DE2635065C2 - Verfahren zur halbkontinuierlichen Behandlung von Gesamtblut zur Herstellung von biologisch aktiven hämatopoetischen Chalonextrakten - Google Patents

Description

Die Erfindung betrifft ein Verfahren zur halbkontinuierlichen Behandlung von Gesamtblut zur Herstellung von biologisch aktiven hämatopoetischen Chalonextrakten, bei dem Blut, welches ein Antlkoagulans enthält. In Gegenwart eines lytischen Mittels lysiert wird, das lysierte Blut mit Einschluß der Leukozyten zentrifugiert wird, daß letztere Im wesentlichen Intakt bleiben, wäh-

a) das Blut In eine kontinuierliche Lysiselnheit leitet, welches eine Zone turbulenter Strömung In einer Gegend aufweist, die an die Rohreinlässe für das Blut und lytische Mittel angrenzt und bei der eine Zone der laminaren Strömung sich an die Zone der turbulenten Strömung anschließt, wobei die Strömungsgeschwindigkeit von Blut und Kochsalzlösungen so eingestellt wird, daß eine nahezu vollständige Lysis der roten Blutzellen mit einem Minimalverlust an Leukozyten während der Verweilzeit In der kontinuierlichen Lyslseinheit gewährleistet Ist, und

b) die nach dem Zentrifugieren an dem Rotor anhaftenden Leukozyten durch Waschen des Rotors mit einer Flüssigkeit entfernt wird, die eine tragende, nicht beschädigende, isotonische salzhaltige Lösung ist.

Das erfindungsgemäße Verfahren unterscheidet sich von dem aus der obenzitierten Literaturstelle, Europ. J. Cancer, bekannten Verfahren im wesentlichen durch den Einsatz eines- Verzögerungsrohrs, das eine kontinuierliche Lysiseinheit darstellt, die garantiert, daß alle Erythrozyten lysiert werden, während die Leukozyten im wesentlichen intakt bleiben. Dies gelingt durch die besondere Führung durch das Rohr. Außerdem werden die intakten Leukozyten und das rohe Blutzellenstroma mit einer besonderen Waschflüssigkeit von der Rotoroberfläche der Zentrifuge abgewaschen, so daß die Zellen lebensfähig bleiben.

Im einzelnen geht man bei dem Verfahren so vor, daß man

(1) das Blut, welches ein Antikoagulans enthält, in Gegenwart eines geeigneten lytischen Mittels, z. B. eines solchen, das die Isotonizität vermindert und das die vorhandenen Erythrocyten gegenüber den Leucocyten, die Im wesentlichen intakt bleiben, im wesentlichen vollständig lysiert, durch eine kontinuierliche Lysiseinheit unter Bedingungen leitet, daß die vorhandenen Erythrocyten im wesentlichen vollständig und den Leucocyten gegenüber, die Im wesentlichen Intakt bleiben, bevorzugt lysiert werden,

(2) das lysierte Blut, das intakte Leucocyten enthält, in einer solchen Welse zentrifugiert, daß die letzteren Im wesentlichen intakt bleiben, während man bewirkt, daß die Leucocyten zusammen mit Stroma, das von der Lysis der roten Blutzellen herrührt, an der Rotoroberfläche haften,

(3) die intakten Leucocyten und das rote Blutzellenstroma von der Rotoroberfläche in einer solchen Weise entfernt, daß die Zellen lebensfähig bleiben. Indem man z. B. eine Flüssigkeit verwendet, die eine tragende, nicht beschädigende, isotonische und salzhaltige Lösung ist,

(4) die im wesentlichen Intakten Leucocyten zusammen mit dem Stroma mit einem geeigneten Extraktionsmittel extrahiert, das vorzugsweise eine nährstoffhaltige, Ins Gleichgewicht gesetzte, salzhaltige Lösung mit neutralem pH-Wert ist,

(5) den Extrakt, der granulocytische, erythrocytische und lymphocytische Chalone enthält, in einer solchen Welse einer Ultrafiltration unterwirft, daß das granulocytische und das erythrocytische Chalon von dem lymphocytischen Chalon und von den anderen restlichen Blutmaterlalien abgetrennt wird, und daß man

(6) die gränulocytlschen, erythrocytlschen und lymphocytischen Chalone aus den be! der Ultrafiltration erhaltenen Fraktionen gewinnt.

Eine weitere Reinigung der einzelnen Fraktionen kann beispielsweise durch Gelfiltration durchgeführt werden, um gereinigte Chalonzubereltungen zu erhalten.

Die besten Extraktlonsergebnisse werden mit frischem Blut erhalten, doch können gute Leucocytenausbeuten nach Zugabe eines geeigneten Antikoagulans auch mit einem Blut erhalten werden, das bei niedriger Temperatur (etwa 4⁰C) gelagert worden ist. Die Antlkoagulans-Zubereltung Phosp^ro »B« (Aldrinprodukte: 1,01 des 2,0%igen wäßrigen Produkts Phospro »B« pro 10 1 Blut) ist für diesen Zweck zufriedenstellend verwendet worden. Als Blut wird vorzugsweise Rinder-, Schweine- oder Schafblut verwendet.

Das Verfahren wird anhand der beigefügten Zeichnungen näher erläutert. Es zeigt

Fig. 1 ein schematisches Fließschema des Extraktionsprozesses und
F i g. 2 eine Verzögerungsrohr-Lysiseinheit des Typs,

ίο wie er bei dem erfindungsgemäßen Verfahren verwendet wird.

Das Verfahren soll nachstehend genauer unter besonderer Beschreibung eines Beispiels des Extraktionsprozesses erläutert werden. Bei diesem wurde Ochsenblut verwendet, obgleich das Verfahren auch mit Erfolg sowohl auf Schafs- als auch Schweineblut angewendet worden ist.

Ochsenblut hat ein Verhältnis von Lymphocyten zu Granulocyten von 3:2 mit einer durchschnittlichen Gesamtzählung an weißen Zellen von 5200 Zellen/mm³. Wie bereits oben zum Ausdruck gebracht wurde, kann in dieser Stufe Glucose (0,1% Gewicht/Volumen) zu dem Blut gegeben werden, um die Zellebensfähigkeit zu verbessern, wie sie durch den Trypan-Blaufarbstoff-Exkiuslonstest gemessen wird (vgl. Rablnowitz, Blood, 1964, 23, Seiten 811 bis 828; Phillips In »Tissue Culture:

Methods and Applications«, Ed. K.use & Patterson, Pub.

Academic Press, 1964).

In Flg. 2 ist eine kontinuierliche Lysiseinheit dargestellt, die aus einem QVF-(Jobling-)Glasrohr konstruiert Ist. Das Verzögerungsrohr 1 Ist aus einem 12 m langen Rohr mit einem Innendurchmesser von 50 mm und mit einem Volumen von 12,51 gebildet. Es wird durch die Quelle 7 für die Kochsalz-(Lysis-)Lösung durch den Pumpenkopf 6 einer Normandos-Pumpe 4 NP. 33 (eine mikrometereingestellte doppelköpfige Dosierungspumpe/ durch den Einlaß 8 beschickt. Blut wird von der Quelle 2 abgenommen und durch die Pumpe 4 auf dem Wege über den Kopf 3 in den Einlaß 5 eingeführt. Das Gemisch wird nach dem Durchtritt durch das Verzögerungsrohr 1 dem Einlaß 9 einer Zentrifuge 10 zugeführt, aus der Flüssigkeit beim Auslaß 11 abgenommen wird. Das Rohr enthält auch einen Probeabnahmeauslaß 12.

