DE2840636C2

DE2840636C2 -

Info

Publication number: DE2840636C2
Application number: DE2840636A
Authority: DE
Inventors: Hamao Tokio/Tokyo Jp Umezawa; Takaaki Fujisawa Kanagawa Jp Aoyagi; Tomio Tokio/Tokyo Jp Takeuchi; Tetsushi Yono Saitama Jp Saino
Original assignee: Microbial Chemistry Research Foundation
Current assignee: Microbial Chemistry Research Foundation
Priority date: 1977-09-21
Filing date: 1978-09-19
Publication date: 1988-04-14
Also published as: DE2840636A1; GB2005687B; JPS6026099B2; FR2409259A1; FR2409259B1; GB2005687A; IT7851141A0; US4185156A; IT1157187B; JPS5455542A; CA1117136A

Description

Die Erfindung betrifft Dipeptide, Verfahren zu ihrer Herstellung und sie enthaltene Arzneimittel gemäß den voranstehenden Patentansprüchen.

Umezawa et al. ist es vor kurzem gelungen, Bestatin [(2S, 3R)- 3-Amino-2-hydroxy-4-phenylbutanoyl-(S)-leucin] mit einer starken inhibierenden Wirkung gegenüber Aminopeptidase B, Leucinaminopeptidase und Bleomycinhydrolase aus der Kultur eines Bestatin-bildenden Fungus, der zu den Actinomyces gehört, zu isolieren (vgl. z. B. US-PS 40 29 547).

Angesichts der ausgezeichneten physiologischen Aktivitäten von Bestatin wurde nun nach Verfahren zur synthetischen Herstellung dieser Verbindung und neuer Peptide mit einer ähnlichen Struktur wie Bestatin, von denen angenommen wurde, daß sie die gleichen physiologischen Aktivitäten wie Bestatin aufweisen, gesucht und dabei ist es gelungen, Bestatin und seine analogen Verbindungen der allgemeinen Formel

worin R₁ eine niedere Alkylgruppe, eine Cycloalkanalkylgruppe, eine Phenylgruppe, eine Benzylgruppe oder eine substituierte Benzylgruppe und R₂ eine Alkylgruppe mit 1 bis 6 Kohlenstoffatomen, eine Hydroxyalkylgruppe, eine Mercaptoalkylgruppe, eine Carboxyamidoalkylgruppe, eine Alkoxyalkylgruppe, eine Alkylmercaptoalkylgruppe, eine Carboxyalkylgruppe, eine Arylgruppe, eine Aralkylgruppe oder eine substituierte Aralkylgruppe bedeuten, zu synthetisieren (vgl. z. B. GB-PS 15 10 477).

Bei weiteren Untersuchungen auf diesem Gebiet ist es nun gelungen, Peptide der oben angegebenen Formel (I) und ihre Säureadditionssalze, insbesondere ihre pharmazeutisch verträglichen Säureadditionssalze, zu synthetisieren, und Tests zur Bestimmung der inhibierenden Wirkung dieser Verbindungen gegenüber Aminopeptidase B zeigten die überraschende Tatsache, daß diese Verbindungen eine etwa 3- bis etwa 20mal so hohe inhibierende Wirkung haben wie Bestatin. Es wurde festgestellt, daß die erfindungsgemäßen Verbindungen wegen ihrer starken Aminopeptidase B-Aktivität die Bildung von Bradykinin zur Erzeugung einer antiphlogistischen Wirkung verhindern bzw. hemmen können und deshalb als Heilmittel für verschiedene Erkrankungen verwendbar sind. Es wurde auch gefunden, daß die erfindungsgemäßen Verbindungen eine starke inhibierende Wirkung gegenüber Leucinaminopeptidase sowie Bleomycinhydrolase aufweisen und auch als Adjuvans zur Verbesserung der carcinostatischen Wirkung von Bleomycin dienen können.

