KR840001342B1

KR840001342B1 - N-포밀 펩타이드로부터 포밀그룹 제거방법

Info

Publication number: KR840001342B1
Application number: KR8202080A
Authority: KR
Inventors: 지오비오 빈센쪼; 오나토 지오지오; 부라치 리비오; 만지아 알베르토
Original assignee: 윤영환; 주식회사 대웅제약
Priority date: 1981-05-13
Filing date: 1982-05-13
Publication date: 1984-09-19
Also published as: NO821585L; JPS5810546A; NZ200583A; IT8121674A1; US4434097A; DE3216512A1; JPS616080B2; AU8361282A; FI821412A0; NL8201821A; GB2098220A; IT8121674A0; FR2505829A1; FI821412L; DE3216512C2; AU537275B2; CA1244406A; ES8302633A1; ZA823232B; PT74892B

Abstract

내용 없음.

Description

N-포밀 펩타이드로부터 포밀그룹 제거방법

본 발명은 펩타이드에 관한 것이며 더욱 특히 특정한 pH조건하에 하이드라진 또는 하이드라진 유도체를 사용하여 펩타이드 또는 그의 N-포밀에스테르로부터 포밀그룹을 제거하는 방법에 관한 것이다.

아미노산의 아미노그룹은 펩타이드를 활성하는 과정중에 아미노그룹을 보호하기 위하여 포밀 잔기를 사용하여 차단시킬 수 있다는것은 이미 화학문헌에 공지된 사실이다. 반응이 종료되면 포밀그룹을 제거하여 아미노그룹을 유지시킬 필요가 있음은 명백하다. 그 공정의 첫단계(즉 포밀화)는 쉽게 진행될 수 있지만, 계속하여 통상의 방법으로 진행되는 포밀제거 반응의 최종 단계에서 얻어지는 결과는 만족스럽지 못하다. 실제적으로 통상 적용되는 포밀 제거반응 조건은 매우 간단하지만, 얻어지는 결과는 만족스럽지 못하며 그 이유는 펩타이드 분자내에서 다소 상당한 변화가 일어나며 또한 이러한 변화에는 펩타이드결합까지도 포함된다. 통상적인 포밀 제거반응 조건하에서 반응을 시킬경우 위와같은 결과가 발생된다. 즉, 물 및 1내지 5의 탄소수를 함유하는 알콜의 용액내에서 엽산, 황산, 질산 P-톨루엔설폰산 또는 트리풀루오르 아세트산과 같은 강산의 존재하에서 일어난다.

위에서 언급한 화학 구조중의 변화는 포밀화된 펩타이드 대신에 포밀화 및 에스테르화된 펩타이드로 구성된 기질을 사용하는 경우 더욱 명확하다. 그 이유로는 위에서 언급한 난점이외에도 때로는 에스테르그룹의 가수분해가 다소 인식할 정도의 범위내에서 발생되는 생성물은 상응하는 디케토피페라진으로 되기 때문이다.

펩타이드의 포밀 젝반응은 상당한량의 관계문헌에 밝혀져 있다:Zehra, A. Ber. 23,3625(1980); Hillmann-Elies, A. Naturforsch:6,340(1951); Waley S. G Chem. Ind. 1953, 107; Biossonnas, R. A. Helv. Chem. Acta 36,875(1953); Sheehan J. C. J. Am. Chem. Soc. 80,1154(1958); 기타의 상세한 기술은 펩타이드에 관한 고전 문헌에서 볼수 있다. 예를들면 Chem of Am Acids, Ⅱ, (244,46,47). 동일한 저자가 산성 매질중에서 시행되는 포밀 제거반응에 대하여 연구하였다.

최근에 다른 연구마들은 다른 조건하에 실험을 행하였으며 아세틸 클로라이드 또는 하이드록실아민 또는 하이드라진과 같은 다름 물질을 탈포밀화제로 사용하여 탁월한 결과를 얻었다. 그러나 이 저자들은 하이드라진이 에스테르의 포밀 제거반응에 적당하지 않다고 언급하였는데 그 이유로는 상응하는 하이드라진 유도체가 생성되기 때문이라고 설명하였다〔참조:Lefrancier, Bull. Soc. Chim. France 1965, 3668; Geiger GB-PSI, 182, 450).

