DE3850981T2 - Wasserunlösliches Teilchen und immunoreaktives Reagens, analytische Elemente und Verfahren zu ihrer Verwendung. - Google Patents

Description

• Diese Erfindung betrifft ein Kern-/Hüllen-Polymerteilchen mit einem bestimmbaren oder feststellbaren Tracer-Material lediglich im Kern. Die Erfindung betrifft ferner ein immunoreaktives Reagens und die Verwendung des Reagens in analytischen Elementen und Methoden.
• Biologisch aktive Polypeptide oder Proteine, die an unlösliche Trägermaterialien gebunden sind, wie beispielsweise polymere Teilchen, sind in einer Vielzahl von Methoden verwendet worden. Beispielsweise wird die Diagnose von pathologischen oder anderen Zuständen beim Menschen und beim Tier oftmals durchgeführt unter Anwendung immunologischer Prinzipien für die Bestimmung einer immunologisch reaktiven Spezies, beispielsweise von Antikörpern oder einem Antigen, in den Körperflüssigkeiten der Person oder des Tieres. Ein Antigen ist allgemein bekannt als eine Fremdsubstanz, wie beispielsweise ein Arzneimittel, Hapten, Toxin, Lektin, Glykoprotein, Polysaccharid, Glykolipid, Polypeptid oder Protein, das, wenn es in den Körper gelangt, zur Erzeugung von bestimmten löslichen Proteinen führt, die als Antikörper bekannt sind.
• Andere Proteine (wie zum Beispiel Enzyme oder Avidin) oder Biotin sind kovalent an verschiedene Trägermaterialien gebunden worden, um sie im Rahmen einer Affinitätschromatographie, im Rahmen von enzymatischen Reaktionen, analytischen Verfahren, spezifischen Bindungsreaktionen sowie Immunoassays, zu verwenden. Zu geeigneten Trägermaterialien gehören Erythrozyten vom Schaf und vom Menschen, Bakterienzellen, Latexteilchen, harzförmige Teilchen und fein verteilte, diazotierte Aminocellulose.
• Die Antigen-Antikörperreaktion ist die Basis sämtlicher immunologischer Testverfahren. Das normale Ansprechen des Körpers auf eine Fremdsubstanz hat zur Entwicklung einer Anzahl von Techniken geführt, die angewandt werden zur Diagnose verschiedener Krankheiten, Funktionsstörungen und physiologischen Zuständen. Andere spezielle Bindungsreaktionen können zwischen einem Liganden und entsprechenden Rezeptorverbindungen auftreten. Beispielsweise reagieren Avidin oder ein Derivat desselben speziell mit Biotin oder einem Derivat hiervon. Andere spezifische Bindungsreaktionen treten auf zwischen Enzymen und ihren Substratanalogen, Inhibitoren oder Cofaktoren, Lektinen und Zuckern (einschließlich Mono-, Oligo- und Polysacchariden sowie Glykoproteinen), Nukleinsäuren und komplementären Basensequenzen, Histonen und Bindungsproteinen sowie Hormonen und ihren Rezeptoren. Ganz allgemein läßt sich eine Komponente der Reaktion definieren als Ligand, wohingegen die entsprechende Komponente, die mit dem Liganden reagiert, als Rezeptor bezeichnet wird.
• In vitro-Tests für das Vorhandensein eines erwarteten Proteins (zum Beispiel eines Antigens oder Antikörpers) in einer biologischen Probe erfolgen durch Zugabe des immunologischen Gegenstückes zur biologischen Probe. Liegt die erwartete Substanz vor, so kann die ablaufende Antigen-Antikörperreaktion erkannt werden durch Ausfällung des Antigen- Antikörper-Komplexes. Dieser Reaktionskomplex ist im allgemeinen visuell nur schwierig festzustellen. Aus diesem Grunde werden oftmals entweder Antikörper oder Antigene an unlösliche Teilchen gebunden, beispielsweise an Polymerlatexteilchen, so daß, wenn der Komplex gebildet wird, dieser leicht erkennbar ist aus der stattfindenden Agglutination, entweder durch Beobachtung der sich bildenden Klumpen oder durch einen feststellbaren Tracer, der mit den Teilchen assoziiert ist. Eine Agglutination ist gekennzeichnet durch eine Klumpenbildung von Teilchen aus einer Suspension von Teilchen. Weitere Details bekannter Agglutinationsverfahren finden sich in den U.S.-Patentschriften 4 419 453 und 4 459 361.
• Die U.S.-Patentschrift 4 259 313 beschreibt Reagentien aus einem Polymer oder einer Mischung von Polymeren in teilchenförmiger Form mit einem über die Teilchen verteilten fluoreszierenden Chelat einer seltenen Erde, welche die Reagentien unter Verwendung einer geeigneten Ausrüstung bestimmbar macht. An die Teilchen gebunden werden Moleküle einer immunologischen Spezies, wie beispielsweise eines Antikörpers oder Antigens. Das erhaltene Reagens kann in Immunoassays eingesetzt werden. Jedoch ist eine fluorometrische Ausrüstung im Falle der Verwendung dieser Reagentien erforderlich. Es gibt jedoch viele Fälle, in denen eine solche Ausrüstung nicht zur Verfügung steht oder unpraktisch ist. Beispielsweise wäre es vorteilhaft, wenn immunoreaktive Reagentien zur Verfügung stehen würden, die leicht von einem Verbraucher ermittelt werden können, ohne Notwendigkeit einer Bestimmungsvorrichtung, entweder im Haushalt eines Benutzers oder in einer Arztpraxis. Derartige Reagentien würden in wünschenswerter Weise innerhalb einiger weniger Minuten visuell mit dem unbewaffneten Auge bestimmbar sein.
• Im Hinblick hierauf ist vorgeschlagen worden, verschiedene Farbstoffe oder farbbildende Materialien in derartige Reagentien einzuführen, indem man sie innerhalb der Polymerteilchen dispergiert. Obgleich dies die Reagentien leicht bestimmbar macht, wurde überraschenderweise Weise gefunden, daß die Farbstoffmoleküle an der Oberfläche der Teilchen oftmals immunologische Reaktionen stören, wie solche, wie sie für Agglutinationsassays erforderlich sind. Andere Stoffe an der Oberfläche solcher Teilchen, wie beispielsweise oberflächenaktive Verbindungen oder Stabilisatoren, können in ähnlicher Weise die Reaktionen stören.
• Die U.S.-Patentschrift 4 401 565 beschreibt ein Reagens, das ein Kern-/Hüllen-Polymer ist, mit einer hieran gebundenen immunologischen Spezies. Diese Reagentien enthalten kein Tracer-Material und werden in dem Bestimmungsverfahren durch Licht-Streuungstechniken bestimmt, die eine komplizierte Vorrichtung erfordern, die nur in einem klinischchemischen Laboratorium zur Verfügung steht. Selbst die einfachste Technik zur Messung von Trübungen erfordert die Verwendung eines Spektrophotometers (vgl. Spalte 4, Zeilen 1 ). Diese Technik ist eindeutig nicht geeignet für die Durchführung von Assays, die zu Hause durchgeführt werden, in Arztpraxen und anderen Orten, wo Vorrichtungen oder Apparaturen nur in begrenztem Umfange zur Verfügung stehen oder unpraktisch sind. Infolgedessen besteht ein Bedürfnis nach einem leicht bestimmbaren immunoreaktiven Reagens, das leicht bestimmt werden kann ohne komplizierte Vorrichtung und komplizierte Verfahren und das Störungen vermeidet, die durch Materialien an der Oberfläche von Teilchen verursacht werden.
• Die oben im Zusammenhang mit bekannten Reagentien geschilderten Probleme wurden überwunden mit einem in Wasser unlöslichen polymeren Teilchen mit einem inneren Kern mit einem ersten Polymeren, das sich von einem oder mehreren ethylenisch ungesättigten polymerisierbaren Monomeren ableitet, und
• einer äußeren Hülle mit einem zweiten Polymeren, das sich von einem oder mehreren ethylenisch ungesättigten polymerisierbaren Monomeren ableitet, wobei
• das Teilchen dadurch gekennzeichnet ist, daß
• (i) das erste Polymer einen Tg&sub1;-Wert von weniger als 100ºC aufweist, sowie ferner einen feststellbaren Tracer, der in dem Polymer verteilt ist und der eine starke Affinität für das erste Polymer aufweist,
• (ii) das zweite Polymer einen Tg&sub2;-Wert aufweist, der grösser oder gleich ist der Beziehung [Tg&sub1;-10ºC] und das sich ableitet von mindestens einem Monomeren mit reaktiven Gruppen, die direkt oder indirekt mit freien Amino- oder Sulfhydrylgruppen einer immunoreaktiven Spezies zu reagieren vermögen, wobei der Tracer für dieses Polymer eine wesentlich geringere Affinität aufweist, relativ zum ersten Polymeren, und
• (iii) das Teilchen praktisch keinen Tracer innerhalb der äußeren Hülle oder auf seiner äußeren Oberfläche aufweist.
• Ein immunoreaktives Reagens weist auf:
• (a) ein wasserunlösliches polymeres Teilchen mit einem inneren Kern mit einem ersten Polymeren, das sich von einem oder mehreren ethylenisch ungesättigten polymerisierbaren Monomeren ableitet, und
• eine äußere Hülle mit einem zweiten Polymeren, das sich von einem oder mehreren ethylenisch ungesättigten polymerisierbaren Monomeren ableitet, und das reaktive Gruppen aufweist, wobei das Teilchen kovalent durch die reaktiven Gruppen an die äußere Oberfläche gebunden ist, an
• (b) eine immunoreaktive Spezies, die dazu in der Lage ist, an einer immunologischen Reaktion mit einer Verbindung von biologischem Interesse teilzunehmen, wobei
• das Reagens dadurch gekennzeichnet ist, daß
• (i) das erste Polymer einen Tg&sub1;-Wert von weniger als 100ºC aufweist und ferner einen feststellbaren oder ermittelbaren Tracer, der in dem Polymer verteilt ist und der eine starke Affinität für das erste Polymer aufweist,
• (ii) das zweite Polymer einen Tg&sub2;-Wert aufweist, der größer oder gleich ist der Beziehung [Tg&sub1;-10ºC] und das sich ableitet von mindestens einem Monomeren mit reaktiven Gruppen, die direkt oder indirekt mit freien Amino- oder Sulfhydrylgruppen einer immunoreaktiven Spezies zu reagieren vermögen, wobei der Tracer für dieses Polymer eine wesentlich geringere Affinität aufweist, relativ zum ersten Polymeren, und
• (iii) das Teilchen praktisch keinen Tracer innerhalb der äußeren Hülle oder auf seiner äußeren Oberfläche aufweist.
• Ein analytisches Element umfaßt ein absorbierendes Trägermaterial mit einer oder mehreren Zonen und enthält in einer oder mehreren der Zonen das oben beschriebene immunoreaktive Reagens.
• Ein Verfahren zur Bestimmung einer Verbindung von biologischem Interesse in einer wäßrigen Flüssigkeit umfaßt:
• A. das Kontaktieren der Flüssigkeit mit einem immunoreaktiven Reagens mit:
• (a) einem wasserunlöslichen polymeren Teilchen mit:
• einem inneren Kern mit einem feststellbaren Tracer, der innerhalb eines ersten Polymeren verteilt ist, für das der Tracer eine hohe Affinität aufweist, und das einen Tg&sub1;-Wert von weniger als 100ºC aufweist, wobei sich das erste Polymer von einem oder mehreren ethylenisch ungesättigten polymerisierbaren Monomeren ableitet, und
• einer äußeren Hülle mit einem zweiten Polymer, für das der Tracer eine wesentlich geringere Affinität im Vergleich zum ersten Polymer aufweist, wobei das zweite Polymer einen Tg&sub2;-Wert aufweist, der größer ist oder gleich der Beziehung [Tg&sub1;-10º], und wobei sich das zweite Polymer von einem oder mehreren ethylenisch ungesättigten polymerisierbaren Monomeren ableitet, wobei mindestens eines der Monomeren reaktive Gruppen aufweist, die direkt oder indirekt reaktiv mit freien Amino- oder Sulfhydrylgruppen einer immunoreaktiven Spezies sind,
