JPS5942896A - Ｌ−グルタミン酸の分析法、分析用試薬および分析用キット - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 〔１〕　　発明の背景 技術分野 本発明は新規なし一グルタミン酸オキンダーゼを用いる
分析試料中のＬ−グルタミン酸の分析法に関する。また
、本発明はＬ　グルタミン酸オキシダーゼを含有するし
一グルタミン酸の分析用試薬に関する。さらに本発明は
Ｌ−グルタミン酸オキノダーゼを利用ずるし一グルタミ
ン酸の分４Ｊｉ　ＩＩＩキッ１・に関する。

従来技術 従来、Ｌ−グルタミン酸の分析法としてクロマ１・グラ
フィー法、微生物足ｈ１法、電気泳動法おＪ；び酵素法
が知られているが、一般にはクロマ１・グラフィ−＝法
および酵素法が用いられている。

クロマＩ・グラフィ−法としてはアミノ酸自動分析計を
使用する方法が一般的である。この方法は精度および信
頼度が高く優れた方法であるが、装置か高価であり、試
料によっては除蛋白が必要で試料調製法か複雑となるな
との問題点がある。

酵素法としては■Ｌーグルタミン酸脱炭酸酵素を用いる
／Ｊｔノ、および■Ｌ　グルタミン酸脱水素酵素を用い
る方法が知らＡ１でいろ。しかし、これらの既知酵素を
用いる方法は以ドのような問題点があろう すなわち、■■，ーグルタミン酸脱炭酸酵素を用いる方
法においては、反応の測定は反応生成物である炭酸ガス
を検出することによって行われており、通常　■ワ　ル
ブルク検圧計を用いる方法、または＠オートアナライザ
ーを用いる力法が採用され一Ｃいる。■のワールブルク
検圧計を用いる方法は精度は高いが、かなりの熟練を要
する方法であり、測定に長時間を要し、サンプル処理能
力が低い。また、＠のオ　１・アリ−・フィダーを用い
る方θ、は、炭酸ガスをフェノール−ツタレイ．ンの炭
酸ナトリウム溶液に吸収させ、減［＜！　麿から発生し
た炭酸ガスｌｅｔを測定する方法であるので、あらかじ
め酵素液と緩衝液中の炭酸ガスおよび酸素の脱気を冷却
しながら行うなど、予備操作か心安てあり、反応後に気
液分離が必要であり、装置か複雑化するという問題点が
ある。なお、グルタミン酸脱炭酸酵素としては一般にカ
ポチャもしくは大腸菌１１１来の酵素が使用されるが、
カボヂャ由来の酵素は、ウレアーゼ活性を有しており、
尿素を含（ｊ”する試料を対象とする場合には尿素由来
の炭酸カスによって測定誤差を生じるおそれがあり、ま
たこの酵素は酢酸等の有機酸の阻害を受けるため、有機
酸を多く含むサンプルでは酵素活性が阻害されて正確な
結果を得られない欠点があるっまた、大腸菌由来の酵素
は、Ｌ−アルギンおよびＬ−グルタミンに対して活性を
示すので、これらのアミノ酸を多く含む試料を対象とす
る場合には１１；確’Ｌ　Ｑ＋’ｉ果か得られない。ま
た、酵素自体の保存性も良＜　ｔ，１い。

■Ｉ７ーグルタミン酸脱酸素水素酵素Ｌ　グルタミン酸
と水とをＮＡＤ　（酸化型−　：Ｊ−ｆンアミ１・−ノ
′デニンジヌクレオチド）の存在下に反応さゼて／７ー
ケ１・グルタル酸、アンモニアおよびＮＡＤＴＩ（還元
型ニコヂンアミドアデ！ンジヌクレオチド〕を生成する
反応を触媒するか、この酵素を用いる方法においては、
反応の測ｉｉ４１．１．　Ｎ　Ａ　Ｄ　ｆ（の生成量を
３４０ｎｍにおりる吸光１皇の増加を検出することによ
ってなされる。しかし、この酵素反応の平衝けＬ　グル
タミン酸形成に傾いており、この酵素を使用してＩ、−
グルタミン酸を分析するためには、反応の平衝をα−ケ
トグルタル酸を生成する側に寄せなければならす、この
ため種々の二［夫が必要となる。この目的で通常σ−ケ
トグルタル酸の捕捉剤か反応系に添加されるが、濃度を
厳密に調節しなければ反応を阻害することもある。さら
にＮＡＤ／Ａ度も厳密に調節しなければならない。

なお、幅浦ｔ、Ｌど測定波長において吸収を示す物質を
含ｆ１する試料を対象とする場合、空試験の値を用いて
反応によって得られた値を補正しなければならｌまい。

また、使用する酵素に乳酸脱水素酵素活性かイｆ在する
場合かあるのてこのｊ；うな酵素活性の影響も考慮しな
け４１ばならない。

最近、■、−グルタミン酸に対する基質特異性の高いし
　アミノ酸オキシダーゼかストシブ１゛マイセス＜３ｔ
ｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ　；以）、ＩＳｌと略ずこともあ
る。）属に属する微生物、具体的にはス１−レフトマイ
セス・バイオレツセンスの培養によって生産されること
が見出された（特開昭５７　４８６８５　弓公ｍ　参照
）。このグルタミン酸′Ａ−１ノタゼ（以下、「公知酵
素」と略すこともある。）の蛋白質としての理化学的性
質は明らかでは１．Ｘいか、酵素学的性質として記載さ
れている性質を挙けると次のとおりである。

（１）基質特異性 Ｌ　グルタミン酸に対する１１ζ性を１００と（、た場
合、Ｌ−グルタミンに対して８．４．Ｌ−ヒスチジンに
対して６．８の相対活性をン」テし、他のアミノ酸に対
しては実質的な活性は小さない。

（２）　　至適ｐＨ ｐＨ５〜６ （８１ｐＨ安定性 １）Ｈ８，５〜６．５の範囲（３７°Ｃ，１時間保持）
で安定である。

（４）　　温度安定性 ５０°Ｃまて（１０分間保持）安定である。

（５）阻害剤の影響 水銀イオン、銅イオンお、１：ひジエチルジチオブＪル
バメイＩ・ににつてほぼ完全に阻害される。

」１記のようｔ公知酵素をＬ　グルタミン酸の分析に利
用するには種々の問題点がある　すなわち、公知酵素は
従来知られていたＬ−アミノ酸オキシダ　ゼと比較すれ
ばＬ　グルタミン酸に対するノ、（質性異性は高いが、
上記のとおり依然として他のアミノ酸に明確な活性を不
１ので、１５す、これらのアミノ酸の存在士におけるＩ
、　クルタミン酸の特異的定量には使用できない。また
、公知酵素は安定性が高くはなく、分析用試薬としての
保存安定性および使用安定性も必すしも良いとは考えら
れない。さらに、分析試料中に銅イ、オンが存在する場
合、公知酵素活性は顕著に阻害され分析が困難に１．（
ると考えらＡする。

なお、従来、Ｉ、　アミノ酸オキシダーゼを使用するし
　アミノ酸の分析法は知１）れていたが、公知の［−ア
ミノ酸オキシダーゼは、Ｌ　グルタミン酸に対しては作
用しに＜＜、このにうＩよ酵素を使用する方法ではＬ−
グルタミン酸の特異的な分析はてきなかった。

（１）　　発明の概要 要旨 本発明は、前記のような従来技術の問題点を解決すへく
なされたものであり、新たに分離されたストレプトマイ
セス属微生物の）ｐ、イを物より本発明者らによって見
出された新規なＬ−グルタミン酸オキソダーゼが適当な
条件下においてＬ−グルタミン酸に極めて特異的に作用
し、定頃的に酸素を消費して過酸化水素、アンモニアお
よびα−ケトグルタル酸を生成することを知見し、この
知見に基づいて本発明酵素の応用について研究をＴＲね
た結果、本発明を完成するに到った。

本発明は、分析試料中のし一グルタミン酸に対し、１．
　グルタミン酸に対するノ１（τ１特１，１．ｊ、　ｆ
Ｉｌかきわめて高（、Ｌ−グルタミン酸以外のアミノ酸
に（Ｊ実質的に作用せず、安定性の商い１−　グルタミ
／酸オキシダーゼ（以下Ｓ゛１本発明酵素１と略称する
（ともある。）を酸素と水の存在下、作用させ、反応に
きもｆ、Ｌう酸素の消費ｉｌｌニーは過酸化水素、アン
モニアもしくはｌｌ　　ケトグルタル酸の生成を検出す
るこ吉を特徴とするし　グルタミン酸の分析ｄ、を提供
Ａるものである。

また、本発明はＬ−グルタ１ン酸ととモニ実質的に本発
明のし一りルタミン酸の分析に影響を与える程度釜［１
１のし一アスパラギン酸を含有する分析試料中のＬ−グ
ルタミン酸１１二対し、前記し一グルタミン酸オキンダ
　ゼを酸Ａ、と水の存在下、作用させるに際し、ｐＨ５
〜６において反応させ、反応に七もなう酸素の消費また
は過酸化水素、アンモニアもしくはａ〜ケトグルタル酸
の生成を検出することを特徴とするし一グルタミン酸の
分析法を提Ｖ（するものである。

また、本発明はｎｉＪ記Ｌ＝しルタミン酸オキンダーセ
を含（Ｔ　してなるＬ　グルタミン酸の分析用試薬を提
供するものである。

さらに、本発明は前記■７　　グルタミン酸オキシダー
ゼと該酵素による反応の検出試薬とからなるし一グルタ
ミン酸の分析用キットを提供するものである。

効果 本発明酵素はＬ−グルタミン酸に特異的にイ′１川し、
他のアミノ酸には実質的にはイ′１川しないしアミノ酸
オキシダーゼとしては初めて見出された酵素である。

しタカッテ、ＷＩＩＩＭＩＷＩｉ　ＩＩ　ＩＩ＠　１１
１１　＠多Ｍ　類］ｙ　ミノ酸を含有する試料であって
も、本発明酵素を作用させ、その反応を検出することに
より、試料中のＬ−グルタミン酸を特異的に分析するこ
とかできる。また、Ｌ−グルタミン酸に対する特異性か
きわめて高いので分析に際して試料中のアミノ酸を分別
するなど前処理は一切必要ない。

例えば、多種類のアミノ酸を含Ｏｒする醤油、その他の
液体調味料などの食品は、Ｌ−グルタミン酸含量がその
品質評価の重要な指標にちるが、本発明方法によれば、
これらの試料中のし一グルタミン酸を容易かつ迅速に、
しかも特ｙＩ：的に定１當１するＣとかできる。

また、臨床検査における重要な測定項目であるグルタミ
ン酸・オキザロ酢酸トランスアミナーゼ（ＧＯＴ）およ
びグルタミン酸・ピルビン酸トランスアミナ　セ（Ｇ　
Ｐ　ｉ”　）の活性測定ヲ、コレラの酵素θノ反応生成
物である［、−グルタミン酸を本発明方法によって直接
分析することにより行うことかでき、これらの酵素活性
の測定をより迅速に、かつ容易に１１える道か開けた。