Es Ist möglich, eine (nicht gezeigte) Dämpfungseinrichtung sowohl In die Kochsalzleitung als auch In die Blutleitung zwischen den Pumpen 6 bzw. 3 und das Verzögerungsrohr 1 einzuschalten, wobei diese Dämpfungseinrichtungen in Form von Ballasttanks vorliegen, die Luftbeutel enthalten und die dazu verwendet werden, um die Fließgeschwindigkeiten des Blutes und der Kochsalzlösung durch Einstellung der Größe des Luftbeutels einzustellen, wodurch es möglich ist, die Pulsierungen der peristaltlschen Pumpe auszuschalten. Dies führt zu geringeren Beschädigungen des Verzögerungsrohrs 1 und der Zentrifuge 10. Hierdurch wird eine Ausbeuteerhöhung von 80% erhalten.

Im vorliegenden Falle wurde eine Gesamtflleßgeschwindlgkelt von 60 l/h durch das Verzögerungsrohr aufrechterhalten, wodurch eine Verweilzeit von etwa 12 min erhalten wurde.

Das Gesamtblut (das Antikoagulans und Glucose enthielt) und die Kochsalzlösung (Natriumchlorid, 0,2% Gt'vlcht/Volumen In Wasser) werden In die Lysiseinheit gleichzeitig mit einem durch die Dosierungspumpe geregelten Verhältnis der Fließgeschwindigkeiten von 1 : 4 bis 1:6 eingeleitet. Die Fließgeschwindigkeiten müssen je nach der Natur und dem Zustand des zu verarbeitenden Blutes eingestellt werden, um das optimale Ergebnis

der vollständigen Lysis der Erythrocyten mit einem minimalen Verlust an Leucocyten zu erhalten. Es kann auch vorteilhaft sein, die Temperatur des Lyslsgemisches zu kontrollleren, indem man das Blut abkühlt, bevor es In die Lyslselnhelt eintritt. Das Ausmaß der Lysis wird am besten dadurch getestet, daß man am Austrittsende der Lyslselnhelt durch den Probeentnahmehahn 12 eine Probe entnimmt und sie sodann in einem graduierten konischen Zentrifuglerrohr mit 10 ml zentrifugiert. Bei Bedingungen einer nicht angemessenen Lysis bilden die intakten roten Zellen eine dunkelrote Schicht am Boden des Rohrs, und die Fließgeschwindigkeiten werden so eingestellt, bis diese Schicht kaum mehr wahrnehmbar ist. In dieser Stufe wurden Ausbeuten von ungefähr 60% der gesamten Population der weißen Zellen erreicht, is obgleich genaue Werte aufgrund einer ausgeprägten Klumpenbildung der nach dem Zentrifugieren gewonnenen Zellen schwierig erhältlich sind.

In der Zentrifuglerungsstufe wurde eine hermetisch abgeschlossene Klärungseinrichtung von Westfalia, Typ LG205-9 (nun als Typ KAI-47-525 bekannt) verwendet. Am Ende des Versuches wurde die Schicht der Zellen entfernt. Das Volumen des Gesamtbluts, das bei einem Lauf gut verarbeitbar ist, beträgt ungefähr 45 bis 50 I. Der Lauf wird beendigt, Indem das Blut durch isotonische Kochsalzlösung ersetzt wird und die Zentrlfugierung weitergeführt wird, bis die Abfallfiüssigkelt nur mehr geringfügig gefärbt Ist. Die Zellen wurden sechsmal mit Hanks ausgewogener Salzlösung (BSS) extrahiert, wobei jede Extraktion 1 h lang bei 37 ⁰C erfolgte. Die Zellen wurden nach jeder Extraktion durch eine Förderzentrifugation abgetrennt. Die Inhibierungsaktivität steigt augenscheinlich auf ein Maximum beim dritten oder vierten Extrakt an, und sie fällt im siebten Extrakt auf 0 ab, was auf die begleitende Extraktion in der ersten Stufe von nicht spezifischen Stlmulatoren zurückzuführen Ist, die die Chalonaktlvität in dem Untersuchungssystem beeinträchtigen. Das nachfolgende Abfallen erfolgt wahrscheinlich nach einer Erschöpfung der Chalonvorräte und aufgrund eines gesteigerten Zellabsterbens während des Verfahrens.

Das Volumen der Zellextraktion von einer eintägigen Verarbeitung betrug etwa 3 1. Für die Ultrafiltrationsstufen wurden jedoch mehrere Ansätze des Extrakts (z. B. 5 oder 6) vereinigt, wodurch 15 bis 20 1 des Materials erhalten wurden. Unter Verwendung einer Amicon-Einheit, Typ DC2, die mit einer Hohlfaserpatrone mit einem nominalen Abschneiden von 50 000 Dalton, wie oben beschrieben, versehen war, wurden die hochmolekularen Mitogene als eine erste Fraktion (R-50) in einer Gesamtausbeute von 20 bis 30 mg/! Gesamtblut erhalten. Be! einer zweiten Stufe der Ultrafiltration wurde unter Verwendung einer ähnlichen Einrichtung mit einer Hohlfaserpatrone mit einer Abschneidung von 10 000 Dalton rohes lymphocytisches Chalon (Fraktion R-10) in einer Menge von 8 bis 13 mg/1 Gesamtblut erhalten, während eine weitere Filtration mit einer TCSE-Amicon-Dünnkanaldialyse/Konzentrations-Einheit mit UMO5-Membranen die Fraktion (R-5) ergab, die granulocytische und erythrocytische Chalone enthielt. Das Endultrafiltrat, dessen Volumen in dieser Stufe auf etwa 28 1 als Ergebnis der Waschflüssigkeits-Einschlüsse, die zur Vervollständigung der Abtrennungen erforderlich waren, angestiegen war, wird verworfen.

Die gefriergetrocknete Fraktion (R-5) wird durch eine Gelfiltrationssäulenchromatographie auf Sephadex G25 (Pharmacia [GB] Ltd.) nach herkömmlichen Verfahrensweisen weiter gereinigt, wobei das Eluierungsmittel V]₀ der Stärke von Hanks-BSS-Medlum hatte. Das granulocytische Chalon hat ein mittleres Verhältnis von V_P/V„ von etwa 2,1, wobei V₁, das Volumen des Elulerungsmittels bedeutet, das zur Eluierung des Bandes der Aktivität bei der maximalen Intensität erforderlich Ist, und V₀ das Hohlraumvolumen der Säule, d. h. das Volumen des Elulerungsmlttels, mit dem Arten mit großem Molekulargewicht die nicht In die Gelporen eindringen können, elulert werden. Fraktionen über den V,,/V„-Bereich von 1,9 bis 2,3 werden gesammelt, vereinigt, entsalzt (unter Verwendung der Amlcon-TC5E-Elnheit, die mit UMO5-Membranen versehen ist) und gefriergetrocknet. Das getrocknete Produkt wird sodann (durch seinen Effekt auf die Aufnahme von trltllertem Thymldin durch Rattenknochenmarkszeüen) wieder untersucht, wobei die Endausbeute etwa 140 mg/g der R-5-Fraktlon, d. h. etwa 3 mg/1 Gesamtblut, beträgt. Die weitere Reinigung kann durch eine Vielzahl von Methoden, Insbesondere eine Gelfiltration auf einer Säule von Sephadex G15, durch Polyacrylamid-Gelelektrophorese und durch Isoelektrische Fokussierung erfolgen.

