JPH08507206A - アナライトの嫌気的定量に有用な組成物 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】 本発明は、サンプル中のアナライトを嫌気的に定量するのに有用な組成物に関する。この組成物はアナライト酸化剤、電子移動剤、鉄（III）イオンおよび２種類のキレート剤を含む。第１のキレート剤は鉄（III）イオンと結合するが、鉄（II）イオンに対しては良好な親和性を示さない。第２のキレート剤は鉄（II）イオンとキレート結合し、該イオンを含む着色錯体を形成する。アナライトの指標となるのが着色錯体である。さまざまな剤型の組成物が開示される。

Description

【発明の詳細な説明】 アナライトの嫌気的定量に有用な組成物発明の分野 本発明は、特定アナライト（被分析物）の定量に有用な組成物に関するもので ある。特に、本発明は、一連の反応の最終結果として鉄（II）イオン含有錯体が 形成される組成物に関するもので、錯体の量がサンプル中のアナライトの量に相 関している。背景および従来の技術 臨床化学の主な関心事はサンプル中の特定アナライトの定性および定量測定に ある。血液、血清、尿などの体液サンプルの分析に特に関心が集中している。各 種アナライトの存在および／または量を測定し、その後、確立されたパラメータ ーと比較することにより、疾病すなわち異常な状態の診断が下される。 当技術分野では血液、血清、尿などのサンプル中のグルコース、コレステロー ル、クレアチン、サルコシン、尿素、その他の物質の測定が研究されてきたので 、体液サンプルの分析測定に関する文献は膨大である。 初期の臨床医学文献はアナライトの非酵素的定量法を教示している。この例は KaplanおよびPesceがClinical Chemistry：Theory，Analysis and Correlation （Mosby 1984），p．1032-1042において教示したグルコース定量試験である。こ の試験は銅イオンの還元、銅とモリブデン酸の反応などを含むものである。 上記文献が指摘するように、この方法は低い特異性と他のアナライトによる干渉 のために精度が不十分である。Kaplanらによって開示された１つの方法はアルカ リ性フェリシアン化物試験である。この方法は、アルカリ性条件下で、フェリシ アン化物の存在下にグルコース含有溶液を加熱することが必要である。反応は、 次式： に従う黄色から無色への色の変化により達成される。この色の消失を測定するか 、あるいは無色のフェロシアンイオンと鉄（III）イオンとの反応（着色沈殿物 の「プルシアンブルー」を形成する）を測定する。 これら初期の「キレート化」型試験は、酵素科学が発展してきたため、特異性 の高いアッセイに置き換えられるようになった。酵素はその極端な特異性につい て知られており、こうして、当業者は適切な酵素を使用することにより、特定の アナライトが存在するかどうか、そしてその量はどれほどかを、むしろ簡単に測 定できるようになった。これらの酵素系は、酵素反応と組み合わせたとき検出可 能なシグナルを発する指示薬系を併用する必要がある。Kaplanはグルコース‐ヘ キソキナーゼ系およびグルコース‐オキシダーゼ系を開示しており、これらは当 技術分野でかなりよく知られている。それらはトリンダー試薬（Trinder reagen t）として知られる「共役指示薬」のような指示薬系、またはｏ−トルイジンお よび3,3’,5,5’‐テトラメチルベンジジンのような被酸化性指示薬とともに用 いられる。こうした系では、酵素とその基質 の反応が酵素によって担持される余剰電子を生成し、この電子が指示薬系によっ て取り除かれる。続いて、サンプル中のアナライトの有無または量を示す発色が 生じる。 特許文献はこのような系の論議に満ちている。かかる特許の非限定的例として 、米国特許第4,680,259，4,212,938，4,144,129および3,925,164号（コレステロ ールオキシダーゼ）；同第4,672,029，4,636,464，4,490,465および4,418,037号 （グルコースオキシダーゼ）；ならびに同第4,614,714号（Ｌ−グルタミン酸オ キシダーゼ）を挙げることができる。