なお、本発明酵素は、その酵素反応が臨床検査ある−い
は食品分析Ａ、９１こおいて最も広く実用化されている
オキシダーゼ反応であることから、酵素反応の検出もオ
キシダーゼ反応の検出手段として汎用されている公知の
方法をそのまま転用できる利点がある。

さらに、本発明酵素は公知酵素をはじめ一般の分Ｕ１用
酵素と比較しても高い安定性を有しているので、本発明
の分析用試Ｗ　Ｉｌｌ　（！１！存および使用に際して
安定であり、高い汎用性と経済性を備えているばかりで
はなく、本発明酵素を酵素電極とじてＬ−グルタミン酸
の分析に応用する際にも（−Ｊ−利である。

〔１１〕　　発明の詳細な説明 １）本発明酵素 本発明酵素は、Ｌ−グルタミン酸に対する」ｌ（質特異
性かきわめて高＜、Ｌ−グルタミン酸以外のアミノ酸に
は実質的に作用せす、安定性の高いＬ−グルタミン酸オ
キシダーゼであればよく、そθ起源・由来を問わず、そ
の調製法も問わない、以下に本発明酵素の一例としてス
トレプトマイセス この例示酵素について具体的＋質および調製法を説明す
る。

（Ｎ本発明酵素の酵素学的および理化学的性質後に示す
参考例の方法で製造したＬ−グルタミン酸オキシダーゼ
の精製酵素標品の酵素学的および理化学的性質は下記の
とおりである。

（１）　　作用 本発明酵素はＬ−グルタミン酸を基質とした場合、下記
反応式のごとくＬ　グルタミン酸１ｍ０１につき、Ｉｍ
ｏｌの酸素と１ｍ０１の水を要求し、１ｍ０１のａ−ケ
トグルタル酸、１ｍＯ＋のアンモニアおよび１１１１０
１の過酸化水素を生成する。

Ｃ００ＩＩ　　　　　　　　（’００！１１ ＣＨ２（’、、＋（：！ １　　　　　　　　　　］ ＣＨ２＋０２ト１１２０−ＣＩ！、４　１−　ＮＨ３＋
　Ｈ２Ｏ２）　　　　　　　　　　Ｉ ＣＨＮＩＩ２Ｃ，−０ ］　　　　　　　　　　Ｉ Ｃ０ＯＩＩ　　　　　　　　Ｃ００ＩＩＬ　グルタミン
酸　　　　　　　（１−リ゛トクルタル酸（２）　　基
質４１１．１，１．ｊ竹 種々のアミノ酸に対して本発明酵素の精製標品を作用さ
せた結果が第１表である。各基質の濃度は１０１１Ｍ　
であり、反応はｐｌ−１７，４（０，１Ｍりん酸カリウ
ム緩衝液）および［）ｌ−１６，０（０，１Ｍ酢酸緩衝
液）で行った。酵素活性は後述する酸素電極法により測
定し、Ｌ−グルタミン酸に対する活性の相対値として表
わした。

第１表（１） 第１表（２） 以りのとおり本発明酵素はＬ−グルタミン酸に対する基
質特異性が高く、他のアミノ酸に対しては、ｐＨ７，４
においてＬ−アスパラギン酸にわすかな活性（０，６％
）を示ずだけて、Ｌ−グルタミン酸およびＬ−ヒスチジ
ンを含む他のＬ−アミノ酸およびＤ−グルタミン酸には
実質的には全（活性を示さず、１）１１６．０において
はＬ−アスパラギン酸に対しても実質的に活性を示さな
い。

以」二の本発明酵素に対し、前記のとおり公知酵素はＬ
−アスパラギン酸に対しては活性を小さない（０，１％
以下）が、Ｌ−グルタミノに対して８．４％、Ｌ−ヒス
チジンに対して６．８％の活性をそれぞれ示す酵素であ
り基質性ｙＩ：性において両者は異る。

なお、本発明酵素のし一りルタミン酸に対するｂ値はｐ
Ｉ−１、７，４において２．１Ｘ１０’Ｍで、Ｌ−アス
パラギン酸に対するｋｍ値は１）Ｉ−１７，４において
２．９Ｘ１０−２Ｍである。

（３）力価の測定 本発明酵素の力価の測定は、酸素電極法で行った。すな
わち、１０　ｍＭのし一グルタミン酸すｉ・リウムを含
む０．１Ｍりん酸カリウム緩衝液（ｐＨ７，４）１ｍｌ
を酸素電極セルに入れ、１０１Ｉ７？　の酵素液を添加
して酸素消費速度を測定した。３０°Ｃで１分間に１７
ｚｒｎｏｌ　の酸素を消費する酵素１７」を１中位（１
ｎｉｔＨ本明細書においてｒ　Ｕ　Ｊと略称する。）と
した。

なお、反応液の溶存酸素濃度は温度の上昇とともに減少
するので高い反応温度での活性測定には上記方法は使用
できない。このような場合にはＭＢ　Ｔ　Ｉ’ｌ法（ア
ナリティカル・バイオケミストリー（，４ｎａ１．１３
ｉｏｃｈｅｍ、’）、　　２５．　２’２８　（、１９
６８）参照）によって行う。すなわちＬ〜グルタミン酸
すトリウム、カタラーゼおよび本発明酵素を含有する反
応液を適当温度で２０分間「ンキユベートし、トリクロ
Ｕ酢酸（Ｔ　ＣＡ　）を加えて反応を停止し、この反応
停止り液に酢酸緩衝液（ｐＨ５，０）および３−メチル
−２−ベンゾチアゾｔンヒドラゾンハイドロクロライド
（ＭＢＴＨ）を加えて５０°Ｃて３０分間インキユヘー
トした後、室温まで〆合印して３１６０ｒｎの吸光度を
測定し、検量線から生成（７たα−ケトグルタル酸を定
量する。

（４）　　至適ｐ　ｔｔ 至適ｐ　Ｉ−１は第１図に示すとおり、Ｉ）Ｈ７〜８．
５付近である。各ｐ　Ｈにおける酵素活性の測定は、基
質としてＬ〜グルタミン酸ナトリウムを使用し、緩衝ｉ
ｔｋとして０．２Ｍ酌酸緩衝液（１）Ｈ８，５〜６．０
）、０、２　Ｍりん酸カリウム緩衝ｉ１ｋ　（１）Ｈ６
，Ｏ〜８，５）および０．２　Ｍグリシン−塩化プトリ
ウムー水酸化ナトリウム緩衝液（１）Ｈ８，５〜１２．
０　）を使用し、３０°Ｃで行った。

なお、第１図番こは本発明酵素と公知酵素の至適１）Ｈ
の比較のため、本発明酵素（実線）と公知酵素（点線：
特開昭５７−４８６８５号公報の第１図より引用した。

）のｐＨ活性曲線を（７１記した。

第１図から明らかなように本発明酵素は至適１）Ｈにお
いても公知酵素とは相異する。

また、アスパラギン酸をノ、（質とした場合の作用ｐＨ
範囲は狭く、至適ｐＨは７〜８であるか、ｐｔ＋６．０
以上およびｐｉ−ｉｔｏ、ｏ以」二においてはＬ−アス
パラギン酸に対してほとんと作用しない（＋）ＴＩ６．
０においてグルタミン酸に苅する１、ｒＪ性の０．１％
以下）。

（５１ｐＨ安定性 １）Ｈ８，５〜１１．５ノ各１）Ｉ−１ニおイエ３フ°
Ｇ、６０分間、４５°Ｃ１１５分間オヨび６０’Ｃ，１
５分間の各条件で保持した後、Ｉ）Ｈ７，４においてグ
ルタミン酸に対する酵素活性を測定した。

その結果、３７℃、６０分間保持の条件ではＩ）ｆ１５
．５〜１０．５の範囲において安定であり（第２図。

実線）、４５°Ｃ１１５分間保持の条件でもｐＨ５，５
〜　９．５　の範囲において安定【あり（第３図）、６
０°Ｃ９１５分間保持の条ｆ’ｌ　−＋？　ｌ；１．１
＋ＩＩ　５．５〜７．５の１ｉｉ’、ｉ　１１１１１＋
″」、い−（７安定゛てあ・ツノ、：（第４図）、。

／、（お、第２図には本発明酵素と公知酵素のｐＩ−１
安定？１１のＪｔ軸のｌ−め、公知酵素の吐安’ｊｊｉ
曲線（特開昭５７　４８６８５号公報の第２図より引用
し、点線て小した。）を本発明酵素のものとイノ１記し
た。。

以」、の第２〜４図がら明らがなように、本発明酵素と
公知酵素の安定＋＋Ｈｌｌ１ｉ４囲を比較すると、両者
は明らか）Ｃ５＋、′、す、＋ｊｉＪＦ？５の方が後前
に比へ°Ｃ広いｐＨ範囲にもいて安定である。

（６１作用２１＆渦の範囲 ３０８Ｃ−ｉｌ　（＋　’ＣＯ）　ｔ５　ｆｎ！　＋ｇ
　ｔｃ　に　イｃ　Ｌ　−りｒし９　ミン酸すトリウド 記Ｍ　Ｂ　ＴＩ＋　／７：　テＡＹ　２４旨ｌｆｉ性の
測定をｊｊ　−）　だ。

その鈷１４！、木グｌ゛明酵素のｆ′１川適用の範囲は
３０〜６０°Ｃであり、作用〒適温度は５０　０Ｃ　（
−３近てあ一］た（第５図）。

（７）熱安定性 ４０°Ｃ〜９０°Ｃの各温度においてｐｌｉ　５．　５
　、Ｉ）Ｈ７、５おＪ：びｐＨ９．５の各条イ１１て１
５分間保持した後、ｐＨ　７．　４においてグルタミン
酸に対する酵素活性を測ｅ＋こした。

その結果、ｐＨ　５．　５において＋．ｌ　Ｇ　５°Ｃ
Ｊて：ム定てあり、８５６Ｃで約５０％の残（ｆ／ｌｌ
ｉＩＩＩを小り（第（：図，＾−＾，）。ｐｌ−１７．
５においてＩＪ　ｆｉ　１１０ｃまで安定であり、７５
°Ｃて約６０％の残存活性を小１−（第６図，９−の’
　ｏｐＨ　９．　５に１，；いても４５°し１テ安定で
Ｊ）　リ、７０°Ｃ　テ約５　ｏ　＜６　１／Ｊ　残（
ｆ　／Ｊｒ　１１ヲ−＋ず（第６図．＃−ｎ）、。

なお、本発明酵素と公知酵素の熱安定＋’ｌの比較のた
め、公知酵素の温度安定曲線（　’ｌｒ’？開昭５′ｉ
４　ａ　（ｌ　ｓ　５　＋：公報の第３図より引用１，
　、　！，’，ｉ線でホした。）を本発明酵素のもの．
Ｊ＝　ＩＩＩ記１−　／二，。

