DE3784538T2

DE3784538T2 - Verfahren zur trennung von glycopeptid-antibiotika.

Info

Publication number: DE3784538T2
Application number: DE8787104167T
Authority: DE
Inventors: Anacleto Gianantonio; Giambattista Panzone
Original assignee: Lepetit SpA
Current assignee: Aventis Bulk SpA
Priority date: 1986-04-11
Filing date: 1987-03-20
Publication date: 1993-06-24
Anticipated expiration: 2007-03-21
Also published as: DK173231B1; GB8608798D0; IL82118A0; HUT43868A; EP0241758A2; ATE86631T1; ES2053460T3; CA1320795C; EP0241758B1; IE870783L; JPH07116230B2; US4994555A; DE3784538D1; EP0241758A3; JPS62250000A; IE59748B1; KR870010075A; ZA872298B; DK170587D0; HU197926B

Description

Die Erfindung betrifft die Gewinnung glykopeptidischer Antibiotika aus wäßrigen Lösungen, die aus Fermentationsbrühen oder Verfahrensströmen stammen.
Beispiele glykopeptidischer Antibiotika, mit denen das erfindungsgemäße Verfahren durchgeführt werden kann, sind die folgenden: Vancomycin, Actaplanin, Ristocetin, Avoparcin, Actinoidin, LL-AM-374, A 477, OA 7653, A 35512 B, A 515668, AAD 216, A 41030, A 47934, A-40926 (europäische Patentschrift 177 882), die individuellen Faktoren, Derivate und Pseudo-Aglycone und die Aglycone davon, Teicoplanin und Teicoplanin-artige Verbindungen.
Die Trennung biologisch aktiver Materialien einschließlich der Antibiotika aus wäßrigen Medien durch Adsorption an einer festen Matrix wird in der US-Patentschrift 3 531 463 beschrieben. In diesem Fall werden nichtionogene, makroretikulare, wasserunlösliche Polyvinylbenzolharze verwendet.
Die Gewinnung von Ristocetin aus der gefilterten Fermentationsbrühe durch Adsorption an Kationenaustauschharzen, die saure Gruppen enthalten, wird in der britischen Patentschrift 813 559 beschrieben. Die Gewinnung und die Reinigung von Vancomycin- und Actaplanin-Antibiotika durch Adsorption an makroporösen, nichtfunktionellen Styrol-Divinylbenzol-Copolymer-Harzen wird in der US-Patentschrift 4 440 753 beschrieben.
Die Abtrennung einzelner Faktoren des Antibiotikums A-4696 (Actaplanin) aus einer gereinigten Präparation von A-4696-Komplex mittels Säulenchromatographie an einer Polyamidsäule wird in der US-Patentschrift 4 322 406 beschrieben.
Die Herstellung von kristallinem A-4696 aus rohem A-4696-Hydrochlorid, isoliert aus der Fermentationsbrühe, wird in der US-Patentschrift 4 064 233 beschrieben. In diesem Fall umfaßt die Isolierung von rohem A-4696-Komplex aus der Fermentationsbrühe verschiedene schwierige Trennverfahren, wie die Adsorption an einer Kohlenstoffsäule, die Eluierung, die Eliminierung von Sulfationen, die Konzentrierung, die Lösung in Wasser, die weitere Adsorption an Aktivkohle, die weitere Eluierung mit einer Chlorwasserstoffsäure/Aceton-Lösung, die Konzentrierung des Eluats und die Präzipitation des rohen A-4696-Hydrochlorids durch Zugabe von Methanol.
Das isolierte rohe A-4696-Hydrochlorid wird dann in Wasser gelöst, und die Lösung wird über eine Polyamidharz-Säule geleitet, die dann mit einem Wasserstrom gewaschen wird. Die antibiotische Aktivität wird dann aus dem Effluenten durch Verdampfen wiedergewonnen und in Wasser/Methanol gelöst, mit HCl angesäuert und durch Zugabe von Aceton präzipitiert, wobei das gereinigte Hydrochlorid von A-4696 gewonnen wird, welches dann aus Wasser/Ethanol umkristallisiert wird.
Die Trennung der einzelnen Faktoren des Antibiotikums A-35512 aus einer Probe des isolierten Komplexes durch Hochleistungs-Flüssigkeitschromatographie unter Verwendung eines Polyamidharzes als stationäre Phase wird in der US-Patentschrift 4 122 168 beschrieben. In diesem Fall wird die vorherige Abtrennung des Komplexes aus der Fermentationsbrühe durch Adsorption an einem makroporösen nichtionischen Polystyrolharz (Amberlite XAD-4) durchgeführt.
Beispiele für die Wiedergewinnung und Reinigung von glykopeptidischen Antibiotika mittels Affinitätschromatographie an einem immobilisierten Liganden, der ein D-Alanyl-D-Alanin-Oligopeptid enthält, werden in den europäischen Patentanmeldungen 122 969 und 132 117 beschrieben.
Erfindungsgemäß wurde gefunden, daß glykopeptidische Antibiotika auf geeignete Weise aus wäßrigen Lösungen, die diese Substanzen, begleitet von beachtlichen Mengen an verschiedenen unerwünschten Produkten verschiedener Art und verschiedenen Ursprungs, enthalten, auf geeignete Weise isoliert werden können, indem sie an bestimmten Polyamid-Chromatograhie-Harzen adsorbiert und anschließend mit wäßrigen Gemischen eluiert werden.