• wobei das Teilchen praktisch keinen Tracer innerhalb der äußeren Hülle oder auf seiner äußeren Oberfläche aufweist, und wobei das Teilchen kovalent durch die reaktiven Gruppen an der äußeren Oberfläche gebunden ist, an
• (b) eine immunoreaktive Spezies, die dazu befähigt ist, an einer immunologischen Reaktion mit der Verbindung von Immunologischem Interesse teilzunehmen,
• unter Erzeugung eines unlöslichen Reaktionsproduktes aus der biologischen Verbindung und der immunoreaktiven Spezies, und
• B. Bestimmung der Menge des Tracers entweder in dem Reaktionsprodukt oder in nicht umgesetzten Materialien.
• Durch die vorliegende Erfindung werden Reagentien bereitgestellt, die im Rahmen einer Vielzahl von immunologischen Techniken eingesetzt werden können, so daß hoch empfindliche Assays durchgeführt werden können. Die wasserlöslichen polymeren Teilchen, die zur Herstellung der Reagentien verwendet werden, haben leicht zugängliche reaktive Gruppen an der äußeren Oberfläche, die entweder direkt mit einer immunoreaktiven Spezies reagieren, die freie Amino- oder Sulfhydrylgruppen aufweist, oder die indirekt reaktiv sind mit den Gruppen durch Aktivierungs- oder Bindungsreste. In allen Fällen ist die Spezies an die Teilchen kovalent gebunden.
• Die Reagentien sind leicht feststellbar oder bestimmbar ohne Verwendung komplizierter spektrophotometrischer oder lichtstreuender Vorrichtungen. Dieser Vorteil ergibt sich durch die Verwendung eines Tracer-Materials innerhalb der Teilchen, das leicht bestimmbar ist mit dem unbewaffneten Auge oder einer nicht kostspieligen Vorrichtung. Im Falle einer bevorzugten Ausführungsform ist der Tracer ein Farbstoff, der leicht mit dem unbewaffneten Auge sichtbar ist. Dies macht das Bestimmungsverfahren der vorliegenden Erfindung geeignet für ein Verbraucherprodukt, das von einem durchschnittlichen Verbraucher mit nur geringen technischen Kenntnissen oder einer entsprechenden Ausrüstung beschafft und verwendet werden kann. Es kann ferner in Arztpraxen durchgeführt werden, In denen komplizierte Vorrichtungen nicht zur Verfügung stehen.
• In einem Versuch zur Herstellung von gefärbten Agglutinationsreagentien wurde unerwarteterweise gefunden, daß restlicher Farbstoff auf der äußeren Oberfläche der Teilchen die Reaktion von Antikörper mit Antigen stört. Die Reagentien der vorliegenden Erfindung werden jedoch mit dem Tracer-Material innerhalb der Teilchen hergestellt und sie weisen dieses Problem nicht auf. Das Problem der Störung wird vermieden durch Verwendung von Teilchen, die aus dem Stande der Technik bekannt sind als "Kern-/Hüllen"-Teilchen. Derartige Teilchen weisen ein Polymer im Kern auf und ein zweites in der Hülle. Im Falle der vorliegenden Erfindung ist das Kernpolymer derart beschaffen, daß der Tracer eine hohe Affinität hierfür aufweist, wohingegen der Tracer eine wesentlich geringere Affinität für das Hüllenpolymer im Vergleich zum Kernpolymeren aufweist. Mit anderen Worten, der Tracer ist in einem viel größeren Umfange im Kernpolymer gelöst als im Hüllenpolymer derart, daß sich praktisch sämtlicher Tracer im Kern befindet. Es war überraschend festzustellen, daß Kern-/Hüllen- Polymere entwickelt werden konnten, in denen Tracer-Materialien lediglich im Kern vorliegen, wohingegen die Hülle praktisch frei von Tracer-Material ist. Die Merkmale der Polymeren, die diesen Vorteil bieten, werden im folgenden im größeren Detail beschrieben.
• Durch die vorliegende Erfindung wird ein Polymerteilchen aus einem Kern und einer Hülle bereitgestellt sowie ein hieraus hergestelltes Reagens für die Verwendung im Rahmen analytischer Elemente und Verfahren. Das Verwendungsverfahren kann zu einer sehr schnellen analytischen Bestimmung führen. Dies erlaubt, daß der Assay in einer Arztpraxis durchgeführt werden kann oder in einem Haushalt durch einen Benutzer, der an einem unmittelbaren diagnostischen Ergebnis interessiert ist. Der Test kann durchgeführt werden, um das Vorhandensein oder die Abwesenheit oder die Menge an immunoreaktiven Spezies in einer wäßrigen Flüssigkeit, zum Beispiel einer biologischen Probe, festzustellen.
• Eine immunoreaktive Spezies ist hier definiert als eine beliebige biologische oder chemische Verbindung, die ein oder mehrere Zentren für eine Komplexbildung mit einem entsprechenden spezifischen Bindungs-Rezeptormolekül aufweist. Beispielsweise kann die Spezies eine immunologische Spezies sein, bei der es sich handelt um (1) eine beliebige Substanz, die, wenn sie einem immunokomponenten Wirt dargeboten wird, zur Erzeugung eines spezifischen Antikörpers führt, der dazu befähigt ist, mit der Substanz eine Bindung einzugehen, oder (2) den auf diese Weise erzeugten Antikörper, welche Spezies an der Antigen- Antikörperreaktion bei der Verwendung hiervon teilnimmt. Zu repräsentativen immunologischen Spezies gehören primäre Amine, Aminosäuren, Peptide, Proteine, Lipoproteine, Glykoproteine, Arzneimittel, Steroide, Lipide, Nukleinsäuren, Hormone, Vitamine, Polysaccharide, Glykolipide, Alkaloide, Organismen (Bakterien, Protozoen, Pilze, Viren, Rickettsia und dergleichen) und Komponenten hiervon, Blutsubstanzen, Gewebe und Organ-Antigene sowie andere, dem Fachmann bekannte Materialien (vgl. zum Beispiel die U.S.-Patentschrift 4 181 636). In manchen Fällen ist die immunologische Spezies ein Antikörper, der gerichtet ist auf ein Arzneimittel, Hormon, ein Antibiotikum oder andere Verbindungen mit antigenen Eigenschaften. Alternativ kann die immunologische Spezies ein antigenes Material sein. In einer weiteren anderen Ausführungsform ist die immunologische Spezies ein Antikörper, der gegen einen anderen Antikörper gerichtet ist (d. h. ein Anti-Antikörper). Es können sowohl monoklonale als auch polyklonale Antikörper verwendet werden, und sie können ganze Moleküle oder verschiedene Fragmente hiervon sein, solange sie mindestens eine reaktive Amin- oder Sulfhydrylgruppe aufweisen, die direkt oder indirekt umgesetzt werden kann mit den abstehenden reaktiven Gruppen auf der Oberfläche der äußeren Hülle der polymeren Teilchen dieser Erfindung.
• Die vorliegende Erfindung ist nicht begrenzt auf immunologische Spezies. Die immunoreaktive Spezies, die an die Teilchen gebunden ist, kann bestehen aus Enzymen, Proteinen oder anderen biologischen Verbindungen, die nicht immunologisch sind, die jedoch ein oder mehrere Zentren für eine Komplexbildung mit einem entsprechenden Rezeptormolekül aufweisen.
• Die immunoreaktive Spezies kann direkt oder indirekt an die Teilchen gebunden sein mit oder ohne Aktivierung oder durch verbindende Reste oder Gruppen.
• Unter einer "direkten" Bindung ist hier gemeint, daß die immunoreaktive Spezies direkt mit den reaktiven Gruppen auf der Außenseite der Teilchen reagiert, ohne jede Aktivierung oder verbindende Reste oder Gruppen. Im Gegensatz hierzu wird der Ausdruck "indirekte" Bindung dazu gebraucht, um eine Reaktion der iminunoreaktiven Spezies zu kennzeichnen, nachdem die reaktiven Gruppen aktiviert wurden, um sie direkt reaktionsfähig zu machen (beispielsweise eine Aktivierung von Carboxylgruppen unter Verwendung von Carbodiimiden), oder die Verwendung von verbindenden Resten oder Bindegliedern, die gebunden sind entweder an die Spezies oder an die Teilchen (verwiesen wird beispielsweise auf die U.S.-Patentschrift 4 581 337). In manchen Fällen können bestimmte verbindende Reste oder Gruppen dazu verwendet werden, um die immunoreaktive Spezies zu binden, selbst wenn die reaktiven Gruppen an den Teilchen zu einer "direkten" Bindung befähigt sind.
• Die immunoreaktive Spezies, die Teil des immunoreaktiven Reagens ist, ist dann ein Rezeptormolekül für die immunoreaktive Spezies, die bestimmt werden soll, und der umgekehrte Fall tritt ein.
• Im Falle bestimmter Ausführungsformen ist die immunologische Spezies ein Enzym, das an das polymere Teilchen gebunden ist. Zu Enzymen, die in dieser Weise gebunden oder befestigt werden können, gehören jene, die reaktive Amingruppen aufweisen, die mit den aktiven Gruppen an den Polymerteilchen umgesetzt werden können. Zu repräsentativen Enzymen gehören Aspartat- Aminotransaminase, Alanin-Aminotransaminase, Lactat-Dehydrogenase, Creatin-Phosphokinase, Gamma-Glutamyltransferase, alkalische Phosphatase sowie prostatische Säurephosphatase. Methoden der Herstellung derartiger Reagentien sind aus dem Stande der Technik allgemein bekannt.
• Das wasserunlösliche Reagens der vorliegenden Erfindung wird hergestellt durch Bindung der oben beschriebenen immunologischen Spezies an ein wasserunlösliches Polymerteilchen spezieller Zusammensetzung. Diese Teilchen werden hergestellt aus den ethylenisch ungesättigten polymerisierbaren Monomeren, die unten beschrieben werden, derart, daß abstehende (pendant) reaktive Gruppen vorliegen. Derartige Gruppen sind frei und befähigt zu einer direkten oder indirekten Reaktion mit den Amin- oder Sulfhydrylgruppen einer immunoreaktiven Spezies, wie oben beschrieben.
• Die polymeren Teilchen sind im allgemeinen wasserunlösliche Latexteilchen mit einer Teilchengröße von größer als 0,01 Mikrometern, vorzugsweise einer Größe im Bereich von 0,05 bis 5 Mikrometern und in besonders vorteilhafter Weise von 0,3 bis 3 Mikrometern.
• Die Teilchen dieser Erfindung weisen einen inneren Kern aus einem ersten Polymer auf sowie eine Hülle aus einem zweiten Polymer, in einer ähnlichen oder entsprechenden Anordnung, wie sie in der U.S.-Patentschrift 4 401 765 beschrieben wird. Im allgemeinen besteht der Kern der Teilchen aus einem ersten Polymer, für das der Tracer (wie unten beschrieben) eine hohe Affinität aufweist. Das heißt, das Tracer-Material und das erste Polymer werden derart aneinander angepaßt, daß der Tracer leicht innerhalb des Polymeren gelöst wird oder löslich gemacht wird. Im allgemeinen ist das Tracer-Material (zum Beispiel eine kolorimetrische oder fluoreszierende Verbindung oder eine, einen Farbstoff bildende Verbindung) hoch hydrophob und infolgedessen muß das erste Polymer ebenfalls hydrophob sein. Dieses erste Polymer leitet sich von ethylenisch ungesättigten, polymerisierbaren Monomeren ab, die ein oder mehrere ethylenisch ungesättigte polymerisierbare Reste aufweisen.
• Obgleich ein jedes beliebige Kern-/Hüllen-Polymerteilchen mit einem Tracer-Material lediglich im Kern und mit reaktionsfähigen Gruppen auf der äußeren Oberfläche, die zu einer Reaktion mit einer immunoreaktiven Spezies befähigt sind, als eine neue Zusammensetzung gemäß dieser Erfindung vorgeschlagen wird, beschreiben die folgenden Formeln (I) und (II) bevorzugte Zusammensetzungen. Diese Zusammensetzungen sind bevorzugt aufgrund ihrer Fähigkeit der selektiven Einarbeitung von Tracer-Material in den fern der Teilchen durch die relativ einfache Aufsaug-Technik, die hier beschrieben wird und im Detail diskutiert wird in der U.S.- Patentschrift 4 199 363. Die bevorzugten Tracer für die Verwendung in diesen bevorzugten Zusammensetzungen sind aromatische Farbstoffe (wie die am meisten bevorzugten Azofarbstoffe), die primär löslich gemacht werden durch die hydrophoben (beispielsweise aromatischen) Gruppen in dem Kernpolymer. In manchen Fällen wird die Lösung des Tracer-Materials in dem Kernpolymer erleichtert durch Wasserstoffbindung.