第６図より明らかなように、本イＣ：明酵素は公知酵素
よりも温度安定性が高い。

（８）　　阻害、活性化および安定化 本発明酵素に対する種々の１４加物？′ＪのＩＪｅ響４
調べるために、第２表に示す各物質１…Ｎ１　を、／Ｘ
Ｊむ反浴液（ｐＨ７，４）中で酵素反応を行った。

その結果は第２表に示すとおりである。

第２表 １１　　Ｅ　Ｉ）　ｉ’　Ａ　：エチレノ／・アミノ四
酢酸２１ＮＥＮｌ：Ｎ−エチルマレイミド ３１　　＋１　ｕ’　ｋｌ　Ｉｓ　：ノ・ラフＬＩ　Ｉ
＋　−７キュリヘン゛ノエイト４）　　Ｉ）　Ｉ）　’
ｌ”　Ｃニジエチル／（Ｐカル／くメイト５ｌ−７−ｕ
）：４．ｆｉ　　デヒト１ｊキノー２７１−ヘンセノノ
スルホン酸Ｊ−ナトリウム 第２表より明らかなように本発明酵素は、パラクロロマ
ーキュリベンゾエイＩ・によって約４５％阻害されるが
、塩化第二銅およびジエチルノチオカルバメイＩ・には
全く阻害され１４い。一方、公知酵素は塩化第二銅およ
びジエザルジチＡカルバメイトによって完全に阻害され
る１、したか−〕で両酵素は阻害剤による影響という点
１こおいても相′Ｊ＋、ｊ　するっなお、本発明酵素の
活性化ｎｌおよび安スｉ！化剤はまだ見出されていない
。

（９）紫外線吸収スペクトル（第７図参！！！！　１λ
Ｈ１ａＸ　’　　　２　　７’　　８　　１１１ｎ　　
、　　３　　８　　５　　１１１１１　　、４　　　（
ｉ　　　５　１１１１１肩：　２９０　ｎｍ　イマＪ近
＋　　４９０１ｕ１１１．１近（１０）　　補酵素 本発明酵素を熱処理またはｌ　１１りＩＪＩ：Ｉ酢酸（
′１゛ＣＡ）処即し、遠沈して得られた上清は、その吸
収がフラビンアデニンジヌクレ−ｋ　（ド（１７Δ１〕
）と一致し、Ｄ−アミノ酸オキ／ダー（ｉの°ｒ・１゛
酊Ｚ。

を活性化したので、本発明酵素の補酵素か１・Δ１）で
あることが判明した。

また、薄層クロマトグラフィーにおりる＋＜　Ｉ’　４
Ｑ　４からもＦＡＤであると同定された。

ＦＡＤは本発明酵素１ｍｏｌにつき２ｍｏｌ存在するも
のと推定された。

（１１）　　ポリアクリルアミドゲル電気泳動および５
ＤＳ−ポリアクリルアミドゲル電気泳動 精製された本発明酵素はいずれの方法１こおし１てもｑ
ｉ−バンドを小した。

（１２）　　分子］省１ 本発明酵素の分子量は、セーノ！′デ・ノクスＧ−２０
０（７アルマノア　）了イ／ケミカルズ社製）によるゲ
ルｉｌ、ｊｉ過１人ては１３５．０＋１０　＋−１０，
０００と測定された。

（１３）　　等電入１．ｊ アンフオライン（＋−Ｋ　Ｂ社製）を用０た等電点電気
泳動にｊ、り測定したところ、Ｉ）Ｉは　６．２　でて
あった。

（１４１結晶構侍および元素分析 本発明酵、＜：　１．Ｌ　Ｌ’：晶イヒされていな（１
のて測５Ｌ　Ｌでいない。

（１５）　　精製１ノ法 本発明酵素の精製は塩析法、等電点沈澱法、有機溶媒に
よる沈澱法、けいそう土、活に１炭など番こよる吸着法
、各種クロマトグラフ法等を適宜ζこ摩１１合せて行う
ことができる。精製方法の具体例シよ参考例に示すとお
りである。

＋Ｂｌ　　本発明酵素の調製 次に本発明酵素を微生物の培養によって製造する方法を
具体的に示す。

使用微生物 本発明酵素の製造に使用される微生物は、ストレプトマ
イセス（３１ｒｅｐｆｏｍｙｃｅｓ　、ｌ属に属し、本
発明酵素を生産する能力を有する微生物である。

このよう１．Ａ微生物の具体例としては、千葉県香取郡
東庄町の１−壌Ｊ、り分離され、単一の菌株としＴｌ１
ｔｆｉサレタＸ　　Ｉ　＋　９−６株を挙げる口とがで
きる。仁の菌株の菌学的性質を以下に記載する。

Ａ、顕微鏡的観察 気菌糸は、直線状でその幅は０９〜１．　Ｏ／Ｉてあり
、中細’ｒ）　ｔ’ｔを小づ。胞子柄は、多数の胞子の
連鎖よりｌよっており、２〜５回転の螺旋を形成する。

胞子はやや楕円形で、その人、へさは０．９〜１．Ｏｘ
１、１　＞：　１．２　／／　テア’、Ｊ　、電ｔ′Ｗ
ｉｔ微鏡ニＪ：　−）−ｃ表面はとげ状構造であること
か観察される。基菌糸の分断は認めＩ、れｌｓい、ｌ Ｂ　肉眼的観、察 ３種１７’７地ニ第１Ｊルイ１．育（３０”Ｃ、ｌ　６
　Ｌｌ　間培養）の肉眼的観察の結果は次のとおりであ
る。

（１）ソニークロース・硝酸塩寒天培地その生育は不良
である。ノ、（菌糸は級？ｌ、！色で寒天中に侵入せず
、気菌糸は粉状で寒天十に放射状に薄（広がる。色は灰
褐色で、灰色の胞子を形成する。培地中への色素の生成
は認められないうｆ２１グルコース・アスパラギン寒天
培１１ｊｌその生育は良好である。〕、（菌糸は白黄色
て寒天中に侵入するとともに　わずかに盛りしる。気菌
糸は白色で、貧弱であり、培地中−・のＶ、素の生成は
認められない。

（３）グリセリン・アスパラギン寒天Ｊｆ１地その生育
は良好である。ノ、（菌糸は白黄色で、′）ｌ；人中に
侵入するとともに　盛り上る。気菌糸（Ｊ形成されず、
培地への色素の４１；成も認められ／ｌい。

（４）澱粉・無機塩寒天培地 その４１育は良好である。ｈ’；　ｔ′＋’＋糸は白黄
色で、寒天中に侵入するとともに　盛り１．る１、気菌
糸（，１白色で、豊富であり、灰色の胞ｊ゛をｊ“１生
ずる。１ｆζ地中への色素の生成は認められｌｓい、。

（５）チロノン寒天培地 その生育は良好である。）Ａ菌糸は白黄色である。

気菌糸は白色で、豊富であり、灰色の胞子を着生する。

培地中への色素の生成は認められない。

（６）栄径寒天培地 その生育は極めて良好である。基菌糸は白黄色で寒天中
に侵入するとともに　盛り上る。気菌糸は白色で、胞ｒ
の着生は認められない。培地中への色素の生成も認めら
れない。

（７）イースＩ　麦、ｌ寒天培地 その牛Ｙ７は極めて良好である。基菌糸は白黄色で、寒
天中に侵入するとともに　盛り上る。気菌糸は白色で、
Ｃ９富であり、灰色の胞子を着生する。

培地中への色素の生成は認め１〕れない。

（８）オートミール寒天培地 その生育１」極めて良好である。Ｊ、＋７菌糸は白色で
、寒天中にｆＪ人するか、Ｊ８地−１には盛り上らない
。

気菌糸は白色で、盟富であり、灰色の胞子を着生ずる。

培地中への色素の生１戊は認められない。

Ｃ生理的ｔ’ｌ質 生育温度範囲は８〜４０°Ｃであり、３５°Ｃ近辺が最
適である。

チロシン寒天培地およびペプトン・イースト鉄寒天培地
では、共にメラニン様色素は生成ゼす、ゼラチンをわず
かに液化し、澱粉を加水分解する。

Ｄ、各種炭素源の同化性 プリドハム・ゴドリーブ寒火培地上での各種炭　　　　
□素源の利用性は第８表のとおりである。

第３表 ソ′＋（利用する。）　　−（ｆ１１用しない。）以上
の性状を要約すると次のとおりである。すなわち、気菌
糸は螺旋状で、胞子の表面はとげ状である。培地上での
発育ては白黄色または灰褐色を呈し、気菌糸は白色〜灰
褐色で、溶解性の色素およびメラーノ様色素の生成は認
められない。また、スターチ氷解性は強い方である。

これらの結果と第３表に示した炭素源の同化性ヲ基準に
ハーノエーズ　マニュアル・オブ・デイタミネーテイブ
ーバクテリオロジ−（Ｂｅｒｇｅｙ　’ｓＭａｎｕａｌ
　ｏｆ　Ｄｅｔｅｒｍｉｎａｔｉｖｅ　Ｂａｃｔｅｒｉ
ｏｌｏｇｙ　）　　第８版（ｔ　９７４　＜＋）におけ
る分類体系に従って本菌株の同定を行ったところ、本菌
株はストレプトマイセス属に属するか、本菌株の特徴に
十分に合致する公知の種は見出せす、本菌株を新菌株で
あると同定し、ストレプトマイセス・エスピー　Ｘ〜１
１　ｇ　−６（３ｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅ、ｓ　ｓｐ、　
Ｘ　−１１９−６）と命名した。

本菌株について、昭和５６年通商産業省告示第１７８づ
に従って」−業技術院微生物工業技術研究所に対して寄
託申請を行い、昭和５７年６月５日付けで受託され、受
託番号として微工研菌寄第６５６０号（ＦＥＲＭ　　Ｐ
−６５６０）が付与されている。

上記菌株は本発明酵素の生産能の高い菌株の一例であり
、本発明の使用微生物はこれに限定されるものではない
。また、このような本発明酵素生産菌を通常の微生物突
然変異誘導ｔノ１、たとえは紫外線、Ｘ線、ｒ線照射な
との物理的処理、ニドｒｓソグアニジンなどの薬剤によ
る化学的処理なとの処理法によって変異させて得られた
本発明酵素の高生産性突然変異株のいずれをも（ｌｆ適
に使用できる。さらに本発明の製造法の目的はＩＩ、本
釣には、前記微生物の本発明酵素の生産に関する遺伝情
報を担う遺伝子デオキシリボ核酸（ＤＮＡ　）による酵
素蛋白の合成機能を利用することにある。したかつて、
このような遺伝子ＤＮＡを適当なベクターに組み込み、
前記以外の属の微生物へ形質転換により移入させるか、
または遺伝子ＤＮＡをフロドプラスト法による細胞融合
によって仙痛微生物に取り込ませるなと遺伝子操作的手
法によって得た微生物による本発明酵素の製造法も本発
明の範囲に包含される。