Bei weiteren Versuchen in bezug auf die Verwendbarkeit der erfindungsgemäßen Peptide für medizinische Zwecke wurde festgestellt, daß sich diese Peptide für die Erhöhung der Immunität von Organismen, für die Verhinderung der Übertragung von Krebs und des Auftretens von Krebsrückfällen eignen und daß sie bei Verwendung als Adjuvans in Bleomycin oder anderen derzeit als Antikrebsmittel verwendeten Verbindungen den carcinostatischen Effekt dieser Verbindungen in erstaunlicher Weise verbessern können. Darauf beruht die vorliegende Erfindung, die nachfolgend näher beschrieben wird.

Der Substituent R steht bevorzugt in o- oder p-Stellung. Als Halogene sind bevorzugt Fluor, Chlor, Brom oder Jod. Besonders bevorzugt sind Chlor und Brom, insbesondere Chlor. Als Alkylgruppen für den Substituenten R sind bevorzugt solche mit 1 oder 2 Kohlenstoffatomen, insbesondere Methyl.

Die Erfindung umfaßt auch die verschiedenen optisch aktiven Isomeren, die z. B. durch Verwendung von optisch aktiven Ausgangsstoffen oder durch Aufspaltung erhalten werden können.

Das einen weiteren Gegenstand der Erfindung bildende Verfahren zur Synthese der erfindungsgemäßen Verbindungen der Formel (I) besteht darin, daß man (2S, 3R)- und (2RS, 3RS)-Aminosäuren der allgemeinen Formel

worin R die oben angegebenen Bedeutungen hat, X und Y ein Wasserstoffatom oder eine Aminoschutzgruppe bedeuten, oder reaktionsfähige Derivate davon unter Anwendung eines üblichen Peptidbindungsverfahrens mit (S)-Arginin kondensiert und dann erforderlichenfalls die Schutzgruppe eliminiert.

Die (2S, 3R)- und (2RS, 3RS)-Aminosäuren der oben angegebenen Formel (II) können hergestellt werden durch Hydrolyse von Nitrilderivaten der allgemeinen Formel

worin R, X und Y die oben angegebenen Bedeutungen haben, mit einer Säure.

Als Aminoschutzgruppe können in den Verbindungen der Formeln (II) und (III) beliebige in der Peptidchemie bekannte Aminoschutzgruppen eingesetzt werden. Als bevorzugte Beispiele für solche Schutzgruppen können die folgenden genannt werden:

Schutzgruppen vom Acyl-Typ: Formyl, Acetyl, Trifluoracetyl und substituiertes oder unsubstituiertes Benzoyl, wie Benzoyl, Nitrobenzoyl oder Tolyl; Schutzgruppen vom Urethan-Typ: substituiertes und unsubstituiertes Benzyloxycarbonyl, wie Benzyloxycarbonyl, Methoxybenzyloxycarbonyl, Nitrobenzylcarbonyl oder Halogenbenzyloxycarbonyl, Alkoxycarbonyl mit 1 bis 6 Kohlenstoffatomen und Cycloalkanoxycarbonyl; andere Schutzgruppen: substituiertes und unsubstituiertes Arylsulfonyl, wie Benzolsulfonyl, Methoxybenzolsulfonyl, Nitrobenzolsulfonyl, Toluolsulfonyl oder Naphthalinsulfonyl; o-Nitrophenylsulphenyl und Trityl.

Die Carboxylgruppe von Arginin kann geschützt sein oder nicht. Erfindungsgemäß kann jede beliebige bekannte Carboxyl-Schutzgruppe, wie sie in der Peptidchemie eingesetzt wird, verwendet werden. Unter diesen Schutzgruppen am meisten bevorzugt sind eine Alkylgruppe mit 1 bis 4 Kohlenstoffatomen, eine Phenylgruppe, eine substituierte Phenylgruppe, wie z. B. eine halogenierte oder nitrierte Phenylgruppe, eine Benzylgruppe und eine substituierte Benzylgruppe, wie z. B. eine Methoxybenzyl- oder Nitrobenzylgruppe. Zum Schützen der Guanidingruppe können ein Proton und andere allgemein verwendete Schutzgruppen, wie z. B. eine Nitrogruppe und eine Tosylgruppe, verwendet werden.