• Geeignete erste Polymere weisen eine Glasübergangstemperatur (hier als Tg&sub1; bezeichnet) von weniger als 100ºC aufs und vorzugsweise von -25a bis 95ºC, um die Lösung und Immobilisierung des Tracer-Materials im Kernpolymeren zu erleichtern. Dieser TG&sub1;-Wert ist ein berechneter Wert, bestimmt unter Anwendung der folgenden Gleichung [mit den Glasübergangstemperaturwerten in ºK (Kelvin), die leicht in ºC umgerechnet werden können]:
• worin m1, m2, . . . mn die einzelnen Monomeren darstellen, aus denen sich das erste Polymer ableitet und den Tg (ºK)- Wert des Homopolymeren identifizieren, das aus jedem einzelnen Monomer hergestellt ist, worin x&sub1;, x&sub2;, . . . xn die Gewichtsanteile der Monomeren darstellen, die zur Herstellung des ersten Polymeren verwendet werden, und worin n die Anzahl von Monomeren darstellt, die zur Herstellung des ersten Polymeren eingesetzt werden.
• Bevorzugte erste Polymere lassen sich wiedergeben durch die Formel (I):
• -(A)u-(B)v-(D)w-
• worin -A- für wiederkehrende Einheiten steht, die sich ableiten von einem oder mehreren hydrophoben ethylenisch ungesättigten Monomeren, welche zu einer Wasserunlöslichkeit der Teilchen führen,
• -B- steht für wiederkehrende Einheiten, die sich von einem oder mehreren ethylenisch ungesättigten Monomeren ableiten, deren Homopolymere eine Glasübergangstemperatur (d. h. Tg) von weniger als 55ºC aufweisen, und
• -D- steht für wiederkehrende Einheiten, die sich von einem oder von mehreren ethylenisch ungesättigten Monomeren ableiten, die verschieden sind von jenen, die durch -A- oder -B- dargestellt werden, die in den verwendeten Mengen die Wasserunlöslichkeit der Teilchen oder die Lösung des Tracer-Material im Kern nicht nachteilig vermindern.
• In der oben angegebenen Strukturformel steht u für 30 bis 95 Mol-%, v für 5 bis 50 Mol-% und w für 0 bis 20 Mol-%. Vorzugsweise steht u für 55 bis 95 Mol-%, v für 5 bis 35 Mol-% und w für 0 bis 10 Mol-%.
• Monomere, von denen sich die wiederkehrenden -A-Einheiten ableiten, sind hydrophob und liefern Homopolymere, die in Wasser unlöslich sind. Vorzugsweise weisen diese Monomeren aromatische Gruppen auf. Zu repräsentativen hydrophoben Monomeren gehören, ohne daß hierauf eine Beschränkung erfolgt, Styrol sowie Styrolderivate (zum Beispiel 4-Vinyltoluol, 2,5-Dimethylstyrol, 4-t-Butylstyrol, 2-Chlorostyrol und andere aus dem Stande der Technik bekannte Monomere), Acrylsäure- und Methacrylsäureester und -amide (zum Beispiel n- Butylacrylat, Propylmethacrylat, Methylacrylat, Methylmethacrylat, Ethylmethacrylat, 2-Ethylhexylmethacrylat, N-Phenylacrylamid und andere aus dem Stande der Technik bekannte Monomere), Acrylonitril sowie Vinylacetat.
• Im Falle der für diese Erfindung geeigneten Polymeren kann bei der Herstellung derselben der Kern gegebenenfalls quervernetzt werden, und zwar in jeder geeigneten Weise. Ein Verfahren besteht darin, eine kleine Menge, d. h. bis zu 10 Mol-%, und vorzugsweise 0,3 bis 5 Mol-%, eines Monomeren zuzugeben, der zwei oder mehrere ethylenisch ungesättigte polymerisierbare Gruppen aufweist. Zu diesen Monomeren gehören die hydrophoben Monomeren, von denen sich -A- ableitet. Repräsentative Monomere werden beschrieben in der Literaturstelle Research Disclosure, Publikation 19551 Juli 1980, Seite 304, wobei zu diesen beispielsweise gehören Divinylbenzol, Ethylendimethacrylat, N,N'-Methylenbisacrylamid, 2,2-Dimethyl-1,3-propylendiacrylat, Allylacrylat, Ethylidyntrimethacrylat sowie Ethylendiacrylat. Eine Quervernetzung mit derartigen Monomeren vermindert jedoch die Quellbarkeit des Kernes durch das organische Lösungsmittel, das im Falle der bevorzugten Aufsaugtechnik angewandt wird. Infolgedessen wird eine Quervernetzung im allgemeinen begrenzt auf geringe Mengen, die erforderlich sind, um dem Kern eine Wasserunlöslichkeit zu verleihen.
• Bevorzugte Monomere, aus denen sich die wiederkehrenden -A- Einheiten ableiten, sind vinylaromatische Monomere, insbesondere Styrol und Styrolderivate.
• Zu den Monomeren, von denen sich die wiederkehrenden -B- Einheiten ableiten, gehören jene, die, wenn sie polymerisiert werden, Homopolymere bilden, die einen Tg-Wert von weniger als 55ºC aufweisen. Zu repräsentativen Monomeren gehören, obwohl keine Beschränkung hierauf beabsichtigt ist, jene, die aktive Methylengruppen aufweisen [2-Acetoacetoxyethylmethacrylat, Ethylacryloylacetat, 6-Vinylphenyl-2,4- hexandion, N-(2-Acetoacetoxyethyl)acrylamid, sowie andere aus dem Stande der Technik bekannte Monomere, beispielsweise jene, die beschrieben werden in den U.S.-Patentschriften 3 459 790, 3 904 418, 3 929 482, 3 939 130 und 4 247 673] sowie Monomere mit Amino-, Hydroxy-, Ester-, Amid- und Ketonresten (wie zum Beispiel Butylacrylat, 2-Ethylhexylacrylat, 2-Aminoethylacrylat, 2-Hydroxyethylacrylat, 2-Hydroxyethylmethacrylat, 2,3-Dihydroxypropylacrylat, Benzylacrylat, Butylacrylat, Ethylacrylat, Cyclohexylacrylat und andere aus dem Stande der Technik bekannte Monomere).
• Es ist offensichtlich, daß einige der Monomeren mehr als eines der gewünschten Erfordernisse aufweisen, wie beispielsweise das Erfordernis Tg&sub1; und der Hydrophobizität, d. h. es besteht eine gewisse Überlappung zwischen den Monomeren für die -A- und -B-Einheiten. Es gibt jedoch einige Monomere, die allein geeignet sind für entweder -A- oder -B-Einheiten.
• Zu bevorzugten Monomeren, von denen sich -B-Einheiten ableiten, gehören 2-Acetoacetoxyethylmethacrylat, 2-Ethoxyethylacrylat, Butylacrylat, Cyclohexylacrylat sowie Benzylacrylat.
• Zu Monomeren, von denen sich die wiederkehrenden -D-Einheiten ableiten, gehören beliebige Monomere, die verschieden sind von jenen, die für die -A- und -B-Einheiten oben angegeben wurden. Vorzugsweise sind diese Monomeren polarer als die -A- oder -B-Monomeren. Zu repräsentativen Monomeren gehören, ohne daß eine Beschränkung hierauf beabsichtigt ist, anionische Monomere, wie zum Beispiel Natrium-2- acrylamido-2-methylpropansulfonat, Acrylsäure, Methacrylsäure, 2-Carboxyethylacrylat, Styrolsulfonsäure, Kaliumsalz und m & p-Carboxymethylstyrol sowie andere ethylenisch ungesättigte polymerisierbare Sulfonate, Carboxylate, Sulfate sowie Phosphonate.
• Bevorzugte -D-Monomere sind Natrium-2-acrylamido-2-methylpropansulfonat, Acrylsäure, Methacrylsäure, Styrolsulfonsäure sowie m & p-Carboxymethylstyrol.
• Zu repräsentativen ersten Polymeren, aus denen der Kern der Teilchen aufgebaut sein kann, gehören die folgenden Materialien (die Tg&sub1;-Werte wurden für einige der Polymeren berechnet): Poly(styrol-co-2-acetoacetoxyethylmethacrylat) (molare Verhältnisse 50 : 50, 70 : 30, 85 : 15 und 95 : 5, mit Tg&sub1;-Werten von 270, 470, 690 bzw. 91ºC), Poly(styrol-co-m ∂ p-chloromethylstyrol-co-2-hydroxyethylacrylat) (Molverhältnis 67 : 30 : 3) Poly(styrol-co-n-butylacrylat) (molares Verhältnis 78,7 : 21,3, Tg&sub1;-Wert 47ºC) sowie Poly)styrol-co-benzylacrylat) (molares Verhältnis 90 : 10).
• Die Hülle der Teilchen der vorliegenden Erfindung weist ein zweites Polymer auf, das reaktive Zentren für eine kovalente Bindung der immunoreaktiven Spezies liefert, und eine ausreichende Quellbarkeit in mit Wasser mischbaren organischen Lösungsmitteln aufweist, die in bevorzugter Weise zum Aufsaugen von Tracer-Materialien in den Kern der Teilchen verwendet werden, ohne daß das Tracer-Material dazu ermuntert wird, in der Hülle zurückzubleiben. Infolgedessen kann das Hüllenpolymer eine minimale Menge von wiederkehrenden -B-Einheiten aufweisen, wie sie oben für das erste Polymer beschrieben wurden.
• Das heißt, eine ausreichende Menge dieser Einheiten kann dazu verwendet werden, um eine Quellbarkeit zu bewirken, jedoch nicht zu viel, um das Tracer-Material zu lösen. Die Hülle kann ausreichend quellbar sein, ohne die Einarbeitung von -B-Einheiten.
• Im allgemeinen weist das zweite Polymer einen Tg&sub2;-Wert auf, der gleich ist oder größer als die Beziehung [Tg&sub1; weniger 10ºC]. Tg&sub2; ist gewöhnlich größer als Tg&sub1;, kann jedoch gleich Tg&sub1; sein oder um so viel als 10ºC weniger als Tg&sub1;. spezieller lassen sich bevorzugte zweite Polymere durch die Formel (II) wiedergeben:
• -(E)x-(F)y-(G)z-
• worin -E- steht für wiederkehrende Einheiten, die sich aus einem oder mehreren hydrophoben ethylenisch ungesättigten Monomeren ableiten,
• -F- steht für wiederkehrende Einheiten, die sich von einem oder mehreren ethylenisch ungesättigten Monomeren ableiten, mit den erforderlichen reaktiven Gruppen, die direkt oder indirekt mit den freien Amin- oder Sulfhydrylgruppen der iminoreaktiven Spezies reagieren, die hier beschrieben werden, und
• -G- steht für wiederkehrende Einheiten, die sich von einem oder mehreren ethylenisch ungesättigten Monomeren ableiten, die verschieden sind von jenen, die durch -E- oder -F- dargestellt werden.
• Im Falle der Formel (II) steht x für 0 bis 99,9 Mol-%, y für 0,1 bis 100 Mol-% und z für 0 bis 15 Mol-%. Vorzugsweise steht x für 45 bis 99 Mol-%, y für 1 bis 50 Mol-% und z für 0 bis 5 Mol-%.
• Monomere, von denen sich die wiederkehrenden -E-Einheiten ableiten, sind im Falle von allgemeinen wie auch bevorzugten Ausführungsformen die gleichen, wie jene, die angegeben wurden, von denen sich die wiederkehrenden -A-Einheiten der Formel (I) ableiten.
• Zu Monomeren, von denen sich die wiederkehrenden -F-Einheiten ableiten, gehören, ohne daß eine Begrenzung hierauf beabsichtigt ist, Monomere mit einem aktiven Halogenatom (wie zum Beispiel Vinylchloroacetat, chloroalkylierte vinylaromatische Verbindungen, wie beispielsweise Chloromethylstyrol oder Chloroalkylacrylsäure- oder -methacrylsäureester, wie zum Beispiel Chloroethylmethacrylat, 3-Chloro-2-hydroxypropylmethacrylat und 3-Chloropropylacrylat), Monomere mit einer oder mehreren abstehenden Carboxylgruppen oder ihre funktionellen Equivalente (wie zum Beispiel Acrylsäure, Methacrylsäure, Itaconsäure, Maleinsäure oder ihre Anhyride), Monomere mit Epoxygruppen (wie zum Beispiel Glycidylacrylat, Glycidylmethacrylat, Vinylglycidylether oder Methallylglycidylether), Monomere mit Isocyanatgruppen (wie zum Beispiel Isocyanatoethylacrylat, Isocyanatoethylmethacrylat oder α,α- Dimethylmetaisopropenylbenzylisocyanat), Amingruppen enthaltende Monomere [wie zum Beispiel 2-Aminoethylmethacrylat und N-(3-Aminopropyl)methacrylamid], Monomere mit einer Aziridingruppe [wie zum Beispiel Vinylcarbamoylaziridin, Acryloylaziridin, Methacryloylaziridin, N-Acryloylaziridin und 2-(1-Aziridinyl)ethylacrylat], Monomere mit Aldehydgruppen (wie zum Beispiel Vinylbenzaldehyd oder Acrolein), 2-substituierte Ethylcarbonyl enthaltende Monomere (wie zum Beispiel 2-Chloroethylacrylat, 2-Chloroethylmethacrylat, 2-Methylsulfonyloxyethylmethacrylat und 2-p-Tolylsulfonyloxyethylacrylat) oder Monomere mit abstehenden aktivierten 2-substituierten Ethylsulfonyl- oder Vinylsulfonylgruppen [wie zum Beispiel jene, die in den U.S.-Patentschriften 4 161 407 und 4 548 870 beschrieben werden und andere, dem Fachmann aus dem Stande der Technik bekannte Monomere].