これらの酵素系はすべて、基質（すなわち 、対象のアナライト）から電子を奪い取るという点でその基質を「酸化する」も のである。 いったんアナライトが電子を失うと、アナライトは定量反応においてそれ以上 の役割を果たすことはない。先に示したように、電子は米国特許第4,291,121号 に記載されるトリンダー系のような発色系、または例えば米国特許第4,576,913 号に記載されるようなテトラゾリウム系に移動する。これらの系は酵素から電子 を移す「媒介物質」、「電子移動剤」または「電子シャトル」として知られる物 質を使用する。最後には、媒介物質が電子を放出する。媒介物質は１分子あたり １個または２個の電子を吸着することができる。好適な媒介物質であるフェリシ アン化物は１分子あたり１個の電子を取り上げる。上記の米国特許第4,576,913 号は、別の媒介物質（すなわち、フェナジンメトスルフェート）とテトラゾリウ ム塩との併用を教示している。指示薬として作用するのは後者の化合物である。 これらの媒介物質を使用すると、酸素の不在下での進行が可能である。通常、グ ルコース定量反応では、 還元された酵素から電子を除くのに酸素が必要となる。これは過酸化水素を生成 し、 過酸化水素はペルオキシダーゼの存在下で発色反応に参加する。 往々にして、酸素を用いること、つまり好気系は好ましくない。なぜならば、 こうした系に固有の問題が多々あるからである。例えば、これらの反応では、大 気中のＯ₂の分圧に反応が左右される。さらに、Ｏ₂が試験媒体全体に透過する必 要があるから、かかる透過を可能とするように媒体の設計を適合させねばならな い。それゆえ、嫌気的である指示薬系（例えば、指示薬とともに媒介物質を用い る系）または媒介物質のみを用いる電気化学系には興味がもてる。発色のような 検出可能なシグナルを生じる指示薬反応を利用する嫌気系の必要性が存在してい る。 上記のタイプの指示薬系を利用しうるが、これらには、指示薬分子自体がしば しば不安定で、長い保存寿命を持ち合わせていないという難点がある。かくして 、検出可能なシグナルを発することができる安定した分子を利用する系に関心が 集まることとなる。 Kaplanは、グルコース定量におけるプルシアンブルーの形成を教示したが、特 異性の欠如のために実行可能な代替法としてはそれを退けたことが思い出されよ う。このほかにも、反応が起こると教示された厳しい条件は酵素アッセイには全 く適していない。Kaplanが教示する反応は溶液を沸騰させることを必要とする。 酵素はタンパク質分子であり、タンパク質を煮沸するときに起こる特徴として変 性による不活性化がある。従って、当業者であれば、 Kaplanの加熱パラメーターをスクリーンして、酵素アッセイのためにこの教示を 採用することを避けるであろう。 プルシアンブルー系の記述は上記の米国特許第4,576,913号に見いだせる。こ の特許は、基質分子から２個の電子を取り除くという点でオキシダーゼに類似し た様式で作用するグリセロールデヒドロゲナーゼを教示している。この特許の第 ５欄には、指示薬としてのプルシアンブルー系（「ベルリン青」とも言う）が記 載されている。 しかし、この特許は総括的に読む必要があり、特に酵素の作用についての教示 はそうである。酵素は非常にｐＨ感受性であり、上記特許の酵素はｐＨ６．０〜 １０．０、最適にはｐＨ７．０〜８．５の範囲で作用すると書かれている。従っ て、この教示は、グリセロールデヒドロゲナーゼがアルカリ性ｐＨで作用するか ら、プルシアンブルー系の酵素検出への適合はアルカリ性ｐＨであろうことを、 当業者に示唆するだろう。ところが、アルカリ性ｐＨでは鉄（III）塩が沈殿し 、Adachiが必要であると記述する条件下でプルシアンブルーを形成する反応に鉄 （III）塩を参加させることを妨げるだろう。 プルシアンブルーに基づくアッセイ系の詳細は米国特許第4,929,545号に開示 されており、その開示内容を参考としてここに組み入れる。