Es stehen verschiedene Verfahren zur Verfügung zum Kondensieren von (2S, 3R)- und (2RS, 3RS)-Aminosäuren der Formel (II) mit (S)-Arginin und zu diesen Verfahren gehören: ein Carbodiimid- Verfahren, bei dem Dicyclohexylcarbodiimid oder 1-Äthyl-3- (3-dimethylaminopropyl)carbodiimid verwendet wird; ein Azidverfahren, bei dem Hydrazid verwendet wird; ein gemischtes Säureanhydridverfahren, bei dem Äthylchlorfomiat oder Isobutylchlorformiat verwendet wird; ein aktives Esterverfahren, bei dem ein Cyanomethylester, Vinylester, substituierte und unsubstituierte Phenylester, ein Thiophenylester oder ein Hydroxysuccinimidester verwendet wird; ein O-Acyl-hydroxylaminderivat-Verfahren, bei dem Acetoxim oder Cyclohexanonoxim verwendet wird; und ein N-Acylverbindungs-Verfahren, bei dem Carbonyldiimidazol verwendet wird.

Bei der obigen Kondensationsreaktion können Lösungsmittel, wie sie üblicherweise in der Peptidchemie eingesetzt werden, verwendet werden. Zu diesen Lösungsmitteln gehören Äther, wie Diäthyläther, Tetrahydrofuran und Dioxan, Ester, wie Äthylacetat, Ketone, wie Aceton und Methyläthylketon, halogenierte Kohlenwasserstoffe, wie Methylenchlorid und Chloroform, Amide, wie Dimethylformamid und Dimethylacetamid, und Nitrile, wie Acetonitril.

Wenn eine Verbindung der allgemeinen Formel (II), deren Aminogruppe geschützt ist, und (S)-Arginin, dessen Carboxylgruppe nicht geschützt ist, unter Anwendung des Azidverfahrens oder des aktiven Esterverfahrens miteinander kondensiert werden, wird die Kondensationsreaktion vorzugsweise in Gegenwart einer anorganischen Base, wie Natriumbicarbonat oder Magnesiumoxid, oder einer organischen tertiären Base, wie Triäthylamin oder N-Methylmorpholin, unter Verwendung eines mit Wasser mischbaren organischen Lösungsmittels durchgeführt.

Die Schutzgruppen in den dabei erhaltenen geschützten Verbindungen können unter Anwendung eines üblichen Verfahrens, wie es in der Peptidchemie angewendet wird, beispielsweise durch katalytische Reduktion unter Verwendung von Palladium als Katalysator, mit Bromwasserstoff in Essigsäure, Trifluoressigsäure, Chlorwasserstoff in einem organischen Lösungsmittel, durch Alkaliverseifung oder durch Behandlung mit metallischem Natrium in flüssigem Ammoniak oder flüssigem Fluorwasserstoff, entfernt werden. Dabei erhält man das erfindungsgemäße Produkt der oben angegebenen Formel (I).

Die physiologischen Aktivitäten der erfindungsgemäßen Verbindungen der Formel (I) wurden wie folgt bestimmt:

A) Inhibierende Aktivität gegenüber Aminopeptidase B

Testverfahren:

Zur Bestimmung der Aminopeptidase B-Aktivität wurde eine abgeänderte Ausführung des Hopsu et al.-Verfahrens (vgl. V. K. Hopsu, K. K. Makinen und G. G. Glenner, "Archives of Biochemistry and Biophysics", 114, 557 (1966)) angewendet. Eine gemischte Lösung (pH 7,0) wurde hergestellt durch Zugabe von 1,0 ml 0,1 M Tris-Hydrochlorid-Puffer und 0,7 ml einer die Probe enthaltenden Lösung zu 0,3 ml 0,1 mM Arginin-β-naphthylamid, dann wurde sie 3 Minuten lang auf 37°C erwärmt und danach wurden 0,2 ml einer Aminopeptidase B-Lösung zugegeben, die gereinigt worden war unter Verwendung von Sephadex® G-100 unter Anwendung des Enzymreinigungsverfahrens von Hopsu et al. Nach 30minütiger Reaktion bei 37°C wurden 0,6 ml eines 1,0 M Acetatpuffers (pH 4,2), der Fast Garnet GBC® (ein o-Aminoazotoluoldiazoniumsalz) in einer Konzentration von 1,0 mg/ml und Tween® 20 in einer Konzentration von 1,0% erhielt, zugegeben und die Mischung wurde 15 Minuten lang bei Raumtemperatur stehen gelassen, dann wurde die Extinktion (a) bei 530 nm gemessen. Unter Verwendung der Pufferlösung, welche die Probe nicht enthielt, wurde auch die Extinktion (b) der Kontrolle gemessen. Die Aminopeptidase B-Inhibierung in % wurde aus der Gleichung (b-a)/b×100 errechnet.

Ergebnisse:

Die Prozentsätze der Inhibierung bei verschiedenen Probekonzentrationen wurden unter Anwendung des vorstehend beschriebenen Testverfahrens bestimmt und davon wurde die 50%-Inhibierung (ID₅₀) abgeleitet. Die dabei erhaltenen Ergebnisse sind in der folgenden Tabelle I angegeben.
VerbindungID₅₀ (µm/ml) R=H (2S, 3R)-3-Amino-2-hydroxy-4-phenyl-
butanoyl-(S)-arginin-hydrochlorid0,03 R=p-OH (2S, 3R)-3-Amino-2-hydroxy-4-p-hydroxy-
phenylbutanoyl-(S)-arginin-diacetat0,005 R=p-Me (2RS, 3RS)-3-Amino-2-hydroxy-4-p-methyl-
phenylbutanoyl-(S)-arginin-diacetat0,013 R=o-Cl (2RS, 3RS)-3-Amino-2-hydroxy-4-o-chloro-
phenylbutanoyl-(S)-arginin-dihydrochlorid0,14 Bestatin (Kontrolle)0,10

Wie aus den Ergebnissen der vorstehenden Tabelle hervorgeht, weisen die erfindungsgemäßen Verbindungen (I) eine weit höhere inhibierende Aktivität gegenüber Aminopeptidase B auf als Bestatin.

B) Effekte von (2S, 3R)-3-Amino-2-hydroxy-4-phenylbutanoyl-(S)- arginin und (2S, 3R)-3-Amino-2-hydroxy-4-p-hydroxyphenyl- butanoyl-(S)arginin auf die Lymphozyten-Plastoid-Umwandlung mit Phytohämagglutinin (PHA)

Verfahren:

Aus dem peripheren Blut von gesunden Hunden (männliche Beagle-Hunde) wurden auf aseptische Weise Lymphozyten gewonnen durch Gradientenzentrifugierung von Ficollnatriummetrizoat. Die Lymphozyten (1×10⁶ Zellen/ml) wurden in einem RPMI-1640-Medium mit 10% fetalem Kalbserum, einem Antibiotikum (Kanamycin 60 µg/ml) und 15 µg Phytohämagglutinin (PHA) in einer angefeuchteten Atmosphäre aus 5% CO₂ und 95% Luft bei 37°C kultiviert. Nach einer 48stündigen Inkubation wurden 2 µCi ³H-Thymidin zu jeder Schale zugegeben und die Kultivierung wurde weitere 24 Stunden lang fortgesetzt zur Bestimmung der DNA-Synthese. Die DNA-Synthese wurde gemessen als ³H-Thymidin-Einarbeitung in die säurelöslichen Materialien.

Tabelle II

Ergebnisse:

Wie aus der vorstehenden Tabelle II hervorgeht, verbessern Bestatin, (2S, 3R)-3-Amino-2-hydroxy-4-phenylbutanoyl-(S)arginin und (2S, 3R)-3-Amino-2-hydroxy-4-p-hydroxyphenylbutanoyl-(S)-arginin die Lymphozytenplastoid-Bildung mit PHA. Diese Ergebnisse geben einen Hinweis auf die Stimulierung des Immunmechanismus der Lymphozyten gegenüber Tumor durch diese Verbindungen und die Brauchbarkeit dieser Verbindungen als Immunstimulatoren.