다른 연구가들은 H₂O₂로 산화시키거나(Losse, Am. Chem. 1960, 636, 140) 가소수 분해하여(Losse, J. Prakt, Chem. 1964, 24, 118) 펩타이드의 에스테르 또는 펩타이드를 탈포밀화시켰다.

펩타이드 또는 그들의 N-포밀화 에스테르의 N-탈포밀화는 산업적인 견지에서 매우 중요한 것이다. 산업적으로 중요한 한가지 예로는 펩타이드 구조를 가지며 현저한 감미를 가지며 “아스파르탐”으로 알려져 있는 α-L-아스파르틸-L-페닐알라닌 메틸에스테르가 있다.

이 물질은 펩타이드를 제조하는 오래된 방법을 사용하여 여러가지의 다른 방법으로 제조하였으며 특히 아스파르산의 아미노그룹을 차단시키고 뒤이어 그의 α-카복시그룹을 활성 에스테르 또는 무수물 형태로 활성화시킨후 페닐알라닌 메틸 에스테르와 축합반응을 시키고 생성된 에스테르화 펩타이드중의 아미노그룹을 차단시킨 그룹을 제거하여 제조하였다.

α-L-아스파르틸-L-페닐알라닌 메틸에스테르를 제조하는 공업적 제조방법은 기구를 선택하는데 따르는 난점과 포스겐과 같은 독성물질 또는 카보벤즈옥시 클로라이드와 같은 사용이 어려운 물질들을 사용해야 하는 여러기구에 따르는 실행상의 난점등을 가지고 있다. 그 기구의 또다른 난점은 바라는 생성물의 수율이 낮은 점이다.

아스파르탐을 제조하는 비교적 용이한 공업적 방법은 N-포밀-L-아스파르트산의 무수물을 L-페닐알라닌 메틸에스테르로 축합시키고 이어서 N-포밀α-L-아스파르텔-L-페닐알라닌 메틸에스테르를 N-탈포밀화시켜 얻는다. N-탈포밀화는 특정 용매와 강무기산의 존재하에서 진행시키거나(Takemoto, 독일공개공보 2,635,988) 하이드록실아민과 함께 진행시키거나(Takemoto, 독일공개공보 2,554,421)물의 존재하에 가열시켜 진행하거나(Takemoto, 일본공개공보 7639602) 또는 메탄올내에서 엽산으로 진행시킨다(독일공개공보 2,256,055). 이들 공보에 기술된 방법은, 일반적으로 다른 N-포밀화펩타이드 또는 에스테르의 탈포밀화 반응에 있어서 여러가지 결점을 가지고 있다. 무엇보다도 합성의 마지막 단계에서의 수율이 매우 낮은 결점이 있으며 중간물질이 매우 비싼 결점이 있다. 그 이외에도 최종생성물에 불순물이 들어있어서 수율이 낮으며 또한 정제해야 하므로 기타의 생산가격이 소요된다.

본 발명의 목적은 N-포밀화 펩타이드 또는 그의 반응성 에스테르내에서 포밀그룹을 제거하는 방법을 제공하는 것이며 특히 N-포밀-α-L-아스파르틸-L-페닐알라닌의 메틸 에스테르중의 이그룹을 하이드라진 또는 구조식(Ⅰ)의 하이드라진 유도체를 사용하여 제거하는 방법을 제공하는 것이며 이 반응은 pH 1및 3.5사이에서 진행한다.

여기에서 R은 1내지 5의 탄소수의 알킬잔기이며 이들은 포화 또는 불포화, 선형 또는 측쇄 또는 환상알킬잔기 또는 아릴잔기이며 이들은 다른 관능그룹 또는 아미노그룹에 의해 치환될 수 있다.