• Zu bevorzugten Monomeren, aus denen sich -F- ableitet, gehören jene mit aktiven Halomethylgruppen mit 1 bis 2 Kohlenstoffatomen und die aktivierten 2-substituierten Ethylsulfonyl- und Vinylsulfonylmonomeren.
• Bevorzugte Monomere mit aktiven Halomethylgruppen mit 1 bis 3 Kohlenstoffatomen sind beispielsweise Chloromethylstyrol und Bromomethylstyrol.
• Bevorzugte aktivierte 2-substituierte Ethylsulfonyl- und Vinylsulfonylmonomere können durch die folgende Formel dargestellt werden:
• worin bedeuten:
• R ein Wasserstoffatom oder substituiertes oder unsubstituiertes Alkyl (im allgemeinen mit 1 bis 6 Kohlenstoffatomen, wie zum Beispiel Methyl, Ethyl, Isopropyl oder Hexyl, wobei R vorzugsweise für Wasserstoff oder Methyl steht.
• R¹ steht für -CH=CHR² oder -CH&sub9;CH&sub2;X, worin X eine abspaltbare oder ablösbare Gruppe ist, die ersetzt wird durch ein Nukleophil oder die eliminiert wird in Form von HX durch Behandlung mit einer Base (wie zum Beispiel Halo, Acetoxy, Alkylsulfonyloxy, wie zum Beispiel Methylsulfonyloxy, Arylsulfonyloxy, wie zum Beispiel p-Tolylsulfonyloxy, Trialkylammonio, zum Beispiel ein Trimethylammoniosalz oder ein Pyridiniosalz). R² steht für Wasserstoff, substituiertes oder unsubstituiertes Alkyl (im allgemeinen mit 1 bis 6 Kohlenstoffatomen, wie für R definiert) oder substituiertes oder unsubstituiertes Aryl (im allgemeinen mit 6 bis 12 Kernkohlenstoffatomen, wie zum Beispiel Phenyl, Naphthyl, Xylyl oder Tolyl). Vorzugsweise steht R¹ für -CH&sub2;CH&sub2;X. Diese Gruppe, die eine aktivierte 2-substituierte Ethylgruppe sein kann, kann substituiert sein mit jeder beliebigen Gruppe, die die Verdrängung der abspaltbaren Gruppe X nicht nachteilig beeinflußt.
• L ist eine verbindende Gruppe, die bestehen kann aus einem substituierten oder unsubstituierten Alkylen, im allgemeinen mit 1 bis 20 Kohlenstoffatomen und Heteroatomen in der Kette. Diese Definition einer Alkylengruppe soll besagen, daß die Alkylengruppen unterbrochen sein können oder abgeschlossen sein können durch Oxy, Thio, -NR³ - [worin R³ steht für Wasserstoff, substituiertes oder unsubstituiertes Alkyl mit 1 bis 6 Kohlenstoffatomen (wie zum Beispiel Methyl, Chloromethyl oder 2-Hydroxyethyl) oder substituiertes oder unsubstituiertes Aryl mit 6 bis 10 Kohlenstoffatomen (zum Beispiel Phenyl, Naphthyl oder Xylyl)], Ester-(COO-), Amid- (-CONH-), Urylen-(-NH NH-), Sulfonyl- (-SO&sub2;-), Carbonat-, Sulfonamido-, Azo-, Phosphonogruppen oder andere ähnliche Gruppen. Zu repräsentativen Alkylengruppen gehören Methylen, Ethylen, Isobutylen, Hexamethy- Ien, Carbonyloxyethoxycarbonyl, Methylenbis (iminocarbonyl), Carbonyloxydodecylen-carbonyloxyethylen , Carbonyliminomethyleniminocarbonyliminoethylen, Carbonyliminomethyleniminocarbonylethylen und andere Gruppen, wie sie in den U.S.-Patentschriften 4 161 407 und 4 548 870 beschrieben oder vorgeschlagen werden.
• L kann ferner eine substituierte oder unsubstituierte Arylengruppe sein, im allgemeinen mit 6 bis 12 Kernkohlenstoffatomen. Zu repräsentativen Arylengruppen gehören Phenylen, Tolylen, Naphthylen und andere, die in den oben erwähnten Patentschriften erwähnt werden. Ferner sind in dieser Definition für L eingeschlossen divalente Gruppen, die Kombinationen darstellen aus einer oder mehreren einer jeden der oben definierten Alkylen- und Arylengruppen (zum Beispiel Arylenalkylen, Alkylenarylenalkylen und andere, die von dem Fachmann leicht festgestellt werden können. Vorzugsweise steht L für substituiertes oder unsubstituiertes Phenylenalkylen, Phenylenalkylen, substituiert durch eine oder mehrere Alkylgruppen (wie für R definiert), Alkoxygruppen (im allgemeinen mit 1 bis 6 Kohlenstoffatomen, wie beispielsweise Methoxy-, Propoxy- oder Butoxygruppen) oder Halogruppen, oder Carbonyliminomethyleniminocarbonylethylen.
• Zu repräsentativen geeigneten Monomeren gehören m- & p-(2- Chloroethylsulfonylmethyl)styrol, m & p-[2-(p-Tolylsulfonyloxy)ethylsulfonylmethyl]styrol , m & p-Vinylsulfonylmethylstyrol, N-[m & p-(2-Chloroethylsulfonylmethyl)phenyl]acrylamid und N-[2-(2-Chloroethylsulfonyl)ethylformamidomethyl]acrylamid. Das zuerst angegebene Monomer wird bevorzugt verwendet.
• Zu Monomeren, von denen sich die wiederkehrende -G-Einheiten ableiten, gehören Monomere, die von jenen verschieden sind, von denen sich -E- und -F- ableiten. Speziell leiten sich die wiederkehrenden -G-Einheiten von Monomeren ab, die den Teilchen eine wäßrige Dispersionsstabilität verleihen oder welche dazu beitragen, daß das Tracer-Material nicht in der Hülle zurückgehalten wird. Zu repräsentativen Monomeren gehören, ohne daß eine Beschränkung hierauf beabsichtigt ist, anionische Monomere, wie sie oben für die wiederkehrenden -D-Einheiten angegeben wurden, oder hydrophile, jedoch nicht ionische Monomere, wie beispielsweise 2-Hydroxyethylacrylat und 2-Hydroxyethylmethacrylat und andere, die dem Fachmann aus dem Stande der Technik bekannt sind.
• Bevorzugte G-Monomere sind Acrylsäure, Methacrylsäure, Natrium-2-acrylamido-2-methylpropansulfonat, m & p-Carboxymethylstyrol und p-Styrolsulfonsäure, Kaliumsalz.
• Zu repräsentativen zweiten Polymeren, aus denen die Hülle der Teilchen aufgebaut sein kann, gehören die folgenden (die Tg&sub2;-Werte wurden für einige der Materialien bestimmt): Poly(m & p-chloromethylstyrol) (Tg&sub2; 82ºC), Poly(styrol-com & p-chloromethylstyrol-co-2-hydroxyethylacrylat (molares Verhältnis 67 : 30 : 3), Poly(styrol-co-m & p-chloroethylsulfonylmethylstyrol) (molares Verhältnis 95,5 : 4,5, Tg&sub2; 105ºC), Poly{styrol-co-N-[m & p-(2-chloroethylsulfonylmethyl)phenyl]acrylamid} (molares Verhältnis 99,3 : 0.7), Poly(m & p-chloromethylstyrol-co-methacrylsäure) (molares Verhältnis 95 : 5; 98 : 2 und 99,8 : 0,2, Tg&sub2;-Werte 850, 830 bzw. 82ºC), Poly(styrol-co-m & p-chloroethylsulfonylmethylstyrol-co-methacrylsäure) (molares Verhältnis 93,5 : 4,5 : 2), Poly{styrol-co-N- [m & p-(2-chloroethylsulfonylmethyl)phenyl]acrylamid-comethacrylsäure} (molares Verhältnis 97,3 : 0,7 : 2), Poly(styrolco-m & p-vinylbenzaldehyd) (molares Verhältnis 95 : 5), Poly- (styrol-co-m & p-vinylbenzaldehyd-co-methacrylsäure) (molares Verhältnis 93 : 5:2), Poly(styrol-co-m & p-chloromethylstyrol) (molares Verhältnis 70 : 30, Tg&sub2; 96ºC) sowie Poly(styrol-comethacrylsäure) (molares Verhältnis 90 : 10, Tg&sub2; 113ºC).
• Die Polymerteilchen können unter Anwendung jeder beliebigen geeigneten Polymerisationstechnik hergestellt werden, einschließlich der Emulsions- (einschließlich chargenweiser, halbkontinuierlicher sowie kontinuierlicher Polymerisation) sowie Suspensionspolymerisationstechniken, einer Pfropf-Copolymerisation und anderen bekannten Techniken, die dem Fachmann auf dem Gebiet der Polymerchemie bekannt sind. Die Emulsionspolymerisation wird bevorzugt angewandt, da sie zur Herstellung von Teilchen geeignet ist ohne Verwendung von oberflächenaktiven Mitteln oder Emulgatoren, wie sie beispielsweise beschrieben wird in der U.S.-Patentschrift 4 415 700 und der Literaturstelle Research Disclosure, Publikation 15963 (Juli 1977). Die Literaturstelle Research Disclosure ist eine Publikation, erhältlich von der Firma Kenneth Mason Publications, Ltd., The Old Harbourmaster's, 8 North Street, Emsworth, Hampshire PO10 7DD, England. Die kontinuierliche Emulsionspolymerisation ist die am meisten bevorzugte Technik, wie sie in der oben erwähnten Research Disclosure-Literaturstelle beschrieben wird. Weitere Details von Herstellungsverfahren finden sich in den U.S.-Patentschriften 4 161 407 und 4 548 870.
• Insbesondere kann eine stufenweise Emulsionspolymerisation angewandt werden, um ein Kern-Hüllen-Polymer herzustellen, das aus zwei unterschiedlichen Polymeren aufgebaut ist. Die Emulsionspolymerisation des Kernes wird durchgeführt, bis sie im wesentlichen beendet ist, durch fortgesetzte Zugabe von Reaktionskomponenten in ein Reaktionsgefäß unter Standardbedingungen. Monomere und Katalysatoren, die benötigt werden, um das Hüllenpolyiner zu erzeugen, werden dann kontinuierlich in das Gefäß zugegeben, das den Latex des Kernpolymeren enthält. Auf diese Weise hat die Hülle eine definierte bekannte Zusammensetzung und es liegt keine Mischung aus Kern- und Hüllenmonomeren vor. Repräsentative Details der Herstellung von polymeren Kern-Hüllenteilchen, die für diese Erfindung geeignet sind, finden sich in den weiter unten folgenden Beispielen.
• Das Kernpolymer des Teilchens macht im allgemeinen 30 bis 80 und vorzugsweise 40 bis 70 Gew.-% des Teilchens aus.
• Das allgemeine Verfahren zur Herstellung des Reagens dieser Erfindung schließt ein die kovalente Bindung der immunologischen Spezies an die Teilchen unter Anwendung von allgemein bekannten Reaktionen. Im Falle vieler abstehender Gruppen, wie beispielsweise im Falle von Haloalkyl-, 2-substituierten aktivierten Ethylsulfonyl- und Vinylsulfonylgruppen, kann die immunologische Spezies direkt an die Teilchen gebunden werden. Im allgemeinen werden die Polymerteilchen mit der immunologischen Spezies in einer wäßrigen abgepufferten Lösung (pH-Wert im allgemeinen bei 7 bis 10) sowie einer Konzentration von 0,01 bis 40 Gew.-% Polymerteilchen (vorzugsweise von 0,01 bis 10 Gew.-%) vermischt. Die Menge an immunologischer Spezies liegt bei einem Verhältnis von Spezies zu Polyiner von 0,1 : 1000 bis 1 : 10 und vorzugsweise bei 1 : 100 bis 1 : 10. Das Vermischen erfolgt bei einer Temperatur im Bereich von 5 bis 50ºC und vorzugsweise 5 bis 40ºC, 0,5 bis 48 Stunden lang. Jeder geeignete Puffer kann eingesetzt werden. Die Details eines repräsentativen Herstellungsverfahrens werden in dem weiter unten folgenden Beispiel 1 veranschaulicht.
• In einigen Fällen müssen die abstehenden reaktiven Gruppen an der äußeren Oberfläche modifiziert oder aktiviert werden, um eine kovalente Bindung der immunologischen Spezies zu bewirken. Beispielsweise müssen Carboxylgruppen aktiviert werden, unter Anwendung der bekannten Carbodiimidchemie oder anderen chemischen Aktivierungsmethoden.