培養方法および条件 前記使用微生物の培養方法および条件は、該微生物か良
好に生育し、本発明酵素が十分に生産される方法および
条件であれは特に限定されないが、固体培養法もしくは
それに埠する方法が好適である。

固体培養に使用する固体培地は通常使用されるものと何
ら変らない。ずなわぢ、固体培地とはフスマ、脱脂人Ｑ
、米ヌカ、トウモロコシ、菜種粕小麦、米、もみから等
の天然固体原料の巾独あるいは二種以」二の組合せたも
のを主体とし、さらに必要に応して本発明の使用微生物
が資化可能な栄養源、たとえばグルコース、／ニークロ
ース、アラビノース、フラクト−ス、マンニトール、イ
ノシトール、可溶性澱粉、エタノール等の炭素源、各種
アミノ酸、ペプトン、大豆粉、蛋白質加水分解物、コー
ンステイープリカー、肉エキス、酵母エキス、各種アン
モニウム塩、各種硝酸塩、尿素等の窒素源、各種のナト
リウム塩、カリウム塩。

カルンウム塩、マンガン塩、マクネシウム塩、　％。

鉛塩、鉄塩、りん酸塩、硫酸塩等の塩類、サイアミン、
リボフラビン、ニコチノ酸、ハントｆ　７　酸。

ビオチン、ｐ−アミノ安息香酸、ヒタミンＩＪ１２　Ｚ
’ｊの発育素を適宜添加した培地、またはこれらを３１
＆宜な配合、大きさ、形状に造もシした培地なとである
。このような固体培地は児法により滅菌あるいは変性処
理し、種菌を接種して固体培養を行うっまた。」−記以
外の培養法、たとえはスフ１！フノ′−の適宜の担体に
液体培地を吸収よたＩＩ肢）υ１７（１１１開昭４９−
１４６７９号公報なｌＱ　）　、ｉΦ菌を接ｌｌｌ１し
て培１をする方法であっても使用微生物かり；：　’／
ｌ’°ｉし、本発明酵素を良好に生産する６＋１！り採
用できる。

培養条（’ｌは使用微生物の種類に応して酵素のイ１産
に最適の条件を選択ずれは、１：　（、特に限定されな
い。通常、たとえば２０〜３０’Ｃ１１ｕｌｌ　　５〜
７て５〜１５［１間培養すればよい。

本発明酵素の採取 使用微生物の培養により生産された本発明酵素は、適当
な抽出法により培養物、すなわち培地および／または培
養菌体から抽出分離され、そのまま粗酵素ｉｌｌとして
使用するか、あるいは前記したとおり通゛畠の酵素精製
法に１ｉＬ−：＋て使用目的に応した精製段階に精製さ
れる。

抽出法は、特に限定され・１−１１６法１＜、より行わ
れる。たとえは、固体培養物かりの抽出は、通常、水ま
たはＨｉ＋ｆｉｌｌにより？ｊわれる。また、菌体内の
本発明酵素は常ｌノｓにより菌体４・破砕し、可溶化し
て抽出する。

２）分析試料 本発明において［分析試料１という用語は、■その含有
成分としてＬ−グルタミン酸を含有し、もしくは含有す
ることが予セされる試ｆ１てあってＬ−グルタミン酸含
量もしくはその（ｊ　ｉ！！（を分析すべき試料、また
はｔ９Ｌ−グルタミン酸を遊離し、もしくは遊離するこ
とが予想される反応系をｒηイｆする試料てあって、そ
の系の１７　グルタミン酸含量の変化を測定することに
より、その系に関ＩＪする酵素活性もしくはその系にお
いてＩ、−グルタミン酸に変換する物質の含有量あるい
はこれらの物質のイ］無を分析するための試を二１を意
味する、。

上記のに分類される試料としては　食品（たとえば、醤
油、アミノ酸調味料、各種エキス類、液体だしの素など
の液体調味食品、清酒、みりんｔ了どのアルコール含有
食品、水産ねり製品、ノーセージ、ハムなどの固型食品
の抽出液なと）、生体試ト１（尿、血液など）、その他
が挙げられ、ｑ３１に分類される試料としては、グルタ
ミン酸セ、グルタミン酸ラセマーゼ、ＧＯＴ、（ｉＩＪ
Ｔなとし−グルタミン酸を反応生成物とする酵素とその
基質を含イ了する系、もしくは前記の系と他の一種また
は二種以−にの他のＪｌ、役酵素系とを含有する系か挙
げられる。

３）１．−グルタミン酸の分析 本発明におけるし一グルタミン酸の分析法は、試料中の
１、−グルタミン酸の本発明酵素による酵素反応系、特
に多量のアスパラギン酸が共存する試料中の１．−グル
タミン酸に対してはＩ）Ｈ５〜６における酵素反応系と
、これにともなって消費もしくは生成される示標物質の
定Ｉｉ的もしくは定性的な検出をｌう小村物質の検出系
とからなる。

酵素反応 Ｌ−グルタミン酸の分析（ｉおける酵素反応条件は次の
とおりである。

ずなわち、反応ｐ１１は、本発明酵素が失活せす、１、
−グルタミン酸に対して十分に作用するｐ　ｉ−１であ
ればよく、さらに示標物質の検出系がｐＨに依存するも
のであればこのような条件も考慮してｐＨを設定するこ
とか好ましい。通゛；：も、ｐＨ５〜９の範囲で酵素反
応は行われる。なお、試ｔ′［中に実質的に本発明によ
るし一グルタミン酸の分析に影響を−りえる程度多量の
し一アスパラギン酸が含まれる場合、本発明酵素は至適
ｐ　Ｉ−１（：Ｉ近ではＩ−−−アスパラギン酸に対し
て多少作用するのて、１．・−グルタミン酸に対しては
示標物質の検出に１分な程度作用し、■、−アスパラギ
ン酸に′ｌＩ　しては作用しない条件を選択して反応を
行うことによりこのような試料でもし一グルタミン酸を
特異的に分１ｈすることがてきる。このような条件とし
てはｐＬ＋　５〜６の反応条件が好適である。

また、酵素反応のｐＩＩを好適な範囲に軒（持する目的
で、反応媒質として各種の緩衝液を使用することか好ま
しい。緩衝液としては、１）ｆｆ記のｐＩｌ　範囲を維
持てき、かつ本発明酵素を１９Ｉ害しないものであり、
示標物質の検出系に影響を、りえないものであればよい
。たとえば、りん酸緩衝液、トリス−塩酸緩衝液、酢酸
緩衝液、くえん酸緩衝液、ヘロナール緩衝液などが例示
される。

反応温度は特に限定されない。本発明酵素の十適温度、
安定温度および使用する示標物質の検出系ｔよとを勘案
して当業者ならば容易に決定することができる。

また、反応に際し、本発明酵素は可溶性酵素または、包
括法、吸着性、架橋ｎ１、共有結合法なとの一°般的ｌ
より法によって固定化された固定化酵素として使用され
る。

固定化の態様は特に限定されない（［−固定化酵素」、
千畑一部編集、昭和５０年３月２０日、■講談社発１」
、参照）。たとえば、固定化担体の素材としてはセルロ
＝−ス（セ１１ファン）、アセチルセルロース、ニトロ
セル口　ス（コロジオン）、カルボキシメチルセルロー
スｔ、＞どセルロース系誘導体、でん粉、デキストラン
、アガロース、キトサンなどの多糖類、コラーゲン、フ
ィブロイン、ケラチン、アルブミンなとの蛋白質、ポリ
アクリルアミド、ポリビニルピロリドン、ポリビニルア
ルコール、カラギーナン、アルギン酸、キサンタンガム
、大人なとの品分ｊ’−ｆ！ｌゲル、ポリ塩化ビニル、
ポリスチレン、ポリエチレン、ポリプロピレン、ポリウ
レタン、ポリカーボネート、ナイロン、テフロン、吸着
樹脂、イオン交換樹脂なとの合成有ｍ　高分子、ガラス
、ンリカ、セラミック、アルミナなどの無機高分子なと
か使用され、膜状、ゲル状、粒状、粉末状、マイクＵＪ
　Ｊ）ブセル状、チューブ状、容器状の型態の担体か使
用される。固定化方法としては、本発明酵素の、冒３分
子−性ケルＺによる包括、多孔性もしくはイオン交換個
物質活パ・の吸着、ペプチド法、アルキル化法、ジアゾ
化法等による担体への共有結合、グルタルアルデヒド、
ヘキサメチレンジイソンアネ　−１・ｔ５の多官１１に
性架橋剤による担体への架橋、もしくは酵素相互の架橋
などの適宜な方法を採用することができる。

固定化酵素としての使用態様は反応方式および／または
測定方式によって異るが、たとえば酵素電極として反応
するときは膜状固定化酵素として電極に密ｉ′１シて装
首され、もしくは電極表面に的接固定化されて使用され
、リアクタ一方式によって反応するときは粒状固定化酵
素カラムによるカラム型リアクター、チューブ内面に酵
素を固定化したチューブ型リアクター、または測定容器
の内壁に酵素を固定化して使用することができる。

示標物質の検出−匙 本発明力ｎ、によって１７−グルタミン酸を分析するた
めの小村物質は、酵素反応によって消費され名酸素なら
びに生成する過酸化水素、アンモニアおよびα−ケトグ
ルタル酸である。

各示標物質の検出はそれぞれ任意の方法によって（」わ
れ、本発明はその検出方法には限定されない。すなわち
、検出力〃、は通常公知の方法が採用されるが、今後さ
らに開発されるべき種々の方法も採用可能と考えられる
。

゛　なお、１小標物質の検出系１とは以下に小ず各示標
物質の検出プロセスとその検出結果に基いてＬ−グルタ
ミン酸を定性的もＬ　＜は定量的に分析（１）　　酸素
の検出 消費された酸素を検出する方法としては、ワールブルク
検月、法（生化学実験＋！Ｍ座５　酵素研究法山　第３
５〜４１頁、■東京化学同人、１９７５（１８月２０１
７Ｉ発行）と酸素電極法（電極法による酸素測定、萩原
文二編、■講談Ｊｌ：　、　　１９７７　（ｌｕｌ１月
２０１」光行）か知られており、本発明においてはいず
れの方法を採用してもよい。

酸素電極法に使用する電極としては作用電極として白金
、金、イリジウムなとＱ〕１＋ｉ全１＋ｉを用い、列用
電極として銀、銀／塩化銀糸、飽和ＪＪ　ＩＪ液が被験
液とテフロン膜、ポリプロピレン膜、ポリエチレン膜の
ような酸素透過性の電極膜でへたてられるように一体化
された複合型電極（クラク型電極などの隔膜酸素電極）
あるいは作用電極側と対照電極側が塩橋て連結された分
離型電極か使用される。その方式はポーラログラフ方式
であっても、ガルバーニ電池方式であってもＪ−い、。