본 발명에 따른 방법에서 pH는 1및 3.5사이 이어야만 한다. 만일 반응이 하이드라진 또는 하이드라진 유도체의 부재하에 산과 반응이 일어나고, 반응이 pH1이하에서 60℃에서 1시간 진행된다면, 포밀 에스테르 출발물질은 완전히 소멸되고 탈포밀화 생성물은 약 15%의 낮은 수율로 형성된다.

TLC를 사용하여 실질적인 생성물의 양은 디케토피페라진이라는 것을 알수 있다(아래 참조).

한편, pH가 3.5이상에서 반응이 진행되면, 매우짧은 시간동안 반응이 진행되므로 탈포밀화는 거의 무시할 정도로 매우 조금 일어난다. 그러므로 반응을 진행시키는데 필요한 pH범위는 반응이 일어나는 동안 일정하도록 해야하는데 그 이유는 염기가 유지될 경우 pH는 증가되는 경향이 있기 때문이다. 이러한 것을 억제하기 위해서는 반응 혼합물에 10%의 염산용액 또는 황산 또는 파라 톨루엔 설폰탄의 용액을 가하여 준다. 적당한 완충용액을 사용하는 것도 가능하다.

다른 연구가들은 하이드라진이 상응하는 하이드라지드를 형성할 수 있으므로 N-포밀화 펩타이드 에스테르의 탈포밀화에 적합하지 않다고 보고한 것은 이미 위에서 논의하였다(P Lefrancier et al Bull Soc. Chim. France 1965, 3668).

그러나 놀라웁게도 본 발명에 따르는 반응을 pH 1 내지 3.5의 범위에서 진행시키면 이러한 결점을 최소로 할수 있다는 것이 발견되었다. 실험조건을 참고로 하여서 하이드라진의 양은 펩타이드 또는 상응하는 에스테르의 각 몰당 1 및 3몰사이로 변경시켜 탈포밀화를 일어나게 하는데 이때 용매는 메탄올 또는 메탄올과 물의 혼합물 또는 다른 용매를 사용하며 용매의 구조 및 양은 그다지 문제가 되지않는다. 어떠한 경우 에라도, 만족한 반응이 진행되도록 하기위해, 혼합물의 pH를 처음에 1내지 3으로 조정할 필요가 있으며, 반응이 일어나는 동안 위의 pH범위를 유지시켜야 하고, 반응은 20내지 100℃에서 진행될 수 있으며 온도에 따라 반응시간은 서로 달라진다. 사용할 수 있는 산은 염산 또는 황산 또는 질산과 같은 강한 광산을 사용하거나 파라톨루엔 설폰산을 사용할 수 있다.

N-탈포밀화가

(여기에서 R은 위에서 설명한 것과 같다)의 구조를 가진 물질의 존재하에서 진행될 경우 수율은 증가된다는 것을 발견하였다. 반응 그 자체는 최소의 변화로 쉽게 진행되며 수율은 매우 높으며(75내지 90%정도) 사용하는 물질에 따라 다소 높을 수도 있다. 탈포밀화제로서

의 활성은 가장 간단한 물질인 아세틸 하이드라진, 벤조일 하이드라진, 트리메틸아미노 아세틸 하이드라지드 클로라이드인 경우에 특히 높으며 소위 “Girard T”라고 부르는 후자의 물질은 매우 복잡하며 기타의 관능그룹과 세미카바지드를 함유하고 있다.

실험 조건을 참고로 하여 탈포밀화 물질의 양은 탈포밀화될 펩타이드 또는 에스테르의 1몰에 대해 1내지 5몰이며 실제적인 경제적인 이익은 없지만 반응물을 많이 사용할 수도 있다.