Der vorliegenden Erfindung liegt in der Tat die Aufgabe zugrunde, ein Verfahren zur Gewinnung glykopeptidischer Antibiotika aus wäßrigen Lösungen, die von Fermentationsbrühen oder Verfahrensströmen stammen, zur Verfügung zu stellen, gemäß dem die wäßrige Lösung mit einem Polyamid-Chromatographie-Harz behandelt wird, welches die antibiotische Aktivität adsorbieren kann, das Harz aus der wäßrigen Lösung abgetrennt wird, das Harz mit einem wäßrigen Eluierungsgemisch gewaschen und das glykopeptidische Antibiotikum aus dem eluierten Material gewonnen wird.
Typische wäßrige Lösungen, die glykopeptidische Antibiotika enthalten, die von unerwünschten Produkten begleitet werden, sind die Fermentationsbrühen, die von den Mycelien abfiltriert wurden, oder teilweise gereinigte Verfahrensströme.
Beispiele unerwünschter Nebenprodukte, die oben erwähnt wurden, sind zum Beispiel gefärbte Verunreinigungen, Nebenprodukte, nichtumgesetzte Reaktionsteilnehmer bei dem Herstellungsverfahren, wie auch die Salze und wasserlösliche Komponenten der Fermentationsmedien.
In keiner der oben beschriebenen Literaturstellen wird die Isolierung von glykopeptidischen antibiotischen Substanzen aus wäßrigen Lösungen, die aus Fermentationsbrühen oder Verfahrensströmen stammen, mittels Adsorption an einer Polyamid-Matrix beschrieben. Die oben genannte Literatur lehrt nur, daß die Chromatographie an einer Polyamid-Matrix die Abtrennung eines glykopeptidischen antibiotischen Komplexes in die einzelnen Komponenten, nachdem er aus der Fermentationsbrühe mittels anderer Maßnahmen isoliert wurde, verwendet werden kann. Alle spezifischen Beispiele für die Isolierung glykopeptidischer Antibiotika aus der Fermentationsbrühe mittels Adsorption an einer festen Matrix, die in der oben beschriebenen Literatur erwähnt werden, betreffen die Verwendung von Ionenaustauschharzen oder makroporösen nichtionischen Polystyrolharzen.
Gemäß einer besonderen erfindungsgemäßen Ausführungsform werden die Polyamidharze auf geeignete Weise für die Wiedergewinnungs- und Reinigungsstufen bei dem Herstellungsverfahren von Teicoplanin und Teicoplaninartigen Verbindungen verwendet. Teicoplanin ist ein glykopeptidischer Antibiotikum-Komplex, der von Actinoplanes teichomyceticus nov. Sp. ATCC 31121 erzeugt wird und gegen anaerobe grampositive Bakterien aktiv ist. Wie es in seiner biologischen Anwendung eingesetzt wird, besteht Teicoplanin im wesentlichen aus dem Faktor A&sub2; (T-A2), begleitet von einer geringen Menge Faktor A&sub3; (T-A3). Der Faktor A&sub2;, der sich in den üblichen chromatographischen Systemen (beispielsweise Dünnschichtchromatographie und Papierchromatographie) als homogenes Produkt verhält, zeigt, wenn er durch Umkehrphasen-Hochleistungschromatographie untersucht wird, fünf Hauptkomponenten mit sehr ähnlicher Polarität, welche als TA2-1, TA2-2, TA2-3, TA2-4 und TA2-5 bezeichnet werden. Vergleiche beispielsweise A. Borghi et al. in Journal of Antibiotics, Bd. 37, Nr. 6, S. 615-620, Juni 1984. Teicoplanin und seine Hauptkomponenten sind durch die Anwesenheit sowohl einer primären Aminoals auch einer Carboxylfunktion charakterisiert.
Der Ausdruck "Teicoplanin", wie er hierin verwendet wird, soll das Produkt, das oben beschrieben wurde, umfassen. Der Ausdruck "Teicoplanin-artige Verbindungen" soll die einzelnen Faktoren T-A&sub2; und T-A&sub3; und jede der fünf Hauptkomponenten von T-A&sub2;, wie auch die Gemische davon in irgendwelchen Verhältnissen, beispielsweise die, die man durch Zugabe geeigneter Vorstufen zu den Fermentationsmedien gemäß der britischen Patentanmeldung 8 512 795 erhält, umfassen. Der Ausdruck "Teicoplanin-artige Verbindungen" umfaßt also Teicoplaninaglycon und Pseudo-Aglycone, die in der früheren Literatur als Antibiotikum L 17046 (europäische Patentanmeldung 119 574), L 17054 (europäische Patentanmeldung 119 575) und L 17392 (europäische Patentanmeldung 146 053) bezeichnet werden, wie auch die semi-synthetischen Derivate, wie die Ester und Amide von Teicoplanin und seinem Aglycon und den Pseudo-Aglyconen (vgl. beispielsweise europäische Patentschrift 216 775, europäische Patentschrift 218 099 und europäische Patentveröffentlichung 182 157).