酸素電極によって酸素を測定するに際しては、酵素反応
液の溶存酸素を通、７＋Ｈ，の力ｌノ、て測定ずれはよ
い。また、酸素電極と電極表面に装ｊりされた木発明酵
素からなる酵素電極、たとえば固定化酵素もしくは゛１
′透ヤ１膜で覆われた可溶性酵素をクラーク型電極の電
極膜に密着して装着した酵素電極を使用して測定しても
よい。

（２）　　過酸化水素の検出 生成する過酸化水素を検知する方法としては、電気化学
的分析法、分光学的分析法、けい光分析法、化学発光分
析法なとが知られており、本発明においてはいずれの方
法を採用しでもよい。

電気化学的分析法としては、前記の酸素電極と同様の構
Ｊ告の過酸化水素検知型電極を使用し、電流法によ−）
て測定する方法が一般的である。たとえば、白金などの
貴金属電極からなる作用電極と銀電極なとからなる対照
電極と過酸化水素透過性膜からなるクラーク型過酸化水
素電極を使用する方法は本発明に好適に用いりれる。ま
た、酸素電極と同様に酵素電極として使用してもよい。

また、上記の方法の他、電気化学的分析法として本発明
酵素とともにバーオキシダー−Ｖまたはモリブデン酸１
１．１１などの過酸化水素分解用触媒を使用し、過酸化
水素とヨウ素イオンを反応させ、電極表面におけるヨウ
素イオンの活量減少をヨウ素イオン電極で測定する方法
も使用できる。なお、乙の力ｌノ、は本発明酵素とパー
オキシダ−セもしくは触媒をａ有する固定化酵素をヨウ
素イオン電極に装着した酵素電極として好適に使用され
る。

分光学的分析法としては、■被酸化性発色剤をパーオキ
シダーゼもしくは同様の活性を示す物ｔ１の存在下に過
酸化水素と反応させ、生成色瓜の吸光度測定を行うパー
オキシダーゼ法、■アルコー　ルをカタラーゼの存在下
に過酸化水素と反応させ、生成するアルデヒドを発色系
に導き、／Ｉ：　ｒΔ・免疫の吸光度測定を行うか、ま
たはアルデヒド脱水素酵素をニコチンアミドアデニンジ
ヌクレオチＩ’　（Ｎ　ＡＤ）の共存下に作用させ還元
型ＮＡＤ（ＮＡＩ）Ｉ＋）の生成を測定するカタ、・−
ゼ法、ならびに（３）′自ｆｌＶｌ／キシレノール・オ
レンジ系、Ｔｉ（ＩＶＩ／　４−　（２ピリジルアゾ）
レゾルシノール系、Ｖ　ｍ　／キルシノール・オレンジ
系などを使用する化学的方法かある。

■のパーオキシダーゼ法において９色反応１；Ｌ、発色
剤単独の酸化反応また（」発色剤と力′ンブラーとの酸
化綜合反応である。ｌｉｉ＋　８のｈ゛法では発色剤と
してＯ−ジアニシジン、０〜トリジン、０−トルイジン
、（］−アミノフェノ　ル、２．４−ジクロロインドフ
ェノ　ル、ベンジジン、８．８：　５．５’　−ｆトラ
アルキルヘンジジン（８，３：　５．５’−テトラメチ
ルヘンジジンなど）、４−メトキシ−１−ナフトール、
２．２′−アミノ　−ジ（３−エチルベンツ゛チアゾリ
ンー６−スルホン酸）、グアヤク脂（グアイヤフール）
、Ｎ−（４−アンチピリル）−アニリン誘導体ＩＮ−（
４’−アンチピリル）−２−カルボキン−４−ヒドロキ
シアニリンなど）、ｐ−ヒドロキ７フェニル酢酸ＷＮ　
、　Ｎ　−ジメチル−ｐ−フェニレンジアミンなとを使
用するこト力（７’ｌル。

また、後者の方法では発色剤として４−アミノアンチピ
リン、４−アミノアンチピリンアミトナＳとの４−アミ
ノアンチピリン誘導体、４−アミノフェナジン、４−ア
ミノ−Ｎ、Ｎ−ジメチルアニリン、ｐ−フェニレンジア
ミン、４−アミノ−Ｎ。

Ｎ−９エチル−ｍ−トルイジンなとび〕フェニレンジア
ミン誘導体、３−メチル−２−ヘン′ノチアソ゛Ｉ声ノ
ヒドラゾン（ＭＢＴｌしなとか使用され、）Ｊツプラ−
とじてはフェノール、ノツチコール、レノ゛ヤ ルシン、ヒドロキノン、クレゾル、ファイ−コール、ピ
ロガロール、オルノ／　ル、ｌ）　　／７　Ｌ）　ｕフ
ェノール、Ｉ）−プロモフエ／−ル、２．４−ノクロロ
フェノール、２．４−シフロモフエノ　ル、２゜４、６
−　トリブロモフェノ　ル、アニリン′、Ｎ、Ｎ−ジメ
チルアニリン、Ｎ、Ｎ−ジエチルアニリン、Ｎ−エチル
−Ｎ−（３−メチＩレフエニル）−Ｍアセチレンジアミ
ン、３−アセトアミノ−Ｎ、　Ｎ−ジエチルアニリン、
Ｎ、Ｎ−ンエチＪレ−１１１−１・′ルイジン、Ｎ−エ
チル−Ｎ−（２−ヒトロキ７３−スルホプロピル−ｍ−
トルイノン、Ｎ−り゛ＩＪシルーＮ−エチルーｍ−トル
インン、ｐ２−ンメチールアミノフェノール、０−アミ
ノフェノ　ル、１１１−アミノフェノール、ｐ−メチル
アミノフエノル、２−クロロ−６−メチルフェノールロ
ロ−３−メチルフェノ−　ｌし、３．５　　ツクＩｌ　
＋．１２−ヒドロギアベンゼンスルホン酸なとのフェノ
ール系、アニリン系もしくはトルイジン系化合物、また
は４−ハロゲノ−１−す７１・−ルー２−スルホンａ　
（４−クロロ−１−１−フト−ルー２−スルホン酸なと
）、１−ナフトール−２−スルホン酸、２−アミノ−５
−ナフトール−７−スルホン酸、２．４−ツタＵロー１
−ナフト　ル、１−ヒドロキノ−２−ナフトイック酸、
４．５−ジヒドロキシナフタレン　２，７−ジスルホン
酸なとのナフト−ル系化合物、ナフチルアミンも１くは
その誘導体、ヒドロキシキノリン、アミノキノリンなど
のキノリン系化合物なとを使用することができる１発色
剤とカップラ　の好適な組合せ例としては、４−アミノ
アンチピリンとフェノール、Ｎ、Ｎ−ジメチルアニリン
、Ｎ、Ｎ−ジエチル“アニリンもしくはＮ−ジエチル−
ｍ−ｌ・ルイジンとの組合せ、まそ たは３−メチル−２−ヘンソチアソリノヒドラゾンとＮ
、　　Ｎ　　ジメチルアニリンとの組合せが挙げられる
。本発明はこれらの発色剤または発色剤とカップラーの
種類には限定されす、定量的に酸化も使用可能である。

また、パーオキ／ダーゼは通常、西洋わさび（ホースラ
ディソユ）またはさつまいも由来の酵素が使用されるが
、バーオキノダーゼ様活性を示すものであれはよく、特
に限定されない。さらに、パーオキ／ダーゼと同様の活
ｔ４１を示す触媒であってもよい。

■のカタラーゼ法において発色系を用いる方法には通常
アルコールとしてメタノ　−ルが使用され、ウムンアノ
フエノラート、塩什第−鉄なと）の（ｆ注下でヒドラゾ
ン（たとえば３−メチル−２−ヘンゾチアゾリノンヒド
ラゾン、４−アミノ−３−ヒドラジノ−５−メルカプト
＝１．２．４〜　トリアソール（ＡＩ（ＭＴｌなど）と
反応させて発色させる方法、ホルムアルデヒドをアセチ
ルアセトンおよびアンモニウム塩とハンッ反応て反応さ
せて発色する方法などが採用される。また、クルタチオ
ンを使用し、過酸化水素−グルタチオンパーオキ／ダー
ゼにより酸化型タルタチオンに導き、これを法（アナリ
テイカル・バイオケミストリー（４ｎａｌ。

Ｂｉｏｃｈｅｔｎ、　）　７６　、　１　８４　−１　
９１　　＋　　１　９７６　　）　　）、銅イオン−ヒ
スタミン系で・ｆンジゴカルミンを酸化脱色し、その色
度の減量から定１１；する方法などもある。

けい光分析法としては、・１；モバニリン酸をパーオキ
ツタ　セの存在ド、過酸化水素と反応させてけい光性の
２．２′−ジヒドロキシ−３，３′−ジメトキシビフエ
ニル−５，５′−ノ酢酸に変換し、けい光強度を測定す
る方法か挙げられる。同様の方法で、ホモバニリン酸の
代りにｐ−ヒドロキソフェニル酢酸、ジアセチルフルオ
レスシン誘導体（シアセチルフルオレスソン、ジアセチ
ルジクロロフルオレスソンＩよと１などを発けい光試薬
として用いてもよい。また、スコポレチン、３．５−ジ
アセチル−１，２−ジヒドロキシ７）なとのけい光性物
質を過酸化水素／パーオキ／ダーゼにより酸化して非け
い光性物質に変換し、けい光の減少を測定する方法もあ
る。

化学発光分析法としては、ルミノールをパーオキノタ−
ゼの存在下、過酸化水素と反応させて酸化し、発光爪を
測定する方法（特開昭５７７１３９９号、特開昭５７−
７１４００シづ参照）かある。同様の方法でルミノール
の代りにイノルミノール、ピロガロール、ビス（２，４
，６−１・リクロロフェニル）オキザレートなとを使用
してもよく、パーオキ／ダーゼの代りにヘモグロビン、
ヘマチン、ヘミン、シアン化鉄（側カリウム、塩化コバ
ルトなとを触媒として使用してもよい。

（３）　　アンモニアの検出 アンモニアはミクロケルタ゛　ル法、ネスラ　１人、イ
ンドフェノール法、ニンヒドリン法、フエノサフラン法
などの方法によって分析できる。また、カチオン選択性
電極によってアンモニウムイオンを分析する方法または
疎水性のカス透過性膜を装着したカラス電極からなるア
ンモニアガス電極によってアンモニアガスとして分析す
る方法なと、電気化学的分析法によって分析してもよい
。さらに、これらの電極と本発明酵素を組合せた酵素電
極によってアンモニアを検出し、Ｌ−グルタミン酸を分
析してもよい。

（４）　　α−ケトグルタル酸の検出 ７フーーケトグルタル酸＋１．８−メチル−２−ベンゾ
チアゾ、、ｔｐ、ヒドラゾン（Ｍ　Ｉ−３Ｔ　Ｉ−１）
と反応させて生成物の吸光度を測定する方法、２．４−
ジニトロフェニルヒドラジンと反応させ、生成物の吸光
度を測定する方法、０−フェニレンジアミンと反応させ
て生成物の吸光度を測定する方法、その他公知の方法を
使用することができる。

