DE3588216T2

DE3588216T2 - Methode ein enzymatisch aktives Polypeptidanalog des menschlichen Cu/Zn SOD herzustellen

Info

Publication number: DE3588216T2
Application number: DE3588216T
Authority: DE
Inventors: Daniel Bartfeld; Jacob R. Hartman; Dov Kanner
Original assignee: Savient Pharmaceuticals Inc
Current assignee: Savient Pharmaceuticals Inc
Priority date: 1984-08-27
Filing date: 1985-08-26
Publication date: 2000-02-03
Anticipated expiration: 2005-08-27
Also published as: DE3588216D1; IL108976A0; JP2688180B2; HUT40697A; DK384185D0; JP2933280B2; EP0483113A2; AU4667785A; CA1340597C; EP0173280A1; IL108976A; PT81025A; IL76192A; EP0173280B1; IE61141B1; JPH07236490A; MY130321A; EP0483113A3; HU214977B; ATE184916T1

Description

Hintergrund der Erfindung

Ein Aspekt der DNA-Rekombinationstechnik umfaßt die Insertion von fremden, von eukaryotischen Quellen stammenden DNA-Sequenzen in Escherichia coli oder andere Mikroorganismen. Ein weiterer Aspekt der DNA-Rekombinationstechnik betrifft die Induktion des erhaltenen Mikroorganismus zur Produktion von durch die fremde DNA codierten Polypeptiden. Die Produktion von Polypeptiden kann als ein Zwei-Schritte- Verfahren angesehen werden, wobei jeder Schritt zahlreiche Teilschritte umfaßt. Die zwei Schritte sind Transkription und Translation. Zur Produktion eines Polypeptids in wirksamer Weise und in einer Menge müssen beide Schritte des Verfahrens wirksam sein. Die Transkription ist die Produktion einer mRNA von dem Gen (DNA). Die Translation ist die Produktion eines Polypeptids von der mRNA.
Ein entscheidender Teilschritt des Transkriptions- Verfahrens ist die Initiation, d. h. die Bindung von RNA- Polymerase an eine Promotor-Operator-Region. Die Sequenz der Desoxyribonucleotid-Basen, die die Promotor-Region bilden, kann variieren und somit die relative Wirksamkeit des Promotors beeinflussen. Die Wirksamkeit hängt von der Affinität der RNA-Polymerase zu dem Promotor ab.
Die Wirksamkeit der Translation wird durch die Stabilität der mRNA beeinflußt. Eine verbesserte Stabilität der mRNA erlaubt eine verbesserte Translation. Obwohl die genauen Faktoren für die mRNA-Stabilität nicht exakt bekannt sind, weiß man, daß die Sekundärstruktur der mRNA, die durch die Sequenz ihrer Basen bestimmt ist, eine Rolle für die Stabilität spielt.
Der initiale Teilschritt der Translation umfaßt die Bindung des Ribosoms an eine Basensequenz in der mRNA, die als Shine-Dalgarno-Sequenz oder als die ribosomale Bindungsstelle (RBS) bekannt ist. Die Synthese von Polypeptiden beginnt, wenn sich das Ribosom entlang der mRNA auf das AUG- Startcodon für die Translation hinbewegt. Im allgemeinen werden diese Codons etwa 10 Basen "downstream" von der Shine-Dalgarno-Stelle gefunden. Faktoren, die die Wirksamkeit der Translation verstärken, umfassen jene, die die Bindung der Ribosomen an die Shine-Dalgarno-Stelle erhöhen. Es wurde gezeigt, daß die Struktur der mRNA in der Region der Shine-Dalgarno-Sequenz und des AUG-Codons sowie die Entfernung zwischen der Shine-Dalgarno-Sequenz und dem AUG-Codon jeweils eine entscheidende Rolle in der Bestimmung der Translations-Wirksamkeit spielen. Weitere Faktoren, die die Wirksamkeit der Translation beeinflussen, sind vorzeitige Termination und Attenuation. Die Wirksamkeit der Translation kann verbessert werden, indem die Attenuationsstellen entfernt werden.
Eine Schwierigkeit, die in Versuchen auftritt, große Mengen von eukaryotischen Polypeptiden in Bakterienzellen herzustellen, umfaßt die Unfähigkeit von große Mengen von mRNA produzierenden Zellen, wirksam zu wachsen. Diese Schwierigkeit kann vermieden werden, indem die Transkription durch ein als Repression bekanntes Verfahren verhindert wird. Bei Repression werden Gene durch die Wirkung eines Proteininhibitors (Repressorprotein) abgeschalten, der die Transkription durch Bindung an die Operator-Region verhindert. Nach Kultivierung der Mikroorganismen zu gewünschten Zelldichten werden die reprimierten Gene durch Zerstörung des Repressors oder durch Zugabe von als Induktoren bekannten Molekülen, die die Wirkung des Repressors überwinden, aktiviert. Zahlreiche Berichte finden sich in der Literatur, die die Klonierung von eukaryotischen Genen in Plasmiden betreffen, welche den PL-Promotor des Bakteriophagen λ tragen (vgl. Bernard, H. V. et al., Gene (1979) 5, 59; Derom, C. et al., Gene (1982) 17, 45; Gheysen, D. et al., Gene (1982) 17, 55; Hedgpeth, J. et al., Mol. Gen. Genet. (1978) 163, 197; Remaut, E. et al., Gene (1981) 15, 81 und Derynck R. et al., Nature (1980) 287, 193). Zusätzlich beschreibt die europäische Patentanmeldung Nr. 041 767, veröffentlicht am 16. Dezember 1981, Expressionsvektoren, die den PL-Promotor des Bakteriophagen λ enthalten. Keine dieser Literaturstellen beschreibt jedoch die Verwendung der CII- Ribosomenbindungsstelle.
Die Verwendung eines Vektors, der den PL-Promotor des Bakteriophagen λ und die CII-Ribosomenbindungsstelle enthält, wurde beschrieben (vgl. Oppenheim, A. B. et al., J. Mol. Biol. (1982) 158, 327 und Shimatake, H. und Rosenberg, M., Nature (1981) 292, 128). Diese Veröffentlichungen beschreiben die Produktion erhöhter Mengen des CII-Proteins, sie umfassen jedoch nicht noch beschreiben sie die Produktion von eukaryotischen Proteinen.
Weitere Vektoren, die den PL-Fromotor und die CII- Ribosomenbindungsstelle enthalten, wurden ebenfalls beschrieben (vgl. Courtney, M. et al., PNAS (1984) 81, 669- 673; Lautenberger, J. A. et al., Gene (1983) 23, 75-84 und Lautenberger, J. A. et al., Science (1983) 221, 858-860). Alle diese Vektoren führen jedoch zu der Produktion von Fusionsproteinen, die den aminoterminalen Teil des CII- Proteins enthalten.
1982 zeigten Shatzman und Rosenberg ein Poster bei dem 14. Wintersymposium in Miami (vgl. Shatzman, A. R, und Rosen berg, M., 14 Miami Winter Symposium, Abstrakt S. 98 [1982]). Dieser Abstrakt liefert eine nicht-ausreichende Offenbarung der Verwendung eines Vektors, der PL des Bakteriophagen λ, Nut und die CII-Ribosomenbindungsstelle enthält, wodurch ein "eukaryotisches" Polypeptid (SV4O small T Antigen ist tatsächlich kein eukaryotisches Polypeptid, sondern ein virales Protein) in einer Menge größer als 5% des Zellproteins in einem nicht-genannten bakteriellen Wirt synthetisiert worden ist. Der verwendete Operator wird nicht definiert. Es wird weder ein Replikationsursprung noch ein Gen für einen selektierbaren Phänotyp identifiziert. Dieses den Vektor verwendende System wird so beschrieben, daß es bestimmte lysogene Wirte umfaßt, in die der Vektor stabil transformiert werden kann.
Die Anmelder wissen von der Existenz einer anhängigen US- Patentanmeldung im Namen von M. Rosenberg, die unter der Seriennummer 457 352 durch National Institutes of Health, Dept. of Health and Human Services, U.S.A. angemeldet worden ist. Teile dieser Anmeldung wurden von dem National Technical Information Service, U.S. Dept. of Commerce erhalten. Die Ansprüche sind jedoch nicht erhältlich und werden unter Verschluß gehalten. Die erhältlichen Teile der Anmeldung sind überprüft worden. Ihre Offenbarung ist nicht ausreichend. Es wird darauf hingewiesen, daß der Wirt wichtig ist (Seite 8, Zeile 17), ein geeigneter Wirt wird jedoch nicht genannt. Ferner wird die Verwendung einer λ-Mutante als wichtig bezeichnet, diese wird jedoch nicht genannt (Seite 4, Zeile 20). Es wird darauf hingewiesen, daß der Wirt Lysogene enthält (Seite 8, Zeile 18), anders als die vorliegende Erfindung, in der der Wirt nicht lysogen ist. Es wird die Klonierung und Expression eines eukaryotischen Gens, des Affen-Metallothionein-Gens erwähnt (Seite 7, Zeile 18), jedoch werden keine Details geliefert. Es wird ausgeführt, daß weder die Sequenz noch die Position eines Nucleotids in der CII-Ribosomenbindungsregion verändert worden ist (Seite 3, Zeile 27).
Die anhängige, mitangeführte U.S.-Patentanmeldung mit der Seriennummer 514 188, angemeldet am 15. Juli 1983, beschreibt neue Vektoren, die sich zur Expression von Polypeptiden in Bakterien eignen. Diese Vektoren umfassen PLOL, eine N-Erkennungsstelle für die Bindung des Antiterminator- N-Proteins, eine ribosomale Bindungsstelle, ein ATG-Codon, eine Restriktionsenzymstelle zur Insertion des das gewünschte Polypeptid codierenden Gens, einen Replikationsursprung und einen Selektionsmarker. In diesen Vektoren ist der Abstand zwischen der N-Erkennungsstelle und der ribosomalen Bindungsstelle größer als etwa 300 Basenpaare. Zusätzlich enthält jeder dieser Vektoren eine spezifische ribosomale Bindungsstelle, die nicht rasch ersetzt werden kann. Diese Vektoren waren nicht gleichermaßen zur Expression von verschiedenen Polypeptiden geeignet.
T&sub1;T&sub2;-rRNA-Transkriptionsterminationssequenzen wurden beschrieben: (vgl. Brosius, J. et al., J. Mol. Biol. (1981) 148, 107). Die Lage von T&sub1;T&sub2;-rRNA-Terminationssequenzen an dem 3'-Ende eines prokaryotischen Gens und die Expression eines solchen Gens unter der Kontrolle eines Promotors wurden beschrieben (vgl. Amann, E. et al., Gene (1983) 25, 167; Zabeau, M. et al., The EMBO Journal (1982) 1, 1217).
Die europäische Patentanmeldung Nr. 81 304 573.9, veröffentlicht am 14. April 1982 unter der europäischen Veröffentlichungsnr. 049 619, beschreibt die Verwendung des thermoinduzierbaren Repressors λ cI857 als stabilisierendes Element. Der Repressor ist auf dem Plasmid kloniert. Ein bezüglich Repressor-Synthese defekter Prophage λ cI90 wird durch Infektion eingeführt. Der Prophage wird durch den klonierten Repressor bei Temperaturen unter 32ºC beibehal ten. Jegliche das Plasmid verlierende Zelle wird lysiert. Wird die Temperatur auf über 38ºC erhöht, wird der Repressor zerstört oder inaktiviert und die Zellen lysieren. Dieses Stabilisierungssystem ist nicht mit den erfindungsgemäßen Vektoren vereinbar, die den λ PL-Promotor enthalten und Polypeptide bei Temperaturen oberhalb von 38ºC exprimieren.
Replikationsursprünge von Plasmiden mit konstitutiv hoher Kopienzahl, sind bekannt. Beispielsweise ist der pOP1Δ6- Replikationsursprung von Co1E1 beschrieben worden (vgl. Gelfand, D. H. et al., PNAS (1978) 75, (12), 5869 und Muesing, M. et al., Cell (1981) 45, 235). Zusätzlich sind Runaway-Replikationsplasmide mit hoher Kopienzahl im Unterschied zu Plasmiden mit konstitutiv hoher Kopienzahl bekannt (vgl. Remant, E. et al., Gene (1983) 22, 103).
Die vorliegende Erfindung betrifft Vektoren, die unerwarteterweise zu einer erhöhten Expression von verschiedenen Polypeptiden führen. Durch Verwendung verschiedener ribosomaler Bindungsstellen in den erfindungsgemäßen Vektoren ist es möglich, erhöhte Expressionsmengen von verschiedenen Polypeptiden in Relation zu jenen Mengen zu erreichen, die mit den früheren Vektoren erzielt wurden. Zusätzlich ist es unter Verwendung der gleichen ribosomalen Bindungsstellen wie in den früheren Vektoren möglich, eine erhöhte Expression der gleichen Polypeptide zu erreichen. Darüber hinaus ist es durch den Einbau von T&sub1;T&sub2;-rRNA-Terminationssequenzen an dem 3'-Ende des Gens, das ein Polypeptid codiert, dessen Expression gewünscht ist, möglich, die Menge des gewünschten Polypeptids im Verhältnis zu dem gesamten, durch einen bakteriellen Wirt produzierten Polypeptid zu erhöhen. In wichtiger Weise erlauben die vorliegenden T&sub1;T&sub2;-rRNA- Transkriptionsterminationssequenzen Replikationsursprüngen, die von Plasmiden mit konstitutiv hoher Kopienzahl stammen, in einen Expressionsvektor eingebaut zu werden, ohne daß die Fähigkeit der Replikation mit konstitutiv hoher Kopienzahl verlorengeht.
Ein Replikationsursprung, der von pBR322 oder von Plasmiden mit nicht-konstitutiv hoher Kopienzahl außer Runaway- Plasmiden mit hoher Kopienzahl stammt, ist nach Insertion in einen Vektor nur zur Produktion einer bestimmten Kopienzahl pro Zelle, typischerweise weniger als 40 Kopien pro Zellen, in der Lage. Durch Einbau eines Replikationsursprungs von einem Plasmid mit konstitutiv hoher Kopienzahl hat es sich unerwarteterweise gezeigt, daß die Menge der Polypeptid-Expression erhöht wird.
Die bevorzugten erfindungsgemäßen Vektoren werden in dem bakteriellen Wirt stabilisiert und wenn Plasmide enthaltende Bakterien, die die Vektoren und die Polypeptide codierenden Gene enthalten, kultiviert werden, werden die Plasmide nicht verloren. Auf diesem Wege wird der durch eine Plasmid-Instabilität hervorgerufene Ausbeuteverlust überwunden. Darüber hinaus wird durch die Verwendung solcher bevorzugter Vektoren die Verwendung einer Antibiotikumresistenz als Selektionsmarker vermieden, wodurch niedrigere Kosten zur Produktion von Polypeptiden erreicht werden.
Superoxid-Dismutase (SOD) und Analoga davon sind einige von mehreren Polypeptiden, die durch Verwendung der neuen Expressionsvektoren der vorliegenden Erfindung hergestellt werden können.
Die vorliegende Erfindung betrifft im einzelnen Expressionsplasmide, die unerwarteterweise zu einer erhöhten Expression von Superoxid-Dismutase und Analoga davon führen, indem die gleichen ribosomalen Bindungsstellen wie in den früheren Vektoren verwendet und auch andere in der vorliegenden Erfindung beschriebene ribosomale Bindungsstellen eingesetzt werden.
Die vorliegende Erfindung betrifft auch ein Verfahren für erhöhte Produktion von SOD und Analoga davon in Bakterien unter Verwendung dieser Plasmide.
Superoxid-Dismutase (SOD) und das Phänomen von freien Sauerstoffradikalen (O&sub2;&supmin;) wurde 1968 von McCord und Fridovich entdeckt (vgl. McCord, J. M. und Fridovich, I., J. Biol. Chem. (1969) 244, 6049-6055). Superoxid-Radikale und andere hoch reaktive Sauerstoffverbindungen werden in jeder atmenden Zelle als Nebenprodukte des oxidativen Stoffwechsels gebildet und es ist gezeigt worden, daß sie große Schäden an einer Vielzahl von Makromolekülen und zellulären Komponenten verursachen (vgl. Fridovich, I., in Advances in Inorganic Biochemistry, herausgegeben von Eichhorn, G. L. und Marzilli, L. G. (Elsevier/North Holland, New York) (1970) 67-90 und Freeman, B. A. und Crapo, J. D., Laboratory Investigation (1982), 47, 412-426). Eine Gruppe von als Superoxid-Dismutasen bekannten Metallproteinen katalysieren die Oxidations-Reduktions-Reaktion 2 O&sub2;&supmin; + 2 H&spplus; → H&sub2;O&sub2; + O&sub2; und stellen somit einen Verteidigungsmechanismus gegenüber der Sauerstofftoxizität bereit. Es gibt drei bekannte Formen von SODs, die verschiedene Metalle in den Proteinmolekülen enthalten, nämlich Eisen, Mangan oder Kupfer und Zink. Alle von ihnen katalysieren die gleiche Reaktion mit äußerster Wirksamkeit und alle arbeiten über einen ähnlichen Mechanismus, in dem das Metall der katalytische Faktor an der aktiven Stelle ist. Diese Enzyme gehören verschiedenen Evolutionsgruppen an.
Die Mn- und Fe-SODs werden in erster Linie in prokaryotischen Zellen gefunden, während CuZn-SOD tatsächlich in allen eukaryotischen Organismen vorliegt (vgl. Steinman, H. M. in Superoxide Dismutase, herausgegeben von Oberley, L. W. (CRC Press, Florida) (1982), 11-68).
Humanes Cu/Zn-SOD-1 ist ein dimeres Metallprotein, das aus identischen, nicht-kovalent verbundenen Untereinheiten besteht, wobei jede ein Molekulargewicht von 16000 Dalton aufweist und ein Kupfer- und ein Zinkatom enthält (vgl. Hartz, J. W. und Deutsch, H. F., J. Biol. Chem. (1972) 247, 7043-7050). Jede Untereinheit besteht aus 153 Aminosäuren, deren Sequenz aufgeklärt worden ist (vgl. Jabusch, J. R., Farb, D. L., Kerschensteiner, D. A. und Deutsch, H. F., Biochemistry (1980) 19, 2310-2316 und Barra, D., Martini, F., Bannister, J. V., Schinina, M. W., Rotilio, W. H., Bannister, W. H. und Bossa, F., FEBS Letters (1980), 120, 53-56). Darüber hinaus wurde kürzlich ein die gesamte Codierungsregion von humanem SOD-1 enthaltender cDNA-Klon isoliert und sequenziert (vgl. Lieman-Hurwitz, J., Dafni, N., Lavie, V. und Groner, Y., Proc. Natl. Acad. Sci, USA (1982) 79, 2808- 2811 und Sherman, L., Dafni, N., Leiman-Hurwitz, J. und Groner, Y., Proc. Natl. Acad. Sci. USA (1983) 80, 5465- 5469). EP-A-138111 beschreibt die Klonierung und Expression von Superoxid-Dismutase in Mikroorganismen.
Das produzierte humane Cu-Zn-SOD-Analogon unterscheidet sich von natürlichem humanem Cu-Zn-SOD darin, daß das aminoterminale Alanin nicht acetyliert ist. Das natürliche humane SOD ist an dem aminoterminalen Alanin acetyliert (vgl. Hartz, J. W. und Deutsch, R. F., J. Biol. Chem. (1972) 247, 7043-7050; Jabusch, J. R. et al., Biochemistry (1980) 19, 2310-2316; Barra et al., FEBS Letters (1980) 120, 53 und Oberly, L. W., Superoxide Dismutase, Bd. 1, CRC Press, Florida (1982) 32-33). Das natürliche humane SOD ist wahrscheinlich wie Rinder-SOD glykosyliert (vgl. Huber, W., US- Patent Nr. 3 579 495, erteilt am 18. Mai 1971). Bakteriell produziertes humanes SOD ist mit ziemlicher Sicherheit nicht glykosyliert, da Escherichia coli Proteine, die es produziert, nicht glykosyliert. Die Aminosäuresequenz des bakteriell produzierten SOD-Analogons ist identisch mit jener des reifen humanen SODs und weist an seinem N-Terminus keinen Methioninrest auf.
Die vorliegende Erfindung stellt ein Verfahren zur bakteriellen Produktion und Reinigung eines enzymatisch aktiven Analogons von humaner Cu/Zn-SOD bereit.
Superoxid-Dismutase ist wegen ihrer pharmakologischen Eigenschaften von besonderem Interesse. Es wurde gefunden, daß natürlich vorkommende, von Rindern stammende Superoxid- Dismutase (Orgotein) entzündungshemmende Eigenschaften hat und sie wird daher laufend in bestimmten europäischen Ländern, z. B. Westdeutschland, zur Anwendung in der Behandlung einer Entzündung verkauft. Sie wird auch in einer Anzahl von Ländern, einschließlich den USA, als Veterinärprodukt zur Behandlung von Entzündungen, insbesondere zur Behandlung von entzündeten Sehnen in Pferden, verkauft.
Zusätzlich läßt die wissenschaftliche Literatur vermuten, daß sich SOD auch für einen großen Bereich klinischer Anwendungen eignen könnte. Diese umfassen die Verhinderung von Tumorbildung und Tumorpromotion wie auch die Verminderung cytotoxischer und cardiotoxischer Effekte von Anti- Krebsmitteln (vgl. Oberley, L. W. und Buettner, G. R., Cancer Research (1979) 39, 1141-1149; Protection of Ischemic Tissues (McCord, J. M. und Roy, R. S., Can. J. Physiol. Pharma. (1982) 60, 1346-1352) and Protection of Spermatozoa (Alvarez, J. G. und Storey, B. T., Biol. Reprod. (1983) 28, 1129-1136). Zusätzlich gibt es ein großes Interesse, die Wirkung von SOD auf den Alterungsprozeß zu untersuchen (vgl. Talmasoff, J. M., Ono, T. und Cutler, R. G., Proc. Natl. Acad. Sci. USA (1980) 77, 2777-2782).
Die vorliegende Erfindung betrifft auch die Verwendung von rekombinanter humaner Superoxid-Dismutase (hSOD) oder Analoga davon, um die Reduktion von Superoxid-Radikalen in Gegenwart von H&spplus; zu Wasserstoffperoxid und molekularem Sauerstoff zu katalysieren. Insbesondere befaßt sich die vorliegende Erfindung mit der Verwendung von hSOD-Analoga zur Verringerung eines Reperfusionsschadens nach einer Ischämie und Verlängerung der Überlebensdauer herausgeschnittener isolierter Organe. Sie befaßt sich auch mit der Verwendung von hSOD oder Analoga davon zur Verringerung eines Reperfusionsschadens nach einer Organtransplantation und einer Rückenmarksischämie.