• In anderen Fällen kann eine Epoxygruppe an der äußeren Oberfläche unter Bildung einer Diolverbindung hydrolysiert werden, die dazu befähigt ist, mit Cyanogenbromid zu reagieren, das als ein Kupplungsmittel für Amingruppen in der immunologischen Spezies wirken kann. Aldehyde können direkt mit Aminen unter Bildung einer Schiff'schen Base umgesetzt werden, die anschließend reduziert werden kann, unter Erzeugung einer kovalenten Bindung. Alternativ kann der Aldehyd zu einer Säure oxidiert werden und eine Chemie, wie oben für Carboxylgruppen angegeben, kann angewandt werden, um eine Amidbindung zu erzeugen.
• Die Polymerteilchen, die in dieser Erfindung verwendet werden, enthalten innerhalb der Hülle oder auf ihrer äußeren Oberfläche praktisch kein bestimmbares oder feststellbares Tracer-Material. Ein Tracer ist ein Material, das mit dem unbewaffneten Auge feststellbar ist oder durch Verwendung einer geeigneten Vorrichtung und geeigneter Techniken. Dies bedeutet, daß praktisch der gesamte Tracer in dem Kern der Teilchen vorliegt.
• Zu geeigneten Tracern gehören, obwohl keine Begrenzung hierauf beabsichtigt ist, Radioisotope, die Gammastrahlen emittieren, fluoreszierende Verbindungen oder Farbstoffe, biolumineszierende Verbindungen, chemilumineszierende Verbindungen, Chromogene, wie zum Beispiel Farbstoffe und Farbstoffbildner sowie andere, dem Fachmann bekannte Stoffe. Im allgemeinen gehört zu ihnen jedes beliebige bestimmbare Material, das in geeigneter Weise in das erste Polymer eingeführt werden kann. Diese Einführung kann erfolgen durch Zugabe des Tracers zu den polymerisierbaren Monomeren, die dann polymerisiert werden. Alternativ kann der Kern hergestellt werden und der Tracer kann hierauf aufgebracht werden oder in geeigneter Weise in den Kern eingeführt werden, beispielsweise indem man den Tracer von dem Kernpolymer aufsaugen läßt unter Anwendung von Verfahren, wie sie beispielsweise beschrieben werden in den U.S.-Patentschriften 4 199 363 und 4 283 382.
• In vorteilhafter Weise werden die Kern/Hüllenteilchen hergestellt und ein Tracer-Material wird von den Teilchen aufgesaugt, unter Anwendung von Techniken, die in den erwähnten Patentschriften beschrieben werden. Da der Tracer eine Affinität für das Kernpolymer und nicht für das Hüllenpolymer aufweist, diffundiert der Tracer durch die Hülle bis in den Kern. Repräsentative Details eines solchen Verfahrens werden in dem unten folgenden Beispiel 1 beschrieben.
• Zu Tracer-Materialien, die bevorzugt im Rahmen dieser Erfindung verwendet werden, gehören, ohne daß hierauf eine Beschränkung beabsichtigt ist, colorimetrische oder fluorometrische Verbindungen.
• Im Falle einer bevorzugten Ausführungsform dieser Erfindung besteht das Tracer-Material aus einem aromatischen Farbstoff, der in dem Kernpolymeren gelöst wird. Derartige Farbstoffe können jede beliebige geeignete Farbe aufweisen, die im Rahmen eines Assays leicht feststellbar ist. Im allgemeinen enthalten sie ein oder mehrere aromatische Reste, welche sie in organischen Lösungsmitteln lösbar machen, die mit Wasser mischbar sind. Derartige Farbstoffe werden nicht als wasserlöslich bezeichnet. Zu bevorzugten aromatischen Farbstoffen gehören Azofarbstoffe, wie zum Beispiel Oil Red EGN und Kodak Oil Red O. Andere geeignete Farbstoffe lassen sich von dem fachkundigen Chemiker leicht durch einen Routineversuch feststellen, wobei festgestellt wird, ob die Farbstoffe die gewünschte Löslichkeit in organischen Lösungsmitteln aufweisen und selektiv löslich sind in einem speziellen Kernpolymer.
• Die Menge an Tracer-Material in den Kern/Hüllenteilchen hängt von dem speziellen Material, das verwendet wird, ab und der Menge, die für eine geeignete Bestimmung benötigt wird. Werden farbige Farbstoffe verwendet, so liegt die Menge im allgemeinen im Bereich von 0,1 bis 15%, bezogen auf das Teilhengewicht.
• Wird ein Farbstoff als Tracer verwendet, so besteht eine bevorzugte Methode der Einführung des Farbstoffes in die Teilchen darin, den Farbstoff in einem geeigneten, mit Wasser mischbaren organischen Lösungsmittel zu lösen, die erhaltene Lösung stufenweise dem Polymerlatex bei einer Temperatur im Bereich von 20 bis 90ºC zuzusetzen und das organische Lösungsmittel in geeigneter Weise zu entfernen. Natürlich können Abweichungen dieses Verfahrens vorgenommen werden, wie beispielsweise die Zugabe des polymeren Latex zur Farbstofflösung, wie es in der U.S.-Patentschrift 4 199 363 beschrieben wird. Eine Filtration der Latexteilchen gewährleistet die Entfernung von teilchenförmigen Farbstoffkristallen. Das Verhältnis von organischem Lösungsmittel zu Wasser muß bei einem Wert gehalten werden, derart, daß das Polymer nicht gelöst wird. Zu bevorzugten Lösungsmitteln gehören Acetonitril, N,N-Dimethylformamid, kurzkettige Alkohole, wie zum Beispiel Methanol und Ethanol, Tetrahydrofuran, Ketone, wie zum Beispiel Aceton, sowie 1-Methyl-2-pyrrolidon.
• Die Kern/Hüllenteilchen mit dem Tracer sowie die Reagentien, die hieraus hergestellt werden, können verwendet werden, aufbewahrt werden oder in Testsätzen (kits) bereitgestellt werden, in Form wäßriger Suspensionen.
• Die Reagentien der vorliegenden Erfindung können verwendet werden zur Bestimmung (qualitativen oder quantitativen Messungen) eines Analyten in wäßrigen Flüssigkeiten. Diese Bestimmung kann erfolgen durch einfache Bestimmung der Gegenwart oder der Abwesenheit des Analyten oder durch quantitative Bestimmung der Menge an Analyt. Soll der Analyt nach immunologischen Methoden festgestellt werden, so wird er hier als Ligand bezeichnet. Die Erfindung kann insbesondere angewandt werden zur Untersuchung biologischer Flüssigkeiten von Tieren, des Menschen oder von Pflanzen, jedoch vorzugsweise des Menschen. Derartige Flüssigkeiten enthalten, sind jedoch beschränkt hierauf, ganzes Blut, Plasma, Serum, Lymphflüssigkeit, Gallenflüssigkeit, Urin, spinale Flüssigkeit, seminale Flüssigkeit, Tränenflüssigkeit, vaginale Sekretionen, Sputum, Schweiß und dergleichen, wie auch Stuhlproben. Es ist ferner möglich, flüssige Präparate von menschlichem oder tierischem Gewebe zu untersuchen, wie beispielsweise skeletale Muskel, dem Herzen, der Niere, der Lungen, des Gehirns, des Knochenmarks, der Haut und dergleichen.
• Die vorliegende Erfindung kann dazu verwendet werden, um (d. h. entweder qualitativ oder quantitativ) jeden einer beliebigen Menge von Liganden zu bestimmen, der reaktiv mit der immunologischen Spezies des Reagens der Erfindung ist. Zu derartigen Liganden gehören, ohne daß eine Beschränkung hierauf beabsichtigt ist, Proteine, Hormone, Arzneimittel, Kohlehydrate, Pflanzenlektine oder Lipopolysaccharide, die ein oder mehrere Zentren für eine Komplexbildung mit der immunologischen Spezies des Reagens aufweisen. Beispielsweise weist das Reagens Antikörper auf, die auf den Liganden gerichtet sind, der ein Arzneimittel oder ein Hormon sein kann.
• Alternativ kann der Ligand ein Antikörper oder Antigen sein, der bzw. das zwei oder mehr Zentren für eine Komplexbildung mit einer oder mehreren immunologischen Spezies aufweist, wovon eine Teil des Reagens dieser Erfindung ist. In dem diagnostischen Assay, der hier beschrieben wird, kann der Ligand aus Streptococcus A Antigen bestehen, Antigenen von chlamydialen oder gonokokkalen Organismen, HTLV-Antigenen oder Antikörpern (zum Beispiel HTLV-I oder HTLV-II), HIV- Antigenen oder Antikörpern (zum Beispiel HIV-I oder HIV-II), stimulierenden Thyroid-Hormonen, Apoliproteinen, menschlichem chorionischem Gonadotropin, leutinisierendem Hormon, carcinoembryonischem Antigen, Hepatitisantigen, Herpesviren oder anderen biologischen Verbindungen.
• Das Reagens kann in einem Lösungsassay verwendet werden oder im Rahmen von kompetitiven Bindungs-Immunoassays. Unter einem Lösungsassay ist ein Assay zu verstehen, bei dem die Reagentien dieser Erfindung in einer flüssigen Suspension in einem Immunoassay verwendet werden. Es können entweder gebundene (d. h. komplex gebundene) oder ungebundene (d. h. nicht komplex gebundene) markierte Materialien bestimmt werden. Eine physikalische Trennung von gebundenen und ungebundenen Materialien kann, falls erwünscht, unter Anwendung einer beliebigen geeigneten Trennungsmethode durchgeführt werden. Bei Verwendung der oben beschriebenen analytischen Elemente kann entweder eine vertikale oder horizontale Trennung angewandt werden.
• Im Falle einer anderen Ausführungsform kann das Reagens in einer Form eingesetzt werden, die auf diesem Gebiet bekannt ist als ein immunometrischer Assay, beispielsweise ein "Sandwich"-Assay. Die Details derartiger Assays werden beschrieben in der U.S.-Patentschrift 4 486 530. Das Reagens der vorliegenden Erfindung eignet sich in derartigen Assays, in denen der zu bestimmende Ligand zwei oder mehrere epitopische Zentren für eine immunologische Reaktion mit zwei oder mehreren Rezeptormolekülen aufweist. Die Rezeptormoleküle können die gleichen sein oder voneinander verschieden. Eines der Rezeptormoleküle wird hier als eine erste immunologische Spezies bezeichnet. Eine zweite immunologische Spezies wird ebenfalls verwendet, die zu einer immunologischen Reaktion mit dem Liganden an einer Stelle befähigt ist, an der die erste Spezies reagiert. Das Ergebnis dieses Verfahrens besteht in der Bildung eines ternären Komplexes der zwei ausgeprägten immunologischen Spezies mit dem Liganden. Mindestens eine der immunologischen Spezies wird kovalent an ein Kern/Hüllenteilchen, wie hier beschrieben, gebunden, das in dem Kern mit einem Tracer-Material markiert ist. Im Falle eines bevorzugten immunometrischen Assays sind beide immunologischen Spezies ausgeprägte Antikörper, die auf ein Antigen gerichtet sind. Sie können gleiche oder verschiedene Antikörper sein, ganze Antikörper oder Fragmente, monoklonal oder polyklonal.
• Im Falle einer weiteren Ausführungsform dieser Erfindung umfaßt das Reagens dieser Erfindung ein Antigen und der zu bestimmende Ligand ist ein Antikörper. Die Menge an Antikörper in der Testprobe wird bestimmt durch Messung der Menge des Tracers in den umgesetzten oder nicht umgesetzten Materialien.
• Das Verfahren dieser Erfindung kann ferner unter Verwendung eines trockenen analytischen Elementes durchgeführt werden. Das einfachste Element kann aus einem absorbierenden Trägermaterial bestehen, beispielsweise einem dünnen Blatt eines selbsttragenden absorbierenden oder saugfähigen Materials, wie beispielsweise Filterpapier oder Filterstreifen mit einer oder mehreren Zonen, wobei mindestens eine Zone das Reagens dieser Erfindung enthält. Andere Zonen können andere geeignete Reagentien enthalten. Derartige Elemente sind aus dem Stande der Technik als Teststreifen, diagnostische Elemente, Eintauchstäbe oder diagnostische Mittel bekannt.