分析用試薬 本発明の分析用試薬は少なくとも本発明酵素を含イ」す
る試薬である。すなわ１：Ｉ、その形態は限定されず、
溶液状、凍結状、粉末状もしくは顆粒状の可溶↑／１酵
素であってもよへ、さらに、前記のごとく、各種のｈ°
法によって膜状、ゲル状、粒状、粉末状、マイクロカプ
セル状、チューブ状もしくは容器状の担体に固定化され
た固定化酵素てあってもよい。また、本発明酵素の他に
液状もしくは粉末状のり尻酸緩衝剤、トリス−塩酸緩衝
剤、酢／ 酸緩衝剤、くえん酸緩衝剤、べＵす　ル緩衝剤ｆ、ｇと
の緩衝剤、塩類（塩化ナトリウムなと）、糖ｍｆｉ　（
ショ糖すど）、多価アルコール類（グリセロール、プロ
ピレングリコール、ソルビト−ルナト’　）　、補酵素
類（ＦＡＤなど）、その他適宜の安定化剤、界面活性剤
などを添付してもよい。

Ｌ−グルタミン酸の分析に際し、」−記分析用試薬は、
前記各種の検出法に応して、必要な酵素’／＋１性が得
られるように使用される。また、予め各検出法に応した
量を試薬ビン、アンプルなとの容器に封入してもよい。

分析用キット 分析用キットは前記の本発明酵素を、′イ有する分析用
試薬と本発明酵素による反応を検出する手段である検出
用試薬から構成される。検出用試薬とは前記した示標物
質の検出に必要な試薬である。

すなわち、過酸化水素を示標物質とする場合、検出用試
薬としては、たとえばバーオキ／ダーゼもしくはパ　オ
キノダーセ様ｌ、Ｉ；性物と発色剤もしくは発色剤おに
びノＪツブラーとの組合せ、カタラーゼもしくはカタラ
ーゼ様活性物とアルコールド色系に必要な試薬もしくは
共役酵素系に必要な試薬との組合ゼ、バーオキ／ダーゼ
もしくはノマーオキンダーゼ様活性物と発けい光剤との
組合せ、／＜−オキノダ　セもしくはパー　オキシダー
ゼ様活性物と発光試薬との組合せなとか例示される。こ
れらの試薬の具体例は＋ｉｉｆ記（−過酸化水素の検出
１の記載より明らかである。

また、ア／モニｒまたはｒｔ−ケトグルりＪし酸を示標
物質とする場合も同様に必要な検出試薬を本発明酵素を
含ｒ１する分析用試薬と組合せ、分析用キットとして構
成すること（、“Ｃきる，、なお、本発明酵素を含イ■
する分析用試薬と前記の検出試薬は全てを混合して中−
の試薬としてもよく、相互に十／ｌ＋＞する成分がイｒ
（１：する場合には各成分を適宜な組合せとなるように
分割【、でもよい。また、これらは溶バに状もしくは粉
末状試薬として調製してもよ（、さらにこ４【らを成紙
もしくはフィルムなどの適当な支持体に含有させ、試験
紙もしく１よ分ＩＪ＋用フィルムとして調製してもよし
）。

なお、本発明の分析用キ・ント１こ＋！ー，ｌ記ｏ’ｒ
　ｉｌｌ　＜’Ｈ　＋ｉ試薬の他、し−グルタミン酸の
−・定Ｉ＋を含有Ｊ−る標準試薬を添付してもよい、。

本発明の分析用キットの！ｌｒ適な一例として（↓過酸
化水素の分光学的−な検出によー〕で１，−グルタミン
酸を分析するキットが挙げられる、たとえ（ｆ、パーオ
キソダーゼ法によるキットの場合、通常、本発明酵素０
、０２単位＜Ｕ）以１．７／テス）・、ノぐオキシダー
ゼ１〜１０ｔＪ／テスト、発色剤と１，て４−アミノア
ンチピリンとフェノールもしく　Ｉｔ　Ｎ。

Ｎ−ジメチルアニリンとを使用する場合、こ］しらの試
薬は生成する過酸化水素に対して１モル以−１−、好ま
しくは２モル以」１使用される。

４）具体例 以下、本発明の分析法、分析用試薬および分析用キット
の置体的−例を実施例として示す。また、本発明酵素の
製造法を参考例として示す。ただし、本発明はこれらの
実施例および参考例に限定されるものでは１４い。

実施例１ （１１キットの調製 試ＩＡ：　　Ｌ−グルタミン酸オキシダ　ゼｌ　ｍｇ（
］　ＯＵ／’Ｗｔ　）　、　バー第４−　ソダーゼ５ｍ
１（ｌｏ。

Ｕ／■　；西ｌＹわさび由来、東洋紡績■製）および４
−アミノアンチピリン４０ｔＲｇが１本の試薬ビンに含
まれるように０．２　Ｍりん酸カリウム緩衝液（＋）Ｈ
，６，５）２肩ｔに溶解し、常法により凍結乾燥した。

試薬Ｂ：　■フェノール４０ｍｇをｏ、ＩＭりん酸緩術
液（ｐＨ６，５）に溶解し、１００　ｍｌとして試薬ビ
ンに入れ、または■ジメブルアニリン１００ｍｇを０．
ＩＭりん酸カリウム緩衝液（＋）Ｈ６，５）に溶解し、
Ｉ　ＯＯｍｌとして試薬ビンに入れた。

（２）　　操作法 試験管にＬ−グルタミン酸すＩ・リウムの標に’ｊ　ｉ
ｌｋおよび水をそれぞれ０．１　ｍ１分注し、−１記試
ｆｉ　Ａ　ｃｌ）凍結乾燥物を試薬Ｂの■または■いず
れかの溶ｌＮ１００　ｍｌで溶解したものを上記各試験
管にそ４１それ０．９　ｄ添加し、３７°Ｃて好気的に
振盪１．亀が１゛。

２０分間インキュベートした１、水ての盲検を勾１ｉｊ
ｊとして一ヒ記■を使用する場合は５００　ｎｍの、」
記■を使用する場合は５６５　’ｎｍの吸光１１！庖測
＞ｊＩした。これらの検ｍ線を第８図（試薬１３力（１
・のｊ、ｌｌ。

合）および第９図（試薬Ｂか（２）の場合）に示４゛、
。

実施例２ （１）　　試薬の調製 発色試薬：　　フェノール２０ｖ、４−アミノアンチピ
リン２０＋１７および西洋わさびバーオキノダ−Ｗ８ｔ
ｔｒ９　（１００Ｕ／ＩＲＦＩ　）を５０　ｍｌ　（７
）　０．２　Ｍりん酸カリウム緩衝液（１）Ｈ７，４）
に溶解した。

Ｌ−グルタミン酸オキシダ　セ二　精製酵素３００　ｔ
ｔ’Ｊ　　（５５［Ｊ／ｓ＋ｇ）を８０　ｗｔｔ　（１
）　０．０２　Ｍ　Ｉ）ん酸カリウム緩衝液（＋）Ｈ７
，４）に溶解した（０．０５０／肩ｔ　）。

（２）操作ｔノ、 試験管に発色試薬０．８　ｍｌ　６−分注し、Ｌ−グル
タミン酸オキ／ダーゼ溶液０．１　ｍｌを加え、３７°
Ｃ恒温槽に入れて５分間加温（７）・。＋４＋　’７Ｌ
−グルタミン酸すトリウム溶液（０〜２　／／ｌＴｌ０
Ｉ　７＊ｔ　）または試料名Ｔ＃ｔ（各種製品醤油を水
で１５０倍化稀釈した溶液）０．１＊ｔを加えてｊ：＜
撹拌し、３７°Ｃで好気的に振盪しながら２０分間イン
キュベートした。

盲検を対照として５００　ｎｍの吸光度を測定し、第１
０図に示す検量線を作成し、た。この検量線から求めた
前記試料中のし一グルタミン酸定量値をＬ−グルタミン
酸脱炭酸酵素を用いた従来法（テクニコン・オートアナ
ライデーによってフェルールフタレインの減色度を測定
する方法）による同試刺中のＬ　グルタミン酸定耐値と
比較して第４表（実施例３の後に小ず。）１・示した。

なお、相関係数γ　０．９９７．回帰式ｙ　　１．００
５ｘ−０，５７５てあった。

実施例３ 試験管に０．１Ｍりん酸カリウム緩衝液（ｐＨ肝臓由来
、シグマ・ケミカル？ｉ製）溶液０．１　ｍｌおよびＬ
−グルタミン酸オキシダ　ゼ（０，６Ｕ、／肩υ溶液０
．１　ｍｌを取り、３７°Ｃで５分間加ｌ！！　した　
これに標準Ｌ−グルタミン酸すトリウｌ、溶液（０〜５
７１ｍｏｌ／＊ｔ）　　または試料溶液（実施例２と同
一の製品醤油稀釈液）　０．１　ｗｅを加えて反応を開
始さぜた。３７°Ｃｌ２Ｏ分間好気的に振盪しｌ↓から
インキュベ−１・した後、２５９６トリク（１０酢酸０
．１　ｍｌを加えて反応を停止させた。反応停止液にＩ
　Ｍ　ｌｌｉ酸緩衝液（１）Ｈ５，０）　１．９肩ｔと
０１％３　メチル−２−ベンゾチアゾ１ψノヒドラゾン
塩酸塩溶１（ｋＯ，８ｍｌを加え、撹拌後、５０°Ｃて
３０分間イノ４ユベートシた。室温まで冷却後、盲検を
対照として８１６　ｎｍの吸光度を測定し、第１１図に
小ず検１１１線を作成した。この検１１１線から求めｔ
二試オｌ溶液中のし一グルタミン酸定帛値を１．　グル
タミン酸脱炭酸酵素を用いた従来法にょる試料溶液中の
し一りルタミン酸定量値と比較［、第４表に小した。な
お、相関係数γ−０，！Ｊ　９６　、回帰式ｙ＝１．０
２　Ｇ　Ｘ−８，１２２てあ−Ｊ　／、：　。

第４表 実施例４ （１）　　試薬の調製 発［Ｑ　試ａ　：　　フェノール８０ｍｖ、４−アミノ
アンチピリン３０ｍｇ、西洋わさびパーオキシダーゼ４
ｍｇ　（１００Ｕｙ’ｍｌｌ　）およびＬ−グルタミン
酸オキシダーゼ１　ｍｇ　（１０ｕ／ｉｇ）を０．２　
Ｍりん酸ノＪリウム緩衝液（１）Ｈ６，５）　５０ｗｅ
に溶解した。

基質溶液Ａ：　Ｌ−アスパラギン酸−＋−トリウム２０
０　ｍｆｌおよびα−ケトグルタル酸１５ｒｎｇをｏＩ
Ｍりん酸カリウム°緩衝液（１）ｌ−１’１．０＞　　
１０ｍｒに溶解した。