Die Isolierung von Teicoplanin aus der gefilterten Fermentationsbrühe von Actinoplanes teichomyceticus nov. Sp. ATCC 31121, die in der früheren Literatur (M.R. Bardone et al., Journal of Antibotics, Bd. 31, Hr. 3, S. 170-177, März 1978) beschrieben wird, umfaßt die Extraktion mit Butanol bei saurem pH und anschließende Wasch- und Konzentrierungsverfahren. Dieses Verfahren, wie auch irgendeine alternative Verwendung stark saurer Ionenaustauschharze bewirkt einen Abbau in dem Zucker-Molekülteil. Die Verwendung stark basischer Ionenaustauschharze begünstigt im Gegensatz die Epimerisierung, die zum Verlust der biologischen Aktivität führt. Weiterhin begünstigt die schlechte Spezifität der Ionenharze nicht die Abtrennung der glykopeptidischen Antibiotika von all den gefärbten Verunreinigungen und Nebenprodukten, die in den wäßrigen Lösungen enthalten sind. Nichtionische makroporöse Harze (wie auch Ionenaustauschharze) besitzen den Nachteil, daß sie fast irreversibel beachtliche Mengen an antibiotischer Substanz binden und daher die Eluierung Bedingungen erfordert, die mit der chemischen Stabilität des Produktes nicht verträglich sind. Die Verwendung der Affinitätschromatographie an immobilisierten Liganden, welche D-Alanyl-D-Alanin- Oligopeptide enthalten, besitzt, obgleich sie wirksam ist, verschiedene wirtschaftliche Nachteile für die Anwendung in industriellem Maßstab.
Es wurde gefunden, daß Polyamidharze bei dem Trennverfahren von glykopeptidischen Antibiotika aus wäßrigen Lösungen nützlich sind, und insbesondere werden Teicoplanin, Teicoplanin-artige Verbindungen und das Antibiotikum A 40926 von den Polyamid-Säulenchromatographie-Harzen ausgewählt, die im allgemeinen als Polycaprolactam, Nylon (6/6, 6/9, 6/10 und 6/12) bekannt sind, und von vernetztem Polyvinylpyrrolidon. Die Chromatographie- Polyamidharze sind im allgemeinen durch ein Porenvolumen (*) (ml/g) im Bereich zwischen 1 und 5, einen Oberflächenbereich (*) (m²/g) im Bereich zwischen 1 und 100, eine scheinbare Dichte (g/ml) im Bereich zwischen 0,15 und 0,50, einen durchschnittlichen Porendurchmesser (*) (A-Einheiten) im Bereich zwischen 100 und 3000 und eine Teilchengrößenverteilung, worin mindestens 40% der Teilchen eine Größe unter 300 um aufweisen, charakterisiert.
Spezifische Beispiele für im Handel erhältliche Polyamid-Säulenchromatographie-Harze, die für die erfindungsgemäße Ausführungsform geeignet sind, sind die folgenden:
Die Polyamidharze Polyamid-CC 6, Polyamid-SC 6, Polyamid-CC 6.6, Polyamid-CC 6AC und Polyamid-SC 6AC von Macherey-Nagel & Co. (Deutschland), das Polyvinylpyrrolidonharz PVP-CL von Aldrich Chemie GmbH & Co. KG (Deutschland), das Polyamidharz PA 400 von M. Woelm (Deutschland). Beispielsweise besitzen zwei der oben angegebenen Harze die folgenden Eigenschaften: Harz Porenvolumen(*) Oberflächenbereich(*) scheinbare Dichte durchschnittl. Porendurchmesser(*) Teilchengrößenverteilung Polyamid (*) bestimmt mit einem Quecksilber-Porosimeter Modell Serie 200 von C. Erba SpA, Mailand, Italien
Gemäß dem allgemeinen Verfahren für die erfindungsgemäße Ausführungsform wird eine wäßrige Lösung, die aus der Fermentationsbrühe eines glykopeptidischen Antibiotikums stammt und von dem Mycelienkuchen abfiltriert wurde, oder ein Verfahrensstrom, der aus der Brühe stammt oder der von einer chemischen Modifizierungsreaktion eines glykopeptidischen Antibiotikums stammt (insbesondere Teicoplanin, eine Teicoplanin-artige Verbindung oder das Antibiotikum A 40926), auf eine Polyamidharz-Säule in einer Strömungsgeschwindigkeit des Fluids durch die Säule, die im Bereich von etwa 20 ml/cm² pro Stunde bis etwa 400 ml/cm² pro Stunde liegen kann, gegeben. Wenn eine hohe Strömungsgeschwindigkeit erforderlich ist, wird die wäßrige Lösung auf die Säule unter Vakuum durch Ansaugen vom Boden oder unter Druck oder unter Verwendung eines Polyamidharzes mit größerer Teilchengröße gegeben. Im letzteren Fall wird eine geringe Abnahme in der Adsorptionskapazität des Harzes beobachtet.
Alternativ kann das Polyamidharz zu der wäßrigen Lösung, die die antibiotische Aktivität enthält, zugegeben werden und gut während vorbestimmter Zeit damit vermischt werden, die von einer halben Stunde bis sechs Stunden varrieren kann, und dann wird die erschöpfte Lösung entfernt.