Zusammenfassung der Erfindung

Diese Erfindung betrifft ein Verfahren zur Herstellung eines enzymatisch aktiven Polypeptidanalogons von Human- Cu/Zn-Superoxid-Dismutase mit einer zu der von natürlich vorkommender Human-Cu/Zn-Superoxid-Dismutase im wesentlichen identischen Aminosäuresequenz und der biologischen Aktivität von natürlich vorkommender Human-Cu/Zn-Superoxid- Dismutase, umfassend:
(a) Wachsenlassen einer Kultur von mit einem Plasmid, das darin eingebaut DNA mit Codierung für das Polypeptidanalogon von Human-Cu/Zn-Superoxid-Dismutase enthält, transformierten Bakterienzellen in einem zinkhaltigen Produktionsmedium, das mit einer nichtwachstumshemmenden Menge von Cu&spplus;&spplus; derart ergänzt ist, daß die Endkonzentration von jeweils Cu&spplus;&spplus; und Zn&spplus;&spplus; im Medium mehr als 2 ppm beträgt, wobei die transformierten Zellen zur Expression der DNA mit Codierung für das Polypeptidanalogon von Human-Cu/Zn- Superoxid-Dismutase fähig sind, und
(b) Gewinnen des so hergestellten, enzymatisch aktiven Polypeptidanalogons von Human-Cu/Zn-Superoxid-Dismutase.
In einer bevorzugten Ausführungsform dieses Verfahrens ist die Bakterienzelle eine Escherichia coli-Zelle, die ein eine DNA-Sequenz mit Codierung für ein Analogon von Human- Superoxid-Dismutase enthaltendes Plasmid enthält.
Die Erfindung betrifft ferner ein Verfahren, wie in Anspruch 14 beansprucht, zur Gewinnung gereinigter, enzymatisch aktiver eukaryotischer Superoxid-Dismutase oder eines Analogons davon, die in der Bakterienzelle gemäß dem erfindungsgemäßen Verfahren hergestellt wurden. Die Gewinnungsstufe umfaßt hierbei das Isolieren der Bakterienzelle aus dem Wachstumsmedium und das Suspendieren der Bakterienzelle in einer geeigneten Lösung eines pH-Werts von etwa 7,0 bis etwa 8,0. Die Zellwand der suspendierten Bakterienzelle wird aufgeschlossen und die erhaltene homogene Lösung wird dann unter geeigneten Bedingungen beschallt. Die beschallte Lösung wird unter geeigneten Bedingungen zentrifugiert und der Überstand wird entfernt und etwa 2 h lang auf etwa 65 ºC erhitzt. Der Überstand wird dann abgekühlt und unter geeigneten Bedingungen zentrifugiert, wobei eine klare Protein-Überstandslösung erhalten wird. Der erhaltene Überstand wird auf ein geeignetes Volumen eingeengt und einer Ionenaustauschchromatographie auf einem geeigneten, bei einem pH-Wert von etwa 7,0 bis etwa 8,0 equilibrierten Anionenaustauscher unterworfen. Die erhaltene Lösung, die die Superoxid-Dismutase oder ein Analogon enthält, wird gesammelt, auf ein entsprechendes Volumen eingeengt und gegen eine gepufferte Lösung mit einem pH-Wert von etwa 7,0 bis etwa 8,0 dialysiert. Diese konzentrierte gepufferte Lösung wird einer Ionenaustauschchromatographie auf einem geeigneten, bei einem pH-Wert von etwa 7,0 bis etwa 8,0 equilibrierten Anionenaustauscher unterworfen und der Anionenaus tausch-Proteinkomplex wird einem geeigneten Salzgradienten unterworfen. Fraktionen, die die Superoxid-Dismutase oder ein Analogon enthalten, werden gesammelt, eingeengt und gegen destilliertes Wasser dialysiert. Der pH-Wert der interessierenden Lösung wird auf einen pH-Wert von etwa 4,0 bis etwa 5,0 mit einem geeigneten Puffer eingestellt. Die gepufferte Lösung wird dann einer Ionenaustauschchromatographie mit einem geeigneten, bei einem pH-Wert von etwa 4,0 bis etwa 5,0 equilibrierten Kationenaustauscher unterworfen. Der Protein-Kationenaustauscherkomplex wird einem geeigneten Salzgradienten unterworfen und die erhaltenen Fraktionen, die die gereinigte Superoxid-Dismutase oder ein Analogon enthalten, werden gesammelt.

Beschreibung der Figuren

Die Restriktionskarten für die einzelnen, in den Fig. 1- 5 gezeigten Plasmide geben nicht alle auf den einzelnen Plasmiden vorliegenden Restriktionsstellen wieder. In einigen Fällen sind Restriktionsstellen in einer Figur, nicht jedoch in einer anderen gezeigt. In allen Fällen sind jedoch die für ein vollständiges Verständnis der Erfindung notwendigen Restriktionsstellen gezeigt.

Fig. 1: Konstruktion von pSODα2

Der Expressionsvektor pJH200 (ATCC-Nr. 39783) wurde mit NdeI gespalten. Das 550 Basenpaare lange, den λ PL-Promotor und die CII-Ribosomenbindungsstelle aufweisende NdeI- Fragment wurde isoliert und in die singuläre Ndel-Stelle des Plasmids pSOD NH-10 inseriert, das mit NdeI gespalten worden war. (Das Plasmid pSOD NH-10 stammt von einem cDNA- Klon von humanem SOD [vgl. Lieman-Hurwitz, J. et al., PNAS (1982) 79, 2808]). Das erhaltene Plasmid pSOD NH-550 wurde mit AluI gespalten. (Nur die relevante AluI-Stelle ist in der Figur gezeigt). Das große, den λ PL-Promotor und das SOD-Gen enthaltende AluI-Fragment wurde isoliert. BamHI- Linker wurden angefügt und das erhaltene Fragment wurde mit BamHI gespalten. Das BamHI-Spaltungsprodukt wurde in die singuläre BamHI-Stelle von pBRM (ATCC Nr. 37283) inseriert, wodurch pSODα2 (ATCC-Nr. 39786) erhalten wurde.

Fig. 2: Konstruktion von pSODα13 und pSODβ1

Das Plasmid pSODα2 (ATCC-Nr. 39786) wurde partiell mit EcoRI gespalten und die erhaltene lineare DNA-Form aus einem Agarosegel isoliert. Die gereinigte DNA wurde mit DNA- Polymerase I (Klenow) aufgefüllt und religiert. Der erhaltene Klon pSODα13 enthält eine am 5'-Ende der ribosomalen Bindungsstelle gelegene EcoRI-Stelle. Ein den β-Lactamase- Promotor und die ribosomale Bindungsstelle enthaltendes Fragment wurde aus dem Plasmid pBLA11 (ATCC-Nr. 39788), das mit EcoRI und AluI gespalten worden war, isoliert. Das 200 Basenpaare lange Fragment wurde mit dem großen aus pSODα13 isolierten Fragment ligiert, wobei pSODα13 mit NdeI gespalten, mit DNA-Polymerase I (Klenow) aufgefüllt und dann mit EcoRI gespalten worden war. Das erhaltene Plasmid pSODβ1 enthält die ribosomale Bindungsstelle des β- Lactamasegens und den λ PL-Promotor.

Fig. 3: Konstruktion von pSODβ&sub1;T&sub1;&sub1;

Das Plasmid pBR322 (ATCC-Nr. 37017) wurde mit EcoRI und Aval gespalten. Die erhaltene DNA wurde mit DNA-Polymerase I (Klenow) aufgefüllt. Das TetR-Genfragment wurde dann isoliert und mit dem großen, aus dem Plasmid pSODβ1 (Fig. 2) isolierten Fragment ligiert, wobei pSODβ1 zunächst mit PstI und dann partiell mit BamHI gespalten und anschließend mit DNA-Polymerase I (Klenow) aufgefüllt worden war. Das erhaltene Plasmid pSODβ&sub1;T&sub1;&sub1; enthält das TetR-Gen.

Fig. 4: Konstruktion von pSODβ&sub1;TT-1

Das rRNA-T&sub1;T&sub2;-Transkriptionsterminationsfragment wurde aus dem Plasmid pPS1 (ATCC-Nr. 39807) isoliert, das mit HindIII gespalten und mit DNA-Polymerase I (Klenow) aufgefüllt worden war. Das Fragment wurde mit dem Plasmid pSODβ&sub1;T&sub1;&sub1; (Fig. 3) ligiert, das partiell mit BamHI gespalten und mit DNA- Polymerase I (Klenow) aufgefüllt worden war.

Fig. 5: Konstruktion von pSODβ&sub1;-BA2

Ein synthetisches DNA-Fragment mit der Sequenz
5'-AATTCAATAATATTGAAAAAGGAAGAG-3' GTTATTATAACTTTTTCCTTCTCAT
die zu der Sequenz der natürlichen β-Lactamase- Kribosomenbindungsstelle ähnlich ist, wurde phosphoryliert und mit dem großen Fragment aus dem Plasmid pSODα13 (Fig. 2), das mit NdeI und EcoRI gespalten worden war, ligiert.