基質溶液Ｂ：　Ｌ−アラニア　１４０　ｍ（ｌおよびα
−ケトグルタル酸１５１ｆｆｇを０．１　Ｍりん酸カリ
ウム緩衝液（ｐＨ’７．０　）　１０　ｍｌニ溶解した
。

（２）操作法 ■グルタミン酸・オキザＴＪ　Ｑ’＋酸トラノスアミナ
ーゼ（ＧＯＴ）の活性測定 試験管に基質溶液Ａ　Ｏ，２ｍｌを取り、ゎツ準酵素液
（ベーリンガ〜山之内■製、　　３８０　Ｕ／ｍｇ）０
、１　ｔｎｔを加え、３７６Ｃ，８０分間イン−ｔ−、
：Ｉ−ヘＩ−Ｌ、た後、２５％トリクロロ酢酸０．１　
ｍｌを加えて反応を停止させた。反応停止液にＩＭりん
酸カリウム緩衝液（ｐＨ６５）ｏ、ＩＭｔおよびＬ　グ
ルタミン酸オキシダーゼを含む発色試薬０．５　ａｔを
加えて３７°Ｃて２０分間インキュへ　１・した。阿検
を対照として５００１ｍの吸光度を測定し、第１２図に
示ず検ＩＩ）線を作成した。

■グルタミン酸・ピルビン酸トランスτミナーゼ（Ｇ　
Ｐ　”］”　）の活性測定 試験９′１にノ１（質溶液Ｂ　Ｏ，２ｍｌを取り、標準
酵素液（ヘ　リンが　山之内■製、１．４０Ｕ／ｉｇ）
０．１ｍｌを加え、３７°Ｃ，３０分間インキュベート
した後、２５％トリクｌｉｔ　ＩＪ酎酢酸０１　ｍｌを
加えて反応を停止１・さＬトた。反応停止ｌ（ｋ中のＩ
、−グルタミン酸含ｍを■と同様に測定し、第１３図に
示す検量線を作成“した。、 実施例５ Ｌ−グルタミン酸オキシダーゼ（０，５Ｕ／肩ｔ）を０
．　ｂ　Ｏ，Ｉ　Ｍ　リ／ｕ　酸力’）　ラム１ｍ　ｔ
！Ｉｉｆ　Ｔ（１，（ｐＨ５，５）１　ｍｌを３０°Ｃ
の恒温水を循環しているポーラログラフ方式の酸素電極
のキュベツトへ密封し、５０ＩＩｅ　の１．　グルタミ
ン酸標イイｊ＋液（０−２１ｔｍｏｌ／Ｈ１）をＬＬ人
して酸素消費１汁を測定し、第１４図に示す検１１（線
を作成した。

実施例６ Ｌ−グルタミン酸オキ／タ　セ　（］　２５Ｕ／ｍＯ溶
液０．５　ｍｌを多孔性二トロセルロ　ス膜（東ｌＹ；
　＋１学産業■製、ＴＭ−５ｉ孔径Ｑ、　ｌ　／１２７
／　、直径２５順、膜厚１４０　ｐｔｎ　）上にハ１１
・・吸引することにより吸イ９固定し、Ｌ−クルタミン
酸オキ／ダ　セ膜調製物を得た。

式 上記固定化酵素膜を円形に■断（直径５０朋）した後、
隔膜酸素電極（■石川製作所要、Ｌ１２型）のガス透過
性膜（テフロン膜、膜厚Ｉ　Ｑ　１ｉ１１１）上に装着
し、さらに固定化酵素膜にセルロース透析膜を装着して
Ｌ−グルタミン酸センリ゛　を製イ′１した。

同センサーを用いて既知ａ度（００５〜１，０１１ｍ０
’７Ｍｅ　　　）　　　＋７）　　Ｌ　　　−グ　／ｌ
／　　９　　　ミ　　７　　酸　ブー　　　Ｌ　　　’
Ｊ　　　’／　　”　　ａ　　”＋”　　溶液に対する
電流減少値を測定し、第１５１×１に示す検は線を作成
した。

実施例７ Ｌ−グルタミン酸オキンダ　セ（４４８１Ｊ／ｒｒυ溶
液０．１　’ｍｔを８０１ｎｍ　ｘ　３　Ｑ　ｍｙ四方
のセｏ　ファンＩＩ’Ａ（膜厚３０μｍ）に滴下、乾固
し、これに２５％グルタルアルデヒド溶液０．１　ｍｌ
を浸潤させ、４°Ｃて一晩乾燥し、Ｌ−グルタミン酸オ
キシダーゼ固定化セ１１７−ノ′ン膜を得た。

」記固定化酵素膜を実施例６と同じ方法で隔膜＋ｉ奎 Ｈ素電極Ｉに装ｊ”ｒ　Ｌ、１７−クルタミン酸センサ
ーを製ｆ′１１−た１、このセンーリ　−４用いて実施
例６と同様にＬ−クルタミン酸標準ｌｒｋに対する電流
減少値を測定したところ００５〜１．　（ｌ　ｎ１Ｍの
濃度範囲で直線関係を得た。

」−記センサーを使用して各ｐＨのＬ−グルタミン酸ナ
トリウム溶液（０，８１１Ｍ　）に対する応答性を測定
（３０°Ｃ）Ｌ、結果を第１６図に示した。

第１６図から明らかなように同センサーの至適ｐ　Ｈは
ｐＨ６，５〜９．５伺近てあった。

また、上記センサ　の各種アミノ酸に対する応答性を測
定し、結果を第５表に示した。なお、各アミノ酸溶液の
濃度は１．０　ｍＭであり、反応はｐＨ７，０（ｆｌ、
　］　Ｍりん酸ノノリτ：１ム緩衝液）で行った。

第５表 なお、上記センサーを３°Ｃ，０，０２Ｍりん酸緩衝液
中に保存し、各紅過］」において上記と同様１ｃＬ−グ
ルタミン酸ナトリウム溶液に対する応答性を測定したと
ころ、１ケ月間にわたり当初の応答性を保持していた。

したかつて、上記固定化酵素膜は３°Ｃにわいて少なく
とも１ケ月間は安定である。

参考例 ５００鮮／容三角フラスコにフスマ２０　（ｌおよび水
１６＊／を入れ、１２０°Ｃ，：３０分間加圧滅菌して
調製したフスマ培地にス１−し・ブトマｆセフ　・１−
スピー　Ｘ−１１９−６（微１研菌第（ｉ　５６Ｑシじ
］を植菌し、２８°Ｃ、７ＩＩ　Ｉｉｌ　１７；　ｊ’
ｉＨｌテ１ｉｌｉ　＋？ｊ　ヲ調製した。

５１容三角フラスコ２５本１ζそれぞれフスマ２００　
ＬＪおよび水１６０＊ｆをノ５．１１．１２０°Ｃ１３
０分間加圧滅菌した後、前記の種菌をｊｊｊ菌的に接種
し、２８°Ｃで２１１間培養後、Ｉ：ｕ’＋度庖２ｏ”
ｃに１・１ノでさらに２週間培養した。

得られた培養物を３７．５　／’の水に１時間ｌＪ請し
た後、濾過し、さらにけいそう」−を通過さｔ”Ｃ’　
Ｉ’１１酵素液約３４ｅを得た。このＩｌｌ酵木液に硫
酸゛ノ′ンモニウムを５０９６飽和まで加え、生成した
沈澱を遠沈採取して０．０２Ｍ酢酸緩１すＩｌｆを（Ｉ
’ｌｌ　５．５　）３．９１ノに溶解し、５７°Ｃで３
（）分間加熱（だ。・二〇熱処理した酵素液を５°Ｃ以
十に冷却後、２倍１１１の予め冷却し−たエタノールを
加え、生成した沈澱を遠沈採取しテ０．０２　Ｍ　リ／
ｕＭ６［ｊｉＪ１液（＋）Ｈ７，４）２ｅに溶解（２、
同一緩衝液τ−・夜透析した。透析中に生成した沈澱を
遠沈除去し、土−清液を同一緩衝１１１．て・Ｉ’　？
Ｉｒ化したＩ）ＥＡＥ（ジ１チルアミノエヂルノ　−セ
ルロースカラム（８，Ｆｉ　ｘ　５０ｚ）に通し、吸石
した酵素を食塩０．８５　Ｍを含む同一緩衝液を用いて
溶出した。溶出された活性区分を集め、００５Ｍの食塩
゛を含む０．０５λ４酢酸緩衝液（＋）Ｈ５，５）て−
イレ透析した。この透析内液を同一緩衝液で・１−漸化
したＩ）　Ｅ　Ａ　Ｅ−セファロースＣＬ−６Ｂ（７ア
ル、゛ノー「・ファイ、／ゲミヵルズン１製）カラム（
２・ｌ０ｎｎ）に通し、吸？’ｆ　Ｌだ酵素を食塩０、
０５−　ｆｌ、　７５　Ｍ　ツリー：　ｊ”　、’／”
、ｉ　−＞　１７ト法て溶出した。溶出された活性区分
≦・ｆｌ４め、透析濃縮後、セファデックスＧ−２００
ｆノγルマンア・ファインケミリルズ１１製）　ｌ／Ｊ
うｉ−（２，５ｘ　１２０ｚ）を用いてり′１１濾過を
イ１い、活性区分を集めて濃縮後、０．　ｆｌ　２　Ｎ
＋りん酸力１１ン１．緩衝液（ｐｆｌ　７．４　）で１
、う析しｌ。この透析内液を遠沈し、上清液を精密蘭過
した後、凍結乾燥して１．−グルタミン酸オキシダーゼ
の精製標品（比活ｆ’ｌ：５５．］Ｕ７・／　ｍｙ蛋白
１収率１８．４％）８０■を得た１、