바람직한 용매는 펩타이드인 경우에 메탄올 또는 메탄올과 물의 혼합물이고 펩타이드 내에 에스테르가 형성되어 있는 펩타이드 에스테르의 경우에는 동일한 알콜이 적당하다. 여기에서도 용매의 구조는 아무런 의미가 없으므로 수많은 2내지 5의 탄소수를 가진 다른 알콜 또는 기타의 용매를 사용할 수도 있으며 기타의 용매는 디옥산, 아세톤, 아세토니트릴 및 디메틸포름아미드와 같이 물에 용해되는 것들이다. 탄화수소, 염소화 탄화수소, 에테르 케톤, 에스테르 또는 이러한 용매의 혼합물과 같이 물에 불용인 다른 용매를 사용할 수도 있다. 이런 모든 용매는 물의 존재 또는 부재하에서 사용할 수 있으며 어떤 경우에는 단일층이 존재하고 다른 경우에는 2층이 존재할 수 있다. 단지 반응시간에 영향을 받으므로 반응온도는 문제가 되지 않는다. 더욱 특히 반응온도는 사용된 용매에 따라 20내지 150℃로 차이가 있으며 반응시간은 30분 내지 30시간으로 차이가 있다. 서로 다른 실험 조건하에서 본 발명에 따른 방법을 실시예로 더욱 상세히 설명하며 그러나 발명의 범위를 제한하지 않는다. 반응과정은 TLC를 사용하여 매우 잘 조절하며 반응과정중 화학구조에서 변화가 낮은 것을 명확히 설명해준다. 사실상 탈포밀화 생성물 이외에도 소량의 “디케토 피페라진”이 존재하는 것은 명백하다. 특히 2-벤질 -3,6-디케토-5-피페라지닐-아세트산은 상품용 아스파르탐내에 2% 정도 존재하고 실제 Food and Durg Adiministration, Title 21, Code of Federal Regulations, paragraph 121, 1258에는 아스파르탐내에 이러한 물질이 최고 2%정도 들어있다고 기술되어 있다.

본 발명에 따라 얻어진 아스파르탐의 순도 시험에 있어서, 시험을 HPLC를 사용하여 행하였으며 위에서 언급한 치환된 디케틴 피페라진은 0.6내지 0.7%이상들어 있지 않다. 상업적 제법에서 유사한 개선점은 α-아스파르틸-페닐알라닌인 아스파르탐내에서 볼수 있는 기타의 불순물에 대하여 개선점을 성취할 수 있었으며 여기에서 아스파르탐의 상업적 시료에는 약 1%가 들어 있었고 본 발명에 따라 얻은 생성물에는 0.3%이하가 들어있다. 반응 생성물의 정량적인 평가는 GLC로 행하였다.

[실시예 1]

N-포밀-α-L-아스파르틸-L-페닐 알라닌 메에스테르3.2g(10밀리몰)을 메탄올 32mℓ에 용해한다. 물을 3.2mℓ가하고 이어서 3%염산 0.5mℓ로 pH를 2로 조정한다. 용액을 70℃로 가열하고 3%염산으로 pH를 1.5내지 3.0으로 유지되도록 계속 조정하는 반면 이 온도를 10시간동안 유지한다. 대조 TLC(용출제:메틸에틸케톤/아세톤/피리딘/물, 32:4:2:6)

닌 히드린 지시계:

한개의 큰 반점:Rf 0.35(아스파르탐)

한개의 반점:Rf 0.1 (탈포밀화 및 탈메틸화 펩타이드)

한개의 반점:Rf 0.9

미측정

GLC분석:α-L-아스파르틸-L-페닐알라닌-메틸에스테르 1.91g(수율:65%)

[실시예 2]

N-포밀-α-L-아스파르틸-L-페닐알라닌 메틸에스테르 3.2g(10밀리몰)을 메탄올 32mℓ에 용해시킨 물 5mℓ용액을 제조하고 pH를 15%염산으로 1.5로 조정한다. 용액을 70°로 가열하고 15%염산으로 pH를 1.5내지 3.5사이로 유지되도록 계속 조정하는 반면 이온도를 7.5시간동안 유지한다.

GLC분석:α-L-아스파르틸-L-페닐 알라닌 메틸에스테르 2g(수율:70%)

[실시예 3]

N-포밀-α-L-아스파르틸-L-페닐 알라닌 메틸 에스테르 3.2g(10밀리몰)을 메탄올 32mℓ에 용해한다. 여기에 물 3.2mℓ와 아세틸 하이드라진(30밀리몰)을 가한다. pH를 10%염산 용액으로 2.5로 조정한다. 혼합물을 54℃로 가열하고 이온도를 pH를 1.5 및 3.5사이로 유지시키는 반면 이온도를 8시간 유지시킨다.