この特許は、フェロ シアンイオンが鉄（III）イオン含有塩Ｆｅ₃（ＳＯ₄）₂からの鉄（III）イオン と反応することを教示している。この系はグルコースやコレステロールを含む種 々のアナライトの定量に用いることができる。 プルシアンブルー系に似た系はキレート剤フェロジン （ferrozine）に基づくものである。米国特許第4,701,420号（その開示内容を参 考としてここに組み入れる）はこの反応を記述している。本質的に、この系はＮ ＡＤ（Ｐ）Ｈ／ＮＡＤ（Ｐ）系とともに電子移動剤を使用するものである。基本 的に、この反応はアナライトからＮＡＤ（Ｐ）Ｈへの１個の電子の移動と、これ に続く電子移動剤への電子の移動を含む。その後、電子移動剤はその電子を鉄（ III）イオン含有錯体へ移し、これにより鉄（II）イオンが生成する。次に、鉄 （II）イオンは第２の物質と結合し、着色物質の形成をもたらす。一連の可能な 物質が鉄（III）イオンのための錯化剤として有用であると記載されている。上 記の’420特許に記載される物質は非常に強いキレート剤である。 今回、驚いたことに、指示薬系において有用であると記述されたことがなく、 しかも当技術分野で記述されたキレート剤よりも弱いキレート剤が指示薬系にお いてより一層有効であることが見いだされた。かくして、これらのキレート剤は ここに記載される発明、つまりアナライトの定量に有用な新規組成物の重要な一 成分である。以下の記載の中で本発明をより詳しく説明することにする。発明の概要 本発明は、サンプル中のアナライトを定量するのに有用な組成物に関する。こ の組成物は、必須成分として、対象となるアナライトのための特異的酸化剤、電 子移動剤、鉄（III）イオン源および２種類のキレート剤を含有する。第１のキ レート剤は鉄（II）イオンに対する親和性よりも高い親和性を鉄（III）イオン に対し て有する点に特徴がある。第２のキレート剤は鉄（II）イオンと結合して対象ア ナライトの指標となる着色組成物を形成するものである。 本発明およびその特徴を以下の「好適な実施態様の詳細な説明」で詳しく述べ ることにする。好適な実施態様の詳細な説明 実施例１ サンプル中に含まれるグルコースの公知の検出系は次の一連の反応を含む。 反応“Ｉ”と“II”は共役しており、すなわち、グルコースの酸化において除か れた電子はｏＰＥＳに移動してｒＰＥＳを生成する。しかし、この物質種ｒＰＥ Ｓは直ちに反応“III”において電子を移し、 これによりｒＰＥＳがｏＰＥＳに戻る。その後、鉄（II）イオン（Ｆｅ²⁺）は反 応“IV”においてフェロジンと結合する。 紫色の強度がグルコースの測定値となる。 この実験では、本発明のキレート剤としてクエン酸ナトリウムを使用した。ク エン酸（２３０ｍＭ）の溶液を調製し、さらにＦｅ₂（ＳＯ₄）₃（２２ｍＭ）の 溶液もつくってそのｐＨを５．００に調整した。これらの物質種はそれぞれ本発 明のキレート剤と鉄（III）イオンに相当する。ＰＥＳ（１８ｍＭ）、すなわち 電子移動剤、の溶液を調製し、グルコースオキシダーゼ（５ｋｕ／ｇ）の溶液も 調製した。最後に、フェロジンの６０ｍＭ溶液を調製した。これらの物質を試験 管の中で合わせて、２００ｍＭ クエン酸、１９．１ｍＭ Ｆｅ₂（ＳＯ₄）₃、 ７．８ｍＭ ＰＥＳ、２６．５ｍＭ フェロジン、および２．５単位のグルコー スオキシダーゼの最終濃度を得た。グルコース溶液（５０ｍｇ／ｄｌ）を加えて ９．１ｍｇ／ｄｌの最終グルコース濃度とした。発色を分光光度計（シマズモデ ルUV160 U）を使って５６３ｎｍの波長で肉眼で観察し、反応速度も調べた。吸 光度を１分間にわたって２秒ごとに測定した。実施例２ 実施例１のプロトコールに従ったが、クエン酸ナトリウムの代わりにｄｌリン ゴ酸ナトリウムを使用した。実施例３ 実施例１のプロトコールに従ったが、クエン酸ナトリウムの代わりにイミノジ 酢酸ナトリウムを使用した。 ３つすべての事例において、生成すると予想された比色沈殿物（すなわち、鉄 （II）イオンとフェロジンとの錯体）が形成され たが、シトレート混合物が最も速やかに沈殿物を形成し、マレートがこれに続き 、イミノジアセテートは最も遅い形成剤であった。詳しくは、１．