DE3216512A1

DE3216512A1 - Verfahren zur entfernung der formylgruppe aus n-formylpeptiden und ihre estern

Info

Publication number: DE3216512A1
Application number: DE19823216512
Authority: DE
Inventors: Livio Ivrea Torino Buracchi; Vincenzo Torino Giobbio; Alberto Milano Mangia; Giorgio Ornato
Original assignee: Pierrel SpA
Current assignee: Pierrel SpA
Priority date: 1981-05-13
Filing date: 1982-05-03
Publication date: 1982-12-23
Also published as: NL8201821A; ZA823232B; AU537275B2; CH648566A5; IT8121674A1; CA1244406A; JPS5810546A; NZ200583A; PT74892B; ES511760A0; GR75497B; ES8302633A1; KR830010053A; AU8361282A; US4434097A; NO821585L; GB2098220A; IT8121674A0; PT74892A; ATA183082A

Description

PATENTANWÄLTE UND ZUGELASSENE VERTRETER VOR DEM EUROPÄISCHEN PATENTAMT

DR. WALTER KRAUS DIPLOM CH EMIKER · DR.-I Ne. AN N EKÄTE WEISERT DIPL.-ING. FACHRICHTUNG CHEMIE IRMGARDSTRASSE15 · D-800O MÜNCHEN 71 · TELEFON 089/797077-797078 . TELEX OB-2121B6 kpotd

TELEGRAMM KRAUSPATENT

3296 AW/rm

PIERREL S.P.A. Neapel / Italien

Verfahren zur Entfernung der Formy1gruppe aus N-Formylpeptiden und ihren Estern

Verfahren zur Entfernung der Formylgruppe aus N-Formyl-

peptiden und ihren Estern 10

Beschreibung

'** Die Erfindung betrifft Peptide und insbesondere die Eliminierung der Formylgruppe aus Peptiden oder ihren N-Formylestern mittels Hydrazin oder Derivaten des Hydrazins bei spezifischen pH-Bedingungen.

Es ist aus der chemischen Literatur gut bekannt, daß die Aminogruppe von Aminosäuren mittels dem Formylrest blokkiert werden kann, um die Aminogruppe im Verlauf der Peptidsynthesen zu schützen. Offensichtlich ist es gegen Ende des Verfahrens erforderlich, die Aminogruppe freizuset-

zen, indem man die Formylgruppe entfernt. Während die erste Stufe des Verfahrens, d.h. die Formylierung, leicht durchgeführt werden kann, sind die Ergebnisse, die man bei der darauffolgenden letzten Stufe der Deformylierung

mittels an sich bekannter Verfahren erhält, nicht zufrie-30

denstellend. In der Tat sind, obgleich die Bedingungen für die Deformylierung, die allgemein verwendet v/erden, recht einfach sind, die Ergebnisse, die man häufig erhält, nicht zufriedenstellend, da Änderungen in den Peptidmolekülen, die mehr oder weniger wesentlich sind,-stattfinden, Änderungen, die sogar die Peptidbindung betreffen. Dies geschieht, wenn man bei den üblichen Deformylierungsbedingungen, d.h. in einer V/asser- und Alkohol-

lösung, mit Alkoholen, die 1 bis 5 Kohlenstoffatomen enthalten, in Anwesenheit starker Säuren, wie Chlorwasser stoff säure, Schwefelsäure, Salpetersäure, p-Toluolsulfonsäure oder Trifluoressigsäure, arbeitet.

Die Änderungen der chemischen Struktur, die oben erwähnt wurden, sind noch eindeutiger, wenn anstelle des formylierten Peptids das Substrat aus einem Peptid besteht, welches formyliert und verestert wird, da zusätzlich zu den oben erwähnten Schwierigkeiten häufig eine Hydrolyse der Estergruppe in dem Ausmaß stattfindet, welches mehr oder weniger merklich ist, wobei das Produkt das entsprechende Diketopiperazin ist.

Eine umfassende Bibliographie der Deformylierungsreaktion von Peptiden findet sich in Zehra A., Ber. 2^, 3625 (1890); Hillmann-Elies, A., Naturforsch., 6 B, 340 (1951); Waley S.G., Chem. Ind., 1953, 107; Boissonnas R.A., HeIv. Chim. Acta, 36, 875 (1953) und Sheehan, J.C,J.