Detaillierte Beschreibung der vorliegenden Erfindung

Gemäß der vorliegenden Erfindung kann ein ein doppelsträngiges DNA-Molekül umfassender Vektor verwendet werden, der es ermöglicht, erhöhte Grade der Genexpression und Polypeptidproduktion zu erreichen.
Bei der Einführung in eine geeignete bakterielle Wirtszelle, die den thermolabilen Repressor CI enthält, verleiht das Plasmid der Wirtszelle die Fähigkeit, bei Erhöhen der Temperatur der Wirtszelle auf eine Temperatur, bei der der Repressor inaktiviert wird, die Expression eines in das Plasmid inserierten gewünschten Gens und die Produktion eines durch das Gen codierten Polypeptids zu bewirken.
Der Vektor umfaßt in der Reihenfolge von 5' nach 3' folgendes:
eine DNA-Sequenz, die den Promotor und Operator PLOL aus dem Bakteriophagen λ enthält;
die N-Erkennungsstelle zur Bindung von Antiterminator-N- Protein;
eine erste Restriktionsenzymschnittstelle, die das Ersetzen der die Ribosomenbindungsstelle enthaltenden DNA-Sequenz gestattet, die danach folgt;
eine DNA-Sequenz, die eine Ribosomenbindungsstelle zur Befähigung der mRNA des gewünschten Gens zur Bindung an Ribosomen innerhalb der Wirtszelle enthält;
ein ATG-Initiationscodon oder eine DNA-Sequenz, die bei Insertion des gewünschten Gens in den Vektor in ein ATG- Initiationscodon umgewandelt wird; und
eine zweite Restriktionsenzymschnittstelle zur Insertion des gewünschten Gens in den Vektor in Phase mit dem ATG- Initiationscodon.
Der Vektor umfaßt auch eine DNA-Sequenz mit einem Replikationsursprung aus einem bakteriellen Plasmid mit der Fähigkeit zur autonomen Replikation in der Wirtszelle und einem Selektionsmittel, ausgewählt aus der Gruppe von DNA- Sequenzen, die ein Gen mit assoziierter selektierbarer oder identifizierbarer phänotypischer und sich bei Anwesenheit des Vektors in der Wirtszelle manifestierender Eigenschaft enthalten, und von DNA-Sequenzen, die das Fragment mit der Bezeichnung cI&sup4;³&sup4; mit dem Gen für das cI&sup4;³&sup4;-Repressorprotein und seine assoziierte Promotor- und Operatorsequenz enthalten. CI&sup4;³&sup4; reprimiert ein cI&sup4;³&sup4;-Lysogen; der Verlust des Plasmids führt zu einer Zell-Lyse. Der Abstand zwischen dem 3'-Ende der PLOL-Promotor- und -Operatorsequenz und dem 5'-Ende der N-Erkennungsstelle beträgt weniger als etwa 80 Basenpaare und der Abstand zwischen dem 3'-Ende der N-Erkennungsstelle und dem 5'-Ende der ribosomalen Bindungsstelle beträgt weniger als etwa 300 Basenpaare.
Eine optionale, zusätzliche Komponente des Vektors ist eine auf der 3'-Seite der zweiten Restriktionsenzymstelle gelegene T&sub1;T&sub2;-rRNA-Transkriptionsterminationssequenz. Zweckmäßigerweise ist die T&sub1;T&sub2;-rRNA-Transkriptionsterminationssequenz weniger als etwa 100 Basenpaare von dem 3'-Ende der zweiten Restriktionsenzymstelle entfernt. Mehr bevorzugt ist die T&sub1;T&sub2;-rRNA-Transkriptions-Terminationssequenz weniger als etwa 20 Basenpaare von dem 3'-Ende der zweiten Restriktionsenzymstelle entfernt.
Der Vektor umfaßt entweder eine DNA-Sequenz, die ein Gen mit assoziierter selektierbarer oder identifizierbarer phänotypischer und sich bei Anwesenheit des Vektors in der Wirtszelle manifestierender Eigenschaft enthält, oder eine DNA-Sequenz, die das ein λ imm434cI&supmin;-Lysogen reprimierende CI&sup4;³&sup4;-Repressorgen enthält, oder beide.
Geeignete mit einer selektierbaren oder identifizierbaren phänotypischen Eigenschaft assoziierte Gene umfassen jene mit Temperatursensitivität oder Arzneimittelresistenz, z. B. Ampicillin-, Chloramphenicol- oder Tetracyclin-Resistenz, assoziierte. Liegt das cI&sup4;³&sup4;-Repressorgen innerhalb eines Wirtes vor, wird der Wirt von einer λimm434cI&supmin;- Prophageninduktion abgehalten. Somit besteht kein Bedarf, teure Antibiotikaselektionssalzlösungen zu verwenden, wenn cI&sup4;³&sup4; vorliegt.
Vorzugsweise umfaßt der Vektor sowohl eine DNA-Sequenz, die ein mit einer selektierbaren oder identifizierbaren phänotypischen Eigenschaft assoziiertes Gen enthält, als auch eine DNA-Sequenz, die ein mit cI&sup4;³&sup4; bezeichnetes Fragment enthält.
Wünschenswerterweise ist das cI&sup4;³&sup4;-Gen, wenn es vom Vektor umfaßt wird, nach dem 3'-Ende der T&sub1;T&sub2;-rRNA-Sequenz lokalisiert.
Der Vektor umfaßt auch einen Replikationsursprung aus einem bakteriellen Plasmid mit der Fähigkeit zur autonomen Replikation in der Wirtszelle. Geeignete Replikationsursprünge können aus einer Zahl von Quellen, z. B. aus pBR322 oder pR1, erhalten werden.
Üblicherweise hat der Vektor einen Replikationsursprung aus einem bakteriellen Plasmid mit konstitutiv hoher Kopienzahl mit der Fähigkeit zur autonomen Replikation in der Wirtszelle von mindestens 400 konstitutiven Vektorkopien. Zweckmäßigerweise ist dieser Replikationsursprung aus ColE1. Vorzugsweise ist der Ursprung aus dem Plasmid pOP1Δ6.
Eine weitere Komponente des Vektors ist eine erste Restriktionsenzymstelle, die den Ersatz der DNA-Sequenz, welche die nachfolgende ribosomale Bindungsstelle enthält, erlaubt. Zahlreiche solche Restriktionsenzymstellen können verwendet werden. Geeignete Stellen umfassen EcoRI.
Eine weitere Komponente des Vektors ist eine zweite Re striktionsenzymstelle zur Insertion des gewünschten Gens in das Plasmid in Phase mit dem ATG-Initiationscodon. Zahlreiche solche Stellen können verwendet werden Geeignete Stellen umfassen NdeI, ClaI, HindIII, SmaI, BglII, XbaI, SacI und AluI.
Im allgemeinen ist es wünschenswert, daß die zweite Restriktionsenzymstelle auch als zweite Restriktionsenzymstelle fungiert, die zum Austausch der die ribosomale Bindungsstelle enthaltenden DNA-Sequenz notwendig ist. Wird die zweite Restriktionsenzymstelle nicht auch für diesen Zweck verwendet, muß der erfindungsgemäße Vektor auch eine dritte Restriktionsenyzmstelle nach der ribosomalen Bindungsstelle, jedoch vor der zweiten Restriktionsstelle, enthalten.
Vorzugsweise enthält der Vektor zwei singuläre Restriktionsenzymstellen. Die erste Stelle erlaubt den Austausch der die ribosomale Bindungsstelle enthaltenden DNA-Sequenz. Die zweite Stelle erlaubt die Insertion des gewünschten Gens in das Plasmid in Phase mit dem ATG-Initiationscodon. Der hier verwendete Ausdruck "singuläre Restriktionsenzymstelle" bedeutet eine Restriktionsenzymstelle, die nur einmal in dem Plasmid vorliegt. In einer derzeit bevorzugten Ausführungsform ist EcoRI die erste Restriktionsenzymstelle und NdeI die zweite Restriktionsenzymstelle.
Vorzugsweise ist der Vektor ein kovalent-geschlossenes, zirkuläres doppelsträngiges Molekül. Es ist jedoch nicht wesentlich, daß das Plasmid kovalent geschlossen ist.
Das Plasmid erreicht seine erhöhte Expression, nachdem die Wirtszelle auf eine Temperatur erwärmt ist, bei der das CI -Repressorprotein inaktiviert ist. Eine Temperatur oberhalb von etwa 38ºC ist wirksam für diesen Zweck und da es ge wünscht ist, einen unnötigen Hitzeschaden für die Wirtszellen soweit wie möglich zu vermeiden, ist es im allgemeinen erwünscht, daß die Temperatur nicht mehr als wenige Grad über 42ºC ansteigt.
Eine wichtige Komponente des Vektors ist die ribosomale Bindungsstelle. Geeignete Stellen sind CII aus dem λ- Bakteriophagen mit der Sequenz:
TAAGGAAATACTTACAT ATTCCTTTATGAATGTA;
eine Mutante von CII aus dem λ-Bakteriophagen mit der Sequenz:
TAAGGAAGTACTTACAT ATTCCTTCATGAATGTA;
das Hauptkopfprotein-Gen des λ-Bakteriophagen mit der Sequenz:
TTTTTTTACGGGATTTTTTTATG AAAAAATGCCCTAAAAAAATAC;
die natürliche, von pBR322 stammende β-Lactamase- Ribosomenbindungsstelle;
ein synthetisches Oligonucleotid mit der Sequenz:
AATTCGAGCGCAAGGAAACAGGCTCA GCTCGCGTTCCTTTGTCCGAGTAT;
ein synthetisches Oligonucleotid mit der Sequenz:
AATTCAATAATATTGAAAAAGGAAGAG GTTATTATAACTTTTTCCTTCTCAT,
und
eine natürliche, von Bacillus thurengensis stammende ribosomale Bindungsstelle.
Im Verhältnis zu den früher beschriebenen Vektoren können die erfindungsgemäß verwendbaren Vektoren verwendet werden, eine erhöhte Expression von einer Vielzahl von wünschenswerte Polypeptidprodukte codierenden Genen zu erhalten. Geeignete Gene umfassen jene, die Wachstumshormone, z. B. Rinder-, Schweine-, Hühner- oder Menschen-Wachstumshormone, Superoxid-Dismutase, Apolipoprotein E oder Analoga von einem der vorhergehenden codieren. Mit Analogon ist ein Polypeptid gemeint, das die gleiche Aktivität wie das natürlich vorkommende Polypeptid hat, jedoch ein oder mehrere unterschiedliche Aminosäuren am N-Terminus des Polypeptids hinzugefügt oder deletiert oder beides hat. Beschriebene SOD- Analoga haben jedoch eine Aminosäuresequenz, die mit jener der reifen humanen SOD identisch ist.
Der bevorzugte Wirt zur Verwendung mit den erfindungsgemäß verwendbaren Plasmiden ist Eschericha coli. Die derzeit bevorzugten Stämme sind A1637, A1645, A2602, A2097, A1563 und A1645 (λ i434cI&supmin; mini Tnl0).
A1645 ist derzeit der am meisten bevorzugte Stamm zur Expression von Superoxid-Dismutase oder einem Analogon davon.
A1645 und A1645 (λi434cI&supmin; mini Tnl0) sind derzeit die am meisten bevorzugten Stämme zur Expression von tierischen Wachstumshormon-Genen.
A2097 ist derzeit der am meisten bevorzugte Stamm zur Expression des Gens, das folgendes produziert:
1) ein Analogon von bGH mit der Aminsäuresequenz met-aspgln angefügt an den Aminoterminus der Phenylalanin-Form von authentischem bGH oder
2) ein Analogon von cGH mit der Aminosäure Methionin angefügt an den Aminoterminus der Phenylalanin-Form von natürlichem cGH.
A1637 wurde aus C600 erhalten, indem ein Transposon inseriert wurde, das das Tetracyclin-Resistenzgen innerhalb des Galactose-Operons wie auch das λ-Expressionssystem enthält, das nahe des Galactose-Operons gelegen ist. C600 ist bei der American Type Culture Collection unter der ATCC- Hinterlegungsnr. 23724 erhältlich.
A1645 wurde aus A1637 durch Selektion auf Gal&spplus; (Fähigkeit, Galactose zu verwenden) sowie auf den Verlust der Tetracyclin-Resistenz erhalten. Es enthält nach wie vor das λ- Expressionssystem, jedoch wurden Teile des Transposons durch Selektion entfernt. Sein Phänotyp ist C600 r&supmin; m&spplus; gal&spplus; thr&supmin; leu&supmin; lacZ&supmin; bl (λ cI857ΔH1ΔBamHI N&spplus;). A1645 wurde bei der American Type Culture Collection in Rockville, Maryland, USA mit verschiedenen nachstehend besser beschriebenen Plasmiden hinterlegt.
A1645 (λ i434cI&supmin; mini Tnl0) wurde erhalten, indem der ein Plasmid enthaltende Escherichia coli Stamm A1645 mit imm434 cI3008 mini Tnl0Δ16Δ17 bei 30ºC infiziert wurde. Tetracyclin-resistente Kolonien wurde isoliert und gereinigt. Dieser das Plasmid pHG50 enthaltende Stamm wurde bei der American Type Culture Collection unter der ATCC- Hinterlegungsnr. 39805 hinterlegt.
A2602 und A1563 stammen von SA500. Ihre Phänotypen sind SA500 his&supmin; ile&supmin; gal&spplus; Δ 8 (λ cI857 Δ H1 Δ Bam N&spplus;) bzw. SA500 his&supmin; ile&supmin; gal&spplus; Δ 8 lacZ&supmin; A21 (λ cI857 int2 xisl nutL&sub3; Δ H1). A2097 stammt von A1645. Sein Phänotyp ist A1645 lac Δ χ A21 proC: :Tn10.
Prototrophe Stämme von Escherichia coli, die eine hohe Polypeptid-Expression erlauben, selbst wenn sie in einem Minimalmedium wachsen, können auch als Wirte für die erfindungsgemäß verwendbaren Vektoren verwendet werden. Bevorzugte prototrophe Stämme umfassen A4200 und A4255. Der das Plasmid p9200 enthaltende Stamm A4255 wurde unter der ATCC- Hinterlegungsnr. 53215 hinterlegt. Noch mehr bevorzugt sind Biotin-unabhängige prototrophe Stämme, wie der das Plasmid pHG44 enthaltende Stamm A4346, der unter der ATCC- Hinterlegungsnr. 53218 hinterlegt wurde.
Lytische Stämme von Escherichia coli können auch als Wirte für die erfindungsgemäß verwendbaren Vektoren verwendet werden. Geeignete lytische Stämme umfassen jene, die bei der Temperatur, bei der das Polypeptid produziert wird, jedoch mit geringerer Rate als das Polypeptid produziert wird, eine Substanz, z. B. ein Enzym, wie Endolysin, produzieren, das die Zell-Lyse verursacht. Dies ermöglicht der Zelle relativ große Mengen des gewünschten Polypeptids zu produzieren, bevor die Menge der produzierten, lysierenden Substanz eine Höhe erreicht, die eine Zell-Lyse verursacht. Beispiele geeigneter lytischer Stämme umfassen jene, die das Plasmid PlcIts umfassen, wie der pHG44 enthaltende Stamm A4048, der unter der ATCC-Hinterlegungsnr. 53217 hinterlegt worden ist.
Alle Hinterlegungen wurden gemäß des Budapester Vertrages über die internationale Anerkennung der Hinterlegung von Mikroorganismen gemacht, außer daß pBR322 und pBRM bei der American Type Culture Collection unter den ATCC- Hinterlegungsnummern 37017 bzw. 37283 voll erhältlich sind, und D4 unter der ATCC-Nr. 31826 in Verbindung mit der Anmeldung einer US-Patentanmeldung hinterlegt worden ist.
Der Vektor kann konstruiert werden durch Verfahren, die dem Fachmann bekannt sind, der auf dem Gebiet der vorliegenden Erfindung tätig ist. Solche Verfahren werden im Detail in verschiedenen hier angegebenen Veröffentlichungen beschrieben, deren Inhalt durch den Verweis auf sie in die vorliegende Offenbarung aufgenommen ist, wodurch eine vollständige Information betreffend des Standes der Technik geliefert wird.
Ein derzeit bevorzugter Vektor ist pJH200. Dieser Vektor wurde in den Escherichia coli-Stamm A1645 unter Verwendung eines üblichen Transformationsverfahrens eingeschleust. Das erhaltene Wirt-Vektorsystem wurde unter der ATCC- Hinterlegungsnr. 39783 hinterlegt. Ein Gen, das das gewünschte Polypeptid, z. B. Rinder-Wachstumshormon, codiert, kann in pJH200 inseriert werden.
Ein zweiter bevorzugter Vektor, pRO211, wurde aus einer partiellen NdeI-Spaltung von pJH200 gewonnen. Rinder- Wachstumshormon cDNA wurde in pRO211 inseriert, indem der Vektor mit NdeI und HindIII gespalten, das große Fragment isoliert und mit der aus pAL500 (ATCC-Nr. 39782) erhaltenen bGH-cDNA ligiert wurde. Das erhaltene Plasmid wird mit pRO12 bezeichnet.
Das Plasmid pRO12 wurde zunächst partiell mit PvuII und dann mit NdeI gespalten. Ein synthetisches, für die ersten 24 Aminosäuren des N-Terminus von authentischem bGH codierendes DNA-Fragment wurde mit dem gespaltenen pRO12 li giert. Das erhaltene Plasmid hat die Bezeichnung pSAL 5200- 6.
Die erfindungsgemäß verwendbaren Vektoren können auch konstruiert werden, um Plasmide zu erhalten, die humane Superoxid-Dismutase (SOD) oder Analoga davon produzieren. Ein den λ PL-Promotor und die CII-Ribosomenbindungsstelle enthaltendes Fragment von pJH200 (ATCC-Nr. 39783) wurde isoliert und in ein Plasmid, pSOD NH-10, inseriert, das das Gen für humanes SOD enthält, wodurch ein in Fig. 1 gezeigtes und mit pSOD NH-550 bezeichnetes Plasmid erhalten wurde. Ein den λ PL-Promotor und das SOD-Gen enthaltendes Fragment wurde nach Spaltung mit AluI aus pSOD NH-550 isoliert. Nach Zugabe von BamHI-Linkern und nachfolgender Spaltung mit BamHI wurde das Fragment in die singuläre BamHI-Stelle von pBRM inseriert. pBRM ist ein Plasmid mit hoher Kopienzahl, das unter der ATCC-Nr. 37283 hinterlegt worden ist. Das erhaltene Plasmid wird mit pSODα2 bezeichnet. Seine Restriktionskarte ist in Fig. 1 gezeigt. Dieses Plasmid wurde in dem E. coli-Stamm A2097 unter der ATCC- Hinterlegungsnr. 39786 hinterlegt.