• Geeignete absorbierende Trägermaterialien sind unlöslich und behalten ihre strukturelle Integrität bei, wenn sie der Einwirkung von Wasser oder biologischen Flüssigkeiten, wie beispielsweise ganzem Blut oder Serum, ausgesetzt werden. Geeignete Elemente lassen sich herstellen aus Papier, porösen teilchenförmigen Strukturen, porösen Polymerfilmen, Cellulose, Glasfasern, gewebten und nicht gewebten textilen Produkten (synthetischen und nicht synthetischen Ursprungs) und dergleichen. Geeignete Materialien und Verfahren zur Herstellung derartiger Elemente sind aus dem Stande der Technik bekannt.
• Vorzugsweise ist das absorbierende Trägermaterial des trockenen analytischen Elementes dieser Erfindung eine poröse Ausbreitzone. Diese Zone kann selbsttragend sein (d. h. aus einem Material bestehen, das fest genug ist, um seine Integrität beizubehalten), befindet sich jedoch vorzugsweise auf einem separaten Träger. Ein solcher Träger kann aus einem beliebigen geeigneten dimensionsstabilen und vorzugsweise nicht porösen und transparenten (d. h. für Strahlung durchlässigen) Material bestehen, das elektromagnetische Strahlung einer Wellenlänge zwischen 200 und 900 nm durchläßt. Ein Träger der Wahl für ein spezielles Element sollte verträglich sein mit der beabsichtigten Art des Bestimmungsverfahrens (Fluoreszenz-, Transmissions- oder Reflexions-Spektroskopie). Geeignete Träger können hergestellt werden aus Papier, Metallfolien, Polystyrol, Polyestern, Polycarbonaten oder Celluloseestern.
• Die poröse Ausbreitzone kann hergestellt werden aus jedem geeigneten fasrigen oder nicht-fasrigen Material oder Mischungen von einem oder beiden. Das Porenvolumen und die mittlere Porengröße dieser Zone kann verschieden sein, in Abhängigkeit von dem beabsichtigten Verwendungszweck. Geeignete Ausbreitzonen lassen sich herstellen unter Verwendung von Materialien und Verfahren, wie sie beispielsweise beschrieben werden in den U.S.-Patentschriften 4 292 272, 3 992 158, 4 258 001 und 4 430 436 sowie der japanischen Patentpublikation 57(1982)-101760.
• Die Elemente können zwei oder mehrere diskrete Zonen aufweisen, entweder in der gleichen Schicht oder übereinander angeordnet. Mindestens eine der Zonen ist vorzugsweise eine poröse Ausbreitzone. Die anderen Zonen können Reagenszonen oder Registrierzonen bilden, entsprechend jenen Zonen, die aus dem Stande der Technik bekannt sind, ferner können sie zusätzliche Ausbreitzonen darstellen, Strahlung blockierende Zonen oder Filterzonen, Haftzonen oder Trennzonen. Die Zonen befinden sich im allgemeinen in einem fluiden Kontakt miteinander, was bedeutet, daß die Fluide oder Flüssigkeiten, Reagentien und Reaktionsprodukte (beispielsweise farbige Farbstoffe) zwischen übereinander angeordneten Bereichen von benachbarten Zonen hindurchgelangen oder transportiert werden können. Mit anderen Worten, befindet sich das Element in Kontakt mit einer Flüssigkeit, so können die Reagentien innerhalb des Elementes miteinander vermischt werden und leicht miteinander reagieren. Vorzugsweise befindet sich jede Zone in einer separat aufgetragenen Schicht, obgleich zwei oder mehrere Zonen separate Zonen in einer einzelnen Schicht des Elementes darstellen können.
• Vorzugsweise wird das Reagens dieser Erfindung dazu verwendet, um eine multivalente immunoreaktive Spezies zu ermitteln, wie beispielsweise Streptococcus A Antigen, wie es in der folgenden Ausführungsform und in Beispiel 1 unten beschrieben wird. Diese Ausführungsform der Erfindung bezüglich Streptococcus A Antigen wird beispielsweise veranschaulicht, und ist nicht derart zu verstehen, daß diese Erfindung hierauf beschränkt werden soll. Eine biologische Probe, von der erwartet wird, daß sie das Antigen enthält, wird einem Patienten in geeigneter Weise entnommen. Nachfolgend werden die Antigene aus dem Organismus in geeigneter Weise extrahiert. Zu bemerken ist, daß manche Antigene direkt ohne Extraktionsverfahren bestimmbar sind.
• Im Falle von Streptococcus A Antigen weisen geeignete Extraktionszusammensetzungen, die aus dem Stande der Technik bekannt sind, eine Mischung von Nitritsalz und Eisessig auf, wie sie beispielsweise beschrieben wird in der E.P.-Publikation 150 567, sowie Enzyme, die sich ableiten von dem Bakterium Streptomyces albus, wie es aus der U.S.-Patentschrift 4 618 576 bekannt ist. Eine bevorzugte Extraktionszusammensetzung besteht aus einer Mischung aus einem Nitritsalz (z. B. Natriumnitrit oder Kaliumnitrit) mit einer organischen Säure (beispielsweise Bernsteinsäure oder Citronensäure) mit oder ohne Bindemittelmaterialien.
• Die Gegenwart eines Liganden, beispielsweise von Streptococcus A Antigen, wird festgestellt durch das immunoreaktive Reagens dieser Erfindung, das Antikörpermoleküle aufweisen kann, die kovalent an die Teilchen gebunden sind. Eine Reaktion (oder immunochemische Bindung) zwischen der immunoreaktiven Spezies und Antikörpern führt dann zu einem reaktiven Produkt, das bestimmt werden kann durch Messung der Menge an Tracer in dem erhaltenen Reaktionsprodukt oder in den nicht umgesetzten Materialien.
• Wenn sich ein Reaktionsprodukt, zum Beispiel ein Agglutinat, gebildet hat, so wird das Reaktionsprodukt gegebenenfalls, jedoch vorzugsweise von den nicht-agglutinierten Materialien in jeder beliebigen geeigneten bekannten Weise abgetrennt. Nach der Abtrennung wird die Menge an Tracer vorzugsweise in dem Agglutinat ermittelt.
• Gleichzeitig mit oder nach dem Kontakt des Reagens mit Rezeptormolekülen unter Bildung des Agglutinates kann das Agglutinat ferner in Kontakt gebracht werden mit einer mikroporösen wasserunlöslichen Membran, um die Trennung zu bewirken. Im Falle einer Ausführungsform kann das Agglutinat in einem separaten Behälter erzeugt und dann in Kontakt mit der Membran gebracht werden. Alternativ und vorzugsweise wird das Agglutinat in Gegenwart der Membran erzeugt. Diese Membran kann in einfacher Weise ein Filtermittel sein, das von Hand gehalten wird, durch welche nicht-agglutinierte Materialien abfiltriert werden. Vorzugsweise jedoch ist die Membran in einer Testvorrichtung montiert, in der der Assay durchgeführt wird. Eine solche Testvorrichtung wird ebenfalls weiter unten beschrieben.
• Jede beliebige, in Wasser unlösliche Membran kann verwendet werden, solange sie inert gegenüber den Materialien ist, die In dem Assay verwendet werden und solange sie die gewünschte Porosität aufweist, die es Flüssigkeiten und nicht umgesetzten Materialien ermöglicht, durch die Membran zu gelangen, die jedoch das Reaktionsprodukt zurückhält. Mit anderen Worten, die Membranporen müssen groß genug sein, um einen Durchtritt des Reagens und von nicht umgesetzten Teilchen zu ermöglichen, sie dürfen jedoch nicht so groß sein, daß sie den Durchtritt von agglutinierten Teilchen erlauben. Insbesondere soll die mittlere Porengröße der Membran mindestens fünfmal so groß sein wie der mittlere Durchmesser der in Wasser unlöslichen oben beschriebenen Teilchen. Vorzugsweise liegt die mittlere Porengröße bei dem 6- bis 15fachen des mittleren Teilchendurchmessers. Zu geeigneten Membranen gehören polymere Materialien, die im Handel aus verschiedenen Quellen erhältlich sind, wie beispielsweise von der Firma Pall Corp. Eine geeignete Membran besteht aus einer mikroporösen Membran aus Nylon-66, hergestellt und vertrieben von dieser Firma als BIODYNE A oder ULTIPOR N-66.
• Im Falle eines Agglutinationsassays kann eine geeignete Inkubationsperiode dazu benutzt werden, um die Agglutination zu optimieren, falls erwünscht, vor oder während des Kontaktes mit der Membran. Nach dieser Periode werden nichtagglutinierte restliche Materialien durch die Membran ausgewaschen, während das Agglutinat auf der Membran hinterbleibt. Jede geeignete Waschflüssigkeit kann in dieser Stufe eingesetzt werden.
• Nachdem die nicht-agglutinierten restlichen Materialien durch die Membran weggewaschen wurden, kann die Menge an immunoreaktiver Spezies in entweder dem Agglutinat oder in restlichen Materialien bestimmt werden, allgemein mit dem unbewaffneten Auge, falls der Tracer eine leicht sichtbare colorimetrische Verbindung ist. Andererseits kann eine übliche colorimetrische Bestimmungsvorrichtung verwendet werden. Andere Typen von Tracern, beispielsweise Radioisotope, fluoreszierende Farbstoffe, phosphoreszierende Farbstoffe und dergleichen, erfordern eine geeignete Bestimmungsvorrichtung. Obgleich die vorliegende Erfindung nicht hierauf beschränkt ist, kann der Assay für eine multivalente, immunoreaktive Spezies durchgeführt werden unter Verwendung einer geeigneten Testvorrichtung, die die beschriebene mikroporöse Membran enthält. Eine derartige Vorrichtung kann ein oder mehrere Behältnisse aufweisen, in die eine Testprobe mit einem Liganden für eine Reaktion mit dem Reagens dieser Erfindung gegeben wird. Dieses Reagens kann in die Vorrichtung während des Assays gegeben werden oder in die Vorrichtung zum Zeitpunkt ihrer Herstellung eingearbeitet werden. Nachdem ein Agglutinat erzeugt worden ist, können die nicht-agglutinierten restlichen Materialien durch die Membran mit der Waschlösung ausgewaschen werden, und zwar in einen separaten Behälter unterhalb der Membran.
• Die folgenden Beispiele veranschaulichen die Praxis der vorliegenden Erfindung.
Beispiel 1 Herstellung eines Reagens
• Dieses Beispiel veranschaulicht die Herstellung eines Kern-/Hüllen-Polyinerteilchens, den Einschluß eines Tracer-Materials und die Bindung einer immunologischen Spezies im Rahmen der Herstellung eines Reagens der vorliegenden Erfindung.
Herstellung von Kern-/Hüllen-Polymerteilchen
• Die drei unten aufgeführten Lösungen wurden kontinuierlich in einen 1300 ml fassenden Behälter gegeben, der von Sauerstoff befreites Wasser von 80ºC enthielt, und zwar in den angegebenen Geschwindigkeiten:
• Lösung 1: Styrol (103 g), 2-Acetoacetoxyethylmethacrylat (91 g) und 1-Dodecanthiol (1,9 g) bei einer Geschwindigkeit von 1,08 g/Min. über 180 Minuten.
• Lösung 2: Ammoniumpersulfat (6,5 g) und destilliertes, von Sauerstoff befreites Wasser (651 g) bei einer Geschwindigkeit von 2,13 g/Min. über 300 Minuten.
• Lösung 3: Natriumpyrosulfit (3,24 g) und destilliertes Wasser (651 g) mit einer Geschwindigkeit von 2,17 g/Min. über 300 Minuten.
• Nach 180 Minuten war die Lösung 1 zugegeben und wurde ersetzt durch eine Lösung von m & p-Chloromethylstyrol (130 g) und 1- Dodecanthiol (1,3 g), die mit einer Geschwindigkeit von 1,08 g über 120 Minuten zugegeben wurde. Die endgültigen Reaktorinhalte enthielten 11,45% Feststoffe. Nach einer 5-tägigen Dialyse enthielt der Latex 8,7% Feststoffe und die mittlere Größe der erhaltenen Kern-/Hüllenteilchen lag bei 0,34 um, ermittelt durch Transmissions-Elektronen-Mikroskopie.
Zugabe von Tracer-Material zu den Teilchen