Die Fermentationsbrühe oder der Verfahrensstrom, aus dem die wäßrige Lösung, die die antibiotische Aktivität enthält, stammt, werden nach Standard-Pilot- oder industriellen Verfahren gebildet und umfassen ebenfalls die Fälle, wo verschiedene Zugaben von geeigneten Vorstufen während des Fermentationsverfahrens durchgeführt werden, um das Verhältnis der einzelnen Hauptkomponenten des glykopeptidischen Antibiotikum-Komplexes selektiv zu erhöhen. Vergleiche beispielsweise die europäische Patentschrift 204 179.
Der pH-Wert der Brühe oder der wäßrigen Lösung, die mit dem Polyamidharz behandelt wird, kann im Bereich zwischen 4 und 10, bevorzugt zwischen 5 und 8, liegen. Die Lösung, die behandelt wird, kann variable Mengen an mit Wasser mischbaren Lösungsmitteln enthalten, um eine Präzipitation der Feststoffmaterialien, welche die Säule verstopfen würden, zu vermeiden.
Die Konzentration der antibiotischen Aktivität in der wäßrigen Lösung, die dem erfindungsgemäßen Wiedergewinnungsverfahren unterworfen wird, kann innerhalb eines großen Bereiches variieren. Bei den derzeitigen, in Pilot- und Industrieanlagen verwendeten praktischen Bedingungen liegt sie im allgemeinen im Bereich von 50 bis 20.000 ppm (Gew./Vol.).
Wenn die Potenz der Ausgangsbrühe nicht zu niedrig ist, erlaubt ein einziger Durchgang durch das Polyamidharz das Erreichen eines zufriedenstellenden Reinigungsgrades.
Die Menge an Polyamidharz, die pro Gewichtseinheit an antibiotischer Aktivität, die in der wäßrigen Lösung enthalten ist, eingesetzt wird, hängt im allgemeinen von der Adsorptionseffizienz des verwendeten Harzes ab. Die Adsorptionseffizienz von jedem Harz kann durch Vorversuche bestimmt werden, indem man nacheinander verschiedene unterteilte Teile einer Probe aus der wäßrigen Lösung, die das glykopeptidische Antibiotikum in bestimmten Konzentrationen enthält, durch eine Säule leitet, die mit einem bestimmten Polyamidharzvolumen gepackt ist.
Die Teile des Eluats der Säule werden durch HPLC geprüft, um den Gehalt an glykopeptidischem Antibiotikum zu bestimmen. Wenn die HPLC-Analyse zeigt, daß das Eluat eines bestimmten Teils der Testprobe antibiotische Aktivität enthält, wird dies als Anzeichen dafür genommen, daß das Polyamidharz gesättigt ist, und die Menge an Antibiotikum, die adsorbiert ist, wird aus dem Gesamtvolumen des Eluats, welches keine antibiotische Aktivität zeigt, berechnet.
Bevorzugt ist das Volumen an Polyamid, das bei dem erfindungsgemäßen Pilot- oder Industrie-Wiedergewinnungsverfahren verwendet wird, größer als das Sättigungsvolumen, welches, wie oben beschrieben, bestimmt werden kann.
Bei den derzeitigen Verfahren beträgt das Verhältnis zwischen Polyamid-Chromatographie-Harz und glykopeptidischer Antibiotikum-Aktivität, die aus der wäßrigen Lösung gewonnen wird, im allgemeinen zwischen etwa 50 und etwa 250, bevorzugt zwischen etwa 60 und etwa 200, Liter Harz für ein Kilogramm antibiotischer Aktivität, die in der Lösung enthalten ist.
Die Polyamidharz-Eluierung erfolgt im allgemeinen bei Raumtemperatur durch Schwerkraft oder unter Saugen oder unter Druck unter Verwendung eines wäßrigen Lösungsmittelgemisches als Eluierungsmittel, bevorzugt eines Lösungsmittelgemisches aus Wasser und einem oder mehreren mit Wasser mischbaren organischen Lösungsmitteln, beispielsweise einem niederen Alkanol, Aceton, Methylethylketon, Tetrahydrofuran, Dioxan und Acetonitril.
Die am meisten bevorzugten Eluierungsgemische sind wäßrige Lösungen, die Wasser und einen niederen Alkanol (beispielsweise Methanol) oder Aceton in einem Verhältnis im Bereich von etwa 1:9 bis etwa 9:1 (Vol./Vol.) enthalten, wobei eine geeignete Menge einer Säure oder einer Base, die in dem Gemisch löslich ist, zugegeben werden kann, um den pH des Eluats im Bereich zwischen 3 und 11 zu halten.
Pufferlösungen können ebenfalls verwendet werden, um den pH-Wert auf dem gewünschten Wert zu halten.
Nützliche Zusatzstoffe für diesen Zweck sind beispielsweise Mineralsäuren, Ameisensäure, Essigsäure, verdünnte wäßrige Alkalimetallhydroxide, wie Natriumhydroxid, Kaliumhydroxid, Natriumbicarbonat, Natriumcarbonat, Ammoniak, Bis-(2-hydroxyethylamin), Natriumhydrogenphosphat-Puffer und ähnliche.