Das erfindungsgemäße Verfahren zur Herstellung der erfindungsgemäßen Verbindungen der Formel (I) wird nachfolgend an Hand von Beispielen näher erläutert.

Herstellung der Ausgangsverbindungen Synthese des N-Hydroxysuccinimidesters der N-Benzyloxycarbonyl- (2S, 3R)-3-amino-2-hydroxy-4-phenylbutansäure

16,50 g N-Benzyloxycarbonyl-(2S, 3R)-3-amino-2-hydroxy-4- phenylbutansäure (J. Med. Chem., 20, 510 (1977)) und 6,33 g N-Hydroxysuccinimid wurden in 150 ml Dioxan und 150 ml Äthylacetat gelöst und nach dem Abkühlen auf -10°C mit weiteren 10,3 g Dicyclohexylcarbodiimid versetzt.

Nach 1stündiger Reaktion bei der gleichen Temperatur wurde die Reaktionslösung bei Raumtemperatur über Nacht stehen gelassen und der gebildete Dicyclohexylharnstoff wurde abfiltriert. Das Lösungsmittel wurde abdestilliert und die erhaltene ölige Substanz wurde mit Petroläther verfestigt und aus Äthylacetat/Petroläther umkristallisiert, wobei man 18,36 g des N-Hydroxysuccinimidesters der N-Benzylcarbonyl-(2S, 3R)-3-amino- 2-hydroxy-4-phenylbutansäure erhielt, F. 111 bis 112°C, [α] = + 35,4° (c = 1,5, AcOH).

Synthese der N-Benzyloxycarbonyl-(2S, 3R)-3-amino-2-hydroxy-p- hydroxyphenylbutansäure A) Synthese der (2RS, 3R)-3-Amino-2-hydroxy-4-p-hydroxyphenylbutansäure

30,0 g öliges N-Benzyloxycarbonyl-(2RS, 3R)-3-amino-2-hydroxy- 4-p-hydroxyphenylbutylronitril wurden in 200 ml konzentrierter Chlorwasserstoffsäure und 200 ml Dioxan gelöst und nach der Zugabe von 17,20 g Anisol wurde die gemischte Lösung 4 Stunden lang unter Rückfluß erhitzt. Nach dem Abdestillieren des Dioxans unter vermindertem Druck wurde die Chlorwasserstoffsäurelösung mit Äther gewaschen und die Wasserschicht wurde unter vermindertem Druck eingeengt und zur Trockne eingedampft. Dann wurden 300 ml Wasser zu dem Rückstand zugegeben und nach dem Abfiltrieren der unlöslichen Substanzen wurde die gleiche Menge Aceton zugegeben und der pH-Wert der Lösung wurde mit Ammoniakwasser auf 5,5 eingestellt. Die Lösung wurde in einem Kühlschrank über Nacht aufbewahrt und die ausgefallenen Kristalle wurden abfiltriert, wobei man 12,61 g (2RS, 3R)-3-Amino-2-hydroxy-4-p-hydroxy phenylbutansäure erhielt, Rf 0,20.

Analyse für C₁₀H₁₂NO₄:
ber.:C 58,81; H 5,92; N 7,82% gef.:C 58,63; H 5,99; N 7,43%

B) Synthese der N-Benzyloxycarbonyl-(2S, 3R)-3-amino-2-hydroxy- 4-p-hydroxyphenylbutonsäure