Am. Chem. Soc. 80, 1154 (1958). Andere genaue Erläuterungen finden sich in der klassischen Literatur über Peptide, wie J. Greenstein: Chem. of Am. Acis, II, 1244, 46, 47. Die gleichen Autoren haben die in saurem Medium durchgeführte Deformylierungsreaktion untersucht.

Kürzlich haben andere Forscher bei anderen Bedingungen gearbeitet und bessere Ergebnisse erzielt, wobei sie als Deformylierungsmittel .andere Substanzen, wie. Acetylchlorid oder Hydroxylamin oder Hydrazin, verwendeten. Diese ™ Autoren haben jedoch angegeben, daß das letztere für die Deformylierung von Estern nicht geeignet ist, da es zur ■ Bildung der entsprechenden Hydrazinderivate führt. (Lefrancier, Bull. Soc. Chim. France 1965, 3668; Geiger,

GB-PS 1 132 450).
35

Andere Forscher haben Peptide oder Ester der Peptide durch Oxidation mit HgO (Losse, Am. Chem. 1960, 636,

14O) oder mittels Hydrogenolyse (Losse, J. Prakt. Chem. 1964, 24, 118) deformyliert.

Die Bedeutung der N-Deformylierung von Peptiden oder ihrer N-formylierten Ester ist auch vom industriellen Standpunkt aus ersichtlich. Ein Beispiel einer Substanz mit industrieller Wichtigkeit mit Peptidstruktur und mit ausgeprägten Süßstoffeigenschaften ist ct-L-Aspartyl-L-phenylalaninmethylester, v/elcher als "Aspartam" bekannt ist.

Diese Substanz wurde nach vielen unterschiedlichen Verfahren hergestellt. Es wurden fast alle die klassischen Verfahren verwendet, die für die Herstellung von Peptiden verwendet werden. Insbesondere wurde die Aminogruppe der Asparginsäure maskiert, wobei, anschließend die a-Carboxygruppe in Form eines aktiven Esters oder Anhydrids aktiviert wurde und dann eine Kondensationsreaktion mit Phenylalaninmethylester erfolgte. Anschließend wurde die Gruppe, die die Aminogruppe in dem erhaltenen veresterten Peptide schützte, entfernt.

Bei den industriellen Verfahren für die Herstellung von a-L-Aspartyl-L-phenylalaninmethylester treten viele praktische Schwierigkeiten auf, bedingt durch die Auswahl des zu verfolgenden Schemas wie auch durch die Tatsache, daß die verschiedenen Schemata die Verwendung toxischer Substanzen, wie hosgen, oder Substanzen mit schwieriger Handhabbarkeit, wie Carbobenzoxychlorid, umfassen. Eine

andere Schwierigkeit ist, daß die verschiedenen Reaktionswege zu dem gewünschten Produkt in niedrigen Ausbeuten führen.

Das industrielle Verfahren, das .relativ leicht für- die

Herstellung von Aspartam durchzuführen zu sein scheint, umfaßt die Kondensation des Anhydrids der N-Formyl-L-asparginsäure mit L-Phenylalaninmethylester und die nachfolgende N-Deformylierung von dem so erhaltenen N-

Formyl-oc-L-aspartyl-L-phenylalaninmethylester. Die N-Deformylierung wird in Anwesenheit eines spezifischen Lösimg smitt els und starker 8.norgani scher Säuren entsprechend der DE-OS 2 635 948 oder mit Hydroxylamin entsprechend der DE-OS 2 554 421 oder durch Erhitzen in Anwesenheit von Wasser entsprechend der JA-OS 76 39 602 oder mit Chlorwasserstoffsäure in Methanol entsprechend der DE-OS 2 256 055 durchgeführt. Die in diesen Publikationen beschriebenen Verfahren besitzen verschiedene Nachteile, insbesondere bei der Deformylierungsreaktion anderer N-formylierter Peptide oder der entsprechenden Ester. Vor allein besteht ein Nachteil darin, daß die Ausbeuten sehr niedrig sind, die man bei der Endstufe der Synthese erhält, und in der Tatsache, daß die Zwischenprodukte sehr teuer sind. Zusätzlich gehen die niedrigen Ausbeuten mit wesentlichen Verunreinigungen in den Endprodukten eirher, die offensichtlich weiter, gereinigt werden müssen, was wesentliche zusätzliche Produktionskosten mit sich bringt.