Gemäß einer bevorzugten erfindungsgemäßen Ausführungsform kann der erste Teil des Eluierungsgemisches einen pH-Wert besitzen, der niedriger ist als der der letzten Teile, und der pH-Wert wird allmählich während der Eluierung erhöht, wodurch die Eliminierung der stärker sauren Verunreinigungen mit den ersten Fraktionen des Eluats möglich wird. In diesem Fall wird der erste eluierte Teil beispielsweise wäßriges Natriumbicarbonat als Base enthalten, während die Zwischenteile Natriumcarbonat und die letzten Teile Natriumhydroxid enthalten können. Alternativ kann nach der Eliminierung der stärker sauren Verunreinigungen die Eluierung des Antibiotikums bei saurem pH-Wert unter Verwendung von einer der oben erwähnten Säuren erfolgen. Ähnliche Effekte können erhalten werden, wenn Gradienten aus mit Wasser mischbaren Lösungsmitteln oder steigende Konzentrationen an Puffersalzen verwendet werden.
Die Eluate werden in verschiedenen Fraktionen gesammelt, welche auf pH 7 neutralisiert und mittels HPLC analysiert werden. Die Fraktionen, welche glykopeptidische antibiotische Aktivität enthalten, werden vereinigt und im Vakuum konzentriert. Das glykopeptidische Antibiotikum wird aus einer konzentrierten wäßrigen Lösung nach an sich bekannten Verfahren isoliert. Beispielsweise kann es aus der konzentrierten wäßrigen Lösung durch Zugabe von einem mit Wasser mischbaren organischen Lösungsmittel, in dem das glykopeptidische Antibiotikum eine niedrige Löslichkeit aufweist, beispielsweise Aceton, präzipitiert werden. Ein alternatives Wiedergewinnungsverfahren, das die Zugabe von mit Wasser mischbaren Lösungsmitteln nicht erfordert, beruht auf dem Filtrieren des präzipitierten Antibiotikums bei einem pH nahe seinem isoelektrischen Punkt aus der konzentrierten Lösung nach dem Stehenlassen während einiger Stunden bei niedriger Temperatur, beispielsweise 5ºC.
In einigen Fällen, insbesondere in solchen Fällen, in denen die Eluate eine unerwünschte Menge an anorganischen Salzen enthalten, die das durch Konzentrierung gewonnene Produkt nicht geeignet erscheinen lassen für seine direkte Verwendung in der pharmazeutischen Praxis, ist es bevorzugt, eine weitere Konzentrierung des Eluats mit einem Entsalzungsverfahren zu kuppeln. Das Verfahren kann gleichzeitig durchgeführt werden, indem ein Ultrafiltrationsverfahren verwendet wird (beispielsweise unter Verwendung einer Membran von FILMTEC CO. mit einer Ausschlußgrenze von 500 bis 1000 Dalton) oder indem das Eluat durch ein nichtionogenes makroretikulares vernetztes Harz (beispielsweise Amberlite XAD-7 oder andere Harze des Typs, wie sie in US-3 531 463, US-3 663 467 und UK-1 581 671 beschrieben werden) geleitet wird, wobei das glykopeptidische Antibiotikum an dem wäßrigen Gemisch adsorbiert und dann mit einem Aceton/Wasser-Gemisch eluiert wird.
Die glykopeptidischen Antibiotika, die nach den obigen Verfahren gewonnen werden, besitzen einen sehr zufriedenstellenden Reinheitsgrad im Vergleich mit denen, die unter Verwendung unterschiedlicher Wiedergewinnungsverfahren, die bis jetzt bekannt sind, gewonnen werden oder die unter Verwendung von Harzen unterschiedlicher Typen, wie beispielsweise makroporöse Harze, gewonnen werden. Die Ausbeute bei der Wiedergewinnung aus den filtrierten Fermentationsbrühen oder den Verfahrensströmen nach dem erfindungsgemäßen Verfahren ist wesentlich günstiger, verglichen mit denen, die man erhält, wenn die oben beschriebenen bekannten Verfahren verwendet werden.
Wird beispielsweise das erfindungsgemäße Verfahren mit Teicoplanin durchgeführt, kann das antibiotische Produkt aus der Säule einen Reinheitsgrad zeigen, der sehr eng an dem Standard liegt, der für seine Verwendung in der pharmazeutischen Praxis erforderlich ist. In der Praxis erfordert ein solches Produkt, damit es als injizierbare pharmazeutische Dosisform verwendet werden kann, nur eine weitere Behandlung für die Eliminierung von pyrogenen Substanzen, wie beispielsweise die Behandlung der Lösung in Wasser oder in mit Wasser mischbaren organischen Lösungsmitteln mit Aktivkohle.
Die Polyamidharze, die einmal für die Wiedergewinnung eines glykopeptidischen Antibiotikums verwendet wurden, können bei vielen aufeinanderfolgenden Adsorptions-Desorptions-Zyklen verwendet werden. Bevor das Polyamidharz wiederverwendet wird, wird normalerweise mit Wasser gewaschen, wobei im allgemeinen mindestens die 5fache Bettvolumenmenge an deminineralisiertem Wasser verwendet wird. Nach drei oder vier vollständigen Zyklen ist es bevorzugt, das Harz mit verdünntem Alkali (pH 12) zu waschen, bis der pH-Wert von 12 konstant ist, und dann das Harz erneut mit demineralisiertem Wasser bis zur Neutralität zu waschen.
Die folgenden Beispiele erläutern die Erfindung, ohne diese zu beschränken.