Das Plasmid pSODα2 (ATCC-Hinterlegungsnr. 39786) enthält die CII-Ribosomenbindungsstelle. Diese ribosomale Bindungsstelle wurde durch ein Fragment ersetzt, das nach einer EcoRI-AluI-Spaltung von pBLA11 erhalten wurde und den β- Lactamasepromotor und die Shine-Dalgarno- Ribosomenbindungsstelle enthält. (Das Plasmid pBLA11 hat die in Fig. 2 gezeigte Restriktionskarte und wurde in dem Escherichia coli-Stamm A1645 unter der ATCC-Nr. 39788 hinterlegt). Die CII-Ribosomenbindungsstelle wird aus dem Plasmid pSODα2, wie in Fig. 2 gezeigt, entfernt. pSODα2 wird partiell mit EcoRI gespalten, mit DNA-Polymerase 1 (Klenow) aufgefüllt und religiert, so daß die einzig verbleibende EcoRI-Stelle in dem Plasmid am 5'-Ende der CII- Ribosomenbindungsstelle lokalisiert ist. Das erhaltene, mit pSOD13 bezeichnete Plasmid wurde mit NdeI gespalten, mit DNA-Polymerase I (Klenow) aufgefüllt und dann mit EcoRI gespalten. Das große Fragment wurde isoliert und mit dem Fragment ligiert, das aus pBLA11 erhalten wurde und den β- Lactamasepromotor und die ribosomale Bindungsstelle enthält, wodurch das Plasmid pSODβ1 erhalten wurde.
pSODβ1 kann so modifiziert werden, daß es anstelle eines Ampicillin-Resistenzgenfragments (AmpR) ein Tetracyclin- Resistenzgenfragment (TetR) enthält. Das AmpR-Fragment wurde aus pSODβ1 durch Spaltung mit PstI und anschließender partieller Spaltung mit BamHI entfernt. Das erhaltene Plasmid wurde mit DNA-Polymerase I (Klenow) aufgefüllt. Das TetR- Genfragment wurde getrennt aus einer EcoRI-AvaI-Spaltung von pBR322 isoliert, aufgefüllt und mit dem aufgefüllten Plasmid ligiert. (Das Plasmid pBR322 ist verbreitet erhältlich, z. B. bei der American Type Culture Collection unter der ATCC-Nr. 37017). Das dann erhaltene Plasmid wird mit pSODβ&sub1;T&sub1;&sub1; bezeichnet. Es hat die in Fig. 3 gezeigte Restriktionskarte.
Ein weiteres Plasmid, das zur Produktion von humaner Superoxid-Dismutase verwendet werden kann, wird mit pSODβ&sub1;-BA2 bezeichnet. Seine Konstruktion aus pSODα13 ist in Fig. 5 gezeigt.
Die erfindungsgemäß verwendbaren Vektoren können auch zur Ausbildung von Plasmiden konstruiert werden, die ein Analogon von Human-Cu/Zn-Superoxid-Dismutase (SOD) produzieren, welches sich von natürlichem humanem SOD darin unterscheidet, daß der Aminoterminus nicht acetyliert ist. Ein solches Plasmid wurde gemäß Fig. 4 konstruiert und erhielt die Bezeichnung pSODβ&sub1;TT-1.
Verschiedene Wirt-Vektorsysteme umfassen E. coli A1637, A1645, A2606, A2097 oder A1563, wenn das Plasmid nicht das cI&sup4;³&sup4;-Fragment enthält, und den Stamm A1645 (i434cI&supmin; mini Tn10), wenn das Plasmid das cI&sup4;³&sup4;-Fragment enthält. Erfindungsgemäße Wirt-Vektorsysteme umfassen auch prototrophe E. coli, wie A4200, A4255, und sie umfassen ferner biotinunabhängige Wirt-Vektorsysteme, wie A4346. Erfindungsgemäße lytische Wirt-Vektorsysteme umfassen jene, worin der Wirt A4048, insbesondere A3111 ist.
Die hier beschriebenen Wirt-Vektorsysteme und Plasmide können zur Produktion verschiedener Polypeptide, wie Rinder-, Schweine-, Hühner- und Menschen-Wachstumshormone, humane Superoxid-Dismutase und humanes Apolipoprotein E, verwendet werden. Hierfür wird das Wirt-Vektorsystem unter geeigneten Bedingungen, die die Produktion eines Polypeptids erlauben, kultiviert, und das Polypeptid dann gesammelt.
Geeignete Bedingungen umfassen das Wachstum des Wirt- Vektorsystems während eines geeigneten Zeitraums bei etwa 42ºC. Günstigerweise beträgt die Wachstumszeit bei 42ºC für alle Wirt-Vektorsysteme etwa 1 bis 5 h, außer für jene zur Produktion von humanem Apolipoprotein E. Die Wachstumszeit für Wirt-Vektorsysteme zur Produktion von humanem Apolipoprotein E beträgt günstigerweise etwa 15 min. Geeignete Medien umfassen Caseinhydrolysat.
Mit den vorstehend angegebenen Verfahren wurden eine Anzahl von bGH-, pGH-, cGH-, hGH-, ApoE- und SOD-Analoga hergestellt.
SOD Analoga wurden hergestellt, deren Aminosäuresequenz identisch mit jener von natürlichem SOD ist, außer daß sie Variationen am N-Terminus aufweist. Beispiele umfassen fol gende:
1) natürliches humanes SOD, das nicht acetyliert ist, und
2) natürliches humanes SOD, das nicht acetyliert und nicht glykosyliert ist.
Diese SOD Analoga können verwendet werden, um die Dismutation oder einwertige Reduktion des Superoxidanions in Gegenwart eines Protons zu katalysieren, wodurch ein Wasserstoffperoxid, wie in der folgenden Gleichung
gezeigt, gebildet wird.
Veterinär- und pharmazeutische Mittel können auch hergestellt werden, die wirksame Mengen von SOD oder ein oder mehrere SOD-Analoga und einen geeigneten Träger enthalten. Solche Träger sind dem Fachmann bekannt. Die SOD oder ein Analogon davon kann direkt oder in Form eines Mittels dem Tier oder Menschen verabreicht werden, z. B. zur Behandlung von Entzündungen oder zur Schadensverminderung durch freie Sauerstoffradikale bei Rückperfusion nach umfassender Ischämie oder Organtransplantation, z. B. Nierentransplantation. Die SOD oder ein Analogon davon kann auch direkt oder in Form eines Mittels dem Perfusionsmedium eines isolierten Organs zugegeben werden, z. B. zur Verminderung des Schadens bei einem isolierten Organ durch freie Sauerstoffradikale bei Perfusion nach Exzision, wodurch die Überlebenszeit des Organs, z. B. der Hornhaut, verlängert wird. Zusätzlich kann die SOD oder ein Analogon davon zur Verminderung eines neurologischen Schadens verwendet werden.
Ein Verfahren zur Produktion enzymatisch aktiver, eukaryotischer Superoxid-Dismutase (SOD) oder eines Analogons davon in einer Bakterienzelle wurde gefunden. Die Bakterienzelle enthält eine die Superoxid-Dismutase oder ein Analogon davon codierende DNA-Sequenz und ist in der Lage, diese zu exprimieren. Das Verfahren umfaßt die Kultivierung der Bakterienzelle unter geeigneten Bedingungen und in einem geeigneten Produktionsmedium. Das Produktionsmedium wird mit einer Menge von Cu&spplus;&spplus; derart ergänzt, daß die Konzentration von jeweils Cu&spplus;&spplus; und Zn²&spplus; in dem Medium größer als etwa 2 ppm ist.
Die Bakterienzelle kann ein Bakterium sein, in das eine die eukaryotische Superoxid-Dismutase codierende DNA-Sequenz durch DNA-Rekombinationstechniken eingeführt worden ist. Das Bakterium muß in der Lage sein, die DNA-Sequenz zu exprimieren und das Proteinprodukt zu produzieren. Die geeigneten Bedingungen und das Produktionsmedium variieren gemäß Bakterienart und -stamm.
Die Bakterienzelle kann die die Superoxid-Dismutase oder ein Analogon davon codierende DNA-Sequenz innerhalb eines Vektor-DNA-Moleküls, wie ein Plasmid, enthalten. Der Vektor oder das Plasmid wird durch DNA-Rekombinationstechniken konstruiert, wodurch die die SOD codierende Sequenz an einer geeigneten Stelle des Moleküls eingeführt wird.
Gemäß einer bevorzugten Ausführungsform der Erfindung ist die Bakterienzelle eine Escherichia coli-Zelle. Der bevorzugte Escherichia coli-Stamm ist A1645. Die erfindungsgemäße E. coli-Zelle enthält ein Plasmid, das für die SOD oder ein Analogon davon codiert. In bevorzugter Ausführungsform der vorliegenden Erfindung ist SOD humane Superoxid- Dismutase oder ein Analogon davon.
Die bevorzugten Ausführungsformen der vorliegenden Erfindung betreffen E. coli-Stämme, die die Plasmide pSODβ1, pSODα2, pSODβT&sub1;&sub1;, pSODβ&sub1;-BA2 oder PSODβ&sub1;TT1 enthalten. Verfahren zur Konstruktion dieser Plasmide werden in den Figurenbeschreibungen beschrieben und die Plasmide selbst werden in Beispiel 3 beschrieben. Diese Plasmide können aus erhältlichen Ausgangsmaterialien durch einen auf dem Gebiet tätigen Fachmann konstruiert werden. E. coli-Stämme, die die verschiedenen Plasmide enthalten, welche sich zur Konstruktion von eine eukaryotische Superoxid-Dismutase codierenden Plasmiden eignen, wurden bei der American Type Culture Collection, Rockville, Maryland 20852, gemäß der Vorgaben des Budapester Vertrages über die Internationale Anerkennung der Hinterlegung von Mikroorganismen zum Zweck patentrechtlicher Verfahren hinterlegt. Diese Plasmide und ihre ATCC- Hinterlegungsnr. sind: pBRM ATCC 37283, pSODα2 ATCC 39786, pBR322 ATCC 37017, pBLA11 ATCC 39788, pJH200 ATCC 39783 und pPSI ATCC 39807.
In einer speziellen Ausführungsform der vorliegenden Erfindung wird ein enzymatisch aktives, humanes Superoxid- Dismutase-Analogon durch eine das Plasmid pSODα2 enthaltende Zelle des E. coli-Stamms A2097 produziert. Diese Zelle wurde bei der American Type Culture Collection unter der ATCC-Nr. 39786 hinterlegt.
Das geeignete Produktionsmedium für die Bakterienzellen kann jegliches verträgliche Wachstumsmedium sein, beispielsweise Caseinhydrolysat oder LB (Luria Broth)-Medium. Geeignete Wachstumsbedingungen variieren mit dem E. coli- Stamm und dem Plasmid, das dieser enthält, beispielsweise wird der das Plasmid pSODβ&sub1;T11 enthaltende E. coli-Stamm A1645 bei 42ºC induziert und bei dieser Temperatur etwa 1 bis etwa 5 Stunden gehalten. Die geeigneten Bedingungen hinsichtlich der Temperatur, der Zeit, des Rührens und der Belüftung für das Wachstum des Inokulums und für das Wachstum der Kultur bis zu einer gewünschten Dichte vor der Produktionsphase wie auch für das Halten der Kultur in der Produktionsphase werden in Beispiel 26 beschrieben.
Die zur Produktion von enzymatisch aktivem SOD notwendige Konzentration von Cu&spplus;&spplus;-Ionen in dem Medium variiert mit dem Typ des verwendeten Mediums. In einem Caseinhydrolysat- Medium wurde eine Cu&spplus;&spplus;-Ionenkonzentration von 200 ppm als wirkungsvoll gefunden.
In einem LB-Medium wurde eine Cu&spplus;&spplus;-Konzentration von 75 ppm als wirkungsvoll gefunden. Bevorzugt ist in allen Wachstumsmedien von komplexem Typ die Medium-Konzentration von Cu&spplus;&spplus; von etwa 50 bis etwa 250 ppm.
Die meisten eukaryotischen Superoxid-Dismutasen sind Cu/Zn- Metallproteine. In einer speziellen Ausführungsform der vorliegenden Erfindung wird Zn&spplus;&spplus; als Ergänzung dem Medium zugegeben, so daß die Konzentration von Zn&spplus;&spplus; in dem Medium größer als etwa 2 ppm ist. In einer bevorzugten Ausführungsform der vorliegenden Erfindung werden Cu&spplus;&spplus;- und Zn&spplus;&spplus;- Konzentrationen ergänzt, indem 0,8 g/l CuSO&sub4; · 5H&sub2;O und 10 mg/l ZnSO&sub4; · 7 H&sub2;O zugegeben werden.
Die speziellen Bestandteile der geeigneten Vorrats-, Kultur-, Inokulierungs- und Produktionsmedien können variieren und sind dem Fachmann auf vorliegenden Gebieten bekannt. Spezielle Beispiele geeigneter Medien werden in Beispiel 26 angegeben.
Die vorliegende Erfindung betrifft auch ein Verfahren zur Sammlung von gereinigtem, enzymatisch aktivem eukaryotischem SOD oder einem Analogon davon, das in einer Bakterienzelle gemäß der erfindungsgemäßen Verfahren produziert worden ist.
Die Bakterienzelle wird zunächst aus dem Produktionsmedium isoliert, nachdem die Kultur abgekühlt worden ist. Die Zelle kann durch ein nicht-zerstörerisches Verfahren, wie Zentrifugation oder Filtration, isoliert werden. Die Zelle wird dann in einer geeigneten Lösung mit einem pH von etwa 7,0 bis etwa 8,0 suspendiert. Vorzugsweise wird eine 50 mM Natriumphosphatlösung mit einem pH von etwa 7,8 verwendet. Die Zellwand wird durch geeignete Mittel, wie Mixer oder Zell-Aufschließer, aufgebrochen und die erhaltene homogene Suspension wird unter geeigneten Bedingungen beschallt. Die Beschallung kann mittels einer Durchflußzelle erfolgen. Die erhaltene beschallte Lösung wird dann unter geeigneten Bedingungen zentrifugiert, wodurch die Zelltrümmer von der Protein-Überstandslösung abgetrennt werden.
Der Überstand wird dann etwa 2 Stunden bei etwa 65ºC erhitzt, abgekühlt und unter den gleichen Bedingungen wie in dem vorhergehenden Zentrifugationsschritt zentrifugiert, wodurch eine klare Proteinlösung als Überstand erhalten wird. Der Überstand wird dann auf ein geeignetes Volumen konzentriert, z. B. wird er auf 1 Liter in einer Ultrafiltrations-Vorrichtung unter Verwendung einer Molekulargewichtsgrenze von 10000 konzentriert.
Die konzentrierte Proteinlösung wird dann einer Ionenaustausch-Chromatographie mit einem geeigneten, bei einem pH- Wert von etwa 7,0 bis 8,0 equilibrierten Anionenaustauscher unterzogen. Vorzugsweise wird die Chromatographie an einer DEAE-Sephacel-Säule durchgeführt, die mit einem 150 mM Natrium-phosphatpuffer eines pH-Werts von etwa 7,8 equilibriert worden ist. Die erhaltene, die Superoxid-Dismutase oder ein Analogon davon enthaltende Durchflußlösung wird dann gesammelt, auf ein geeignetes Volumen konzentriert und gegen eine gepufferte Lösung mit einem pH von etwa 7,0 bis etwa 8,0 dialysiert. Dies kann in einer Ultrafiltrations- Vorrichtung gegen eine 20 mM Tris-HCl-Lösung eines pH-Werts von etwa 7,8 erfolgen.
Diese konzentrierte Lösung wird dann einer Ionenaustausch- Chromatographie unterzogen, wobei ein geeigneter bei einem pH von etwa 7,0 bis etwa 8,0 equilibrierter Anionenaustauscher verwendet wird. Eine QAE-Sepharose-Säule, die mit 20 mM Tris-HCl eines pH-Werts von etwa 7,8 equilibriert ist, eignet sich hierfür. Das an den Anionenaustauscher gebundene Protein wird einem geeigneten Salzgradienten, z. B. 0-200 mM NaCl in 20 mM Tris-HCl pH 7,8, unterworfen. Die erhaltenen, das SOD oder ein Analogon davon enthaltenden Fraktionen werden gesammelt, konzentriert, z. B. mit einer Ultrafiltrations-Vorrichtung, gegen destilliertes Wasser dialysiert und dann mit einem geeigneten Puffer auf einen pH von etwa 4,0 bis etwa 5,0 eingestellt. In bevorzugter Ausführungsform wird die Lösung von Interesse auf 100 mM Natriumacetat gebracht, indem 1 M Natriumacetat mit einem pH von etwa 4,8 hinzugegeben wird.
Diese gepufferte Lösung wird erneut einer Ionenaüstausch- Chromatographie unterzogen, wobei jedoch ein Kationenaustauscher verwendet wird. Eine CM-Sepharose-Säule, die mit einem 100 mM Natriumacetatpuffer eines pH-Werts von etwa 4,7 equilibriert worden ist, ist hierfür geeignet. Das an den Kationenaustauscher gebundene Protein wird einem geeigneten Salzgradienten, wie 100 bis 500 mM NaCl in 100 mM Natriumacetat pH 4,7, unterworfen und die erhaltenen, das gereinigte SOD oder ein Analogon davon enthaltenden Fraktionen werden gesammelt.
Die das gereinigte SOD enthaltenden Fraktionen können zur Lagerung z. B. durch Ultrafiltration konzentriert und lyo philisiert werden.