대조 TLC(용출제:메틸에틸케톤/아세톤/피리딘/물, 32:4:2:6)

닌 히드린지시계:

1반점:Rf 0.35(아스파르탐)

1반점:Rf 0.1 (탈포밀화 및 탈메틸화펩타이드)

매우약함

GLC분석:α-L-아스파르틸-L-페닐 알라닌 메틸 에스테르 2.65g(수율:90%)

[실시예 4]

N-포밀-α-L-아스파르틸-L-페닐 알라닌 메틸 에스테르 3.2g(10밀리몰)을 메탄올 32mℓ에 용해한다. 여기에 물 3.2mℓ와 “Girard T” 시약 5g(30밀리몰)을 가하고 10%염산 용액으로 pH를 2.5로 조정한다. 혼합물을 70℃로 가열하고, pH를 1.5내지 3.5로 조정하고 이 온도를 7시간동안 유지한다.

대조 TLC(용출제:메틸에틸케톤/아세트산/피리딘/물, 32:4:2:6)

닌 히드린지시계:

1반점:Rf 0.35(아스파르탐)

1약한반점:Rf 0.1 (탈포밀화 및 탈메틸화 펩타이드)

GLC분석:α-L-아스파르틸-L-페닐 알라닌-메틸 에스테르 2.2g(수율:76%).

[실시예 5]

N-포밀-α-아스파르틸-L-페닐 알라닌 메틸 에스테르3.2g(10밀리몰)을 메탄올 32mℓ에 용해한다. 여기에 물 3.2밀리몰과 세미카바지드 하이드로 클로라이드 3.33g(30밀리몰)을 가한다. pH는 2이므로 pH를 조정할 필요가 없다. 혼합물을 70℃로 가열하고 pH를 1.5내지 3.5로 조정하고 이 온도를 8시간동안 유지시킨다.

GLC분석:α-L-아스파르틸-L-페닐알라닌 메틸에스테르 2.4g(수율:83%)

[실시예 6]

N-포밀-α-L-아스파르틸-L-페닐알라닌 메틸에스테르3.2g(10밀리몰)을 메탄올 32mℓ에 용해한다. 여기에 물 3.2mℓ와 벤조일 하이드라지드 4g(30밀리몰)을 가한다. pH를 1.5내지 3.5로 조정한다. 용액을 70℃로 가열하고 pH를 1.5내지 3.5로 유지하며 이 온도를 4시간 유지시킨다. 40℃이하의 온도에서 진공으로 증발하고 물 10mℓ를 가하고 pH를 등전점(pH5.2)으로 조정하고 0℃까지 냉각하고 흡입여과한다. 생성물은 아스파르탐 2.5g으로 매우 순수하다(수율:85.4%).

[실시예 7]

N-포밀-α-L-아스파르틸-L-페닐알라닌 메틸에스테르 12.825kg을 디클로로에탄 30ℓ에 용해시키고 여기에 빙초산 10ℓ, 메탄올 10ℓ 아세틸 하이드라진 14kg을 가한다. 온도를 64°로 올리고 pH를 농염산으로 2.2내지 2.3으로 조정한다. pH를 2.2내지 2.3으로 유지시키는 반면 용액을 항상 64℃로 가열하고 이 조건하에서 디포밀화반응을 5시간동안 시킨다. 최종용량은 80ℓ이다. 반응용액은 α-L-아스파르틸-L-페닐알라닌 메틸에스테르의 함량을 분석하는데 사용한다(HPLC). 132mg/mℓ

분석조건은 아래와 같다.

칼람:RP₈10미크론 칼람의 온도 45℃ 유출속도는 지시계로 215nm에서 UV로 2mℓ/분이다.