BEISPIELE

Alle HPLC-Kontrollen werden unter Verwendung einer Hewlett- Packard-Vorrichtung Mo. 1084, die mit einem UV-Detektor (254 nm) und einer Umkehrphasen-C18-vorgepackten Säule (Erbasil 5, 250·4 mm) ausgerüstet ist, durchgeführt.
Die mobilen Phasen sind: (A) 0,02 M wäßriges NaH&sub2;PO&sub4;/CH&sub3; CN, 95:5 (Vol./Vol.), (B) 0,02 M wäßriges NaH&sub2;PO&sub4;/CH&sub3;CN, 25:75 (Vol./Vol.). Der Eluierungsgradient beträgt von 8% B bis 55% B in 40 Minuten. Strömungsgeschwindigkeit: 1,5 ml/min.

BEISPIEL 1

170 l Teicoplanin-Fermentationsbrühe, die von dem Mycelienkuchen befreit ist, wird bei pH 8 in 10 Stunden durch eine 15·10 cm-Glassäule geleitet, die mit 10,5 l Polyamidharz (Polyamid-CC 6 für die Säulenchromatographie), Teilchengröße 50 bis 160 um, scheinbare Dichte 0,20 g/ml, Macherey Nagel, Deutschland) gefüllt ist, geleitet und durch Ansaugen vom Boden unter Vakuum gehalten. Die durchschnittliche Strömungsrate beträgt 100 ml/cm² h.
Die erschöpfte Brühe (170 l) enthält weniger als 5% der Ausgangs- Teicoplaninaktivität und mehr als 80% aller stärker polaren Komponenten der Brühe (unerwünschte Feststoffe und gefärbte organische Materialien). Nach dem Waschen mit 50 l demineralisiertem Wasser erfolgt die Harzeluierung mit 50 l eines Gemisches aus 9:1-Methanol/Wasser (Vol./Vol.), das einen Gradienten von 0,3 bis 1,0 g/l Natriumcarbonat enthält.
Die Eluate werden in fünf Fraktionen von je 10 l gesammelt. Jede Fraktion wird auf pH 7 mit wäßriger Mineralsäure neutralisiert und mittels HPLC-Analyse analysiert. Nur zwei Fraktionen (20 l) des Eluats werden vereinigt, und die entstehende Lösung (die mehr als 90% der eluierten Aktivität enthält) wird bei verringertem Druck bei 45 bis 50ºC bis auf 3,3 l einer wäßrigen Restsuspension konzentriert.
13,2 l Aceton werden zu der obigen konzentrierten Teicoplanin- Suspension unter Rühren gegeben.
Das Präzipitat wird 3 Stunden bei Raumtemperatur stehengelassen, und das klare überstehende Aceton wird abdekantiert.
Der Feststoff wird durch Filtration abfiltriert, und der Kuchen wird in Aceton bei Raumtemperatur aufgeschlämmt.
Das Produkt wird erneut filtriert und über Nacht im Vakuum bei Raumtemperatur getrocknet.
Teicoplanin, 85,7% rein gemäß HPLC, wird mit einer Gewinnungsausbeute von 81,9%, bezogen auf die mikrobiologische Ausgangsaktivität, die in der Fermentationsbrühe enthalten war (Wasser- und Lösungsmittelgehalt: 11,5 Gew.-%; anorganischer Rückstand: 2,8 Gew.-%), erhalten.
Die 16,5 l Mutterlaugen enthalten etwa 2% des Ausgangs-Teicoplanins.
Die Adsorptionseffizienz des Harzes wurde vorläufig nach den folgenden Verfahren bestimmt.
360 ml konzentrierte Lösung, welche 3,1 g/l rohes Teicoplanin enthält, wird in 50-ml-Teilen auf eine Säule, die mit 15 g (60 ml) nassem Polyamid-CC 6-Harz gepackt ist, gegeben. Jeder 50-ml-Teil des Eluats wird mittels HPLC zur Bestimmung des Teicoplaningehalts analysiert. 250 ml Lösung werden durch die Säule geleitet, und kein Teicoplanin wird in dem eluierten Lösungsmittel festgestellt. Der nachfolgende Teil enthält etwa 0,7 g/ml an Aktivität. Dies wurde als Anzeichen angenommen, daß 15 g Harz von 0,9 g Teicoplanin gesättigt wurden. Dieser Wert entspricht 67 l Polyamid-CC 6-Harz pro kg Teicoplanin.

BEISPIEL 2

Die folgenden Versuche werden mit gefilterten Fermentationsbrühen durchgeführt, indem zu dem Fermentationsmedium geeignete Vorstufen der einzelnen Komponenten von Teicoplanin Faktor A&sub2; entsprechend der europäischen Patentschrift 204 179 zugegeben werden.
Polyamid-CC 6-Harz des gleichen Typs, wie es in Beispiel 1 verwendet wurde, wurde als Adsorptionsmatrix verwendet. 60 l fermentierte Brühe, welche von dem Mycelienkuchen befreit war, wurde auf eine Säule, welche 84 l Harz pro kg Aktivität enthielt, gegeben. Nach dem Waschen mit deminineralisiertem Wasser wurde die Aktivität eluiert und gemäß dem in Beispiel 1 beschriebenen Verfahren präzipitiert. Teicoplanin, 86% rein gemäß HPLC, wurde mit einer 77%igen Ausbeute (Wasser- und Lösungsmittelgehalt: 9,1%; anorganischer Rückstand; 4,7%) gewonnen.

BEISPIEL 3

300 l gefilterte Fermentationsbrühen, erhalten durch Zugabe von L-Valin zu dem Fermentationsmedium gemäß der britischen Patentanmeldung 8 512 795, wurden bei pH 6 durch eine 19·100 cm-Glassäule geleitet, welche 25 l Polyamid-SC 6 (Teilchengröße und andere Eigenschaften wie oben beschrieben) enthielt. Die erschöpfte Brühe enthielt kein Teicoplanin. Nach dem Waschen der Säule mit 50 l demineralisiertem Wasser wurde das Harz mit 50 l einer wäßrigen Lösung aus 0,05M Natriumacetat (pH 8) gewaschen. Mehr als 90% der festen Verunreinigungen, die in der Ausgangsbrühe enthalten waren, wurden eliminiert. Dann wurden die Antibiotika mit 50 l eines Aceton/- Wasser-Gemisches, 40:60, dessen pH-Wert mit Essigsäure auf 4 eingestellt war, eluiert. Die nützlichen Fraktionen, die 85% des Ausgangs-Antibiotikums enthielten, wurden vereinigt (30 l). Durch Konzentration bei verringertem Druck bei pH 6,5 bis 7 wurde das Volumen der Lösung auf etwa 12 l reduziert. Durch Zugabe von wäßriger Chlorwasserstoffsäure wurde der pH erneut auf 3,5 bis 4 erniedrigt, und der ausgefallene weiße Feststoff wurde nach dem Stehenlassen während 3 Stunden bei +5ºC gesammelt. Der Kuchen wurde mit Aceton gewaschen und erneut filtriert. Nach dem Trocknen wurde Teicoplanin mit einer 74%igen Gewinnungsausbeute erhalten, und es zeigte eine HPLC- Reinheit von 83% (Wasser- und Lösungsmittelgehalt: 14,1%; anorganischer Rückstand: 2,1%).