• Kodak Oil Red 0-Farbstoff (2,5 g) wurde in Acetonitril (150 g) gelöst. Zu einer 60 g-Probe des oben beschriebenen dialysierten Latex wurde destilliertes Wasser (290 g) zugegeben und die erhaltene Mischung wurde unter Rühren auf 70ºC erhitzt. Zu der heißen Latexlösung wurden 30 g-Portionen der Farbstofflösung zugegeben, eine Portion nach jeweils 30 Minuten, bis die gesamte Menge zugegeben worden war. Die erhaltene Dispersion wurde filtriert, unter vermindertem Druck von restlichem Acetonitril abgestreift und wiederum filtriert, wobei 70 g einer 4,82%igen Mischung von nicht-agglutinierten Kern-/Hüllenteilchen mit dem Farbstoff in lediglich den Kernen erhalten wurden. Der Farbstoffgehalt wurde auf spektrophotometrischem Wege bestimmt und lag bei 8,9% (bezogen auf das Polymergewicht).
Kovalente Bindung von Antikörper an die Teilchen
• Monoklonale Antikörper für Streptococcus A Antigen sowie Casein wurden kovalent auf diesen Teilchen wie folgt immobilisiert: zu 0,6 ml eines 50 inmolaren Boratpuffers (pH-Wert 8,5) wurden zugegeben 0,1 mg Gesamtprotein aus einer 10 : 1 Mischung von Anti-Strep A Antikörper (2,9 mg/ml Lösung in mit Phosphat abgepufferter Salzlösung, aus dem Stande der Technik bekannt als PBS) und Casein (10 mg/ml Wasser). Nach dem Vermischen wurden 41,5 ul einer 5%igen Suspension der polymeren Latexteilchen zugegeben (um 0,3% Feststoffe zu liefern), worauf die erhaltene Lösung rotiert wurde (über Kopf) 24 Stunden lang bei 37ºC, um eine kovalente Bindung des Antikörpers und des Caseins an den Teilchen zu erreichen unter Erzeugung eines immunoreaktiven Reagens.
Beispiel 2 Bestimmung von Streptococcus A unter Verwendung des Reagens dieser Erfindung
• Dieses Beispiel veranschaulicht die Verwendung des Reagens dieser Erfindung zum Zwecke der Bestimmung des Vorhandenseins von Streptococcus A Antigen in einer biologischen Probe.
• Eine Lösung von Bernsteinsäureanhydrid (10 mg/ml Dimethylsulfoxid) wurde zu einer Suspension des Reagens gegeben, das, wie in Beispiel 1 oben beschrieben, hergestellt wurde, in einem Gewichts-Verhältnis von einem Teil Anhydrid zu einem Teil Gesamtprotein. Die erhaltene Suspension wurde 4 Stunden lang bei 25ºC vermischt und dann 5 Minuten lang bei 7000 Upm zentrifugiert, worauf das erhaltene Pellet in einem 0,1 molaren Glycinpuffer (pH-Wert 8,5) re-suspendiert wurde, unter Erhalt einer Konzentration von 0,3% Feststoffen. Durch dieses Verfahren wurden die primären und sekundären Amingruppen der Proteine chemisch modifiziert, die an die Teilchen gebunden waren, wobei ein Wasserstoffatom an den Amingruppen durch eine Carbonsäuregruppe ersetzt wurde.
• Streptococcus A Antigen wurde aus einem Isolat extrahiert, das von einem örtlichen Krankenhaus erhalten wurde, und zwar bei 25ºC über eine Minute unter Verwendung einer Lösung von gleichen Volumina von Natriumnitrit (8 molar) und Citronen- Säure (0,2 molar). Die Lösung wurde dann mit einem gleichen Volumen von 3-(N-Morpholino)propansulfonsäurepuffer (2 molar, pH-Wert 7,5) mit Ethylendiamintetraessigsäure (75 mmolar) neutralisiert.
• Eine mikroporöse Membran aus Nylon 66 (mittlere Porengröße 5 um) wurde in ein Testbehältnis einer Wegwerf-Testvorrichtung eingesetzt und durch Waschen mit 100 ul einer 2%igen succinylierten Caseinlösung vorbehandelt.
• Eine Mischung von Natriumchlorid (80 ul, 1 molar) der oben beschriebenen Reagenssuspension (40 ul) und extrahiertem Antigen (80 ml), enthaltend etwa 4,2·10&sup5; Kolonien bildende Einheiten, wurde in das Testbehältnis der Testvorrichtung mit der Membran gegeben und hierin 2 Minuten lang bei 25ºC inkubiert. Die Flüssigkeit wurde dann in einen Behälter unterhalb der Membran abtropfen gelassen und das Agglutinat auf der Membran wurde mit 150 ul Waschflüssigkeit mit einer Ionenstärke von 0,25 gewaschen.
• Nach der Waschstufe wurde die Farbstoffmenge in dem Agglutinat auf der Membran bestimmt bei 540 nm unter Verwendung einer Reflexions-Meßvorrichtung. Die Williams-Clapper-Gleichung (J. Optical Soc. Am., 43, S. 595, 1953) wurde benutzt, um die Transmissionsdichtewerte zu errechnen. Das Agglutinat auf der Membran war leicht sichtbar und hatte einen beträchtlich größeren Dichtewert als die Dichte eines Hintergrund- Vergleichsmaterials (der Unterschied betrug 0,148). Diese Daten zeigen, daß das Reagens der vorliegenden Erfindung geeignet war für die Bestimmung von Streptococcus A Antigen aus einer biologischen Probe.
Beispiel 3 Bestimmun von hCG unter Verwendung eines Reagens dieser Erfindung
• Dieses Beispiel veranschaulicht die Praxis der vorliegenden Erfindung zum Zwecke der Bestimmung von menschlichem, chorionischem Gonadotropin (hCG).
• Kern-/Hüllen-Polymerteilchen wurden zum Aufsaugen von Oil Red EGN-Farbstoff gemäß dem Verfahren, wie in Beispiel 1 oben beschrieben, verwendet. Die Teilchenkerne bestanden aus Poly(styrol-co-2-acetoacetoxyethylmethacrylat) (Gewichts- Verhältnis 85 : 15) und die Teilchenhüllen bestanden aus Poly- (m & p-chloromethylstyrol-co-rnethacrylsäure) (Gewichts-Verhältnis 99,8 : 0,2). Die Teilchen hatten einen mittleren Durchmesser von etwa 0,32 Mikrometer.
• Monoklonale Antikörper für zwei unterschiedliche epitopische Zentren von hCG wurden kovalent auf diesen Teilchen wie folgt immobilisiert: zu 0,6 ml eines 50 mmolaren Boratpuffers (pH-Wert 8,5) wurden zugegeben 0,1 mg einer 10 : 1- Mischung von hCG-Antikörper (2,9 mg/ml einer mit Phosphat abgepufferten Salzlösung) sowie Casein (10 mg/ml) Wasser. Nach dem Vermischen wurden 41,5 ul einer 5%igen Suspension der oben beschriebenen Latexteilchen zugegeben und die erhaltene Suspension wurde rotiert (über Kopf) 24 Stunden lang bei 37ºC, um eine kovalente Bindung der Antikörper und des Caseins an den Teilchen zu bewirken, unter Erzeugung eines immunoreaktiven Reagens.
• Eine Lösung von Bernsteinsäureanhydrid (10 mg/ml Dimethylsulfoxid) wurde zu einer Mischung des Reagens in einem Gewichts-Verhältnis von einem Teil Anhyrid zu einem Teil Gesamtprotein zugegeben und die erhaltene Mischung wurde 4 Stunden lang bei 25ºC vermischt und 5 Minuten lang bei 7000 Upm zentrifugiert, um die Amingruppen des gebundenen Proteins zu modifizieren. Das erhaltene Pellet wurde in 0,1 molarem Glycin (pH-Wert 8,5) zu einer Konzentration von 0,3% Feststoffen resuspendiert.
• Verschiedene Mengen an hCG (internationale Millieinheiten/ml) wurden zu mit Phosphat abgepufferten Salzlösungen zugegeben (0,1 molar bezüglich Natriumphosphat und 0,15 molar bezüglich Natriumchlorid), enthaltend 0,5% Rinderserumalbumin. Eine mikroporöse Membran aus Nylon 66 mit einer mittleren Porengröße von etwa 5 Mikrometern wurde in ein Testbehältnis einer Wegwerf-Testvorrichtung gegeben, ähnlich derjenigen, wie sie in Beispiel 2 oben beschrieben wurde. Diese Membran wurde mit 2 Tropfen einer 1%igen wäßrigen Lösung von succinyliertem Casein gewaschen. Die hCG-Konzentration in internationalen Millieinheiten ist definiert als 5000 internationale Millieinheiten und equivalent einem Mikrogramm von gereinigtem hCG.
• Eine Mischung von 60 ul von 4 molarem Natriumchlorid, 1 molarem Tricinpuffer (pH-Wert 8,6), 60 ul der Suspension des immunoreaktiven Reagens, wie oben beschrieben, und 240 ul der hCG-Lösungen, wie oben beschrieben, wurde in Teströhrchen gegeben, vorsichtig vermischt und 10 Minuten lang bei 25ºC inkubieren gelassen. Ein Anteil einer jeden Lösung (300 ul) wurde in das Testbehältnis gegeben, das die Membran enthielt, und durch die Membran fließen gelassen. Agglutinat, das sich auf der Membran gebildet hatte, floß jedoch nicht durch die Membran. Es wurde mit 300 ul einer 1 molaren Natriumchloridlösung gewaschen, und die Menge des Farbstoffes in dem Agglutinat wurde bei 540 nm, wie in Beispiel 2 beschrieben, bestimmt. Die Ergebnisse dieser Messungen sind in Tabelle I unten in Form der Transmissionsdichten (DT) angegeben. Die Daten zeigen, daß der Assay dieser Erfindung zur Bestimmung von hCG verwendet werden kann.
TABELLE I hCG-Antigen (Intern. Millieinheiten/ml) DT
• 0 0,043
• 500 0,047
• 1000 0,133
Beispiel 4 Agglutinations-Reagens unter Verwendung von Polymer, das sich von einem Chloroethylsulfonylmonomeren ableitet
• Hergestellt wurden Kern-/Hüllen-Polymerlatexteilchen mit einem Kern aus Poly(styrol-co-2-acetoacetoxyethylmethacrylat) (molares Verhältnis 85 : 15) und einer Hülle aus Poly- [styrol-co-m & p-(2-chloroethylsulfonylmethyl)styrol](molares Verhältnis 95,5 : 4,5), worauf man sie eine 3,5%ige Acetonitrillösung von Oil Red EGN-Farbstoff, wie in Beispiel 1 beschrieben, aufsaugen ließ. Die Teilchen wurden in einem 0,05 molaren Natriumboratpuffer (pH-Wert 8,5), enthaltend 0,1% Natriumazid, suspendiert unter Gewinnung einer 0,3% Feststoffe enthaltenden Suspension.
• Monoklonale Antikörper für Strep-A [0,026 ml einer 3,8 mg/ml Lösung in einem 0,05 molaren Boratpuffer (pH-Wert 8,5), enthaltend 0,1% Natriuinazid], sowie Casein (0,01 ml einer l mg/ml Lösung in Wasser) wurden miteinander in etwa 0,9 ml Boratpuffer vermischt.
• Die Teilchen (0,173 ml einer 1,73%igen Puffersuspension) wurden zugegeben und die Mischung wurde durch Schütteln über Kopf 24 Stunden lang bei etwa 25ºC vermischt. Bernsteinsäureanhydrid (0,01 ml einer 10 mg/ml Dimethylsulfoxidlösung) wurde zugegeben und die Mischung wurde 3 Stunden lang geschüttelt. Die Mischung wurde dann zentrifugiert, die überstehende Flüssigkeit wurde abdekantiert und das Pellet wurde in 0,1 normalem Glycin (pH-Wert 8,5), enthaltend 0,1% Natrium azid, suspendiert unter Gewinnung einer 0,3% Feststoffe enthaltenden Suspension.
Beispiel 5 Vergleichsbeispiel
• Dieses Beispiel vergleicht das Reagens der Erfindung, hergestellt, wie in Beispiel 1 beschrieben, mit einem Vergleichsreagens, das aus einem homogenen polymeren Teilchen bestand. Die Reagentien wurden miteinander verglichen, indem sie in Assays für Streptococcus A Antigen, wie in Beispiel 2 beschrieben, verwendet wurden.
• Die Teilchen des Vergleichsreagens bestanden aus Poly(styrolco-m & p-chloromethylstyrol-co-2-hydroxyethylacrylat) (molares Verhältnis 67 : 30 : 3) und hatten eine mittlere Teilchengröße von 0,77 um. Restliches Monomer, Initiator und Initiatornebenprodukte von der Herstellung der Teilchen wurden unter Anwendung einer Cross-Flow-Filtration entfernt. Kodak Oil Red O-Farbstoff wurde dann in die Teilchen, wie in Beispiel 2 beschrieben, eingeführt. Anti-Streptococcus A Antikörper wurde dann kovalent an die Teilchen, wie in Beispiel 2 beschrieben, gebunden und das erhaltene Reagens wurde, wie in Beispiel 3 beschrieben, getestet.
• Es wurde festgestellt, daß in dem Streptococcus A-Assay das Vergleichsreagens nicht auf dem Membranfilter unter Erzeugung einer bestimmbaren Agglutination agglutinierte. Die Teilchen enthielten keinen aktiven Antikörper, vielmehr schien das Vorhandensein von Farbstoff auf der Teilchenoberfläche in gewisser Weise die gewünschte immunologische Reaktion zu stören. Im Gegensatz hierzu agglutinierte das Reagens der vorliegenden Erfindung leicht und lieferte ein bestimmbares Agglutinat auf der Filtermembran.