7,20 g (2RS, 3R)-3-Amino-2-hydroxy-4-p-hydroxyphenylbutansäure wurden nach einem bekannten Verfahren (T. Nagasawa et al., "Bull. Chem. Soc. Japan", 46, 1269 (1973)) unter Verwendung von 11,21 g Benzyl-(S)-4,6-dimethylpyrimidin-2-yl-thiolcarbonat benzyloxy- carbonyliert und dann als Dicyclohexylaminsalz kristallisiert, wobei man 15,28 g des Dicyclohexylaminsalzes der N-Benzyloxy- carbonyl-(2RS, 3R)-3-amino-2-hydroxy-4-p-hydroxyphenylbutansäure erhielt. Nach der Umkristallisation von 15,22 g des dabei erhaltenen rohen Dicyclohexylaminsalzes aus Methanol/Äthylacetat/Petroläther erhielt man als erste Kristalle 3,20 g optisch unreines Dicyclohexylaminsalz der N-Benzyloxycarbonyl-(2R, 3R)-3-amino-2-hydroxy- 4-p-hydroxyphenylbutansäure.

Die Mutterlauge wurde eingeengt und zur Trockne eingedampft und der Rückstand wurde 3mal aus Äthylacetat/Äther ausgefällt, wobei man 5,02 g optisch reines Dicyclohexylaminsalz der N- Benzyloxycarbonyl-(2S, 3R)-3-amino-2-hydroxy-4-p-hydroxyphenylbutansäure erhielt, F. 121 bis 122°C, [α] = +49,9° (c = 0,87, AcOH).

Analyse für C₃₀H₄₂N₂O₆:
ber.:C 69,46; H 8,16; N 6,17% gef.:C 69,81; H 8,35; N 6,42%

Beispiel 1 Synthese von (2S, 3R)-3-Amino-2-hydroxy-4-phenylbutanoyl-(S)- argininhydrochlorid

Eine Lösung, hergestellt durch Auflösen von 5,27 g (25 mMol) (S)-Argininhydrochlorid und 3,5 ml (25 mMol) Triäthylamin in 30 ml Wasser wurde in 50 ml einer Dioxanlösung von 10,67 g (25 mMol) des N-Hydroxysuccinimidesters der N-Benzyloxycarbonyl- (2S, 3R)-3-amino-2-hydroxy-4-phenylbutansäure über einen Zeitraum von etwa 3 Stunden eingetropft. Nach 2tägiger Reaktion bei Raumtemperatur wurde das Lösungsmittel abdestilliert und der Rückstand wurde in einer Chloroform/Methanol (Volumenverhältnis 1 : 2)-Lösung gelöst und dann einer Säulenchromatographie unterworfen unter Verwendung von Silicagel H, Typ 60, wobei man das gewünschte ölige N-Benzyloxycarbonyl-(2S, 3R)-3- amino-2-hydroxy-4-phenylbutanoyl-(S)-argininhydrochlorid in einer Ausbeute von 5,74 g erhielt.

Dieses Produkt wurde in einer Mischung aus 100 ml Methanol und 50 ml Wasser gelöst und unter Verwendung von Palladiummohr als Katalysator einer 6stündigen katalytischen Reduktion unterworfen. Nach dem Abfiltrieren des Katalysators wurde die Lösung zur Trockne eingedampft und der Rückstand wurde mit Aceton gesammelt, wobei man 3,10 g (2S, 3R)-3-Amino-2-hydroxy-4-phenyl butanoyl-(S)argininhydrochlorid erhielt; [α] = -6,5° (c = 1,2, AcOH), Rf 0,08 (gemessen auf einer Silicagel 60 F₂₅₄-Platte einer Dicke von 0,25 mm unter Verwendung einer n-BuOH/AcOH/H₂O (4 : 1 : 1)-Mischung als Entwicklungslösungsmittel). Diese Substanz war positiv beim Test unter Anwendung der Farbreaktionen mit Ninhydrin und Sakaguchi-Reagens.