Es wurde überraschenderweise gefunden, daß die Eliminierung des N-Formylrestes in Peptiden oder ihren entsprechenden Estern auf einfache Weise mit überraschenden und wesentlich verbesserten Ausbeuten durchgeführt werden kann, wenn die Entfernung der Formylgruppe in Anwesenheit von Hydrazin oder Hydrazinderivaten in einem pH-Bereich zwischen 1 und 3,5 durchgeführt wird. Der pH-Bereich ist für die Reaktion wesentlich.

Gegenstand der Erfindung ist ein Verfahren für die Eliminierung der Formylgruppe in N-formylierten Peptiden oder ihren entsprechenden Estern und insbesondere für die Eliminierung dieser Gruppe in dem Methylester von N-Formyloc-L-aspartyl-L-phenylalanin mit Hydrazin oder Hydrazinderivaten der· Formel I:
35

R-C-NH-NH₉ (I)

It ^

-8-Τ worin R einen gesättigten oder ungesättigten, linearen oder verzweigten AlkyIrest mit 1 bis 5 Kohlenstoffatomen oder eine Cycloalkylgruppe oder eine Arylgruppe, die durch andere funktioneile Gruppen substituiert sein können oder eine Aminogruppe bedeutet, wobei die Reaktion bei einem pH-Wert zwischen 1 und 3»5 durchgeführt wird.

Bei dem erfindungsgemäßen Verfahren muß der pH-Wert zwischen 1 und 3,5 liegen. Wenn man die Reaktion mit Säuren in Anwesenheit von Hydrazin oder Hydrazinderivaten durchführt, bemerkt man, daß, wenn die Reaktion bei einem pH-Wert durchgeführt wird, der unter 1 liegt, nach 1 h bei 60⁰C der als Ausgangsmaterial verwendete Pormylester vollständig verschwunden ist und daß nur eine geringe Ausbeute, etwa 15?ό, des deformylierten Produkts erhalten wird. Mittels TLC (DünnschichtChromatographie) stellt man eine wesentliche Menge eines Produkts fest, von dem festgestellt wurde, daß es Diketopiperazin ist (vgl. die folgenden Ausführungen).

Wenn man andererseits die Reaktion bei einem pH-Wert über 3,5 durchführt, findet nur eine sehr geringe Deformylierung statt, praktisch in keinem wesentlichen Ausmaß, selbst wenn man die Reaktion während langer Zeiten durchführt. Der pH-Bereich, innerhalb dessen es erforderlich ist, die Reaktion durchzuführen, muß daher während des Verlaufs der Reaktion konstant gehalten werden, da, wenn die Base freigesetzt wird, der pH die Tendenz hat, zu steigen. Diese Kontrolle muß durchgeführt werden, indem

man allmählich zu dem Reaktionsgemisch eine Lösung einer anorganischen Säure, wie beispielsweise eine Lösung von 10biger Chlorwasserstoffsäure oder Schwefelsäure oder p-Toluolsulfonsäure, zusetzt. Es ist weiterhin möglich, geeignete Pufferlösungen zu verwenden.

Es wurde bereits oben erwähnt, daß andere Forscher angegeben haben, daß Hydrazin für die Deformylierung von N-

formylierten Peptidestern, bedingt durch die mögliche Bildung der entsprechenden Hydrazide, nicht geeignet ist (P. Lefrancier et al., Bull. Soc. Chim. France 1965, 3663).

Es wurde jedoch überraschenderweise gefunden, daß dieser Nachteil minimal gehalten werden kann, wenn man die Reaktion erfindungsgemäß in einem pH-Bereich zwischen 1 und 3,5 durchführt. Versuchsergebnisse haben gezeigt, daß die Hydrazinmenge zwischen 1 und 3 niol pro mol Ppptid oder der entsprechenden Ester die deformyliert werden soll, variiert werden muß, wenn das Lösungsmittel Methanol oder ein Gemisch aus Methanol und Wasser oder anderen Lösungsmitteln ist. Die Struktur und die Menge der Lösungsmittel selbst besitzen keine große Bedeutung. Um jedoch in jedem Fall das Verfahren zufriedenstellend durchzuführen, ist es erforderlich, wie bereits erwähnt, zu Beginn den pH-Wert des Gemisches auf zwischen 1 und 3,5 einzustellen und diesen pH-Bereich während des Verlaufs der Reaktion beizubehalten. Die Reaktion kann bei einer Temperatür zwischen 20 und 100⁰C durchgeführt werden, offensichtlich mit unterschiedlichen Reaktionszeiten, abhängig von der Temperatur. Die zu verwendende Säure kann eine starke Mineralsäure, wie Chlorwasserstoffsäure oder Schwefelsäure oder Salpetersäure, sein oder man kann p-Toluolsulfonsäure verwenden.