Claims (16)

1. In Wasser unlösliches Polymerteilchen mit einem inneren Kern mit einem ersten Polymeren, das sich von einem oder mehreren ethylenisch ungesättigten polymerisierbaren Monomeren ableitet, und

einer äußeren Hülle mit einem zweiten Polymeren, das sich von einem oder mehreren ethylenisch ungesättigten polymerisierbaren Monomeren ableitet, dadurch gekennzeichnet, daß

(i) das erste Polymer einen Tg&sub1;-Wert von weniger als 100ºC aufweist sowie ferner einen feststellbaren Tracer, der in dem Polymer verteilt ist und der eine starke Affinität für das erste Polymer aufweist,

(ii) das zweite Polymer einen Tg&sub2;-Wert aufweist, der größer oder gleich ist der Beziehung [Tg&sub1;-10ºC] und das sich ableitet von mindestens einem Monomeren mit reaktiven Gruppen, die direkt oder indirekt mit freien Amino- oder Sulfhydrylgruppen einer immunoreaktiven Spezies zu reagieren vermögen, wobei der Tracer für dieses Polymer eine wesentlich geringere Affinität aufweist relativ zum ersten Polymeren, und

(iii) daß das Teilchen praktisch keinen Tracer innerhalb der äußeren Hülle oder auf seiner äußeren Oberfläche aufweist.

2. Polymerteilchen nach Anspruch 1, das einen Durchmesser von 0,05-5 Mikrometer aufweist.

3. Polymerteilchen nach Anspruch 1 oder 2, in dem das erste Polymer durch die Formel (1) dargestellt wird:

-(A)u-(B)v-(D)w-

worin -A- für wiederkehrende Einheiten steht, die sich von einem oder mehreren hydrophoben ethylenisch ungesättigten Monomeren ableiten, die den Teilchen eine Wasserunlöslichkeit verleihen,

-B- steht für wiederkehrende Einheiten, die sich von einem oder mehreren ethylenisch ungesättigten Monomeren ableiten, dessen Homopolymer beziehungsweise dessen Homopolymere eine Glasübergangstemperatur von weniger als 55ºC aufweisen, und

-D- steht für wiederkehrende Einheiten, die sich von einem oder mehreren ethylenisch ungesättigten Monomeren ableiten, die verschieden sind von denen, die durch -A- oder -B- dargestellt werden,

u steht für 30-95 Mol-%, v steht für 5-50 Mol-% und w steht für 0-20 Mol-%,

und wobei das zweite Polymer durch die folgende Formel (II) dargestellt wird:

-(E)x-(F)y-(G)z-

worin -E- für wiederkehrende Einheiten steht, die sich von einem oder mehreren hydrophoben ethylenisch ungesättigten Monomeren ableiten,

-F- wiederkehrende Einheiten repräsentiert, die sich von einem oder mehreren ethylenisch ungesättigten Monomeren ableiten, die reaktive Gruppen aufweisen, die direkt oder indirekt mit den freien Amin- oder Sulhydrylgruppen der immunoreaktiven Spezies reagieren,

-G- steht für wiederkehrende Einheiten, die sich von einem oder mehreren ethylenisch ungesättigten Monomeren ableiten, die sich von denen unterscheiden, die durch -E- oder -F- repräsentiert werden,

x steht für 0-99,9 Mol-%, y steht für 0,1 - 100 Mol-% und z steht für 0 - 15 Mol-%.

4. Polymerteilchen nach Anspruch 3, in dem die Monomeren, von denen sich die F-Einheiten des zweiten Polymeren ableiten, entweder reaktive Halomethyl- oder aktivierte 2-substituierte Ethylsulfonylgruppen aufweisen.

5. Polymerteilchen nach einem der Ansprüche 1 - 4, in dem der feststellbare Tracer eine kolorimetrische oder fluorometrische Verbindung oder eine einen Farbstoff bildende Verbindung ist.

6. Immunoreaktives Reagens mit:

(a) einem wasserunlöslichen Polymerteilchen gemäß einem der Ansprüche 1 - 5, und

(b) einer immunoreaktiven Spezies, die kovalent durch die reaktiven Gruppen an der äußeren Oberfläche gebunden ist, wobei die immunoreaktive Spezies dazu befähigt ist, an einer immunologischen Reaktion mit einer Verbindung von biologischem Interesse teilzunehmen.

7. Reagens nach Anspruch 6, in dem die immunologisch reaktive Spezies ein Arzneimittel, Hormon, Antibiotikum, Antikörper oder eine andere Verbindung mit antigenen Eigenschaften ist.

8. Analytisches Element mit einem absorbierenden Trägermaterial mit einer oder mehreren Zonen, das in einer oder mehreren der Zonen ein immunoreaktives Reagens nach Anspruch 6 oder 7 enthält.

9. Verfahren zur Bestimmung einer Verbindung von biologischem Interesse in einer wäßrigen Flüssigkeit, bei dem man:

A. die Flüssigkeit mit einem immunoreaktiven Reagens nach Anspruch 6 oder 7 in Kontakt bringt, derart, daß sich ein unlösliches Reaktionsprodukt aus der biologischen Verbindung und der immunoreaktiven Spezies bildet, und

B. bei dem man die Menge des Tracers entweder im Reaktionsprodukt oder in nicht umgesetzten Materialien bestimmt.

10. Verfahren nach Anspruch 9, bei dem das Reaktionsprodukt von dem nicht umgesetzten Material vor der Bestimmungsstufe abgetrennt wird.

11. Verfahren nach Anspruch 9 oder 10 zur Bestimmung von hCG in einer biologischen Probe, wobei die immunoreaktive Spezies ein Antikörper für hCG ist.

12. Verfahren nach entweder Anspruch 9 oder 10 für die Bestimmung von Antikörpern bezüglich HTLV oder HIV in einer biologischen Probe, in der die immunoreaktive Spezies ein HTLV- bzw. HIV-Antigen ist.

13. Verfahren nach einem der Ansprüche 10 - 12, bei dem vor, gleichzeitig mit oder nach der Kontaktierungsstufe A die biologische Verbindung mit einer zweiten immunoreaktiven Spezies in Kontakt gebracht wird, die dazu befähigt ist, an einer spezifischen Bindungsreaktion mit der Verbindung teilzunehmen, die jedoch nicht mit der immunoreaktiven Spezies des Reagens reaktiv ist.

14. Verfahren nach einem der Ansprüche 10 - 12, bei dem man vor, gleichzeitig mit oder nach der Kontaktierungsstufe A die biologische Verbindung mit einer zweiten immunoreaktiven Spezies in Kontakt bringt, die dazu befähigt ist, in einer spezifischen Bindungsreaktion mit sowohl der Verbindung als auch der immunoreaktiven Spezies teilzunehmen, jedoch an unterschiedlichen epitopen Stellen, und bei dem die immunoreaktive Spezies eine größere Reaktivität mit der zweiten Spezies aufweist als mit der biologischen Verbindung.

15. Agglutinationsmethode zur Bestimmung von Streptokokkus A Antigen in einer wäßrigen Flüssigkeit, bei der man:

A. eine Extraktionslösung von Streptokokkus A Organismus mit einem immunoreaktiven Reagens nach Anspruch 6 in Kontakt bringt, in dem sich das zweite Polymer von einem oder mehreren ethylenisch ungesättigten polymerisierbaren Monomeren ableitet, wobei mindestens eines der Monomeren reaktive Gruppen aufweist, die sich ableiten von aktiven Halogenatomen oder Carboxyl-, Epoxy-, Isocyanat-, Amin-, Aziridin-, 2-substituierten Ethylcarbonyl-, Aldehyd- oder aktivierten 2-substituierten Ethylsulfonyl- oder Vinylsulfonylgruppen,

wobei das Teilchen kovalent durch die reaktiven Gruppen an die äußere Oberfläche eines Antikörpers für Streptokokkus A Antigen gebunden ist,

derart, daß ein Agglutinat des Reaktionsproduktes des Antigens und des Antikörpers erzeugt wird, und bei der man

B. die Menge an Tracer bestimmt, die entweder in dem Agglutinat oder in nicht agglutinierten Materialien vorliegt.

16. Agglutinationsmethode zur Bestimmung von Streptokokkus A in einer biologischen Probe, bei der man:

(a) Streptokokkus A Antigen von der Probe mit einer Extraktionszusammensetzung extrahiert, bei der man

(b) das extrahierte Antigen mit einem Reagens kontaktiert, das in Wasser unlösliche Polymerlatexteilchen mit einem Kern und einer Hülle aufweist mit Tracermolekülen, die in den Teilchen verteilt sind, wobei praktisch sämtliche der Tracermoleküle in dem Teilchenkern enthalten sind, und mit Antikörpern, die mit dem Antigen reaktiv sind, das kovalent an die Oberfläche gebunden ist, derart, daß ein Agglutinat aus einem Reaktionsprodukt des Antigens und der Antikörper erzeugt wird, wobei das Kontaktieren in einer wäßrigen Mischung in Gegenwart einer mikroporösen, in Wasser unlöslichen Membran durchgeführt wird, die eine mittlere Porengröße aufweist, die um mindestens fünfmal größer ist als der mittlere Durchmesser der in Wasser unlöslichen Teilchen, bei der man

(c) das nicht agglutinierte restliche Material durch die Membran auswäscht, wobei das Agglutinat auf der Membran hinterbleibt, und wobei das Waschen mit einer Waschlösung mit einem pH-Wert von etwa 6 bis etwa 9 sowie einer Ionenstärke von etwa 0,25 bis etwa 3 erfolgt, und bei der man

(d) die Menge an Tracer in dem Agglutinat bestimmt, das auf der Membran zurückgeblieben ist.