Die Gelfiltration mit Sephadex G15 bewirkt die Abtrennung von pyrogenem Material von dem granulocytischen Chalon, wobei eine Zunahme der spezifischen Aktivität der Chalonfraktlon erfolgt. In dieser Stufe hat das Eluierungsmittel wiederum ein Zehntel der Stärke von Hanks-BSS-Medium, und das granulocytische Chalon wird zwischen V,,/V„-Werten von 1,45 und 1,7 eluiert, während das pyrogene Material In dem V,./V„-Bereich von 1,0 bis 1,4 elulert wird. Die pyrogenen Verunreinigungen werden verläßlicher nach der Fraktionierung auf Sephadex Gl 5 entfernt, Indem die kombinierten aktiven Fraktionen zuerst entsalzt werden und indem das zurückgehaltene Material sodann durch eine sorgfältig gereinigte DC2-Einheit mit einer Hohlfaserpatrone mit einem nominalen Abschneiden von 10 000 Dalton geleitet wird.

Das vorhandene erythrocytische Chalon kann auch von einem solchen Gelfiltrationsprozeß (Sephadex G25) erhalten werden, Indem man die Fraktionen sammelt, die dem V,,/V„-Bereich von 2,4 bis 2,6 entsprechen, und sie in ähnlicher Weise, wie oben im Zusammenhang mit dem granulocytlschen Chalon beschrieben, behandelt.

Eine neue Methode zur Erfassung der erythropoetischen Aktivität wurde dazu angewendet, um das erythrocytische Chalon in dem Säulenabstrom zu lokalisieren, und auch dazu, Um seine Abwesenheit in gereinigten granulocytischen Chalonzubereitungen zu bestätigen. Diese Technik baut sich auf der gezeigten Verminderung der DNS-Synthese in den nucleierten Erythrocyten des sich entwickelnden Hühnchen-Embryos auf, wenn das Chalon auf dem Wege über den Luftbeutel verabreicht wird. Hierzu wurde erythrocytlsches Chalon verwendet, das aus gewaschenen Rinder-Erythrocyten extrahiert worden war, und das durch Ultrafiltration teilweise gereinigt worden war (Krivllaakso und Rytömaa, Cell Tissue Kinet. 1971, 4, Seiten 1 bis 9; Bateman, Cell Tissue Kinet. 1974, 7, Selten 451 bis 461).

Die Chalonzubereitungen In Ringer-Lösungen wurden während 24 h in 4-Stunden-IntervaIlen Injiziert. Bei der zweiten Chalonlnjektion wurde ein einziger Impuls von tritiiertem Thymidin gegeben. 24 h nach der Endinjektion wurden Blutabschmierungen von der dorsalen Aorta aus den Kontrollembryos und den behandelten Embryos hergestellt, und es wurden Autoradlographlen hergestellt. Sodann wurden die Verhältnisanteile von roten Zellen mit markierten Kernen bestimmt. Obgleich das Verfahren zu diesem Zeltpunkt nicht dazu Imstande war, quan-

tliative Ergebnisse zu liefern, waren doch die Ergebnisse für Vergleichsuntersuchungen geeignet. Es würden vier Zubereitungen mit der unten angegebenen Zusammensetzung bei 6 bis 10 Eiern getestet, wobei jedem Ei 0,1 ml einer Lösung mil 5 mg/ml injiziert wurde.

a) Extrakt von Rindererythrocyten,
entsalzt und gefriergetrocknet

signifikant aktiv

inaktiv

10

mit Sephadex G25 gereinigtes
Material (aus Rinder-Leucocyten)
VeZV₀ 1,9 bis 2,3, entsalzt und
gefriergetrocknet
(granulocytisches Chalon)

mit Sephadex G25 gereinigtes stark aktiv

Material (von Rinder-Leucocyten),
V₆ZV₀ 2,4 bis 2,6, entsalzt und
gefriergetrocknet
(erythrocytisches Chalon)

20

d) Extrakt von Schaf-Leucocyten schwach

(hergestellt wie hierin beschrieben), aktiv
gefriergetrocknet

Sämtliche der obigen Zubereitungen inhibierten die Aufnahme von tritiiertem Thymidin durch die Rattenknochenmarkszellen.

Erythrocytisches Chalon kann sich als geeignet zur Behandlung von bestimmten proliferativen Störungen des Erythron, z. B. einer primären und sekundären (nicht angemessenen) Polycythämie, einer erythremischen Myelose (Diguglielmo-Syndrom) und einer sideroblastischen Anämie erweisen. Sein Wert kann erhöht werden, wenn das myeloische Zellabteil betroffen ist, indem man es in Verbindung mit granulocytischem Chalon verabreicht.

Eine weitere Reinigung des lymphocytlschen Chalons kann durch üelfillrationschromatographie auf einer Säule von Sephadex G-75 bewirkt werden, doch wird in diesem Falle die inhibierende Aktivität in zwei unterschiedlichen Bändern eluiert, die durchschnittlichen V,,/V„-Werten von 1,4 und 2,4 entsprechen, von denen nur das erstere für Lymphocyte spezifisch ist.

Es hat sich gezeigt, daß die erfindungsgemäß hergestellten biologisch aktiven hämatopoetischen Chalonextrakte zur Behandlung der Leukämie verwendet werden können.

Es wurde nämlich festgestellt, daß Patienten, die an Krankheiten oder Krankheitszuständen leiden, die entweder von einer unkontrollierten Mitose von bestimmten so Elementen des Blutes, die zu einer Leukämie führt, begleitet sind, oder an solchen, bei denen es zweckmäßig ist, die weitere Proliferation von bestimmten Elementen des Bluts zu kontrollieren, z. B. bei Organtransplantationen oder Hautaufpfropfungen, diese mit einem überrasehenden Erfolgsgrad und ohne gefährliche Nebenwirkungen behandelt werden können.

Durch die Erfindung wird daher ein Arzneimittel zur Verfügung gestellt, das zusammen mit einem pharmazeutisch annehmbaren Träger oder Verdünnungsmittel ein hochgereinigtes granulocytisches Chalon oder ein wie oben beschrieben hergestelltes Chalon enthält.

Die Bezeichnung »pharmazeutischer Träger« soll sich nicht auf übliche Lösungsmittel erstrecken, wie sie normalerweise verwendet werden, sondern vielmehr nur solehe Lösungsmittel bezeichnen, die besonders für pharmazeutische Zwecke angepaßt worden sind, indem sie z. B. steril oder pyrogenfrei gemacht worden sind.

Im Falle der myeloischen Leukämie verabreicht man dem Patienten über eine Zeltspanne Dosen eines Arzneimittels mit einem granulocytischen Chalon, oder man wiederholt die Dosisverabreichungen In fixierten Zeitintervallen.

Die Größe und die Frequenz der Dosen und die Dauer und das Ausmaß der Behandlungsperlode oder Behandlungsperloden hängen von solchen Faktoren, wie der Stufe des Fortschreltens der Krankheit und von dem allgemeinen medizinischen Zustand des Patienten, ab.

Das Arzneimittel kann in Dosiseinheitsform vorliegen.

Dosierungen über einen weiten Bereich, z. B. 10 bis 200 mg pro Tag über eine Zeltspanne von 4 bis mehr als 40 Tage, sind erfolgreich verabreicht worden. Je nach dem Zustand bzw. der Stufe der Krankheit können jedoch höhere oder niedrigere Dosierungen und längere oder kürzere Dosierungsperioden zweckmäßig sein.

Das Arzneimittel, das das Chalon enthält, liegt vorzugsweise in Form einer injizierbaren Lösung vor, wobei ein geeigneter Träger z. B. physiologische Kochsalzlösung ist. Ein besonders gut geeignetes Chalon für die Verabreichung auf diese Weise Ist ein nach dem oben beschriebenen Verfahren hergestelltes granulocytisches Chalon. Eine geeignete Formulierung für eine solche Zubereitung ist Ig granulocytisches Chalon in 100 ml physiologischer Kochsalzlösung.

Die Konzentration des Chalons in einer solchen Zubereitung kann Innerhalb weiter Grenzen variiert werden, mit der Maßgabe, daß das injizierte Volumen nicht zu groß wird.