BEISPIEL 4

450 g rohes Deglucoteicoplanin, erhalten gemäß einem der Beispiele, die in der europäischen Patentveröffentlichung 146 053 beschrieben werden, wurden in 7 l Wasser bei pH 8 gelöst, und die Lösung wurde durch eine Glassäule (17·100 cm), die 26 l Polyamid-PA 400 (M. Woelm) enthielt, gegeben. Vergleiche die obige Beschreibung für Teilchengröße und andere Eigenschaften. Nach dem Waschen mit 50 l demineralisiertem Wasser wurde die Säule mit 250 l eines Methanol/Wasser-Gemisches, 9:1, das 0,035% (Gew./Vol.) Na&sub2;CO&sub3; enthielt, eluiert.
Die nützlichen Fraktionen (100 l) wurden vereinigt und enthielten 85% des aufgegebenen Deglucoteicoplanins. Die Lösung wurde dann bei verringertem Druck bei pH 6,5 bis zu einem Restvolumen von 9 l konzentriert. Nach dem Kühlen wurde die Suspension filtriert und der Kuchen mit Aceton gewaschen. Nach dem Trocknen wurde 83% HPLC-reines Deglucoteicoplanin (211 g; Wasser- und Lösungsmittelgehalt: 12,2%) mit 79%iger Ausbeute (bezogen auf die Ausgangs-HPLC-Aktivität) erhalten.

BEISPIEL 5

96 g rohes Antibiotikum L 17046, das, wie in der europäischen Patentveröffentlichung 119 574) beschrieben, erhalten wurde (HPLC-Analyse 68%), werden in 1 l eines Wasser/Methanol-Gemisches, 95:5 (Vol./Vol.), bei pH 8,2 gelöst, und die Lösung wird durch eine Glassäule (10·100 cm), die 5 l Polyamid-SC 6 enthält, geleitet. Nach dem Waschen mit 5 l demineralisiertem Wasser wird die Säule mit 5 l eines Wasser/Methanol-Gemisches, 1:1 (Vol./Vol.), gewaschen. Die Eluierung erfolgt mit einem Gemisch aus Methanol/Wasser, 9:1 (Vol./Vol.), welches 0,03% (Gew./Vol.) Na&sub2;CO&sub3; enthält. Die nützlichen Fraktionen, die 53,9 g L 17046 (83% der Ausgangs-HPLC-Aktivität) enthalten, werden vereinigt. Gemäß dem in Beispiel 4 beschriebenen Verfahren wurden 55,5 g 89% HPLC-reines L 17046 erhalten (Wassergehalt: 11%).

BEISPIEL 6

Eine fermentierte Brühe, die den Antibiotikum-A 40926-Komplex, erhalten gemäß der europäischen Patentschrift 177 882, enthielt, wurde von der Mycelienmasse durch Filtration bei einem pH-Wert zwischen 8,5 und 10,5 befreit und mit Schwefelsäure auf pH 3 angesäuert.
Das präzipitierte Rohmaterial wurde durch Filtration gesammelt und dann in Wasser bei pH 7 gelöst und auf eine Glassäule, welche Polyamid- SC 6AC von Macherey-Nagel & Co. (120 l Harz pro kg antibiotische Aktivität) enthielt, gegeben. Nach dem Waschen mit demineralisiertem Wasser wurde noch mit 0,2M Phosphat-Puffer bei pH 8 zur Entfernung von zusätzlichem gefärbten Material gewaschen. Alternativ können geringe Mengen Detergentien (beispielsweise Natriumlaurylsulfat) zu dem Wasser für den gleichen Zweck zugegeben werden. Der Säulengehalt wurde dann mit 1%igem Ammoniak eluiert, wobei etwa 75% der Ausgangs-Antibiotikum-Aktivität erhalten wurden. Die wäßrige Lösung wurde auf pH 3,5 durch Zugabe von 10%iger (Gew./Vol.) HCl eingestellt und dann bei 5ºC während einiger Stunden gekühlt. Das präzipitierte Produkt wurde abfiltriert, gut mit eiskaltem Wasser gewaschen und dann getrocknet, wobei A 40926-Antibiotikum-Komplex, der im wesentlichen HPLC-rein war, erhalten wurde.
In einem weiteren Versuch wurde die fermentierte gefilterte Brühe direkt auf eine Säule nach pH-Einstellung auf 7 gegeben. Ein 70% reines (HPLC) A 40926 wurde erhalten. Ein zweiter Durchgang an Polyamid-SC 6AC oder ein Adsorptions-Desorptions-Zyklus an Affinitätsharz ergab HPLC-reines Material.