Es wurde gefunden, daß die N-Deformylierung mit verbesserten Ausbeuten abläuft, wenn die Reaktion in Anwesenheit von Substanzen der Struktur
30

R-C-NH- NH₂

durchgeführt wird, worin R die oben gegebene Bedeutung besitzt. Die Reaktion selbst verläuft sehr leicht bei diesen Bedingungen mit minimalen Änderungen und mit sehr guten Ausbeuten, die zwischen 75 und 9O?o variieren und

-ΙΟΙ selbst höher sein können, abhängig von der verwendeten Substanz. Es wurde gefunden, daß die Aktivität der Substanz der Formel:

0 .

R-C-NH- NH₂

als Deformylierungsmittel besonders groß ist im Falle von Acetylhydrazin, welches die einfachste Substanz ist, 10" Benzoylhydrazin, Trimethylaminoacetylhydrazidchlorid, wobei das letztere im allgemeinen als "Girard T" bezeichnet ist, welches komplexer ist'-rund zusätzliche funktioneile Gruppen und Semicarbazid enthält.

v/ie aus den folgenden Versuchsbedingungen folgt, liegt die Menge an Deformylierungssubstanzen zwischen 1 und 5 mol, bezogen auf 1 mol des Peptids oder des Esters, der deformyliert werden soll. Es ist sogar möglich, größere Mengen an dem Reaktionsteilnehmer zu verwenden, man erhält jedoch keine wesentlichen wirtschaftlichen Vorteile.

Bevorzugt verwendet man als Lösungsmittel Methanol oder ein Gemisch aus Methanol und Wasser im Falle von Peptiden, doch im Falle von Peptidestern ist es bevorzugt, den gleichen Alkohol, der den Ester in dem Peptid darstellt, zu verwenden. Selbst hier ist die .Struktur des Lösungsmittels nicht wesentlich, so daß es möglich ist, ebenfalls einen anderen Alkohol mit einer Kohlenstoffatomzahl, die zwischen 2 und 5 liegt, oder andere Lö-

sungsmittel, die in Wasser löslich sind, wie Dioxan, Aceton, Acetonitril und Dimethylformamid, zu verwenden. Es ist weiterhin möglich, andere'Lösungsmittel zu verwenden, die nicht in Wasser löslich sind, wie Kohlenwasserstoffe, chlorierte Kohlenwasserstoffe, Ether,

Ketone, Ester oder Gemische dieser Lösungsmittel. Alle diese Lösungsmittel können in Anwesenheit oder Abwesenheit von Wasser verwendet werden und in einigen Fällen

kann eine einzige Phase vorhanden, sein und in anderen Fällen können zwei Phasen auftreten. Die Reaktionstempe-■ ratur ist nicht kritisch, da die Temperatur nur die Reaktionszeit beeinflußt. Genauer gesagt kann die Temperatur zwischen 20 und 150°C variieren, abhängig von dem Lösungsmittel, welches verwendet wird, und die Reaktionszeit kann zwischen 30 min und 30 h variieren, abhängig von der Temperatur. In den folgenden Beispielen wird das erfindungsgemäße Verfahren bei den verschiedenen Ver-Suchsbedingungen näher erläutert. Das Fortschreiten der Reaktion wird im allgemeinen sehr gut durch Dünnschichtchromatographie (TLC) kontrolliert. TLC zeigt zusätzlich, daß in der chemischen Struktur nur geringe Änderungen im Verlauf der Reaktion auftreten. Tatsächlich stellt man zusätzlich zu dem deformylierten Produkt- nur die Anwesenheit sehr geringer Mengen eines Diketopiperazins fest. Diese Verbindung, insbesondere 2-Benzyl-3,6-diketo-5-piperazinylessigsaure, ist normalerweise in im Handel erhältlichem Aspartam in einer Menge von 2% vorhanden.