Die injizierbare Zubereitung kann durch herkömmliche pharmazeutische Techniken hergestellt werden, wobei man das Chalon in der physiologischen Kochsalzlösung auflöst. Die Lösung wird durch ein geeignetes steriles bakterienfestes Filter oder durch eine andere geeignete Maßnahme sterilisiert. Hierauf wird die Lösung in Ampullen oder andere geeignete Behälter in solcher Weise abgefüllt, daß die Sterilität aufrechterhalten wird. Wenn die Lösung in einen Vleldosenbehälter eingebracht wird, dann kann die Anwesenheit eines Bakteriostatikums zweckmäßig sein.

Eine alternative Formulierung ist 100 mg granulocytisches Chalon In 100 ml Wasser zur Injektion.

Die Formulierung wird nach den oben beschriebenen pharmazeutischen Techniken hergestellt.

Antioxidantien, Puffer oder andere pharmazeutische Hilfsmittel können in den pharmazeutischen Zubereitungen enthalten sein.

Die pharmazeutische Zubereitung kann auch in Form einer Infusionslösung, z. B. einer Lösung für die intravenöse Infusion, vorliegen.

Das granuiocylische oder iymphocyiische Chaion wird in einem geeigneten Träger, z. B. physiologischer Kochsalzlösung, aufgelöst und durch Infusion, z. B. sterile intravenöse Infusion, mit geeigneter Geschwindigkeit und über die gewünschte Zeitspanne verabreicht.

Die pharmazeutische Zubereitung kann auch in Form einer Zubereitung mit kontrollierter Freisetzung verabreicht werden, z. B. als Implantation, wobei das Chalon mit einem Polymeren komplexiert oder kombiniert ist.

Mit 7 Patienten mit myelolscher Leukämie (5 akute und 2 chronische Leukämien in Metamorphose), die mit granulocytischem Chalon über verschiedene Zeltspannen behandelt wurden, wurden klinische Ergebnisse erhalten.

Es wurde gefunden, daß die Verabreichung des Chalons die Proliferation der Leukämie- und vermutlich auch der normalen granulocytischen Zellen inhibierte, wobei alle anderen Zelltypen nicht angegriffen wurden.

Die Inhibierung des Wachstums der leukämIschen Zellen war bei 6 der 7 Patienten ausgeprägt, und In S Fällen erfolgte eine tatsächliche Regression der Leukämie, die In Abwesenheit irgendeiner Aufrechterhaltungstheraple mehrere Monate lang anhielt. In einem Fall erfolgte eine vollständige Remission. Die Chalonbehandlung führte auch zu einer Verstärkung der Erythropoesie und der Megakarypoesle. Weiterhin ergab sie Erscheinungen, von denen einige vollkommen unerwartet waren, z. B. eine Immunostimulierung und eine erhebliche Resistenz gegenüber von bakteriellen Infektionen, und zwar selbst beim Vorliegen einer extremen Granulocytopänie.

Die Untersuchung zeigt eindeutig, daß granulocytisches Chalon gegenüber einer myelolschen Leukämie beim Menschen biologisch aktiv 1st.

Je nach dem unterschiedlichen klinischen Zustand des Patienten variierten die Chalondoslerungen und die Dosierungsschemen weit Innerhalb der einzelnen Patienten und manchmal auch beim gleichen Patienten zu verschiedenen Zelten. Ein weiter Dosierungsbereich, z. B. von 10 mg bis 200 mg pro Tag, hat sich je nach dem klinischen Zustand des Patienten als wirksam erwiesen. Das Chalon wurde über variierende Zelträume, z. B. 4 bis 48 Tage, verabreicht.

Das granulocytlsche Chalon erwies sich auch bei einigen Patienten als wirksam, die zuvor mit der normalen Induktionsbehandlung von cytotoxlschen Arzneimitteln In verschiedenen Kombinationen als Aufrechterhaltungstheraple behandelt worden waren, z. B. mit Daunorubicin, Cytarabln und Prednlson sowie mit Methotrexat und Mercaptopurln. Alle diese Patienten hatten mehr als eine Induktionsbehandlung ohne Erfolg erhalten. Für die Behandlung und die erhaltenen Ergebnisse können Beispiele gegeben werden.

Fall 1

Eine 62jährlge Frau, deren Knochenmark hyperzellular war, zeigte eine aktive pathologische Entstehung von Knochenmarkszellen mit einem Reifungsstillstand und mit Auer-Stäbchen In den Myeloblasten. Das periphere Blut enthielt 8,5% Blaster.. Es wurden 1,5% Promyelocyten/MycIocyten und eine akute myeloische Leukämie diagnostiziert. Am Tag 0, 1 und 2 erhielt die Patientin 2 χ 100 mg granulocytlsches Chalon. Am Tag 3 erhielt sie 2 χ 50 mg Chalon. Keine anderen Arzneimittel, wie cytotoxlsche Mittel, waren zuvor verabreicht woiden. Die viertägige Behandlung führte zu einer vollständigen Remission der Leukämie, wobei die abnormen Zellen aus dem Blut und dem Knochenmark verschwanden. Am Tag 4 wurde durch einen In-vltro-Test gefunden, daß die DNA-Synthese In dem Knochenmark um 70% inhibiert worden war, wobei jedoch die cytopoetlsche Kapazität des Knochenmarks Im Vergleich zu einer am Tag 2 abgenommenen Probe nicht verringert war. Am Tag 16 waren sowohl das Knochenmark als auch das periphere Blut von abnormen Zellen frei. An diesem Tag war die Knochenmarkscytologie normal und der klinische Zustand der Patientin war sehr gut (sie wurde am Tag 10 aus dem Krankenhaus entlassen). Sie war aktiv und bewegungsfähig. Die Verbesserung der Anämie der Patientin, die durch die Bluttransfusion bewirkt worden war, wurde aufrechterhalten, was auf eine Wiederkehr der erythropoetlschen Funktion des Knochenmarks hindeutet. Es wurde eine volle Remission erzielt, welche bis zum Tag 171 fortgeführt wurde.

Nach der ersten Chaloninjektlon nahmen die Werte der ar,-, Ot₁- und y-Globullne zu. So betrug z. B. der IG-Wert 14 g/l am Tag 2, 14 g/l am Tag 4 und 19 g/l am Tag 17. Die Retlculocytenzählungen blieben innerhalb normaler Werte, was wiederum darauf hinweist, daß die Patientin eine aktive Erythropoesie hatte.

Die Plättchenzählungen blieben Innerhalb der normalen Grenzen während und nach der Behandlung.

Obgleich der klinische Zustand der Patientin bis zum Tag 171 ausgezeichnet blieb, begannen etwa am Tag 94 ungefähr 10 bis 15% abnorme Zellen in dem Knochenmark aufzutreten (wobei Auer-Körper festgestellt wurden), doch war das periphere Blut von abnormen Zellen frei. Die Erythropoesie blieb weiterhin aktiv. Ungefähr am Tag 331 hatte sich der Zustand der Patientin verschlechtert mit mehr als 50% Blasten In dem Knochenmark, wobei die Granulopoesle und die Erythropoesie vermindert waren. Am Tag 365 wurde Chalon 9 Tage lang verabreicht, wobei Im Laufe dieses Zeitraums insgesamt 600 mg verabreicht wurden. Die Medikation führte zu einer unmittelbaren Antwort In der Inhibierung des Wachstums der Leukämiezellen, was zu einer Regression führte. Am Tag 373 wurde die Patientin mit ausgezeichnetem Zustand entlassen. Jedoch hatte um den Tag 383 herum die abnormale Zellzählung wiederum anzusteigen begonnen. Es wurde erneut Chalon verabreicht, wobei eine Gesamtdosis von 770 mg im Verlauf von 10 Tagen verabreicht wurde. Die Zunahme der Wachstumsrate der abnormen Granulocyten wurde erneut vermindert. Aufgrund von nicht ausreichenden Chalonvorräten wurden der Patientin cytotoxlsche Arzneimittel bis zum Tag 423 verabreicht, an dem sie an Blutvergiftung starb.