Beispiele

Die folgenden Beispiele werden gebracht, um die vorliegende Erfindung besser verstehen zu können, sie beschränken sie jedoch nicht und können auch nicht diesbezüglich ausgelegt werden. Die Beispiele umfassen keine detaillierten Beschreibungen für übliche Verfahren, die zur Konstruktion von Vektoren, zur Insertion von interessierende Polypeptide codierenden Genen in solche Vektoren oder zur Einführung der erhaltenen Plasmide in bakterielle Wirte verwendet werden. Solche Verfahren sind jenem auf vorliegendem Gebiet tätigen Fachmann bekannt und werden in zahlreichen Veröffentlichungen, einschließlich der folgenden als Beispiel beschrieben:
Maniatis, T., Fritsch, E. F. und Sambrook, J., Molecular Cloning; A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory, New York (1982).
Methods in Enzymology, Bd. 65, "Nucleic Acids (Teil 1)", herausgegeben von Lawrence Grossmann und Kivie Moldave, Academic Press, New York (1980).
Methods in Enzymology, Bd. 68, "Recombinant DNA," herausgegeben von Ray Wu, Academic Press, New York (1981).
Methods in Enzymology, Bd. 100, "Recombinant DNA (Teil B)", herausgegeben von Ray Wu, Lawrence Grossmann und Kivie Moldave, Academic Press, New York (1983).
Methods in Enzymology, Bd. 101, "Recombinant DNA (Teil C)", herausgegeben von Ray Wu, Lawrence Grossmann und Kivie Moldave, Academic Press, New York (1983).
Principles of Gene Manipulation, An Introduction to Genetic Engineering, 2. Auflage, herausgegeben von R. W. Old und S. B Primrose, University of California Press (1981).
Bernard, H. V. et al., Gene (1979) 5, 59.
Oppenheim, A. B. et al., J. Mol. Biol. (1982) 158, 327.
Remaut, E. et al., Gene (1981) 15, 81.

Beispiel 1

Expressionsvektoren

Der hier verwendete Ausdruck "Expressionsvektor" betrifft eine Gruppe von Plasmiden, die sich zur Expression von gewünschten Genen in Bakterien, insbesondere E. coli, eignen. Das gewünschte Gen kann in den Expressionsvektor inseriert werden, andererseits können die Promotoren des Expressionsvektors herausgeschnitten und vor das gewünschte Gen gesetzt werden.

pJH200

pJH200 besteht aus einer DNA, die in das Multicopy-Plasmid pBR322 inseriert worden ist. Die herausragenden Eigenschaften der λ DNA sind, daß sie den λ PL-Promotor, die linke N- Erkennungsstelle (nutL), eine EcoRI-Restriktionsstelle, die tRI-Terminationsstelle, gefolgt von der CII- Ribosomenbindungsstelle und einem ATG-Initiationscodon, das Teil der NdeI-Restriktionsstelle ist, enthält. 116 bp downstream von der NdeI-Restriktionsstelle befinden sich vier singuläre Restriktionsstellen. Die Restriktionsstellen erlauben leicht die Insertion des gewünschten Gens. Die CII- Ribosomenbindungsstelle unterscheidet sich von der natürlichen ribosomalen Bindungsstelle durch eine einzelne Punktmutation.
pJH200 wurde aus pOG11 konstruiert (vgl. A. Oppenheim et al., J. Mol. Biol. (1982) 158, 327) und enthält den λ PL- Promotor und die CII-Ribosomenbindungsstelle, die in pOG11 gefunden werden. Eine 346 bp lange λ DNA, die zwischen dem λ PL-Promotor und der CII-Ribosomenbindungsstelle lokalisiert ist, wurde jedoch deletiert und eine EcoRI- Restriktionsstelle wurde am Verbindungsstück zwischen diesen beiden Elementen eingeführt. Downstream der ribosomalen Bindungsstelle wurde auch ein Multi-Restriktionsstellen- Linker eingeführt. pJH200 wurde bei der American Type Culture Collection unter der ATCC-Nr. 39783 hinterlegt.

pRO211

pRO211 wurde von pJH200 erhalten, indem eine der zwei NdeI- Restriktionsstellen entfernt wurde.
pJH200, pRO211 und Derivate davon, die eukaryotische Gene enthalten, können in geeigneten E. coli-Wirten kultiviert werden. Das wichtigste Merkmal eines geeigneten Wirtes ist, daß er den thermosensitiven Repressor cI857 und das Antitermination-N-Protein bereitstellt (vgl. Gottesman, M. E. et al., J. Mol. Biol. (1980) 140, 57-75).
pRO211 hat gegenüber früher beschriebenen Expressionsvektoren zahlreiche Vorteile, einschließlich:

1. Extrem hohe Expressionsmengen

Der Vektor eignet sich, fremde Proteine in E. coli in Mengen zu exprimieren, die 35% des gesamten zellulären Proteins ausmachen.

2. Ersetzbare ribosomale Bindungsstelle

pRO211 enthält eine singuläre EcoRI-Stelle, die upstream der ribosomalen Bindungsstelle lokalisiert ist, und eine NdeI-Stelle, die downstream der ribosomalen Bindungsstelle lokalisiert ist. Die ribosomale Bindungsstelle ist somit von zwei singulären Restriktionsstellen flankiert. Dies ermöglicht leicht, die vorliegende ribosomale Bindungsstelle (die λ CII-Ribosomenbindungsstelle) herauszuschneiden und durch tatsächlich jede andere natürliche oder synthetische ribosomale Bindungsstelle zu ersetzen, ohne andere Eigenschaften des Plasmids zu verändern. Dies trägt stark zu einer optimalen Expression der gewünschten Polypeptide bei.

3. Thermoinduzierbare Expressionsregulation

Der λ PL-Promotor ist inaktiv, wenn der CI-Repressor an ihn gebunden ist. Der cI857-Repressor ist thermosensitiv, d. h. er bindet bei 30ºC an den Promotor, ist jedoch bei 42ºC inaktiviert. Somit werden durch Erhöhung der Fermentationstemperatur auf 42ºC die Wirtsbakterien induziert, das gewünschte Protein zu produzieren.
Die Vorteile eines solchen Systems umfassen folgendes:
(a) Ein fremdes Protein, das für Escherichia coli toxisch ist, kann spät in dem Fermentationsverfahren produziert werden, wodurch ein früher Zelltod vermieden wird.
(b) Eine Proteinüberproduktion kann das Protein stabilisieren und einen proteolytischen Abbau verhindern (vgl. Cheng, Y. E. et al., Gene (1981) 14, 121). Somit kann eine "momentane" Überproduktion unter Verwendung eines stark re gulierten Promotors, wie λ PL, gegenüber einer kontinuierlichen, niedrigen Produktionsmenge bevorzugt sein.

4. Vereinfachte Induktionsdurchführung

Die durch die in der vorliegenden Patentanmeldung und in der anhängigen, mitangeführten US-Patentanmeldung mit der Seriennr. 514.188 beschriebenen Plasmide hervorgerufene Proteinproduktion wird durch den thermosensitiven cI857- Repressor reguliert.
Die für die in der anhängigen, mitangeführten Patentanmeldung beschriebenen Plasmide notwendige Induktionsdurchführung umfaßte eine Induktion bei 42ºC, der dann ein Wachstum bei 38ºC folgte. Im Gegensatz dazu umfaßte die optimale Induktion der Proteinsynthese bei Verwendung der Vektoren pJH200, pRO211 oder ihrer Plasmidderivate eine Induktion bei 42ºC, der dann ein Wachstum bei der gleichen Temperatur, d. h. bei 42ºC, folgte. Dies führt dazu, daß der Fermenter nicht abgekühlt werden muß.

5. Kopienzahl

Der λ PL-Promotor in pJH200 und pRO211 stammt von einem Plasmid mit höherer Kopienzahl als die in E. coli vorliegenden λ-Transduktionsphagenvektoren. Dies erhöht die Expressionsmengen.

6. Ribosomale Bindungsstelle und Initiationscodon

Der vorliegende Expressionsvektor enthält eine starke prokaryotische ribosomale Bindungsstelle (RBS) wie auch ein Translationsinitiationscodon (ATG). Somit kann jegliches eukaryotische Gen ohne Hinzufügung des Initiationscodons kloniert werden. Ferner erhöht die wirksame RBS die Expres sionsmengen. Die ribosomale Bindungsstelle ist die λ CII- Ribosomenbindungsstelle. Die Sequenz der ribosomalen Bindungsstelle ist:
TAAGGAAGTACTTACAT ATTCCTTCATGAATGTA
Ein Basenpaar ist unterschiedlich zu der im Wildtyp-λ- Phagen gefundenen ribosomalen Bindungsstelle.

7. Geeignete Restriktionsstelle

Der Expressionsvektor hat eine singuläre NdeI- Restriktionsstelle, innerhalb welcher das ATG- Initiationscodon vorliegt. Dies ermöglicht eine geeignete Positionierung des gewünschten Gens. Die singuläre NdeI- Stelle befindet sich direkt hinter der ribosomalen Bindungsstelle.

8. Geeignete Restriktionsstellen zur Insertion eines Gens

116 bp downstream von der NdeI-Restriktionsstelle befinden sich 4 weitere singuläre Restriktionsstellen in nachstehender Reihenfolge: BglII, SmaI, HindIII und ClaI. Die Vielzahl von singulären Restriktionsstellen ermöglicht eine leichte Insertion der gewünschten Gene.

9. Nut-Stelle

Das vom Wirt stammende N-Protein bindet an die Nut-Stelle auf dem Expressionsvektor und verhindert somit eine Transkriptionstermination an der tRI-Stelle oder eine vorzeitige Transkriptionstermination innerhalb des klonierten Gens.

Stämme

Geeignete Wirte für die beschriebenen Vektoren und Plasmide sind für eine Transformation geeignete Stämme von E. coli, einschließlich A1637, A2602, A1563, A1645 (c600 r&supmin; m&spplus; gal&spplus; thr&supmin; leu&supmin; lac&supmin; bl (λ cI857 Δ H1 Δ BamHI N&spplus;)) und A2097 (A1645 lac Δ χ21 proC: :Tn10).

Beispiel 2

Humane Cu/Zn-Superoxid-Dismutase (SOD)

Der Ausgangspunkt für Cu/Zn-SOD-cDNA-Modifikationen ist das Plasmid pS61-10 (vgl. Lieman-Hurwitz, J. et al., PNAS (1982) 79, 2808). Die SOD-cDNA wird auch in der anhängigen US-Patentanmeldung mit der Seriennr. 489.786, angemeldet am 29. April 1983, beschrieben. Die SOD-cDNA wurde modifiziert, wodurch eine NdeI-Restriktionsstelle am 5'-Ende des Gens und eine HindIII-Restriktionsstelle am 3'-Ende des Gens eingefügt wurden. Das erhaltene, mit pSOD NH-10 bezeichnete Plasmid enthält eine SOD-cDNA, die von zwei singulären Restriktionsstellen flankiert ist.

I. pSODα2

Die Konstruktion von pSODα2 ist in Fig. 1 gezeigt und in der Figurenbeschreibung beschrieben. pSODα2 wurde bei der American Type Culture Collection unter der ATCC-Nr. 39786 hinterlegt. Zur Konstruktion von pSODα2 wurden der λ PL- Promotor, die NutL- und die CII-Ribosomenbindungsstelle aus dem Expressionsvektor pJH200 herausgeschnitten und vor das SOD-Gen des Plasmids pSOD NH-10 gesetzt. Dann wurde das den Promotor, die ribosomale Bindungsstelle und das SOD-Gen enthaltende Fragment in den Vektor pBRM inseriert (vgl. Hartman, J. R. et al., PNAS (1982) 79, 233-237), pBRM wurde bei der American Type Culture Collection unter der ATCC Nr. 37283 hinterlegt.
pSODα2 wurde in den Escherichia coli-Stamm A2097 durch Transformation mittels bekannter Verfahren eingeführt. Die erhaltenen Klone produzieren nach Wachstum und Induktion ein SOD-Analogon-Protein. Die durch pSODα2 produzierte Menge des SOD-Analogons betrug etwa 0,1 bis 0,3% des durch die Bakterien produzierten Gesamtproteins, wie durch Scanning von Coomassie Blue-gefärbten SDS-Polyacrylamidgelen abgeschätzt (Tabelle II). Das produzierte SOD-Analogon ist wahrscheinlich identisch mit jenem, das durch das nachstehend beschriebene pSODβ1 produziert wird.