In der Tat gibt die Food and Drug Administration, Titel 21, Code of Federal Regulations, Paragraph 121.125Ö, eine maximale Grenze von 2% für diese Substanz im Aspartam an. Bei den Tests für die Prüfung der Reinheit des Aspartams, welches nach dem erfindungsgemäßen Verfahren erhalten worden ist, wobei die Versuche mittels HPLC (Hochdruck-Flüssigkeitschromatographie) durchgeführt wurden, konnte diese Substanz, das substituierte Diketopiperazin, welches zuvor erwähnt wurde, niemals in Mengen über 0,6 bis 0,7% nachgewiesen werden. Ähnliche Verbes-

serungen im Hinblick auf die technischen Herstellungen wurden bei den anderen Verunreinigungen festgestellt, die normalerweise im Aspartam auftreten, d.h. a-Aspartylphenylalanin, welches in.im Handel erhältlichen Proben von Aspartam in einer Menge von etwa 1% vorhanden ist. In dem erfindungsgemäß hergestellten Produkt tritt diese Substanz niemals in Mengen über 0,3% auf. Die quantitative Untersuchung des Reaktionsprodukts wurde mit GLC (Gas-Flüssigkeits-Chromatographie) durchgeführt.

- 12 Beispiel 1

3,2 g N-Formyl-a-L-aspartyl-L-phenylalaninmethylester (10 mmol) werden in 32 cur Methanol gelöst. Man gibt •7.

3,2 cm·^ Wasser hinzu und dann wird der pH-Wert auf 2 mit 0,5 car 3%iger Salzsäure eingestellt» Die Lösung wird auf 70°C erhitzt und die Temperatur wird 10 h lang gehalten, während der pH-Wert kontinuierlich mittels 3%iger Chlorwasserstoffsäure so eingestellt wird, daß der pH-Wert im Bereich von 1,5 "bis 3»0 liegt.

Vergleich TLC (Eluierungsmittel: Methylethylketon/Essigsäure/Pyridin/Wasser, 32/4/2/6)
Ninhydrinindikator:
ein großer Fleck Rf 0,35 (Aspartam)

ein Fleck Rf 0,1 (deformyliertes und de-

methyliertes Peptid) ein Fleck unbestimmt Rf 0,9

Analyse GLC: a-L-Aspartyl-L-phenylalanin-

methylester 1,91 g (Ausbeute:

6590.

Beispiel 2

3,2 g N-Formyl-a-L-aspartyl-L-phenylalaninmethylester (10 mmol) werden in 32 cnr Methanol gelöst. Getrennt wird eine Lösung aus 1,5 g Hydrazinmonohydrat (30 mmol) in 5 cur Wasser hergestellt und der pH-Wert wird auf 1,5 mit 15%iger Chlorwasserstoffsäure eingestellt. Die-

^ου se Lösung wird zu der ersten Lösung zugegeben und der pH-Wert wird auf 1,5 mit 15/oiger Chlorwasserstoff säure eingestellt. Die Lösung wird auf 7O⁰C erhitzt und diese Temperatur wird während 7,5 h gehalten, während der pH-Wert immer zwischen 1,5 und 315- durch Zugabe von 15%iger

^OJ Chlorwasserstoffsäure gehalten wird.

Analyse GLC: oc-L-Aspartyl-L-phenylalaninmethylester:

2 g (Ausbeute: 70%).

Beispiel' 3

3,2 g N-Formyl-a-L-aspartyl-L-phenylalaninmethylester (10 inmol) werden in 32 cm'' Methanol gelöst. Dazu gibt man 3,2 cnr⁵ Wasser und 2,2 g Acetylhydrazin (30 mmol). Der pH-Wert wird auf 2,5 mit einer 10xigen Chlorwasserstoffsäurelösung eingestellt. Das Gemisch wird auf 70⁰C erhitzt und 6 h bei dieser Temperatur gehalten, während der pH-Wert zwischen 1,5 und 3,5 gehalten wird.

Kontroll-TLC (Eluierdungsmittel: Methylethylketon/Essigsäure/Pyridin/Wasser, 32/^r4/'2/6)

Ninhydrinindikator:

ein Fleck Rf 0,35 (Aspartam) ein Fleck, sehr Rf 0,1 (deformyliertes und demethy-

schwach liertes Peptid)

Analyse GLC: cc-L-Aspartyl-L-phenylalaninmethyl-

ester: 2,65 g (Ausbeute: 90$).