Fall 2

Ein weiteres Beispiel Ist der Fall eines 31 Jahre alten Mannes mit einer erhöhten WBZ-Zählung, wobei ungefähr 80% der Zellen abnorme Myeloblasten waren (Auer-Stäbchen waren vorhanden). Nur 4% der WBZ waren reifere Formen von Granulocyten. Das Knochenmark war hyperzellular, und es zeigte eine aktive pathologische Myelopoesle. Mehr als 90% der Zellen waren abnormale Blasten. Die Erythropoesie und die Megakaryopoesie waren stark gedämpft, jedoch waren sie morphologisch normal. Die nicht zu bezweifelnde Diagnose war eine akute myeloblastlsche Leukämie. Der Patient wurde mit granulocytlschem Chalon In Dosismengen von 10 bis 40 mg pro Tag über eine Gesamtperlode von 40 Tagen behandelt, wobei Dosierungsperioden sich mit Nicht-Dosierungsperloden abwechselten.

Am Tag 0 enthielt des Knochenmark ungefähr 90%

so leukämische Blasten, und das periphere Blut enthielt 75 bis 90% abnorme Zellen. Am Tag 13 waren nach einer 8täglgen Chalonbehandlung mit 40 mg pro Tag die abnormen Zellen auf 52% Im peripheren Blut zurückgegangen. Die Knochenmarksprobe zeigte keine myelo-Ische Mitose. Sie war weniger zellförmig, und ein großer Verhältnisteil der Myeloblasten war verschwunden. Die Erythropoesie und die Megakarypoesle waren ausgeprägter. Am Tag 14 waren die abnormen Zellen In dem peripheren Blut auf ungefähr 29% vermindert worden. Der Patient wurde aus dem Krankenhaus entlassen. Nach einer weiteren Behandlungsperlode waren am Tag 37 keine abnormen Zellen in dem peripheren Blut vorhanden. Die WBZ-Zählung pendelte sich bei C.2x 19°/1 ein. Nach Beendigung der Dosierung blieb diese Situation 2 Monate lang unverändert, wobei sich der Patient in ausgezeichnetem klinischem Zustand befand.

Es wurde eine Verbesserung des Knochenmarksbildes mit einer ausgeprägten Erhöhung der Thrombocyten und

Tag

15

der Reticulocyten aufrechterhalten. Die Anämie sprach Tabelle I auf eine Bluttransfusion an, wobei die Antwort länger aufrechterhalten wurde, als normalerweise zu erwarten gewesen wäre.

Vom Tag 30 bis zum Tag 96 hatte der Patient ein im wesentlichen normales Leben, und zwar trotz der Tatsache, daß er, während er sich Im Zustand einer ausgeprägten Granulocytopänie befand, dem normalen Angriff von Mikroorganismen ausgesetzt war. Die Retlculocyt- und Plättchenzählung des Patienten stieg während der Behandlung auf das 6- bis 8fache an.

Am Tag 80 erlitt der Patient eine schwere Virusinfektion. Die WBZ-Zählung verdoppelte sich, und In dem Blut erschienen leukämische Blasten. Mit rasch fortschreitender Krankheit wurde er wieder in das Krankenhaus eingeliefert. Am Tag 98 wurde Chalon 12 Tage mit 10 mg viermal täglich verabreicht, und der Patient sprach darauf gut an. Die Leukämie wurde zwar angehalten, doch schritt beim Abbruch der Chalonbehandlung die Leukämie erneut fort; was von einer Verminderung der 20 ¹⁸> Serumlmmunoglobullngehalte begleitet war. Aufgrund des Chalonmangels wurden dem Patienten cytotoxische Arzneimittel verabreicht, doch starb dieser am Tag 346 an einer Blutvergiftung.

In allen behandelten Fällen erfolgte eine direkte Antwort auf das Chalon, wobei die Leukämie zumindest kontrolliert werden konnte und in manchen Fällen eine Remission erhalten werden konnte. Wenn man alle akuten Fälle betrachtet, dann wurde eine erhebliche Zunahme der mittleren Lebenserwartung erzielt.

Behandlung der Patientin 3 mit Chalon (Ansätze 1 und 2)

Chalondosierung
Ansatz 2

Ansatz 1

0bis2 .0

4 bis

8,9 10 11, 12
13 bis 17

10 mg X 2

10 mg und 20 mg

20 mg X 2

20 mg

20 mg X 2

20 mg

20 mg X 2

10 mg x 2

keine Behandlung

10 mg

Behandlungsbeobachtungen

Fall 3

Die Patientin war eine 61 Jahre alte Frau, die im März 1975 wegen einer tiefen Thrombophlebitis im rechten Bein in das Krankenhaus eingeliefert wurde. Die Patientin hatte durch Fieber erhöhte ESR-Werte und eine hohe WBZ-Zählung (Fig. 3) mit 80% abnormalen Blasten im Blutausstrich. Ein Knochenmarkaspirat war hyperzellulär, und es zeigte eine aktive pathologische Myelopoesie (mehr als 90% der Zellen waren leukämische Blasten). Die anderen Zellzahlen erschienen normal. Die Milz, die Leber und die Lymphknoten waren nicht vergrößert. Die Patientin hatte eine durch Diät kontrollierte milde Diabetes. Die Thrombophlebitis legte sich nach einer Wärfarintherapie.

Behandlung

Die vollen Einzelheiten der Chalonbehandlung, die in diesem Falle angewendet wurde, sind !n Tabelle I zusammengestellt.

' Die Chalonbehandlung wurde mit zwei täglichen Injektionen von 10 mg (ca. 0,17 mg/kg; zweiter Ansatz) begonnen und nach 3 Tagen auf 20 mg erhöht. Nach 13 Tagen wurde die Behandlung der Patientin auf Injektionen des Ansatzes 1 umgestellt, doch mußte aufgrund des pyrogenen Verhaltens die Dosis vermindert werden (10 mg χ 2). Selbst dann waren die Reaktionen noch stark und von Erbrechen begleitet. Es wurde bald ersichtlich, daß die Chalondosis nicht angemessen war. Ein weiteres Zurückdrängen der Leukämie oder sogar die Aufrechterhaltung der Verbesserung war mit dieser Dosierung nicht möglich, und die Behandlung wurde unterbrochen.

40

45

55

60 Die hämatologischen und biochemischen Werte sind in Fig. 3 und Tabelle V zusammengestellt. Die Zählung der weißen Blutzellen stieg etwa eine Woche nach Beginn der Behandlung lang an. Jedoch verminderte sich nach 10 Tagen die Zellzählung, und der Vorbehandlungswert wurde am Tag 13 erreicht. Nach der Veränderung der Chalonzubereltung am Tag 13 und der verminderten Reduktion der Chalondosierung erfolgte ein weiterer Anstieg der WBZ-Zählung (Tabelle II).

Am Tag 24 wurde eine Chemotherapie (Thloguanin, Daunorubicin, Cytarabln und Prednison) nach einem weltergehenden Anstieg der WBZ-Zählung begonnen. Auf diese Arzneimitteltherapie folgte ein rapider Abfall der Leukozytenzählung (Tabelle II), doch wurde keine komplette Remission erreicht.