II. pSODβ1

Die Konstruktion von pSODβ1 ist in Fig. 2 gezeigt und in der Figurenbeschreibung beschrieben. Zur Konstruktion von pSODβ1 wurde die CII-RBS von pSODα2 durch den β-Lactamase- Promotor und die ribosomale Bindungsstelle von pBLA11 ersetzt. pBLA11 wurde bei der American Type Culture Collection unter der ATCC-Nr. 39788 hinterlegt.
pBLA11 enthält den Promotor und die ribosomale Bindungsstelle des in pBR322 vorliegenden β-Lactamase-Gens zwischen den Koordinaten 4157 und 4353. Ein EcoRI-Linker wurde upstream des Promotors und ein Multi-Restriktionsstellen- Linker unmittelbar nach dem Initiationscodon ATG eingefügt. Somit ist die Sequenz des mit dem Initiationscodon beginnenden codierenden Stranges ATGAGCTCTAGAATTC.
pSODβ1 wurde in den Escherichia coli-Stamm A1645 durch Transformation mittels bekannter Verfahren eingeführt. Die erhaltenen Klone produzieren nach Wachstum und Induktion ein SOD-Analogon. Das produzierte humane Cu/Zn-SOD-Analogon unterscheidet sich von natürlichem, humanen Cu/Zn-SOD darin, daß das aminoterminale Alanin nicht acetyliert ist, wie durch Aminosäuresequenz-Stöchiometrie gezeigt, während das natürliche, humane SOD an dem aminoterminalen Alanin acetyliert ist (vgl. Hartz, J. W. und Deutsch, H. F., J. Biol. Chem. (1972) 234, 7043-7050; Jabusch, J. R. et al., Biochemistry (1980) 19, 2310-2316; Barra et al., FEBS Letters (1980) 120, 53 und L. W. Oberley, L. W., Superoxide Dismutase, Bd. I, (1982), CRC Press, Florida, S. 32-33). Darüber hinaus ist das natürliche humane SOD glykosyliert (vgl. Huber, W., US-Patent 3.579.495, erteilt am 18. Mai 1971), während bakteriell produziertes humanes SOD mit ziemlicher Sicherheit nicht glykosyliert ist, da Escherichia coli selbst-produzierte Proteine nicht glykosyliert. Die Aminosäuresequenz des bakteriell produzierten SOD- Analogons ist identisch mit jener der reifen, humanen SOD und enthält keinen Methioninrest an seinem N-Terminus.
Die Menge der durch pSODβ1 produzierten SOD betrug etwa 3- 8% des durch die Bakterien produzierten Gesamtproteins, wie durch Scanning von Coomassie Blue-gefärbten SDS- Polyacrylamidgelen abgeschätzt (Tabelle II). Die zum Wachstum des Stammes, zur Sammlung der produzierten SOD und zur Reinigung der SOD verwendeten Verfahren sind jene, wie sie nachstehend in Beispiel 7 für pSODβ&sub1;T&sub1;&sub1; beschrieben sind.
III. pSODβ&sub1;T&sub1;&sub1;
Die Konstruktion von pSODβ&sub1;T&sub1;&sub1; ist in Fig. 3 gezeigt und in der Figurenbeschreibung beschrieben. Das β-Lactamase-Gen von pSODβ1 wurde durch das für eine Tetracyclin-Resistenz codierende und aus pBR322 stammende Gen ersetzt.
Die Menge des durch pSODβ&sub1;T&sub1;&sub1; produzierten SOD-Analogons betrug etwa 8-13% des durch die Bakterien produzierten Gesamtproteins, wie durch Scanning von Coomassie Bluegefärbten SDS-Polyacrylamidgelen abgeschätzt (Tabelle II). Das produzierte SOD-Analogon ist identisch mit jenem durch pSODβ1 produzierten.

IV. pSODβ&sub1;-BA2

Die Konstruktion von pSODβ&sub1;-BA2 ist in Fig. 5 gezeigt und in der Figurenbeschreibung beschrieben. Die CII- Ribosomenbindungsstelle von pSODα13 wurde durch ein synthetisches DNA-Fragment der Sequenz:
AATTCAATAATATTGAAAAAGGAAGAG GTTATTATAACTTTTTCCTTCTCAT
ersetzt, die zu der Sequenz der natürlichen β-Lactamase- Ribosomenbindungsstelle ähnlich ist.
pSODβ&sub1;-BA2 wurde in den Escherichia coli-Stamm A1645 durch Transformation mittels dem Fachmann bekannter Verfahren eingeführt. Die erhaltenen Klone produzieren nach Wachstum und Induktion ein Analogon von humaner SOD. Die Menge der durch pSODβ&sub1;-BA2 produzierten SOD betrug etwa 2-4% des durch die Bakterien produzierten Gesamtproteins, wie durch Scanning von Coomassie Blue-gefärbten SDS- Polyacrylamidgelen abgeschätzt (Tabelle II). Das produzierte SOD-Analogon ist identisch mit jenem durch pSODβ1 produzierten. Tabelle II
1. Promotor und ribosomale Bindungsstelle des β-Lactamase- Gens.
2. Synthetische ribosomale Bindungsstelle, die jener des β-Lactamase-Gens entspricht.
3. Menge des produzierten SOD-Analogons, ausgedrückt als Prozentsatz des bakteriellen Gesamtproteins.

Abkürzungen

AmpR = Ampicillin-Resistenz
TetR = Tetracyclin-Resistenz
T&sub1;T&sub2; = Transkriptionsterminationssequenzen

Beispiel 3

Wachstum von SODβ&sub1;T&sub1;&sub1;.

I. Vorrats-Kulturen

Vorrats-Kulturen von pSODβ&sub1;T&sub1;&sub1; wurden auf Caseinmedium (vgl. Inokulum) gehalten, dann zweifach mit Gefriermedium verdünnt und bei -80ºC gelagert. Das Gefriermedium enthält pro 500 ml:
K&sub2;HPO&sub4; 6,3 g
KH&sub2;PO&sub4; 1,8 g
Na-Citrat 0,45 g
MgSO&sub4; · 7 H&sub2;O 0,09 g
(NH&sub4;)&sub2;SO&sub4; 0,9 g
Glycerin 44,0 g

II. Inokulum

Das Inokulum wurde in 20 g/l Caseinhydrolysat, 10 g/l Hefeextrakt und 2 g/l NaCl vermehrt. Steriles Medium in einer Schüttelflasche wurde aus einer Vorrats-Kultur inokuliert und 15 Stunden auf einem Schüttler bei 30ºC und etwa 200 r. p. m. inkubiert. Bei Bedarf wurden nachfolgende Stufen der Inokulum-Vermehrung in belüfteten Fermentern unter Rühren durchgeführt. Steriles Medium wurde mit 2-10% Inokulum inokuliert und 15 Stunden bei 30ºC, pH 7 ± 0,5 unter Rühren und Belüften unter Beibehalten einer gelösten Sauerstoffmenge oberhalb einer 20%igen Sättigung mit Luft inkubiert.

III. Produktion

Das Produktionsmedium enthält:
Caseinhydrolysat 20 g/l
Hefeextrakt 10 g/l
K&sub2;HPO&sub4; 2,5 g/l
MgSO&sub4; · 7 H&sub2;O 1 g/l
NaCl 5 g/l
Biotin 0,1 mg/l
Thiamin 1 mg/l
Lösung von Spurenelementen 3 ml/l
CuSO&sub4; 0,8 g/l
ZnSO&sub4; 10 mg/l
Das Medium enthält auch 12,5 mg/l Tetracyclin. Das Tetracyclin ist nicht zwingend zur Produktion, findet sich jedoch stets in dem zum Wachstum des Inokulums verwendeten Medium.
Biotin, Thiamin und Tetracyclin in konzentrierter Lösung wurden einzeln steril-filtriert und dem sterilen Produktionsmedium vor Inokulierung zugegeben. Eine sterile Glukoselösung wurde zu Erreichung einer Ausgangskonzentration von 10 g Glucose/l zugegeben. Beim Induktionsschritt wurden weitere 10 g Glucose/l zugegeben.
Die Lösung der Spurenelemente enthält:
FeCl&sub3; 16 g/l
ZnCl&sub2; · 4 H&sub2;O 2 g/l
CoCl&sub2; · 6 H&sub2;O 2 g/l
Na&sub2;MoO&sub4; · 2 H&sub2;O 1 g/l
CaCl&sub2; · 2 H&sub2;O 1 g/l
CuCl&sub2; 1 g/l
H&sub3;BO&sub3; 0,5 g/l
Konz. HCl 100 ml/l
Das Medium wird mit 0,5-10% Inokulum-Kultur inokuliert und bei 30ºC inkubiert. Rühr-Belüftungs-Maßnahmen werden ergriffen, um eine gelöste Sauerstoffmenge oberhalb einer 20%igen Sättigung mit Luft beizubehalten. Der pH wird durch NH&sub3; bei 7 ± 0,2 gehalten. Bei einer Zellkonzentration von etwa 3,5 g/l (OD&sub6;&sub0;&sub0; = 10) wird mit der Induktion begonnen.
Die Temperatur wird auf 42ºC erhöht und 1 bis 5 Stunden bei 42ºC gehalten. Die Kultur wird dann abgekühlt und die Zellen werden zur Enzymreinigung durch Zentrifugation gesammelt.

Sammlung von SOD

1 1/2 kg Bakterienzellen (feuchter Kuchen) werden in 12 l 50 mM Natriumphosphat (pH 7.8) in einem Polytron (Kinematica)-Mischer suspendiert, während die Geschwindigkeit zur Minimierung der Schaumbildung kontrolliert wird. Die homogene Suspension wird kontinuierlich durch einen Dynomill KD5-Zellaufschließer (Willy A. Bachofen, Basel) geleitet. Die homogene Suspension aufgeschlossener Zellen wird unter Verwendung eines kontinuierlichen Zellflusses beschallt und in einer CEPA 101-Zentrifuge zentrifugiert. Der Überstand wird 2 Stunden bei 65ºC erhitzt, abgekühlt und wie vorstehend zentrifugiert. Der klare Überstand wird auf 1 l in einer Millipore Pellicon-Ultrafiltrations- Vorrichtung konzentriert, indem 10000 MG-Ausschlußkassetten (Typ PTGC) verwendet werden. Die konzentrierte Proteinlösung wird durch eine DEAE-Sepharosesäule (2 kg DEAE Sepharose) geleitet, die mit einem 150 mM Natriumphosphatpuffer (pH 7,8) equilibriert worden ist. Die Durchflußlösung wird gesammelt, konzentriert und in einer Pellicon- Ultrafiltrations-Vorrichtung gegen 20 mM Tris-HCl, pH 7,8 dialysiert und dann auf eine QAE-Sepharosesäule geladen, die mit einem 20 mM Tris-HCl-Puffer equilibriert worden ist. Die Säule wird mit einem 20 mM Tris-HCl-Puffer, pH 7,8 und einem Salzgradienten (0-200 mM NaCl) entwickelt. SOD- enthaltende Fraktionen werden gesammelt, unter Verwendung einer Pellicon-Ultrafiltrations-Vorrichtung konzentriert, gegen destilliertes Wasser dialysiert und dann auf 100 mM Natriumacetat gebracht, indem 1 M Natriumacetat-Puffer, pH 4,8 verwendet wird. Die Proteinlösung wird dann ferner auf einer CM-Sepharosesäule aufgetrennt, die mit einem 100 mM Natriumacetat-Puffer, pH 4,7 equilibriert worden ist. Die Säule wird unter Verwendung des gleichen Puffers und eines Salzgradienten (100-500 mM NaCl) entwickelt. SOD- enthaltende Fraktionen werden gesammelt, unter Verwendung einer Pellicon-Ultrafiltrations-Vorrichtung konzentriert und lyophilisiert.

Beispiel 4

Aktivität von durch pSODβ&sub1;T&sub1;&sub1; produziertem SOD

Die enzymatische Aktivität des durch pSODβ&sub1;T&sub1;&sub1; produzierten SOD-Analogons (vgl. Beispiel 7) wurde bestimmt, indem die Reduktionsinhibition von Ferricytochrom-c verfolgt wurde, wie durch McCord und Fridovich, J. Biol. Chem. (1969) 244, 6049-6055 beschrieben. Die Ergebnisse zeigten, daß die Aktivität des durch pSODβ&sub1;T&sub1;&sub1; produzierten SOD-Analogons vergleichbar war mit jener von natürlichem humanem SOD (Sigma) und von Rinder-SOD (Orgotein: Grunenthal GmbH).

Beispiel 5

Expressionsvektoren

I. p579

Der Vektor p579 besteht aus einem PL-Promotor, einer N- Erkennungsstelle (NutL), der durch die singulären Restriktionsstellen EcoRI und NdeI flankierten CII- Ribosomenbindungsstelle einem ATG-Initiationscodon und den T&sub1;T&sub2;-Transkriptionsterminationssignalen, die vom Ende des rrnB-ribosomalen RNA-Genoperons von Escherichia coli stammen. Diese Elemente werden in das das Ampicillin- Resistenzgen tragende pBR322 kloniert.
p579 wurde hergestellt, indem die auf dem Plasmid pPS1 vorliegenden T&sub1;T&sub2;-Transkriptionsterminationssignale in die HindIII-Stelle des Vektors pRO211 inseriert wurden. pPS1 wurde in Sarmientos et al., Cell (1983) 32, 1337-1346 beschrieben und bei der American Type Culture Collection unter der ATCC-Nr. 39807 hinterlegt. p579 und seine eukaryotische Gene enthaltenden Derivate können in geeigneten Escherichia coli-Wirten gehalten werden. Das wichtigste Merkmal des Wirts ist die Bereitstellung des thermosensitiven Repressors cI857 und des Antitermination-N-Proteins (vgl. Gottesman, M. et al., J. Mol. Biol. (1980) 140, 57-75).
p579 hat zahlreiche Vorteile gegenüber früher beschriebenen Expressionsvektoren, einschließlich:

1. Extrem hohe Expressionsmengen

Dieser Vektor eignet sich zur Expression fremder Proteine in E. coli in Mengen bis zu 42% des gesamten zellulären Proteins. Diese Expressionsmenge ist höher als jene, die für andere ähnliche, die T&sub1;T&sub2;-Transkriptionsterminationssequenzen nicht aufweisende λ PL-Plasmide beschrieben ist.

2. Transkriptionsterminationssignale

Der Vektor p579 enthält die T&sub1;T&sub2;-Transkriptionsterminationssignale downstream von dem λ PL-Promotor und der CII- Ribosomenbindungsstelle. Die hohen durch Verwendung dieses Vektors erhaltenen Expressionsmengen sind zum Teil an das Vorliegen der T&sub1;T&sub2;-Transkriptionsterminationssignale am Ende des inserierten Gens gebunden, da die T&sub1;T&sub2;- Transkriptionsterminationssignale zur Transkriptionstermination einer N-modifizierten RNA-Polymerase in der Lage sind. Somit verhindern die Transkriptionsterminationssignale die λ PL-kontrollierte Transkription unerwünschter Plasmid-Proteine, wodurch die relative Ausbeute des gewünschten Proteins erhöht wird.

3. Ersetzbare ribosomale Bindungsstellen

p579 enthält eine singuläre EcoRI-Stelle, die upstream der ribosomalen Bindungsstelle lokalisiert ist, und eine singuläre NdeI-Stelle am ATG-Initiationscodon. Somit ist die ribosomale Bindungsstelle durch zwei singuläre Restriktionsstellen flankiert. Dies ermöglicht das leichte Herausschneiden der vorliegenden ribosomalen Bindungsstelle (λ CII-Ribosomenbindungsstelle) und den Einbau von tatsächlich jeder anderen natürlichen oder synthetischen ribosomalen Bindungsstelle, ohne daß dabei andere Merkmale des Plasmids verändert werden. Dies trägt stark zu einer optimalen Expression gewünschter Polypeptide bei.