Analyse für C₁₆H₂₆O₄N₅Cl:
ber.:C 49,52; H 6,76; N 18,06% gef.:C 50,11; H 6,92; N 17,56%

Beispiel 2 Synthese von (2S, 3R)-3-Amino-2-hydroxy-4-p-hydroxyphenylbutanoyl- (S)arginindiacetat

345 mg N-Benzyloxycarbonyl-(2S, 3R)-3-amino-2-hydroxy-4-p-hydroxy phenylbutansäure, 783 mg N^G-Nitro-(S)-argininbenzylester-2p- Toluolsulfonat und 162 mg N-Hydroxybenzotriazol wurden in 20 ml Tetrahydrofuran gelöst und nach der Einstellung des pH-Wertes auf 7,5 mit 0,34 ml Triäthylamin wurde die gemischte Lösung mit 206 mg Dicyclohexylcarbodiimid bei 0 bis 5°C versetzt und über Nacht bei der gleichen Temperatur reagieren gelassen. Die Reaktionslösung wurde eingeengt, mit 50 ml Äthylacetat versetzt und die unlöslichen Substanzen wurden abfiltriert. Die Äthylacetatschicht wurde mit einer 0,5 n Schwefelsäurelösung, einer 2%igen Natriumbicarbonatlösung und Wasser in dieser Reihenfolge gewaschen. Dann wurde sie über wasserfreiem Magnesiumsulfat getrocknet und nach dem Abfiltrieren des Magnesiumsulfats wurde der Rückstand unter vermindertem Druck eingeengt. Die dabei erhaltene hygroskopische ölige Substanz wurde in 10 ml Methanol, 10 ml Essigsäure und 10 ml Wasser gelöst und dann einer 15stündigen katalytischen Reduktion in einem Autoklaven bei 30°C und bei einem Druck von 5 MPa unterworfen.

Nach dem Abfiltrieren des Katalysators wurde die Lösung unter vermindertem Druck zur Trockne eingedampft und der Rückstand wurde einer präparativen Dünnschichtchromatographie mit einer Silicagel 60 F₂₅₄-Platte einer Dicke von 0,5 mm unterworfen unter Verwendung einer n-BuOH/AcOH/H₂O (4 : 1 : 1)- Mischung als Entwicklungslösungsmittel. Dabei erhielt man das gewünschte Produkt in einer Ausbeute von 140 mg, [α] = +2,6° (c = 0,55, AcOH), Rf 0,07 (gemessen unter Verwendung einer 0,25 mm dicken Silicagel 60 F₂₅₄-Platte und einer n-BuOH/AcOH/H₂O (4 : 1 : 1)-Mischung als Entwicklungslösungsmittel).

Dieses Produkt war bei den Farbreaktionen mit Ninhydrin, Sakaguchi- Reagens und α-Nitroso-β-naphthol/Salpetersäure positiv.

Analyse für C₁₆H₂₆O₅N₅ · 2 CH₃COOH · H₂O:
ber.:C 47,49; H 6,98; N 13,86% gef.:C 47,12; H 7,08; N 13,44%

Beispiel 3 Synthese von (2RS, 3RS)-3-Amino-2-hydroxy-4-p-methylphenylbutanoyl- (S)arginindiacetat

1,25 g des Dicyclohexylaminsalzes der N-Benzyloxycarbonyl-(2RS, 3RS)- 3-amino-2-hydroxy-4-p-methylphenylbutansäure (J. Med. Chem., 20, 510 (1977)) wurden in 50 ml Äthylacetat suspendiert und dann mit 3 ml 1 n H₂SO₄ geschüttelt, anschließend wurde eine Flüssigtrennung durchgeführt. Die Äthylacetatschicht wurde mit Wasser gewaschen, über wasserfreiem Magnesiumsulfat getrocknet und unter vermindertem Druck eingeengt, wobei man die ölige N-Benzyl oxycarbonyl-(2RS, 3RS)-3-amino-2-hydroxy-4-p-methylphenylbutansäure erhielt. Diese ölige Substanz wurde zusammen mit 1,57 g N^G-Nitro-(S)-argininbenzylester-2-p-toluolsulfonat, 324 mg N-Hydroxybenzotriazol und 0,67 ml Triäthylamin in 20 ml Tetrahydrofuran gelöst und nach der Zugabe von 412 mg Dicyclohexylcarbodiimid unter Eiskühlung wurde die gemischte Lösung über Nacht bei der gleichen Temperatur reagieren gelassen. Die Reaktionslösung wurde unter vermindertem Druck eingeengt und mit 50 ml Äthylacetat versetzt, anschließend wurden die unlöslichen Substanzen abfiltriert.