Während der ersten Hälfte der Chalonbehandlung schritt die Anämie der Patientin rasch voran (etwa 3 g/l pro Tag). Nach Transfusionen von roten Zellen blieb jedoch der Hb-Wert im wesentlichen etwa 2 Wochen lang konstant (Tabelle II). Nach dem Beginn der Arzneimitteltherapie nahm das Hämoglobin erneut mit hoher Geschwindigkeit ab (fast 5 g/l pro Tag), und der Effekt der nachfolgenden Transfusionen war sodann in typischer Weise nur kurz anhaltend. Die Patientin hatte normale und im wesentlichen konstante Plättchenzählungen während der Periode der Chalonbehandlung, doch verschlechterte sich die Situation mit dem Beginn der Arzne!m!tte!therap!e (vgl. Tabelle H).

Die Werte für diesen Fall zeigen, daß zwar am Anfang ein Zurückgehen der Erkrankung erfolgte, daß dieser Effekt jedoch verlorenging, als als direktes Ergebnis der Unfähigkeit der Patientin, die pyrogene Natur des Ansatzes 1 zu ertragen, die Dosis halbiert werden mußte. Für dies hätte die Krankheit möglicherweise dem Muster von anderen akuten Fällen gefolgt, da am Tag 3 die immunologische Kapazität der Patientin angemessen erschien (Immunoglobulinwerte von 15,0, 3,3 und 2,0 g/I von L.G, LA und I_eM wurden gemessen). Weiterhin zeigten am Tag 24 am Beginn der Standardarzneimitteltherapie die Lymphozyten der Patientin eine vernünftige gute Antwort auf die Stimulierung durch Phytohämaeelutinin.

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Fall 4

Diese Patientin, die erste von drei Fällen, die einer herkömmlichen Chemotherapie gegenüber unempfindlich war, war eine 61 Jahre alte Frau mit einer chronischen granulozytischen Leukämie, die seit 1970 mit Busulphan und Prednison behandelt worden war. Im März 1975 entwickelte sich eine blastische Krise, und die Zahl der weißen Blutzellen der Patientin stieg auf 16Ox 10⁹/l an. Große Dosen von Mercaptopurin verminderten zwar die Zellzählung Innerhalb von 3 Wochen auf 1,6 χ 10Vl, doch war nach weiteren 3 Wochen die WBZ-Zählung erneut hoch (101 χ lO'/l). Eine geringe Dosis von Mercaptopurin wurde 3 Tage lang verabreicht, bevor die Patientin die Chalonbehandlung erhielt.

Der allgemeine Zustand der Patientin war bei der Aufnahme schlecht, und es lag eine offene Diabetes (die eine Insulintherapie erforderlich machte) vor, die wahrscheinlich das Ergebnis einer verlängerten Prednisonverabreichung war. Die Milz war enorm groß, und sie erstreckte sich unter den Umbilicus. Die Leber war mäßig vergrößert. Die WBZ-Zählung war hoch mit 60% leukämlschen Blasten im Blutausstrich. Sie war anämisch, und ihre P13ttchenzählung war subnormal.

Behandlung

Die vollen Einzelheiten der Chalonbehandlung und der Unterstützungstherapie für die Patientin sind in der Tabelle III zusammengestellt.

Die Chalonbehandlung wurde mit zwei täglichen Injektionen von jeweils 10 mg (ca. 0,17 mg/kg, erster Ansatz) begonnen. Nach 2 Tagen wurde die Zubereitung verändert (zweiter Ansatz), und am Tag 7 wurde die Dosis verdoppelt. Am Tag 3 erhielt nach einem Bruch

IS der Milz (vgl. unten) die Patientin, während sie sich immer noch im Schock befand (Blutdruck 60/40 mm Hg), Chalon, das keine nachteiligen Effekte zeigte. Die Chalonbehandlung wurde am Tag 9 abgebrochen, da der klinische Zustand der Patientin hoffnungslos erschien (vgl. unten).

Tabelle III

Behandlung des Falls 4 mit Chalon (Ansätze 1 und 2)

Tag	Chalondosierung
0	10 mg x 2 (Ansatz 1)
1	20 mg (Ansatz 1) + 10 mg (Ansatz 2)
2 bis 5	10 mg x 2 (Ansatz 2)
6	10 mg & 20 mg (Ansatz 2)
7 bis 8	20 mg x 2 (Ansatz 2)
9	20 mg X 2 (Ansatz 2)

unterstützende Behandlung

Einheiten Bluttransfusion am Tag 3

Einheiten Transfusion

Beobachtungen bei der Behandlung

Die hämatologlschen und biochemischen Werte sind In der Tabelle IV angegeben.

Am Tag 3 riß etwa 12 h nach der letzten Chalondosls die Milz der Patientin spontan, und es begann eine Darmblutung. Der Riß wurde sofort entdeckt, und dem Schock wurde in angemessener Welse entgegengewirkt. Indem eine Transfusion durchgeführt wurde. Die Intraabdomlnale und die Darmblutung dauerte jedoch trotz der Plättchentransfusion weiter an.

Der Effekt der Chalonlnjektlonen auf die WBZ-Zählung In diesem Falle war von den Veränderungen überschattet, die von dem Milzriß herrührten (Tabelle IV). Die einzigen Feststellungen, die einen gewissen Effekt auf die Leukämie nahelegen, waren eine Veränderung der blutbasophllen Zahl (Tabelle IV, wobei zu beachten Ist, daß die Basophilen üblicherweise bei chronischer granulozytlscher Leukämie als schlechtes prognostisches Anzeichen angesehen verden) sowie eine temporäre Erhöhung von LDH und der alkalischen Phosphatasewerte, gefolgt von einer Verminderung auf Werte unterhalb der Vorbehandlungswerte (vgl. andere Fälle).

Die Patientin starb am Tag 14. Die Autopsie bestätigte die klinische Diagnose, zeigte jedoch keine Anzeichen für eine chalonlnduzlerte Organbeschädigung.

In diesem Falle kann hinsichtlich des Effekts der Chalonbehandlung des leukämlschen Zustandes keine Schlußfolgerung gezogen werden. Die Tatsache, daß die Behandlung mehrere Tage nach dem Mllzrlß fortgeführt werden konnte, ohne daß der Zustand verschlechtert wurde. Ist jedoch ein Hinwels auf die gutartige Natur der Chalone.

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Fall 5

Die Patientin war eine 53 Jahre alte Frau, bei der eine akute myeloblastlsche Leukämie Im November 1974 diagnostiziert worden war. Im Januar und Februar 1975 erhielt die Patientin 4 Einführungen von Daunomycin, Cytarabln und Prednlson In 10-Tages-lntervallen, wobei Methotrexat und Mercaptopurin als Aufrechterhaltungstheraple gegeben wurden. Eine vollständige Remission der Leukämie wurde jedoch nicht erhalten.

Im April 1975 wurde die Patientin erneut mit schlechtem Zustand in das Krankenhaus eingeliefert. Sie hatte Fieber (39° C), hohe ESR-Werte, Anämie, Thrombocytophenie und erhöhte Zählung der weißen Blutzellen (Tabelle V). Etwa 80% der Blutzellen waren leukämische Blasten. Untersuchungen zeigten, daß die Patientin eine Pleuritis, Pericarditis und maxilare Slnultls hatte. Sie hatte auch einen Herzschaden nichtfestgestellten Typs (der möglicherweise nicht von Daunorubicln bewirkt worden war, da die Gesamtdosis dieses Arzneimittels unterhalb derjenigen lag, die von der WHO als wahrscheinlich angesehen wird, Herzschäden zu bewirken). Am Abend des zweiten Tages der Chalonbehandlung (etwa 12 h nach der letzten Dosis) stieg die schon normalisierte Temperatur der Patientin rasch an, und eine kardiale Arhythmie wurde beobachtet (in dem Elektrokardiogramm wurden sowohl nodale als auch nlchl nodale Rhythmen festgestellt). Am nächsten Tag em wickelte sich ein atrlales Flimmern, das zu einem regulä ren ventrlkulären Rhythmus ohne offene klinisch Symptome führte.

