y3*:aa.

Taulukko III

Fluore- Viri- Emissio Viive Vahvis- Fluoresenssi Tausta Herkkyys soiva tys (max) tus- 1 nM ionille sykäys/ pM

ioni (max) kerroin sykäys/ sekunti nm nm us sekunti

Eu3* 315 612 820 130 2.740.000 580 0.035

Tb3‘ 312 544 323 1078 956.000 2770 0.34

Sm3* 315 647 88 61 5.330 370 7.9

Dy3* 316 574 27 102 16.400 6980 46 ·· Taulukko lv

Fluore- Viri- Emissio Viive Vahvis- Fluoresenssi Tausta Herkkyys

®oiva ^Υβ (max) tus- 1 nM ionille sykäys/ pM

i°ni (max) kerroin sykäys/ sekunti nm ma us sekunti

Eu3' 312 612 948 >1000 6.846.000 1000 0.019

Tb3* 312 545 239 >1000 2.983.000 2400 0.27

Sm3* 312 647 48 309 11.200 100 3.8

Dy3~ 312 575 11 985 24.500 6720 100

Claims (9)

14 6 6 654

1. Fluoresenssiin, erityisesti aikaerotteiseen fluoresenssiin perustuva menetelmä bioaffiniteettireaktioiden kvantitointiin, jossa yksi tai useampi reaktioon osallistuvista bioaffiniteet-tikomponenteista on leimattu lantanidikelaatilla, tunnettu 5 siitä, että lantanidi ennen fluoresenssimittausta saatetaan voimakkaasti fluoresoivaan muotoon sisällyttämällä lantanidi aggregoituun partikkeliin, joka sisältää määritettävän lantanidikelaatin, fluoresenssia lisäävän ionin kelaatin, vapaata beeta-diketonia ja synergistisen aineen sekä tarvitta-10 essa detergentin ja vesiliukoisen orgaanisen liuottimen, jolloin syntyy kofluoresenssia.

2. Patenttivaatimuksen 1 mukainen menetelmä, tunnettu siitä, että lantanidi on Eu3+, Tb3+, Sm3+ tai Dy3+.

3. Patenttivaatimuksen 1 tai 2 mukainen menetelmä, tunnettu 15 siitä, että fluoresenssia lisäävä kolmenarvoinen ioni on Y3+, Gd3+, Tb3+, Lu3+ tai La3+.

4. Patenttivaatimuksen 1 mukainen menetelmä, tunnettu siitä, että kofluoresenssi mitataan joko liuoksesta tai kiinteältä kantajalta.

5. Patenttivaatimuksen 1 mukainen menetelmä, tunnettu siitä, että beeta-diketoni on thenoylitrifluoroasetoni, pivaloylitrifluoroasetoni, 1,1,l-trifluoro-6-metyyli-2,4-heptanidioni, dipivaloylimetaani, bentsoylitrifluoroasetoni, 25 1,1,l,2,2-pentafluoro-5-fenyyli-3,5-pentanidioni, 2-furoylitrifluoroasetoni, p-fluorobentsoylitrifluoroasetoni, 1.1.1.2.2- pentafluoro-6,6-dimetyyli-3,5-heptanidioni, 1,1,1,2,2,3,3-heptafluoro-7,7-dimetyyli-4,6-oktanidioni, 30 1,1,1,5,5,5-heksafluoroasetyyliasetoni, 1.1.1.2.2- pentafluoro-3,5-heksanidioni, is 88654 p-isotiosyanaattibentsoylitrifluoroasetoni, di-p-fluorobentsoyli-metaani tax dibentsoylimetaani.

6. Patenttivaatimuksen 1 tai 4 mukainen menetelmä, tunnettu siitä, että synergistinen aine on 1,10-fenantroliini, 4,7- 5 dimetyyli-l,10-fenantroliini, 4,7-difenyyli-l,10-fenantroliini, 5,6-dimetyyli-l,10-fenantroliini, 2,9-dimetyyli-4,7-difenyyli-l,10-fenantroliini, 2,21-dipyridyyli, 2,21-dipyridyyliamini, 10 2,4,6-trimetyylipyridiini, 2,2^6^, 211--terpyridiini tai 1,3-difenyyliguanidini.

7. Patenttivaatimuksen 1 tai 4 mukainen menetelmä, tunnettu siitä, että vesiliukoinen orgaaninen liuotin on etanoli, propanoli, dimetyylisulfoksidi, 2-metoksietanoli tai ety- 15 leeniglykoli.

8. Patenttivaatimuksen 1 tai 4 mukainen menetelmä, tunnettu siitä, että detergenttinä on Triton X-100, Tritontm X-100, Triton N-101 tai Triton X-405.

9. Patenttivaatimuksen 1 mukainen menetelmä, tunnettu 20 siitä, että bioaffiniteettireaktio on immunomääritys, nukleiinihappohybridisaatio, reseptorimääritys tai lek-tiinireaktio. ie 8 8 654