4. Thermoinduzierbare Expressionsregulation

Der λ PL-Promotor ist inaktiv, wenn der CI-Repressor an ihn gebunden ist. Der cI857-Repressor ist thermosensitiv, d. h. er bindet an den Promotor bei 30ºC, ist jedoch bei 42ºC inaktiviert. Somit werden durch Erhöhung der Fermentationstemperatur auf 42ºC die Wirtsbakterien induziert, das gewünschte Protein zu produzieren.
Die Vorteile eines solchen Systems umfassen folgende:
a)Ein fremdes Protein, das für Escherichia coli toxisch ist, kann spät in dem Fermentationsverfahren produziert werden, wodurch ein früher Zelltod vermieden wird.
b) Eine Überproduktion eines Proteins kann das Protein stabilisieren und einen proteolytischen Abbau verhindern (vgl. Cheng, Y. E. et al., Gene (1981) 14, 121). Somit kann eine "momentane", unter Verwendung eines stark regulierten Promotors, wie λ PL, erzielte Überproduktion gegenüber einer kontinuierlichen, niedrigen Produktionsmenge bevorzugt sein.

5. Vereinfachte Induktionsdurchführung

Die von p579 stammenden Plasmide werden bei etwa 42ºC induziert und bei 42ºC während der Proteinsynthesephase gehalten. Die Induktionsdurchführung für von pMG100 und pND5 stammende Plasmide (vgl. die anhängige, mitangeführte US- Patentanmeldung mit der Seriennr. 514.188) erfordert einen Temperaturshift auf 42ºC, dem eine ausgedehnte Wachstumsphase bei 38ºC folgt. Die optimale Induktionsdurchführung für p579 erfordert keine Abkühlung auf 38ºC und ist somit vereinfacht.

6. Hohe Kopienzahl

Der λ PL-Promotor von p579 stammt von einem Plasmid mit höherer Kopienzahl als λ-Transduktionsphagenvektoren, die in Escherichia coli verwendet werden. Dies erhöht die Expressionsmengen.

7. Ribosomale Bindungsstelle und Initiationscodon

Der vorliegende Expressionsvektor enthält eine starke prokaryotische ribosomale Bindungsstelle (RBS) wie auch ein Translationsinitiationscodon (ATG). Somit kann jegliches eukaryotische Gen ohne Hinzufügung eines Initiationscodons kloniert werden. Ferner werden die Expressionsmengen durch die wirksame ribosomale Bindungsstelle erhöht. Die ribosomale Bindungsstelle ist die λ CII-Ribosomenbindungsstelle, die vorher in den Vektor pND5 kloniert worden ist. Die Sequenz der ribosomalen Bindungsstelle ist
TAAGGAAGTACTTACAT ATTCCTTCATGAATGTA.
Ein Basenpaar unterscheidet sich von der in Wildtypphagen gefundenen ribosomalen Bindungsstelle.

8. Geeignete Restriktionsstelle

Der Expressionsvektor hat eine singuläre NdeI- Restriktionsstelle, innerhalb welcher das ATG- Initiationscodon vorliegt. Dies ermöglicht einen geeigneten Einbau des gewünschten Gens. Die singuläre NdeI-Stelle findet sich unmittelbar nach der ribosomalen Bindungsstelle.

9. Geeignete Restriktionsstellen zur Insertion eines Gens

116 bp downstream von der NdeI-Restriktionsstelle befinden sich die singulären Restriktionsstellen BgIII und SmaI in dieser Reihenfolge. Diese jeweils singulären Restriktionsstellen ermöglichen eine leichte Insertion der gewünschten Gene.

10. Nut-Stelle

Das durch den Wirt gelieferte N-Protein bindet an die Nut- Stelle auf dem Expressionsvektor und verhindert somit eine Transkriptionstermination an der tRI-Stelle oder eine vorzeitige Transkriptionstermination innerhalb des klonierten Gens.

Stämme

Geeignete Wirte für die beschriebenen Vektoren und Plasmide sind für eine Transformation geeignete Escherichia coli- Stämme, einschließlich A1637, A2602, A1563, A1645 (c600 r&supmin; m&spplus; gal&supmin; thr&supmin; leu&supmin; lac&supmin; bl (λ c1857 ΔH1 ABamHI N+) und A2097 (A1645 lac ΔXA21 proC: :Tn 10).

Beispiel 6

Humane Cu/Zn-Superoxid-Dismutase (SOD)

I. pSODβ&sub1;TT-1

Die Konstruktion von pSODβ&sub1;TT-1 ist in Fig. 4 gezeigt und in der Figurenbeschreibung beschrieben. Das Plasmid pSODβ&sub1;TT-1 wurde durch Insertion der T&sub1;T&sub2;- Terminationssequenzen am 3'-Ende des in pSODβ&sub1;T&sub1;&sub1; (Fig. 15) gefundenen SOD-Gens erhalten.
Das Plasmid PSODβ&sub1;TT-1 wurde in den Escherichia coli-Stamm A1645 durch Transformation mittels dem Fachmann bekannter Verfahren eingeführt. Dieser Stamm produzierte nach Wachstum ein SOD-Analogon. Die Menge des produzierten SOD- Analogons betrug etwa 10-15% des durch die Bakterien produzierten Gesamtproteins, wie durch Scanning von Coomassie Blue-gefärbten SDS-Polyacrylamidgelen abgeschätzt.
Die zum Wachstum des Stammes, zur Sammlung des produzierten SOD-Analogons und zur Reinigung des SOD-Analogons verwendeten Verfahren sind in Beispiel 15 beschrieben.
Die Expressionsmenge von PSODβ&sub1;TT-1 war höher als jene, die von pSODβ&sub1;T&sub1;&sub1; (Tabelle II) erhalten worden ist, aufgrund der T&sub1;T&sub2;-induzierten Verminderung der Transkription und Translation von nicht-erwünschten DNA-Sequenzen.
Das produzierte humane Cu-Zn-SOD-Analogon unterscheidet sich von natürlichem humanen Cu-Zn-SOD darin, daß das ami noterminale Alanin nicht acetyliert ist, wie durch Aminosäure-Sequenzierungs-Stöchiometrie gezeigt. Das natürliche humane SOD ist an dem aminoterminalen Alanin acetyliert (vgl. Hartz, J. W. und Deutsch, H. F., J. Biol. Chem. (1972) 247, 7043-7050; Jabusch, J. R. et al., Biochemistry (1980) 19, 2310-2316; Barra et al., FEBS Letters (1980) 120, 53 und Oberley, L. W., Superoxide Dismutase, Bd. I, CRC Press, Florida (1982), 32-33). Das natürliche humane SOD ist glykosyliert (vgl. Huber, W., US-Patent Nr. 3.579.495, erteilt am 18. Mai 1971). Bakteriell produziertes humanes SOD ist mit ziemlicher Sicherheit nicht glykosyliert, da Escherichia coli selbst-produzierte Proteine nicht glykosyliert. Die Aminosäuresequenz des bakteriell produzierten SOD-Analogons ist identisch mit jener von reifem humanem SOD und enthält keinen Methioninrest an ihrem N-Terminus.

Beispiel 7

Wachstum von pSODβ&sub1;TT-1

I. Vorrats-Kulturen

Vorrats-Kulturen von pSODβ&sub1;T&sub1;&sub1; wurden auf Caseinmedium (vgl. Inokulum) kultiviert, dann zweifach mit Einfriermedium verdünnt und bei -80ºC gelagert. Das Einfriermedium enthält pro 500 ml:
K&sub2;HPO&sub4; 6,3 g
KH&sub2;PO&sub4; 1,8 g
Na-Citrat 0,45 g
MgSO&sub4; · 7 H&sub2;O 0,09 g
(NH&sub4;)&sub2;SO&sub4; 0,9 g
Glycerin 44,0 g

II. Inokulum

Das Inokulum wurde in 20 g/l Caseinhydrolysat, 10 g/l Hefeextrakt und 2 g/l NaCl vermehrt. Steriles Medium in einer Schüttelflasche wurde aus einer Vorratskultur inokuliert und 15 Stunden auf einem Schüttler bei 30ºC und etwa 200 r. p. m. inkubiert. Bei Bedarf wurden nachfolgende Schritte in der Inokulum-Vermehrung in belüfteten Fermentern unter Rühren durchgeführt. Steriles Medium wurde mit 2-10% Inokulum inokuliert und 15 Stunden bei 30ºC, pH 7 ± 0,5 unter Rühren und Belüften, wodurch eine gelöste Sauerstoffmenge oberhalb einer 20%igen Sättigung mit Luft beibehalten wurde, inkubiert.

III. Produktion

Das Produktionsmedium enthält:
Caseinhydrolysat 20 g/l
Hefeextrakt 10 g/l
K&sub2;HPO&sub4; 2,5 g/l
MgSO&sub4; · 7 H&sub2;O 1 g/l
NaCl 5 g/l
Biotin 0,1 mg/l
Thiamin 1 mg/l
Lösung von Spurenelementen 3 ml/l
CuSO&sub4; 0,8 g/l
ZnSO&sub4; 10 mg/l
Das Medium enthält auch 12,5 mg/l Tetracyclin. Das Tetracyclin ist für die Produktion nicht zwingend, liegt jedoch jeweils in dem zum Wachstum des Inokulum verwendeten Medium vor.
Biotin, Thiamin und Tetracyclin in konzentrierten Lösungen wurden einzeln steril-filtriert und dem sterilen Produktionsmedium vor Inokulierung zugegeben. Eine sterile Glucoselösung wurde zugegeben, wodurch zunächst eine Glucose- Konzentration von 10 g/l erhalten wurde. Beim Induktionsschritt wurden weitere 10 g/l Glucose zugegeben.
Die Lösung der Spurenelemente enthält:
FeCl&sub3; 16 g/l
ZnCl&sub2; · 4 H&sub2;O 2 g/l
CoCl&sub2; · 6 H&sub2;O 2 g/l
Na&sub2;MoO&sub4; · 2 H&sub2;O 2 g/l
CaCl&sub2; · 2 H&sub2;O 1 g/l
CuCl&sub2; 1 g/l
H&sub3;BO&sub3; 0,5 g/l
Konz. HCl 100 ml/l
Das Medium wird mit 0,5-10% Inokulumkultur inokuliert und bei 30ºC inkubiert. Rühr-Belüftungs-Maßnahmen werden ergriffen, um eine gelöste Sauerstoffmenge oberhalb einer 20%igen Sättigung mit Luft beizubehalten. Der pH wird mit NH&sub3; bei 7 ± 0,2 gehalten. Bei einer Zellkonzentration von etwa 3,5 g/l (OD&sub6;&sub6;&sub0; = 10) wird die Induktion gestartet.
Die Temperatur wird auf 42ºC erhöht und 1-5 Stunden bei 42 ºC gehalten. Die Kultur wird dann abgekühlt und die Zellen werden durch Zentrifugation zur Enzymreinigung gesammelt.

Sammlung von SOD

1 1/2 kg Bakterienzellen (feuchter Kuchen) werden in 12 l 50 mM Natriumphosphat (pH 7,8) in einem Polytron (Kinematica)-Mischer suspendiert, während die Geschwindigkeit des Mischers zur Minimierung der Schaumbildung kontrolliert wird. Die homogene Suspension wird kontinuierlich durch einen Dynomill KD5-Zellaufschließer (Willy A. Bachofen, Basel) geleitet. Die homogene Suspension aufgeschlossener Zellen wird unter Verwendung einer Zelle mit kontinuierlichem Fluß beschallt und in einer CEPA 101- Zentrifuge zentrifugiert. Der Überstand wird 2 Stunden bei 65ºC erhitzt, dann abgekühlt und wie vorstehend zentrifugiert. Der klare Überstand wird auf 1 l in einer Millipore Pellicon-Ultrafiltrations-Vorrichtung unter Verwendung von 10000 MG-Ausschluß-Kassetten (Typ PTGC) konzentriert. Die konzentrierte Proteinlösung wird durch eine DEAE- Sepharosesäule (2 kg DEAE Sepharose) geleitet, die mit einem 150 mM Natriumphosphat-Puffer (pH 7,8) equilibriert worden ist. Die Durchflußlösung wird gesammelt, konzentriert und in einer Pellicon-Ultrafiltrations-Vorrichtung gegen 20 mM Tris-HCl, pH 7,8 dialysiert und dann auf eine mit einem 20 mM Tris-HCl-Puffer equilibrierte QAE- Sepharosesäule gegeben. Die Säule wird mit einem 20 mM Tris-HCl-Puffer, pH 7,8 und einem Salzgradienten (0-200 mM. NaCl) entwickelt. SOD-enthaltende Fraktionen werden gesammelt mit einer Pellicon- Ultrafiltrations-Vorrichtung konzentriert, gegen destilliertes Wasser dialysiert und dann auf 100 mM Natriumacetat durch Zugabe eines 1 M Natriumacetat-Puffers, pH 4,8 eingestellt. Die Proteinlösung wird dann auf einer cm- Sepharosesäule aufgetrennt, die mit einem 100 mM Natriumacetat-Puffer, pH 4,7 equilibriert worden ist. Die Säule wird mit dem gleichen Puffer und einem Salzgradienten (100- 500 mM NaCl) entwickelt. SOD-enthaltende Fraktionen werden gesammelt, mit einer Pellicon-Ultrafiltrations-Vorrichtung konzentriert und lyophilisiert.

Beispiel 8

Aktivität von durch pSODβ&sub1;TT-1 produziertem SOD

Die enzymatische Aktivität des in Beispiel 7 hergestellten, durch PSODβ&sub1;TT-1 produzierten SOD-Analogons wurde bestimmt, indem die Inhibition der Reduktion von Ferricytochrom-c überwacht wurde, wie durch McCord und Fridovich, J. Biol. Chem. (1969) 244, 6049-6055 beschrieben. Die Ergebnisse zeigten, daß die Aktivität des durch pSODβ&sub1;TT-1 produzierten SOD-Analogons vergleichbar war mit jener von natürlicher humaner SOD und von Rinder-SOD (Orgotein: Grunenthal GmbH).

Beispiel 9

Die Ausbeute und Aktivität von humaner Superoxid-Dismutase, die durch die in Beispiel 3 beschriebenen SOD-Wirt-Vektorsysteme produziert wird, kann durch Modifizierung der Wachstumsbedingungen der Wirt-Vektorsysteme verbessert werden. Wie die folgenden Daten zeigen, führt die Kupfer- und/oder Zink-Ergänzung des Wachstumsmediums für das Wirt- Vektorsystem zu einer größeren Ausbeute des Enzyms in aktiver dimerer Form.

Wachstum von PSODβ&sub1;T11 enthaltenden Bakterien

I. Vorrats-Kulturen

Vorrats-Kulturen von pSODβ&sub1;T&sub1;&sub1; wurden in Caseinmedium (vgl. Inokulum) kultiviert, dann zweifach in Gefriermedium verdünnt und bei -80ºC gelagert. Das Gefriermedium enthält pro 500 ml:
K&sub2;HPO&sub4; 6,3 g
KH&sub2;PO&sub4; 1,8 g
Na-Citrat 0,45 g
MgSO&sub4; · 7 H&sub2;O 0,09 g
(NH&sub4;)&sub2;SO&sub4; 0,9 g
Glycerin 44 g

II. Inokulum

Das Inokulum wurde in 20 g/l Caseinhydrolysat, 10 g/l Hefeextrakt und 2 g/l NaCl vermehrt. Steriles Medium in einer Schüttelflasche wurde aus einer Vorrats-Kultur inokuliert und 15 Stunden auf einem Schüttler bei 30ºC und etwa 200 r. p. m. inkubiert. Bei Bedarf wurden nachfolgende Schritte in der Inokulum-Vermehrung in belüfteten Fermentern unter Rühren durchgeführt. Steriles Medium wurde mit 2-10% Flaschenkultur inokuliert und 15 Stunden bei 30ºC, pH 7 ± 0,5 unter Rühren und Belüften inkubiert, wodurch eine gelöste Sauerstoffmenge oberhalb einer 20%igen Sättigung mit Luft beibehalten wurde.