【図面の簡単な説明】

第１図は本発明酵素（実線）と公知酵素（点線）の作用
ｐＨ軸囲を示す。 第２図（Ｊ本発明酵素（実線）と公知酵素（点線）の安
′；ｊ′シｌ）Ｈ４ｉｉｊ囲（３７°Ｃ１６０分間保持
）を示す。 第３図は本発明酵素の安定ｐＨ範囲（４５°Ｃ１１５分
間保持）を小ず。 第４図は本発明酵素の安定ｐＨ＠囲（６０’Ｃ。 １５分間）を小ず。 第５図は本発明酵素の作用適温範囲を示す。 第６図は本発明酵素（実線）と公知酵素（点線。 ○−○）の安定温度範囲をンｐず。第６図においてムー
ムはｐＨ５，５、・−ＯはｐＨ’７．５．閤−哩はｐＨ
９，５の各条件における＾を度安定曲線を示す。 第７図は本発明酵素の紫外線吸収スペクトルを示す。 第８図お」；び第９図は実施例１のキットにおいて、試
薬Ｂとしてフェノール溶液またはジメチルアニリン溶？
Ｉｋを使った場合のし一グルタミン酸の検′ｌｊ線をそ
れぞれ示すものである。 第１０図は実施例２におけるし　グルタミン酸の検量線
を示す。 第１１図は実施例８におけるし一グルタミン酸の検量線
を示す。 第１２図は実施例４におけるＧＯｉ’活＋’ｌの検１ｉ
ｊ線を示す。 第１３図は実施例４におりるＧ　Ｐ　ｉ’　／＋ｌ′ｌ
（’Ｉの検Ｉ１１線を示す。 第１４図は実施例５におけるし一りルタミノ酸の検量線
を示す、 第１５図は実施例６の酵素電極を使用して得られたし一
りルタミン酸の検量線を／ｊ＜す。 第１６図は実施例７の酵素電極の各ｐＩＴにおける応答
性を示すものである。 特許出願人　（６７７）ヤマ”　’！４　／ｌｌ＋株式
会ン１第１図 第２図 第５図 第６図 温　　　ｒ徒 第７図 宥Ｕ　／チューブ 第７４Σ ｙｔｌ　Ｒａｌ　／伽ｌ ＃１６画 ダ　　　ｆ　　　６　　　り　　　８　　　デ　　　ｔ
ｏ　　　ｔｔＨ 手続補正書（自発） 昭和５７年８月２３［１ １、事件の表示 昭和５７年８月２１０提出の特１１願 ２、　発明の名称 （旧）Ｌ〜グルタミン酸の分析法・分析用試薬および分
析用キット３、　補正をする台 事件との関係　　特許出願人 住所　（郵便番号　２８８） 千葉県銚子市新生町２丁目１０番地の１４、　補正の対
象 願内の発明の名称の欄および明細書の発明の訂５　補正
の内容 サノ ２）明細書第２５頁第４〜７１１目（こ１’　＋１１１
　　ポリアクリルアミドゲル電気泳動および５ＤＳ−ポ
リアクリルアミドゲル電気泳動精製された本発明酵素は
いずれの方法１こ第５０ても単一バンドを示した。」と
あるのを ｒ　ｔｉｌｌ　　ポリアクリルアミドゲル電気泳動精製
された本発明酵素は単一・）〈ンドを示した。」と訂正
する。 ３）明細書第５７頁第１行目に１’−０，０５Ｕ／肩／
　１とあるのをｒ　Ｏ，５５Ｕ／＊ｔ、ＩとＪｊ正する
。 手続補正ｌＩ（自発） 昭和５８年９月２７目 特許庁長官　若　杉　和　夫　　殿 １、　事件の表示 昭和５７年特許願第１４５３４６号 ２、　発明の名称 Ｌ−グルタミン酸の分析法、分析用試薬および分析用キ
ット８、補正をする者 事件との関係　　特許出願人 住所　（郵便番ち　２８８） 千葉県銚子市新生町２丁目１０番地の１電話　　０４７
９　ｆ２２）００９５（代表う４、　補正の対象 明細で）の発明の詳細な説明の欄および図面の簡単な説
明の欄ならびに図面 ５、補正の内容 １）明細ｉｌ＋第６頁第１３行［１にｒＬ−アルギン」
とあるのを「Ｌ−アルギニンＪと訂正する２〕　明細；
！）第７頁第８行目に１甲衝−１とあるのを「平衡１と
ｎ’Ｊ正する。 ３）明細書第１７頁下から第６〜５行口に１−Ｌ−み グルタミン酸。］と■るのをＩ■、−グルタミン１とｉ
１正する。 ４）明細書第２４頁第４行目に１カルバメイトには」と
あるのを「カルバメイトにょっては」と３５圧する。 ５）明細書第４０頁第６行口に１型態」とあるのを１形
態」とδＪ圧する。 ６）明細書第５８頁第１７〜１８行目および第１９行目
に１−試料溶液「１−りとあるのを１−試料中」と８Ｉ
正する。 ７）明細書第５９頁第４表に１−試料溶液」とあるのを
１−試料」と訂正する。 ８）明細書箱６１頁第１４　ｉ’＋ＩＩに［りん酸カリ
ウム」とあるのを「酢酸」とｉｊｌ正する９）明細書第
６１頁第１９行１」までの１実施例５」の記載に続いて
以下の文章を加入する。 ［この検量線から求めた試料（各種製品醤油）中のし一
グルタミン酸定量値をＬ−グルタミン酸脱炭酸酵素を用
いた従来法による試料中のＬ−グルタミン酸定ｈ（（ｌ
ｌ’ｆと比較し、第５表に示した。なお相関係数γ−０
．９５８．回帰式Ｙ　＝＝　０．９８０Ｘ＋　６．１１
であった。 第５表 １０）明細書第６３頁第１６行［］に１１５５表とある
のを１−第６表−１と訂正する。 １１）明細７１第６３頁第１６行ロ〜末行に「なお、各
アミノ酸溶液・・・・・・・て行−〕た。−１とあるの
を１なお、Ｌ−グルタミン酸以外のアミノ酸は２．０１
１１Ｍ濃度の溶液を使用し、Ｌ−グルタミン酸は０、４
　ｒｎＭ濃度の溶液を使用して測定し、測定値を換算し
て相対応答値を算出した。反応はｐｉ−１５，５（０，
’Ｉ　Ｍ酢酸−酢酸すｉ・リウム緩衝液〕て行った。」
　とＪｌ正する、 １２〕明細書第６４頁の１−第５表」を削除し、以十の
１第６表」を加入する。 第６表 １３）明細書第６５頁第５行１１まての１実施例７」の
後に「実施例８」として以下の文章を加入する。 ［実施例８ ■、−グルタミン酸オキシタ　セ２ＵおよびＬ−グルタ
ミン２０／１ｍ０１　を含む０．１　Ｍ酢酸緩衝液（ｐ
Ｈ５，５）　１ｍｌを３０°Ｃの恒温水を循環している
クラーク型酸素電極のキュヘットへ密封し、２０／’６
　　の大腸菌由来のグルタミナーゼ標’！　ｉｎｋ　（
４１ｎＵ〜２０１ｎＵ）を注入して酸素消費速度を測定
し、第１７図に示す検量線を作成した。 同様に醤油麹懸濁液（醤油ＪｉｆｉｌＯ’／を５０　ｍ
ｌの０．１Ｍりん酸緩衝液（ｐ）４　７．０　）で１０
００　ｒｐｍ。 ５分間ホモジナイズした後、同緩衝液を加えて３００＃
ｌ／とじた液）　５０　ｔｔ（ｌ　　を注入Ｌ　テｒＶ
Ａ素消費速度を７Ｉｌ１１定し、醤油麹１ｇあたりのグ
ルタミナーゼ活性を求めたと０ろ３・７Ｕてあ７た・コ
１４）明細書第６７貞第４行１−１および第１０行１−
１にＩ平衝化」とあるのを１−平衡化］と１１正する。 １５）明細書（図面の簡単な説明の欄）第７０貞第１５
行１１以降に次の第１７図に関する説明を加入する。 「　第１７図は実施例８におけるグルタミナーゼ活性の
検量線を示す。」 １６）第１２図および第１３図のグラフの（ｒｌ＋輔に
「μＵ／チューブ」とあるのを１ｍＵ／チューブ１と訂
正し、訂正図面を別紙としてｔａ　（・ｊする。 １７）第１７図を新たに追加し、別紙として添イ、ｊす
る。 筑Ｕ／インン゛ヱクシ３ン

Claims (1)

1. 【特許請求の範囲】 １）分析試１１中のＬ−グルタミン酸に対し、Ｌ−グル
   タミン酸に対する基質特異性がきわめて高く、Ｌ　グル
   タミン酸以外のアミノ酸には実質的に作用せず、安定性
   の商いし一グルタミン酸オキシダーゼを酸素と水の存在
   下て作用させ、反応にともなう酸素の消費または過酸化
   水素、アンモニアもしくはα−ケトグルタル酸の生成を
   検出することを特徴とするし一グルタミン酸の分析法。 ２）Ｌ−グルタミン酸オキンタ＝ゼがｐＨ５，５゜１５
   分間の保持条件下におい−（６５’Ｃまては活性が低十
   Ｌ　ｔ４いという安定性をａする酵素である特許請求の
   範囲第１項記載の分析法。 ８）Ｌ−グルタミン酸とともにＬ−アスパラギン酸をな
   自する分析試料中のし一グルタミン酸に対し、Ｌ−グル
   タミン酸に対する基質特異性かきわめて高く、Ｌ−グル
   タミン酸以外のアミノ酸には実質的に作用せす、安定性
   の高いＬ　グルタミン酸オキシダーゼを酸素と水の存在
   ド、作用させるに際し、ｐＨ５〜６において反応させ、
   反応にともなう酸素の消費または過酸化水素、アンモニ
   アもしくはａ−ケトグルタル酸の生成を検出する仁とを
   特徴とするＬ−グルタミン酸の分析法。 ４）　　Ｌ−グルタミン酸オキソダーゼかｐＨ５，５。 １５分間の保持条件下において６５°Ｃまでは粘性か低
   下しないという安定性を有する酵素である特許請求の範
   囲第３項記戦の分析法。 ５）　　Ｌ−グルタミン酸に対する基質特異性かきわめ
   て高く、Ｌ−グルタミン酸以外のアミノ酸には実質的に
   作用せす、安定性の高いＬ　グルタミン酸オキシダーゼ
   を含有してなるＬ　グルタミン酸の分析用試薬。 ６）Ｌ−グルタミン酸オキツタ　ゼかｐＨ５，５。 １５分間の保持条件下において６５°Ｃまては１１１　
   ｔ’１か低下しないという安定性を（ｊする酵素である
   特許請求の範囲第５項記載の分析用試薬。 ７）Ｌ−グルタミン酸オキシダーゼとともに該酵素の反
   応に適する緩衝剤を含有してなる特許請求の範囲 ｉ ８）Ｌ−グルタミン酸オキシダーゼが一体に固定化され
   た固定化酵素である特許請求の範囲第５〜７項のいずれ
   かに記載の分析用試薬。 ９）　　Ｌ−グルタミン酸に対ずろ基質特異性がきわめ
   て高く、Ｌ−グルタミン酸以外のアミノ酸には実質的に
   作用ゼす、安定性の１゜．；》いし−グルタミン酸オキ
   シダ　ゼと該酵素による反応の検出試薬とからなるし一
   グルタミン酸の分析用キッ１・。 １０）Ｌ−グルタミン酸オキシダーゼがｐ．Ｉ−Ｉ，　
   ５．　５　。 １５分間の保持条件下において６５°Ｃまては活性が低
   ｝シ！よいという安定性を有する酵素である特許請求の
   範囲第９項記載の分析用キラ１・。 １１）反応の検出試薬か過酸化水素、アンモニアまたは
   α　ケ１・クルクル酸を検出するための試薬であるｆ’
   ｌ’　Ｎ’ｌ請求の範囲第９または１０項記載の分析用
   キット。 １２）反応の検出試薬が単独の発色剤または発色剤とカ
   ップラーとの組合せ試薬である特許請求の範囲第９〜１
   １項のいずれかに記載の分ｆＪｉ　ＩＩＩキッＩ・０