２９単位の吸 光度の変化に対しシトレートの場合は１７秒かかり、マレートの場合は２３秒、 そしてイミノジアセテートでは６０秒を要した。これらの数値を以下の表１〜３ にまとめてある。最初の２つのキレート剤の方がイミノジアセテートよりも強く 発色した。 上記の実施例は溶液中に含まれるアナライトの定量に有用な試薬組成物の使用 を例示するものである。この組成物の必須成分はアナライト酸化剤、電子移動剤 、鉄（III）イオン源、鉄（II）イオンと比べて優先的に鉄（III）イオンと結合 するキレート剤、および鉄（II）イオン錯化剤を含むが、ただしキレート剤はイ ミノジアセテート含有化合物ではない。 本明細書中で用いる用語「アナライト酸化剤」とは、対象のアナライトから特 異的に電子を取り去る物質を意味する。理想的には、これは酵素酸化剤であり、 こうした物質の活性の特異性についてはよく知られている。例えば、グルコース が対象のアナライトであるならば、グルコースオキシダーゼを用いることができ る。同様に、コレステロールを測定しようとする場合は、コレステロールオキシ ダーゼを用いることができる。当業者はこのような酸化酵素について熟知してい るだろう。 本明細書中で用いる用語「電子移動剤」とは、酸化されたアナライトからの電 子を受け入れるが、直ちに他の物質へその電子を移動させる物質を言う。電子移 動剤は再使用可能な物質で、移動の挙動はきわめて迅速に起こり、こうすること によって移動剤は更なる電子を受け入れるようになる。電子移動剤の非限定的例 として、フェリシアン化物（例えば、フェリシアン化カリウム）、フェナジンメ トスルフェート（ＰＭＳ）、フェナジンエトスルフェート（ＰＥＳ）などを挙げ ることができる。用いる電子移動剤は組成物のｐＨを含めて多くの基準により変 わるだろう。例えば、フェリシアン化カリウムは約３．０〜５．５のｐＨ範囲で 使用される。ＰＥＳはもっと広い範囲、すなわち約３．０〜９．０のｐ Ｈで用いられる。しかし、この試薬が約５．５以上のｐＨで使用されると、鉄（ III）イオンと遊離ヒドロキシル基とが結合して不溶性の水酸化鉄（III）を形成 するという問題が生じる。こうした問題が起こるのを回避するために、キレート 剤は強いものである必要がある。ｐＨ５．０以上においてはクエン酸やクエン酸 ナトリウムのようなシトレートイオンが好適である。また、リンゴ酸やリンゴ酸 ナトリウムのようなマレート含有化合物も好ましいものである。 本組成物はさまざまな剤型に調製することができる。実施例では溶液の形態を 示してあるが、組成物はマルチパートキット（multi part kit）として製剤化す ることもでき、組成物の成分を互いに分離しても、異なる組合せを調製してもよ い。例えば、鉄（III）イオン源をキレート剤から離して容器に保管することが でき、また、２つの成分を一緒にして１つの容器に入れることもできる。試薬成 分の一部または全部が液体または固体の形態であってよく、例えば水溶液、粉末 、錠剤、凍結乾燥品などであり得る。また、試験片や多層分析器具のような分析 装置に組成物を含浸させることもできる。多層分析器具において使用する場合は 、個々の成分を異なる層に含浸させて、上で述べた一連の反応がそれぞれ異なる 層で起こるようにすることができる。試験片のような単一の層を使用する場合は 、逐次反応が試験片の異なる地点で起こるように、試薬類を試験片に沿って配置 することができる。 上で述べたことは試薬組成物の剤型の例であり、その限定として解釈されるべ きでない。 上記説明および実施例は本発明を例示するものであって、制限 するものではないことが理解されよう。本発明の精神および範囲に含まれる他の 態様が当業者には思い浮かぶであろう。