Behandlung

Einzelheiten der Chalonbehandlung und der Unter Stützungsbehandlung sind in Tabelle V zusammenge

ίο stellt.

Neben Chaloninjektlonen und Transfusionen voi roten Zellen erhielt die Patientin Antibiotika (Globacillli [Azidoclllln] sodann Chloramphenicol), Digitalis unc Diuretlka. Nach dem Entschluß, die Chalonbehandlunj

is anzuwenden, wurden cytostatische Arzneimittel am Taj 4 abgesetzt. Die Chalonbehandlung wurde mit einei täglichen Injektion von 20 mg (ca. 0,36 mg/kg, erstei Ansatz) gestartet. Nach 2 Tagen wurde die Dosis aul 20 mg χ 2 (zweiter und dritter Ansatz) erhöht. Der erste Ansatz bewirkte eine starke pyrogene Reaktion, die vor Erbrechen und mäßigen Schmerzen des Respirationstrakts begleitet war. Der zweite und der dritte Ansatz waren jedoch ohne Nebenwirkungen. Nach der erheblichen Verbesserung ihres Allgemeinzustandes beschloß die Patientin, das Krankenhaus zu verlassen, und die Behandlung wurde daher nach dem Tag 19 abgebrochen.

Tabelle V

Tag

Chalondosierung

unterstützende Behandlung

-2 bis -1

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2

6 bis 13

14

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10 mg x 2 (Ansatz 2)

10 mg X 2 (Ansatz 2)
20 mg X 2 (Ansatz 2)
20 mg X 2 (Ansatz 2)
20 mg X 2 (Ansatz 2)
20 mg X 2 (Ansatz 3)

Bluttransfusion (2 Einheiten)
Globacillin 150 mg X 2
Digoxin 0,25 X 1

Globacillin 150 mg X 2

Globacillin 150 mg x 2
Digoxin 0,25 X 1

Globacillin 150 mg x 2
Digoxin 0,25 X 3

Globacillin 150 mg x 2
Globacillin 150 mg X 2
Globacillin 150 mg x 2
Chloramphenicol 500 mg X 3
Chloramphenicol 500 mg X 3

Beobachtungen bei der Behandlung

Die biochemischen und hämatologischen Werte sind in den Tabellen VI und VII zusammengestellt.

Nach dem Absetzen der Arzneimittel war ein Anstieg der Zählung der weißen Blutzellen festzustellen. Der Effekt der Chalonbehandlung war nur nach 2 Wochen erkennbar, als die WBZ-Zählung abzusinken begann (Tabelle VI). Eine Hemmung der leukämischen Proliferation wurde jedoch zuvor durch Knochenmarksproben nahegelegt, die zeigten, daß die Myelopoesie morphologsich chronischer geworden war als beim Beginn der Behandlung.

Es wird erkannt, daß bei der akuten myelolden Leukämie ein Reifungsstillstand in einer frühen Stufe der Sequenz der Entwicklung der granulozyüschen Reihen, beispielsweise des promyelozytischen oder myelozytlsehen Levels, vorliegt. Bei der chronischen Form der Krankheit ist dieser Effekt weniger ausgeprägt, und es wird ein erheblich breiteres Spektrum der Zellreife Innerhalb der Granulozytenreihe beobachtet.

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Leukozyten (Gesamt) X ΙΟ"⁸ (Zellen/l)

Lymphozyten X ΙΟ"⁸ (Zellen/l)

Granulozyten X ICH (Zellen/l)

Promyelozyten

Myelozyten (%)

Metamyelozyten

Bandzellen (%)

polymorphe Neutrophile (%)

gesamte Neutrophile (%)

Eosinophile

Basophile (%)

Monozyten

leukämische Blasten (%)

Lymphozyten (%)

Erythrozyten

x ΙΟ"¹² (Zellen/l)

Reticulozyten (%)

Hämoglobin (g/l)

Hämatokrit (%)

E.S.R.-Wert (mm/h)

Plättchen x ΙΟ"¹⁰ (Zellen/1)

ASAT (SGOT) (Einheiten/1)

LDH

(Einheiten/1)

alkalische Phosphatase (Einheiten/1)

Harnsäure (μΜοΙ/1)

Creatinin (μΜοΙ/1)

Peroxidase H-ve-Zellen

alkalische Phosphatase +ve-Zellen (%)

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280

Tag - Zahl

Leukozyten (Gesamt) x ΙΟ"⁸ (Zellen/l)

Lymphozyten x ΙΟ"⁸ (Zellen/1)

Granulozyten x ΙΟ"⁸ (Zellen/l)

Promyelozyten

Myelozyten Metamyelozyten

Bandzellen

polymorphe Neutrophile gesamte Neutrophile Eosinophile Basophile Monozyten leukämische Blasten Lymphozyten

Erythrozyten

x ΙΟ"¹² (Zellen/l)

Reticulozyten

Hämoglobin (g/l)

Hämatokrit

E.S.R.-Wert (mm/h)

Plättchen x 10"¹⁰ (Zellen/l)

ASAT (SGOT) (Einheiten/1)

LDH

(Einheiten/1)

alkalische Phosphatase (Einheiten/1)

Harnsäure (uMoI/1)

Creatinin (μΜοΙ/1)

Peroxidase +ve-Zellen

alkalische Phosphatase +ve-Zellen (%)

990 SG 93

Nach dem Beginn der Chalonbehandlung verminderte sich tier llümoglobinwerl langsam 3 Wochen lang (ca. Ι..ϊ g/l pro lag), doch stieg er während des nächsten Monats tatsächlich wieder an (Tabelle VI). Diese Reaktionen standen Im scharfen Gegensatz zu den Veränderungen, die nach der Wiederaufnahme der Arzneimitteltherapie gesehen wurden (Tabelle VI). Wie bei den anderen Patienten, zeigte sich auch hier ein indirekter günstiger Effekt der Chalonbehandlung bei den Plätlchenzählungen (vgl. Tabelle VI). Es trat eine Erhöhung auf, die - obgleich sie weniger ausgeprägt als bei einem anderen Kali ist - die subnormale Plättchenzählung verdoppelte. Diener Wert wurde über mehr als l'/₂ Monate aufrechterhalten.

Es war eine ausgeprägte Verbesserung des allgemeinen Zustands der Patientin während der Chalonbehandlung festzustellen, die offenbar auf das Nachlassen sowohl der Pleuritis als auch der Pericarditis (was.durch anschließende Röntgenuntersuchungen gezeigt wurde) zurückzuführen war. Beide Komplikationen waren möglicherweise von einer leukämischen Infiltration anstelle von Bakterien bewirkt worden, was anhand des ausnehmend günstigen klinischen Verlaufs geschlossen werden kann.

Später wurden noch während der Aufrechterhaltungstherapie andere Anzeichen einer leukämischen Infiltration festgestellt, wie z. B. die Entwicklung von Knötchen im üewebe des unteren Augenlids. Diese verschwanden eventuell, als als Ergebnis einer nicht angemessenen hämalologischen Antwort die Dosis der zytotoxischen Arzneimittel erhöht wurde.

Nach dem Aufhören der Chaloninjektionen nahm die WliZ-Zahlung 2 Wochen lang ab (Tabelle VI). Nach weiteren 2 Wochen stieg jedoch die Zellzählung wiederum an. Zu diesem Zeilpunkt wurde die Arzneimitteltherapie (Cyclophosphaniid. Cytarabin, Prednison) wieder aufgenommen.