BEISPIEL 7

13,5 g reines Antibiotikum N&sup6;³-[3-(Dimethylamino)-propyl]-teicoplanin A&sub2;-amidacetat, erhalten gemäß Beispiel 1 der europäischen Patentschrift 218 099, werden in 60 ml Wasser bei pH 6,5 gelöst, und die Lösung wird durch eine Glassäule, welche 250 g Polyamid SC 6 (0,1 bis 0,3 mm) enthält, gegeben. Nach dem Waschen mit 500 ml Wasser bei pH 6,5 erfolgt die Eluierung mit einem Gemisch aus Methanol/Wasser, 3:7 (Vol./Vol.), bei dem gleichen pH.
Die nützlichen Fraktionen (ca. 1500 ml) werden vereinigt und enthalten 75% des aufgegebenen Antibiotikums. Nach dem Abdestillieren des Methanols im Vakuum wurde der pH der restlichen Wasserlösung auf 8,5 eingestellt, und der präzipitierte Feststoff wurde nach dem Kühlen gesammelt, mit Wasser gewaschen und getrocknet u.v. Es wurden 5,8 g an 85% HPLC-reinem N&sup6;³-[3-(Dimethylamino)-propyl]-teicoplanin mit einer Gesamtausbeute von 70% erhalten.

Claims

1. Verfahren zur Gewinnung glykopeptidischer Antibiotika aus wäßrigen Lösungen, die aus Fermentationsbrühen oder Verfahrensströmen stammen, dadurch gekennzeichnet, daß die wäßrige Lösung mit einem Polyamid-Säulenchromatographie-Harz, das die antibiotische Aktivität adsorbieren kann, behandelt wird, wobei das Chromatographie- Harz durch ein Porenvolumen (bestimmt mittels eines Quecksilber-Porosimeters) im Bereich zwischen 1 und 5 ml/g, eine Oberfläche (bestimmt mittels eines Quecksilber-Porosimeters) im Bereich zwischen 1 und 100 m²/g, eine scheinbare Dichte im Bereich zwischen 0,15 und 0,50 g/ml, einen durchschnittlichen Porendurchmesser (bestimmt mittels eines Quecksilber-Porosimeters) im Bereich zwischen 100 und 3000 Å-Einheiten und eine Teilchengrößenverteilung, daß mindestens 40% der Teilchen eine Größe unter 300 um aufweisen, charakterisiert ist, das Harz von der wäßrigen Lösung abgetrennt wird, das Harz mit einem wäßrigen Gemisch als Eluierungsmittel gewaschen wird und das glykopeptidische Antibiotikum aus dem Eluierungsmittel gewonnen wird.

2. Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß das Säulenchromatographie-Polyamidharz ausgewählt wird unter Polycaprolactam, Nylon 6/6, Nylon 6/9, Nylon 6/10, Nylon 6/12 und vernetztem Polyvinylpyrrolidon.

3. Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß das Harz ausgewählt wird unter Polyamid-CC 6, Polyamid-SC 6, Polyamid-CC 6.6, Polyamid-CC 6AC, Polyamid-SC 6AC, Polyvinylpyrrolidon PVP-CL, Polyamid PA 400.

4. Verfahren nach einem der Ansprüche 1, 2 und 3, dadurch gekennzeichnet, daß der pH-Wert der filtrierten Fermentationsbrühe oder des Verfahrensstroms im Bereich zwischen 4 und 10, bevorzugt zwischen 5 und 8, liegt.

5. Verfahren nach einem der Ansprüche 1, 2, 3 und 4, dadurch gekennzeichnet, daß das Verhältnis zwischen Polyamid-Chromatographie-Harz und der glykopeptidischen antibiotischen Aktivität im Bereich zwischen etwa 50 und etwa 250, bevorzugt zwischen etwa 60 und etwa 200, Liter Harz pro Kilogramm antibiotische Aktivität, die in der Lösung enthalten ist, liegt.

6. Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 5, dadurch gekennzeichnet, daß die Eluierung aus dem Polyamid-Säulenchromatographie-Harz unter Verwendung einer gepufferten Wasserlösung oder eines wäßrigen Lösungsmittelgemisches, bevorzugt eines Lösungsmittelgemisches aus Wasser und einem oder mehreren damit mischbaren organischen Lösungsmitteln, ausgewählt unter einem niederen Alkanol, Aceton, Methylethylketon, Tetrahydrofuran, Dioxan und Acetonitril, als Eluierungsmittel durchgeführt wird.

7. Verfahren nach Anspruch 6, dadurch gekennzeichnet, daß das Eluierungsgemisch ein wäßriges Gemisch ist, das Wasser und einen niedrigen Alkohol oder Aceton in einem Verhältnis im Bereich von etwa 1:9 bis etwa 9:1 (Vol./Vol.) enthält und daß der pH des Eluats im Bereich zwischen 3 und 11 gehalten wird.

8. Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 7, dadurch gekennzeichnet, daß das glykopeptidische Antibiotikum ausgewählt wird unter Vancomycin, Actaplanin, Ristocetin, Avoparcin, Actinoidin, LL-AM-374, A 477, OA 7653, A 35512 B, A 515668, AAD 216, A 41030, A 47934, A-40926, den individuellen Faktoren, den Derivaten und den Pseudo-Aglyconen und Aglyconen davon, Teicoplanin und Teicoplanin-artigen Verbindungen.

9. Verfahren nach Anspruch 8, dadurch gekennzeichnet, daß das glykopeptidische Antibiotikum ausgewählt wird unter Teicoplanin, A-40926 und einer Teicoplanin-artigen Verbindung.

10. Verfahren nach Anspruch 9, dadurch gekennzeichnet, daß die Teicoplanin-artige Verbindung eine der folgenden Verbindungen ist: Deglucoteicoplanin, Antibiotikum L-17046, Teicoplanin-Faktor T-A&sub2;, eine der fünf Hauptkomponenten von Faktor T-A&sub2;, ein Teicoplaninamid oder ein Gemisch davon in irgendwelchen Verhältnissen.