용출제:pH 7.5의 인산 완충액(0.0M)/아세토니트릴 티크로솔브=9/1

α-L-아스파르틸-L-페닐알라닌 메틸에스테르의 보유시간:5.2분

α-L-아스파르틸-L-페닐알라닌 메틸에스테르의 수율은 10.55kg(90%)이다.

디클로로에탄과 메탄올을 진공하에 제거하고 물 50ℓ를 가하고 pH를 아스파르탐이 침전되는 등전점인 5.2로 조정한다. 염수로 -5℃로 10시간동안 냉각시킨후 아스파르탐을 원심분리하고 잘 세척한다. 45°로 공기중에서 건조한후 아스파르탐 9kg이 얻어진다.

HPLC:99.3건조

치환 디케토 피페라진(2-벤질-3,6-디케토-5-피페라지닐아세트산):0.5%

N-L-α-아스파르틸-L-페닐알라닌(탈메틸화 아스파르탐):0.1%

아스파르탐 1.5kg이 들어있는 액을 아스파르탐 생성물이 정량적으로 거의 회수될때까지 계속하여 재순환시킨다.

2개의 서로 다른 공업용 시료는 아래와 같은 분석자료를 나타내었다.

시료 “A”:HPLC 98.4%:디케토 피페라진 0.7%:탈메틸화 아스파르탐 2.1%

시료 “B”:HPLC97.0%:디케토 피페라진 2.74%:탈메틸화 아스파르탐 0.45% 완제품에 있어서 HPLC의 분석 조건은 다음과 같다:

칼람:리크로솔브 RP18:10미크론, 길이 25cm, 내부직경 4mm

용출제:메탄올중의 pH4의 인산완충액 아스파르탐의 적정기 당 60/40불순물의 측정 75내지 25

유속:2mℓ/분

지시게:UV로 210nm

보유시간:

아스파르탐:12.8분(적정기의 측정내에서 3.6분)

치환된 디케토 피페라진:5.1분

탈메틸화 아스파르탐:3.3분

Claims

N-포밀화 펩타이드 또는 그의 에스테르를 히드라진 또는 일반식(Ⅰ)의 치환된 히드라진과 pH1내지 3.5에서 반응시키고, 반응혼합물로부터 N-탈포밀화된 펩타이드를 분리시킴을 특징으로 하여 N-포밀화펩타이드 또는 그의 에스테르 중의 포밀그룹을 제거시키는 방법.

상기식중 R은 포화 또는 불포화, 선상 또는 측쇄의 치환된 또는 비치환된 탄소수 1내지 5의 알킬, 치환된 또는 비치환된 사이클로알킬, 치환된 또는 비치환된 또는 아릴 아미노 그룹이다.
제1항에 있어서, 반응중 pH를 무기산 또는 완충제를 가하여 1내지 3.5로 일정하게 유지시키는 방법.
제1항에 있어서, 언급된 하이드라진 또는 일반식(Ⅰ)의 언급된 화합물을 N-포밀화 펩타이드 또는 이의 에스테르 몰당 1내지 5몰 비율로 사용하는 방법.
제1항에 있어서, 일반식(Ⅰ)의 언급된 화합물이 아세틸 하이드라지드, 벤조일하이드지라드, “지라드 T” 및 세미카바지드로 구성되는 그룹중에서 선택되는 방법.
제1항에 있어서, 반응온도가 20내지 150℃인 방법.
제1항에 있어서, 반응을 탄소수 1내지 5의 알콜을 함유하는 용매중에서 시행하는 방법.
제6항에 있어서, 물을 언급된 알콜에 가하는 방법.
제6항 또는 제7항에 있어서, 언급된 용매가 케톤, 디메틸포름아미드, 디메틸설폭시드, 아세토니트릴, 지방족 에스테르, 탄화수소, 염소화 탄화수소 및 이의 혼합물로 구성되는 그룹중에서 선택되는 방법.
제1항에 있어서, 언급된 화합물이 N-포르밀-α-L-아스파틸-L-페닐알라닌 메틸 에스테르이고 언급된 N-탈포밀화된 화합물이 아스파탐인 방법.