Vom Februar bis April 1975 war, obgleich die Aufrechterhaltungstherapie durchgeführt wurde, der klinische Zustand der Patientin sehr schlecht. Die Behandlung mit Chalon ergab eine dramatische Verbesserung dieses Zustands, und sie war erfolgreicher, um eine günstige Veränderung des hämalologischen Bildes zu bewirken, als Methotrexat und Mercaptopurln.

Der Zustand der Patientin hatte sich so verbessert, daß sie aus persönlichen Gründen beschloß, das Krankenhaus

to zu verlassen. Dieser Entschluß wurde in Übereinstimmung mit ihrem Arzt gefaßt. Es wurde keine Form einer Aufrechterhaltungstheraple verschrieben. Ihr Zustand blieb gut, was sich aus den zufriedenstellenden hämalologischen Ergebnissen ergab, die während zwei nachfolgenden Untersuchungen in wöchentlichen Intervallen durchgeführt wurden. Der Patientin wurde gestattet, nach weiteren 2 Wochen ohne Untersuchung oder AuI-rechterhaltungstherapie nach Hause zurückzukehren. Unglücklicherwelse verschlechterte sich die Situation, und es ist anzunehmen, daß, wenn die Chalonbehandlung fortgeführt worden wäre, dann ein günstigerer klinischer Zustand erhalten worden wäre.

Tabelle VII

Serumimmunoglobulinwerte (g/l)
(Fall 5)

Tag Nr.

IgG

IgM

IgM

18

15

2,4
1,7

2,5
1,7

Hierzu 2 Blatt Zeichnungen

Claims (4)

Patentansprüche:

1. Verfahren zur halbkontinuierlichen Behandlung von Gesamtblut zur Herstellung von biologisch aktiven hämatopoetischen Chalonextrakten, bei dem Blut, welches ein Antlkoagulans enthält, in Gegenwart eines lytischen Mittels lysiert wird, das lysierte Blut mit Einschluß der Leukozyten zentrifugiert wird, daß letztere Im wesentlichen intakt bleiben, während Leukozyten zusammen mit von der Lysis der roten Blutzellen herrührenden Stroma an der Rotoroberfläche angeheftet werden, die Intakten Leukozyten und das rote Blutzellenstroma von der Rotoroberfläche entfeint werden, die im wesentlichen intakten Leukozyten zusammen mit dem Stroma mil einem Extraktionsmittel extrahiert werden, der Extrakt, der granulocytische, erythrocytlsche und lymphocytische Chalone enthält, einer Ultrafiltration unterworfen wird, so daß das granulocytische und das erythrocytlsche Chalon von dem lymphocytischen Chalon und von den anderen restlichen Blutmaterialien abgetrennt werden und die granulocytischen, erythrocytischen und lymphocytischen Chalone aus den Fraktionen der Ultrafiltration gewonnen werden, dadurch gekennzeichnet, daß man

a) das Blut in eine kontinuierliche Lyslseinheit leitet, welches eine Zone turbulenter Strömung In einer Gegend aufweist, die an die Rohreinlässe für das Blut und lytische Mittel angrenzt und bei der eine Zone der laminaren Strömung sich an die Zone der turbulenten Strömung anschließt, wobei die Strömungsgeschwindigkeit von Blut und Kochsalzlösungen so eingestellt wird, daß eine nahezu vollständige Lysis der roten Blutzellen mit einem Minimalverlust an Leukozyten während der Verweilzeit in der kontinuierlichen Lysiselnheit gewährleistet Ist, und

b) die nach dem Zentrifugieren an dem Rotor anhaftenden Leukozyten durch Waschen des Rotors mit einer Flüssigkeit entfernt wird, die eine tragende, nicht beschädigende, Isotonische salzhaltige Lösung ist.

2. Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß die Fließgeschwindigkeit des Blutes und des lytischen Mittels durch die kontinuierliche Lysiselnheit 60 l/h beträgt.

3. Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß die Waschflüssigkeit In b) vom Anspruch 1 glucosehaltige Kochsalzlösung Ist, mit einer Konzentration an Kochsalz von 0,9 Gew.-%/Volumen und einer Menge von 0,01% Glucose.

4. Arzneimittel, enthaltend als Wirkstoff den nach den Ansprüchen 1 bis 3 hergestellten Chalonextrakt.

rend Leukozyten zusammen mit von der Lysis der roten Blutzellen herrührendem Stroma an der Rotoroberfläche angeheftet werden, die intakten Leukozyten und das rote Blutzellenstroma von der Rotoroberfläche entfernt werdsn, die im wesentlichen Intakten Leukozyten zusammen mit dem Stroma mit einem Extraktlonsr.iittei extrahiert werden, der Extrakt, der granulocytische, erythrocytlsche und lymphocytische Chalone enthält, einer Ultrafiltration unterworfen wird, so daß das granulocytische und das erythrocytlsche Chalon von dem lymphocytischen Chalon und von den anderen restlichen Blutmaterialien abgetrennt werden und die granulocytischen, erythrocytischen und lymphocytischen Chalone aus den Fraktionen der Ultrafiltration gewonnen werden. Die Erfindung betrifft weiterhin ein Arzneimittel, das den auf diese Welse hergestellten Chalonextrakt enthält. Chalone sind gewebespezifische, jedoch artunspeziflsche chemische Inhibitoren der Mitose, die zur Behandlung der Leukämie verwendet werden können. Die Abtrennung der Leucocyten aus dem Gesamtblut ist, ausgenommen im Laboratoriumsmaßstab, schwierig, und es Ist bislang noch kein Verfahren bekannt gewesen, das auf die Dimension der erfindungsgemäßen Arbeiten anwendbar wäre. Es Ist zwar schon eine kontinuierliche Zentrifuge mit spezieller Bauart für die Isolierung der geformten Elemente von 3lut beschriebsn worden (vgl. Tullis et al, »Blood« 1952, 7, Selten 891 bis 896, Science, 1956, 124, Selten 792 bis 797), jedoch erfolgt darin die Abtrennung für Leucocyten in einem diskontinuierlichen Prozeß, bei dem die Geschwindigkeit des Rotors verlangsamt wird, bevor die erforderlichen Zellen herauskommen. Obgleich die abgetrennte Zellfraktion 70% der Population der weißen Zellen (Leucocyten) enthält, enthält sie auch rote und weiße Zellen In einem Verhältnis von 5:1, und außerdem beträgt die Verarbeitungsgeschwindigkeit nur 3 l/h. Der Blutzellenseparator NCI-IBM mit kontinuierlichem Strom (Graw, Herzing et al, Transfusion, 1971, 11, Selten 94 bis 101) stellt zwar eine Vorrichtung für die kontinuierliche Zentrlfugal-Leucapherese von Spenderblut bei klinischen Bedingungen dar, doch hat sie nur einen Durchsatz von etwa 3 l/h mit mittleren Leucocytenausbeuten von nur 22%.

In Europ. J. Cancer, Vol. 6, Seiten 401 bis 410, 1970, wird bereits ein Verfahren zur Herstellung von Chalonen beschrieben, das jedoch für eine Produktion In größerem Maßstab nicht geeignet Ist und zudem nur rohe Zubereitungen liefert.

Aufgabe der Erfindung Ist es, ein Verfahren zur halbkontinuierlichen Behandlung bzw. Verarbeitung von Gesamtblut zur Verfügung zu stellen, um ein Zellmaterlal zu erhalten, aus dem die hämatopoetischen Chalone In einem erheblich größeren Ausmaß als bislang extrahiert werden können.

Diese Aufgabe wird erfindungsgemäß bei einem Verfahren der eingangs erwähnten Art dadurch gelöst, daß man