Beispiel 4

3,2 g N-Formyl-oc-L-aspartyl-L-phenylalaninmethylester (10 mmol) werden in 32 ml Methanol gelöst. Dazu gibt man 3,2 cm^ Wasser und "5 g "Girard T" (30 mmol) und der pH-Wert wird auf 2,5 mit 1Obiger Chlorwasserstoffsäurelösung eingestellt. Das Gemisch wird auf 70°C·erhitzt und bei dieser Temperatur 7 h gehalten, wobei der pH-Wert zwischen 1,5 und 3,5 gehalten wird.

Kontroll-TLC (Eluierungsmittel: Methylethylketon/Essigsäure/Pyridin/Wasser, 32/4/2/6)
Ninhydrininidikator:·

ein Fleck Rf 0,35 (Aspartam) ein schwacher Fleck Rf 0,1 (deformyliertes und demethy-

liertes Peptid)

_ 14 _

Analyse GLC: α-L-Aspartyl-L-phenylalaninmethylester:

2,2 g (Ausbeute: 76%).

Beispiel 5

3,2 g N-Formyl-a-L-aspartyl-L-phenylalaninmethylester (10 mmol) werden in 32 cnr Methanol gelöst. Dazu gibt man 3»2 mmol Wasser und 3»33 g Semicarbazidhydrochlorid, d.h. 30 mmol. Der pH-Wert beträgt 2 und es ist nicht erforderlich, den pH-Wert zu korrigieren. Das Gemisch wird auf 70⁰C erhitzt und bei dieser Temperatur 8 h gehalten, wobei man den pH-Wert zwischen 1,5 und 3,5 hält.

Analyse GLC: a-L-Aspartyl-L-phenylalaninmethylester: 2,4 g (Ausbeute: 83%).

Beispiel 6

3,2 g N-Formyl-a-L-aspartyl-L-phenylalaninmethylester ' (10 mmol) werden in 32 cur Methanol gelöst. Man gibt 3,2 cnr Wasser und 4 g Benzoylhydrazid (30 mmol) hinzu. Der pH-Wert wird auf 1,5 bis 3,5 eingestellt. Die Lösung wird auf 70⁰C erhitzt und bei dieser Temperatur 4 h gehalten, wobei man den pH-Wert im vorbeschriebenen Bereich hält. Das Material wird unter Vakuum bei einer Temperatur unter 4O⁰C verdampft, 10 ccr Wasser werden zugegeben, der pH-Wert wird bis zum isoelektrischen Punkt (pH = 5,2) eingestellt, dann wird auf O⁰C gekühlt und durch Absaugen filtriert. Man erhält 2,5 g Aspartam, welches analytisch rein ist (Ausbeute: 85,4%).

Beispiel 7

12,825 kg N-Formyl-oc-L-aspartyl-L-phenylalaninmethylester werden in 30 1 Dichlorethan gelöst. Dazu gibt man 10 1 Eisessig, 10 1 Methanol und 14 kg Acety!hydrazin. Die Temperatur wird auf 64°C erhöht und der pH-Wert wird

•j auf 2,2 bis 2,3 durch Zugabe Lösung von konzentrierter Chlorwasserstoffsäure eingestellt. Die Lösung wird auf 64⁰C erhitzt, während man den pH-Wert im Bereich von 2,2 bis 2,3 hält. Bei diesen Bedingungen wird die Deformylierungsreaktion in einer Zeit von 5 h beendet. Das Endvolumen beträgt 30 1. Die Reaktionslösung wird zur Durchführung der Analyse (Hochdruck-Flüssigkeitschromatographie, HPLC) verwendet, um den Gehalt an a-L-Aspartyl-L-phenylalaninmethylester zu bestimmt. Der Wert beträgt 132 mg/ 3
^cm ·

Die analytischen Bedingungen sind wie folgt:

Säule: RP_Q 10 /um, Temperatur der Säule 45°C, Strömungsgeschwindigkeit 2 car/min mit UV

bei 215 nm als Indikator. Eluierungsmittel: Phosphatpuffer mit einem pH-Wert von

7,5, 0,01 M/Acetonitrillichrosolv = 9/1 Die Retentionszeit von a-L-Aspartyl-L-phenylalaninmethylester beträgt 5,2 min.

Ausbeute an a-L-Aspartyl-L-phenylalaninmethylester beträgt 10,55 kg (9056).

Dichlorethan und Methanol werden im Vakuum entfernt. 50 Wasser werden zugegeben und der pH-Wert wird auf 5,2 eingestellt. Dies ist der isoelektrische Punkt der Ausfällung von Aspartam. Nach dem Kühlen mit Salzlösung auf -5°C während 10 h wird Aspartam zentrifugiert und gut gewaschen. Nach dem Trocknen bei 45⁰C in einem Luftstrom erhält man 9 kg Aspartam mit den folgenden qualitativen Werten.