III. Produktion

Das Produktionsmedium enthält:
Caseinhydrolysat 20 g/l
Hefeextrakt 10 g/l
K&sub2;HPO&sub4; 2,5 g/l
MgSO&sub4; · 7 H&sub2;O 1 g/l
NaCl 5 g/l
Biotin 0,1 mg/l
Thiamin 1 mg/l
Lösung von Spurenelementen 3 ml/l
Tetracyclin 12,5 mg/l
In einigen Fällen wurde hinzugegeben:
CuSO&sub4; · 5 H&sub2;O 0,8 g/l
ZnSO&sub4; · 7 H&sub2;O 10 mg/l
Biotin, Thiamin und Tetracyclin in konzentrierten Lösungen wurden einzeln steril-filtriert und dem sterilen Produktionsmedium vor Inokulierung zugegeben. Eine sterile Glucoselösung wurde zugegeben, wodurch eine Ausgangsglucose- Konzentration von 10 g/l erhalten wurde. Beim Induktionsschritt wurden weitere 10 g Glucose/l zugegeben.
Die Lösung der Spurenelemente enthält:
FeCl&sub3; 16 g/l
ZnCl&sub2; · 4 H&sub2;O 2 g/l
CoCl&sub2; · 6 H&sub2;O 2 g/l
Na&sub2;MoO&sub4; · 2 H&sub2;O 2 g/l
CaCl&sub2; · 2 H&sub2;O 1 g/l
CuCl&sub2; 1 g/l
H&sub3;BO&sub3; 0,5 g/l
Konz. HCl 100 ml/l
Das Medium wird mit 0,3-10% Inokulum-Kultur inokuliert und bei 30ºC inkubiert. Rühr-Belüftungs-Maßnahmen werden ergriffen, um die gelöste Sauerstoffmenge oberhalb einer 20%igen Sättigung mit Luft zu halten. Der pH wird mit NH&sub3; bei 7 + 0,2 gehalten. Bei einer Zellkonzentration von etwa 3,5 g/l (OD&sub6;&sub6;&sub0; = 10) wird mit der Induktion begonnen.
Die Temperatur wird auf 42ºC erhöht und 1-5 Stunden bei 42 ºC gehalten. Die Kultur wird dann abgekühlt und Zellen werden durch Zentrifugation zur Enzymreinigung gesammelt.

Sammlung von SOD

1 1/2 kg Bakterienzellen (feuchter Kuchen) werden in 12 l 50 mM Natriumphosphat (pH 7,8) in einem Polytron (Kinematica)-Mischer suspendiert, während die Geschwindigkeit des Mischers zur Minimierung der Schaumbildung kon trolliert wird. Die homogene Suspension wird kontinuierlich durch einen Dynomill KD5-Zellaufschließer (Willy A. Bachofen, Basel) geleitet. Die homogene Suspension aufgeschlossener Zellen wird unter Verwendung einer Zelle mit kontinuierlichem Fluß beschallt und in einer CEPA 101- Zentrifuge zentrifugiert. Der Überstand wird 2 Stunden bei 65ºC erhitzt, abgekühlt und wie vorstehend zentrifugiert. Der klare Überstand wird auf 1 l in einer Millipore Pellicon-Ultrafiltrations-Vorrichtung unter Verwendung von 10000 MG Ausschluß-Kassetten (Typ PTGC) konzentriert. Die konzentrierte Proteinlösung wird durch eine DEAE-Sephacelsäule (2 kg DEAE-Sephacel) geleitet, die mit einem 150 mM Natriumphosphatpuffer (pH 7,8) equilibriert worden ist. Die Durchflußlösung wird gesammelt, konzentriert und in einer Pellicon-Ultrafiltrations-Vorrichtung gegen 20 mM Tris-HCl, pH 7,8 dialysiert und dann auf eine QAE-Sepharosesäule gegeben, die mit einem 20 mM Tris-HCl-Puffer equilibriert worden ist. Die Säule wird mit einem 20 mM Tris-HCl-Puffer, pH 7,8 und einem Salzgradienten (0-200 mM NaCl) entwickelt. SOD-enthaltende Fraktionen werden gesammelt, mit einer Pellicon-Ultrafiltrations-Vorrichtung konzentriert, gegen destilliertes Wasser dialysiert und dann auf 100 mM Natriumacetat durch Hinzufügung eines 1 M Natriumacetatpuffers, pH 4.8 gebracht. Die Proteinlösung wird dann ferner auf einer CM-Sepharosesäule, die mit einem 100 mM Natriumacetatpuffer, pH 4,7 equilibriert worden ist, aufgetrennt. Die Säule wird unter Verwendung des gleichen Puffers und eines Salzgradienten (100-500 mM NaCl) entwickelt. SOD- enthaltende Fraktionen werden gesammelt, mit einer Pellicon-Ultrafiltrations-Vorrichtung konzentriert und lyophilisiert.

Beispiel 10

Enzymatische Aktivität von durch Bakterien produziertem SOD

Das gereinigte, durch Bakterien in Beispiel 9 unter Standard-Wachstumsbedingungen (d. h. ohne Hinzugabe von zusätzlichem CuSO&sub4;) produzierte humane SOD (hSOD) besaß nur 5% der enzymatischen Aktivität im Vergleich zu Rinder-Cu/Zn- SOD. Eine Analyse des Metallgehaltes zeigt, daß das Enzym wenig Kupfer enthält und zwar nur 8% des erwarteten Werts. Darüber hinaus scheint es, daß die meisten Cu²&spplus;-Stellen durch Zn-Ionen ersetzt sind, da das Protein fast zweimal soviel Zn enthält, wie nötig. Ein vollständig Metall-freies Apoprotein, das aus dem bakteriell produzierten h-SOD gewonnen worden ist, erhält im wesentlichen wieder die volle enzymatische Aktivität nach Rekonstitution in Lösung. Die Lösung enthält Cu²&spplus; und Zn²&spplus;, jeweils in einer Konzentration von 1,2 Ionenmole pro Mol aktive Stelle (Tabelle IV).
Die obigen Daten ließen vermuten, daß die intrazelluläre Konzentration von Cu²&spplus; beschränkt ist und nicht ausreichend ist, das produzierte hSOD abzusättigen. In einer Serie von Experimenten wurde gezeigt, daß erhöhte Cu&spplus;&spplus;-Konzentrationen in dem Wachstumsmedium zu einer Zunahme in der spezifischen Aktivität von hSOD führten. In der Tat produzierten E. coli, die in Caseinhydrolysat (Beispiel 9), ergänzt mit 200 ppm Cu&spplus;&spplus; wuchsen, nach Induktion ein voll aktives hSOD mit der natürlichen Metallzusammensetzung und voll enzymatischer Aktivität (Tabelle IV). Zusätzliche Experimente haben den gleichen Effekt gezeigt, wenn die zugegebene Menge von exogenem Cu&spplus;&spplus; im Bereich von 50-250 ppm lag. Ein ähnlicher Effekt wurde mit LB (Luria Broth)-Medium gesehen, das mit 75 ppm Cu&spplus;&spplus; ergänzt worden ist.

Tabelle IV

Aktivität und Metallgehalt von SOD Präparationen

¹hSOD hergestellt, wie in Beispiel 9 beschrieben. Das verwendete Medium enthielt kein zugegebenes Cu&spplus;&spplus; und Zn&spplus;&spplus;.
²hSOD hergestellt, wie in Beispiel 9 beschrieben. Das verwendete Medium enthielt zugegebenes Cu&spplus;&spplus; und Zn&spplus;&spplus;.
SOD-Konzentrationen wurden nach dem Verfahren von Lowry (vgl. Lowry, O. H., Rosebrough, N. J., Farr, A. L. und Randall, R. J., J. Biol. Chem. (1951) 193, 265-275) bestimmt, indem, Rinderserumalbumin als Standard verwendet wurde. Eine Aktivitätsmessung, bei der die Inhibition der Reduktion von Ferricytochrom-c verfolgt wurde, wurde wie durch McCord und Fridovich (McCord, J. M und Fridovich, I., J. Biol. Chem. (1969) 244, 6049-6055) beschrieben, durchgeführt. Der Kupfer- und Zink-Gehalt in reinen SOD-Präparationen wurde durch Atom-Absorption bestimmt. SOD-Apoenzym wurde gemäß Weser und Hartmann (Weser, U. und Hartmann, H. J., FEBS Lett. (1971) 17, 78-80) hergestellt und durch gleichzeitige Zugabe von Cu und Zn rekonstituiert (vgl. Jewett, S. L., Latrenta, G. S. und Beck, C. M., Arc. Biochem. Biophys. (1982), 215, 116-128).

Beispiel 11

Aminoterminale Sequenz von durch Bakterien produziertem hSOD

Die Sequenz von 5 Aminosäuren am Aminoterminus von gereinigtem, gemäß, Beispiel 9 hergestelltem SOD wurde durch Edmann-Abbau bestimmt. Die Aminosäuresequenz ist identisch mit dem N-Terminus von humanem Cu/Zn-SOD, d. h. sie ist Ala- Thr-Lys-Ala-Val. Dies bestätigt die Authentizität des bakteriellen Produkts. Es scheint daher, daß das lösliche hSOD Prozessierungsenzymen von E. coli zugänglich ist, die das N-terminale Methionin entfernen.

Diskussion

Es wurde gezeigt, daß Bakterien, die zur Produktion großer Mengen von hSOD induziert werden, wenn sie auf LB- oder Caseinhydrolysat-Medien gewachsen sind, ein enzymatischinaktives Protein produzieren. Das so produzierte Protein kann durch Rekonstitution und Zuführung von fehlenden Cu&spplus;&spplus;- und Zn&spplus;&spplus;-Ionen aktiviert werden. Unerwarteterweise können die Bakterien durch Wachstum auf Medien, die mit Cu&spplus;&spplus; ergänzt worden sind, zur Produktion von enzymatisch aktivem hSOD induziert werden. Während man nicht wünscht, durch eine Theorie gebunden zu sein, glauben wir, daß bestimmte Komponenten eines Vollmediums (wie LB und Caseinhydrolysat) das meiste des vorliegenden Kupfers in Chelaten binden, so daß die Bakterien nicht ausreichend freies Kupfer zum Auffüllen sämtlicher Stellen in den SOD-Molekülen haben, die in erhöhten Mengen produziert werden. Die Zugabe von 50-250 ppm Cu&spplus;&spplus;-Ionen zu den Medien erhöht offensichtlich die Cu&spplus;&spplus;-Konzentration innerhalb der Bakterien auf eine Höhe, die ausreichend ist, sämtliches Cu&spplus;&spplus; bereitzustellen, das für das überproduzierte humane Cu/Zn-SOD notwendig ist.

Claims

1. Verfahren zur Herstellung eines enzymatisch aktiven Polypeptidanalogons von Human-Cu/Zn-Superoxiddismutase mit einer zu der von natürlich vorkommender Human- Cu/Zn-Superoxiddismutase im wesentlichen identischen Aminosäuresequenz und der biologischen Aktivität von natürlich vorkommender Human-Cu/Zn-Superoxiddismutase, umfassend:

(a) Wachsenlassen einer Kultur von mit einem Plasmid, das darin eingebaut DNA mit Codierung für das Polypeptidanalogon von Human-Cu/Zn-Superoxiddismutase enthält, transformierten Bakterienzellen in einem zinkhaltigen Produktionsmedium, das mit einer nichtwachstumshemmenden Menge von Cu&spplus;&spplus; derart ergänzt ist, daß die Endkonzentration von jeweils Cu&spplus;&spplus; und Zn&spplus;&spplus; im Medium mehr als 2 ppm beträgt, wobei die transformierten Zellen zur Expression der DNA mit Codierung für das Polypeptidanalogon von Human-Cu/Zn-Superoxiddismutase fähig sind, und

(b) Gewinnen des so hergestellten enzymatisch aktiven Polypeptidanalogons von Human-Cu/Zn-Superoxiddismutase.

2. Verfahren gemäß Anspruch 1, wobei die Bakterienzellen Escherichia coli-Zellen umfassen.

3. Verfahren gemäß Anspruch 1, wobei das Plasmid pSODα2 mit der in Fig. 1 angegebenen Restriktionskarte, das unter der ATCC-Hinterlegungsnummer 39786 hinterlegt ist, pSODβ1 mit der in Fig. 2 angegebenen Restriktionskarte und einer Länge von 3,0 kb, pSODβ&sub1;T&sub1;&sub1; mit der in Fig. 3 angegebenen Restriktionskarte und einer Länge von 3,7 kb, pSODβ&sub1;TT-1 mit der in Fig. 4 angegebenen Restriktionskarte und einer Länge von 4,8 kb oder pSODβ1-BA2 mit der in Fig. 5 angegebenen Restriktionskarte ist.

4. Verfahren gemäß Anspruch 1, wobei die Bakterienzelle vom das Plasmid pSODα2, ATCC 39786, enthaltenden Escherichia coli-Stamm A2097 ist.

5. Verfahren gemäß Anspruch 1, wobei das Produktionsmedium aus einem Caseinhydrolysatmedium besteht.

6. Verfahren gemäß Anspruch 5, wobei das Caseinhydrolysatmedium aus LB-Medium besteht.

7. Verfahren gemäß Anspruch 1, wobei die Cu&spplus;&spplus;-Konzentration etwa 50 bis etwa 250 ppm beträgt.

8. Verfahren gemäß Anspruch 7, wobei die Cu&spplus;&spplus;-Konzentration etwa 200 ppm beträgt.

9. Verfahren gemäß Anspruch 7, wobei die Cu&spplus;&spplus;- Konzentration etwa 75 ppm beträgt.

10. Verfahren gemäß Anspruch 1, wobei das Produktionsmedium auch so mit einer Zn&spplus;&spplus;-Menge ergänzt ist, daß die Konzentration von Zn&spplus;&spplus; im Medium mehr als etwa 2 ppm beträgt.

11. Verfahren gemäß Anspruch 10, wobei das Produktionsmedium mit etwa 0,8 g/l CuSO&sub4; · 5 H&sub2;O und etwa 10 mg/l ZnSO&sub4; . 7 H&sub2;O ergänzt ist.

12. Verfahren gemäß Anspruch 1, wobei nach der Stufe (a) die erhaltene Bakterienzellkultur zur Expression der DNA und Erzeugung des enzymatisch aktiven Human-Cu/Zn- Superoxiddismutase-Polypeptidanalogons induziert wird.

13. Verfahren gemäß Anspruch 12, wobei die Induktion eine Wärmeinduktion umfaßt.

14. Verfahren zur Herstellung eines gereinigten, enzymatisch aktiven Polypeptidanalogons von Human-Cu/Zn- Superoxiddismutase gemäß Anspruch 1 oder 12, wobei das Gewinnen von Stufe (b) umfaßt:

(a) Isolieren der Bakterienzellen aus dem Produktionsmedium,

(b) Aufbrechen der Bakterienzellen zur Bildung einer Suspension, die Zellabfall und eine überstehende Proteinlösung umfaßt,

(c) Abtrennen des Zellabfalls von der überstehenden Lösung von löslichem Protein,

(d) Erhitzen des abgetrennten Proteinüberstands während etwa 2 h auf etwa 65ºC,

(e) Abkühlen des erhitzten Proteinüberstands,

(f) Abtrennen des erhaltenen Proteinüberstands zur Herstellung einer klaren überstehenden Proteinlösung, die das Superoxiddismutaseanalogon enthält, und

(g) Gewinnen des enzymatisch aktiven Human-Cu/Zn- Superoxiddismutaseanalogons aus der klaren überstehen den Proteinlösung.

15. Verfahren von Anspruch 14, wobei das Gewinnen des enzymatisch aktiven Human-Cu/Zn-Superoxiddismutaseanalogons aus der klaren überstehenden Proteinlösung folgende Stufen umfaßt:

(a) Behandeln der klaren überstehenden Proteinlösung zur Gewinnung einer konzentrierten Lösung des Superoxiddismutaseanalogons,

(b) Durchführen sowohl einer Anionen- als auch einer Kationenaustauschchromatographie bei der konzentrierten Lösung, und

(c) Sammeln der erhaltenen Fraktionen, die gereinigtes Superoxiddismutaseanalogon enthalten.