【手続補正書】特許法第１８４条の７第１項 【提出日】１９９４年５月３０日 【補正内容】 １．サンプル中のアナライトを定量する方法であって、該サンプルと、 （ｉ）アナライト酸化剤、 （ii）電子移動剤、 （iii）鉄（III）イオンとキレート剤との錯体〔ここで、該キレート剤は鉄 （II）イオンに対してよりも鉄（III）イオンに対して高い親和性を有するもの であるが、ただし該キレート剤はイミノジアセテート含有化合物ではない〕、お よび （iv）鉄（II）イオンと結合するとき発色する鉄（II）イオン錯化剤、 を含有する組成物とを接触させ、そして該サンプルに含まれるアナライトの指標 として該サンプルにおける発色を測定することを含む方法。 ２．アナライト酸化剤が酵素を含む、請求項１に記載の方法。 ３．酵素がグルコースオキシダーゼである、請求項２に記載の方法。 ４．酵素がコレステロールオキシダーゼである、請求項２に記載の方法。 ５．電子移動剤がフェリシアン化物である、請求項１に記載の方法。 ６．電子移動剤がフェナジンエトスルフェートである、請求項１に記載の方法。 ７．電子移動剤がフェナジンメトスルフェートである、請求項１に 記載の方法。 ８．キレート剤がシトレートイオン含有化合物である、請求項１に記載の方法。 ９．キレート剤がマレートイオン含有化合物である、請求項１に記載の方法。 10．キレート剤がフェロジンである、請求項１に記載の方法。 11．前記の組成物がバッファーをさらに含有する、請求項１に記載の方法。 【手続補正書】特許法第１８４条の８ 【提出日】１９９５年２月２７日 【補正内容】 （３４条補正） 請求の範囲 １．サンプル中のアナライトを定量する方法であって、該サンプルと、 （ｉ）アナライト酸化剤、 （ii）電子移動剤、 （iii）鉄（III）イオンとキレート剤との錯体〔ここで、該キレート剤は鉄 （II）イオンに対してよりも鉄（III）イオンに対して高い親和性を有するシト レートイオン含有化合物およびマレートイオン含有化合物よりなる群から選ばれ 、イミノジアセテート含有化合物は存在しない］、および （iv）鉄（II）イオンと結合するとき発色する鉄（II）イオン錯化剤、 を含有する組成物とを接触させ、そして該サンプルに含まれるアナライトの指標 として該サンプルにおける発色を測定することを含む方法。 ２．アナライト酸化剤が少なくとも１つの酵素を含む、請求項１に記載の方法。 ３．少なくとも１つの酵素がグルコースオキシダーゼである、請求項２に記載の 方法。 ４．少なくとも１つの酵素がコレステロールオキシダーゼである、請求項２に記 載の方法。 ５．電子移動剤がフェリシアン化物である、請求項１に記載の方法。 ６．電子移動剤がフェナジンエトスルフェートである、請求項１に 記載の方法。 ７．電子移動剤がフェナジンメトスルフェートである、請求項１に記載の方法。 ８．キレート剤がシトレートイオン含有化合物である、請求項１に記載の方法。 ９．キレート剤がマレートイオン含有化合物である、請求項１に記載の方法。 10．キレート剤がフェロジンである、請求項１に記載の方法。 11．前記の組成物がバッファーをさらに含有する、請求項１に記載の方法。

Claims (1)

1. 【特許請求の範囲】 １．サンプル中のアナライトの定量に有用な組成物であって、 （ｉ）アナライト酸化剤、 （ii）電子移動剤、 （iii）鉄（III）イオンとキレート剤との錯体〔ここで、該キレート剤は鉄 （II）イオンに対してよりも鉄（III）イオンに対して高い親和性を有するもの であるが、ただし該キレート剤はイミノジアセテート含有化合物ではない〕、お よび （iv）鉄（II）イオンと結合するとき発色する鉄（II）イオン錯化剤 を含有する組成物。 ２．アナライト酸化剤が酵素を含む、請求項１に記載の組成物。 ３．酵素がグルコースオキシダーゼである、請求項２に記載の組成物。 ４．酵素がコレステロールオキシダーゼである、請求項２に記載の組成物。 ５．電子移動剤がフェリシアン化物である、請求項１に記載の組成物。 ６．電子移動剤がフェナジンエトスルフェートである、請求項１に記載の組成物 。 ７．電子移動剤がフェナジンメトスルフェートである、請求項１に記載の組成物 。 ８．キレート剤がシトレートイオン含有化合物である、請求項１に記載の組成物 。 ９．キレート剤がマレートイオン含有化合物である、請求項１に記載の組成物。 10．鉄（II）イオンキレート剤がフェロジンである、請求項１に記載の組成物。 11．バッファーをさらに含有する、請求項１に記載の組成物。