Titer (HPLC): trocken 99,3

substituiertes Diketopiperazin (2-Benzyl-3,6-diketo-5- *" piperazinylessigsäure): 0,5$

N-L-cc-Aspartyl-L-phenylalanin (demethyliertes Aspartem): 0,1%.

■j Die Mutterlauge, die etwa 1,5 kg Aspartam enthält, während der darauffolgenden Aufarbeitung rezyklisiert. Dies erlaubt eine fast quantitative Gewinnung des Produktes Aspartam.

Zwei im Handel erhältliche Proben unterschiedlichen Ursprungs besitzen die folgenden analytischen Werte:

Probe "A" Titer (HPLC) 93,4%; "Diketopiperazin" 0,7%; demethyliertes Aspartam 2,1%;

Probe "B" Titer (HPLC) 97,0%;" »Diketopiperazin" 2,74%; demethyliertes Aspartam 0,45%.

Bei dem fertigen Produkt sind die analytischen Bedingungen der HPLC wie folgt:

Säule: Lichrosorb RP^, 10 um, Länge 25 cm, Innendurchmesser 4 mm.

Eluierungsmittel: Phosphatpuffer pH 4 in Methanol: 60/40 pro Titer von Aspartam; 75 bis 25 für die

Bestimmung der Verunreinigungen

Strömung: 2 cnr/min

Indikator: UV bei 210 nm.

Retentionszeit: Aspartam: 12,8 min (3,6 min bei der Be-Stimmung des Titers)

substituiertes Diketopiperazin: 5,1 min demethyliertes Aspartam: 3,3 min.

Claims

Patentansprüche

1J Verfahren zur Entfernung der Formylgruppe in einer Verbindung, welches das N-formylierte Peptid oder einen Ester eines N-formylierten Peptids ist, dadurch gekennzeichnet , daß man die Verbindung mit Hydrazin oder einem substituierten Hydrazin der Formel I:

R-C-NH-

worin R eine gesättigte oder ungesättigte, lineare oder verzweigte, substituierte oder unsubstituierte Alkylgruppe mit 1 bis 5 Kohlenstoffatomen oder eine substituierte oder unsubstituierte Cycloalkylgruppe oder eine substituierte oder unsubstituierte Arylgruppe oder eine Aminogruppe bedeutet, bei einem pH-Wert von 1 bis 3,5 umsetzt, wobei man den pH-Wert während der Reaktion konstant hält, und daß man das N-deformylierte Peptid aus dem Reaktionsgemisch isoliert.
2. Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet , daß der pH-Wert bei einem Wert zwi- sehen 1 und 3,5 während der Reaktion durch Zugabe einer anorganischen Säure oder eines Puffers konstant gehalten wird.
3. Verfahren nach Anspruch 1, dadurch g e k e η η zeichnet, daß das Hydrazin oder die Verbindung der Formel I in einem Verhältnis von 1 bis 5 mol pro mol Peptid oder Ester des N-formylierten· Peptids verwendet wird.
4. Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet , daß man als Verbindung der Formel I eine Verbindung aus der Gruppe Acetylhydrazid, Benzoyl-

hydrazid, "Girard T" und Semicarbazid verwendet.
5. Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet , daß die Temperatur während der Reak- tion zwischen 20 und 150⁰C gehalten wird.
6. Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß die Reaktion in einem Lösungsmittel durchgeführt wird, welches einen Alkohol mit 1 "bis 5 Kohlenstoffatomen enthält.
7. Verfahren nach Anspruch 6, dadurch gekennzeichnet , daß Wasser zu dem Alkohol zugegeben wird.
8. Verfahren nach Anspruch 6 oder 7, dadurch gekennzeichnet, daß man ein Lösungsmittel aus der Gruppe Ketone, Dimethylformamide, Dimethylsulfoxid, Acetonitril, aliphatische Ester, Kohlenwasserstoffe, chlorierte Kohlenwasserstoffe und ihre Gemische verwendet .
9. Verfahren nach Anspruch 1, dadurch g e k e η η *- zeichnet, daß man als Verbindung N-Formyl-a-L-aspartyl-L-phenylalaninmethylester verwendet und daß die N-deformylierte Verbindung Aspartam ist.