Die Äthylacetatschicht wurde mit 0,5 n H₂SO₄, Wasser, einer 2%igen NaHCO₃-Lösung und Wasser in dieser Reihenfolge gewaschen und dann über wasserfreiem Magnesiumsulfat getrocknet. Nach dem Abfiltrieren des Magnesiumsulfats und dem Abdestillieren des Lösungsmittels unter vermindertem Druck wurde der Rückstand gereinigt, indem man ihn einer Säulenchromatographie mit Silicagel H vom Typ 60 unter Verwendung von Äthylacetat und Methanol als Entwicklungslösungsmittel unterwarf. Die dabei erhaltene ölige Substanz wurde in 5 ml Methanol und 5 ml Essigsäure gelöst und einer 10stündigen katalytischen Reduktion bei 25°C unter einem Druck von 5 MPa unterworfen.

Nach dem Abfiltrieren des Katalysators und dem Abdestillieren des Lösungsmittels unter vermindertem Druck wurde der Rückstand in 5 ml Wasser gelöst und dann gefriergetrocknet, wobei man das gewünschte (2RS, 3RS)-3-Amino-2-hydroxy-4-p-methylphenylbutanoyl- (S)-arginindiacetat in einer Ausbeute von 861 mg erhielt, [α] = +4,5° (c = 1,1, AcOH), Rf 0,07 (gemessen unter Verwendung einer 0,25 mm dicken Silicagel 60 F₂₅₄-Platte und eines n-BuOH/AcOH/H₂O (4 : 1 : 1)-Gemisches als Entwicklungslösungsmittel). Die Elektrophorese (AVICEL®, 5mA, 800 V, 10 Minuten, pH 1,6, HCOOH: AcOH : H₂O = 25 : 75 : 900) dieses Produktes ergab einen einzelnen Fleck mit dem Ninhydrin- und Sakaguchi- Reagens.

Analyse für C₁₇H₂₇O₄N₅ · 2 CH₃COOH · 2H₂O:
ber.:C 48,34; H 7,54; N 13,43% gef.:C 48,01; H 7,77; N 12,99%

Beispiel 4 Synthese von (2RS, 3RS)-3-Amino-2-hydroxy-4-o-chlorphenylbutanoyl- (S)arginindihydrochlorid

2,29 g (2 RS, 3RS)-3-Amino-2-hydroxy-4-o-chlorphenylbutansäure (J. Med. Chem., 20, 510 (1977)), 3,05 g tert.-Butyloxycarbonyl- (S)-4,6-dimethylpyrimidin-2-ylthiolcarbonat und 2,1 ml Triäthylamin wurden miteinander gemischt und in 20 ml Dioxan und 20 ml Wasser über Nacht bei Raumtemperatur unter Rühren miteinander umgesetzt. Das Lösungsmittel wurde bis auf das halbe Volumen abdestilliert und dann wurde mit 20 ml Äthylacetat gewaschen. Die Wasserschicht wurde mit 1 n H₂SO₄ auf pH 1 eingestellt und die ausgefallene ölige Substanz wurde mit 100 ml Äthylacetat extrahiert. Danach wurde mit Wasser gewaschen, über wasserfreiem Magnesiumsulfat getrocknet und unter vermindertem Druck eingeengt, wobei man ein öliges Produkt erhielt.

2,44 g dieser N-tert.-Butyloxycarbonyl-(2RS, 3RS)-3-amino-2- hydroxy-4-o-chlorphenylbutansäure wurden in 20 ml Äthylacetat und 20 ml Dioxan gelöst und nach der Zugabe von 1,02 g N-Hydroxysuccinimid wurde die gemischte Lösung auf eine Temperatur unterhalb -5°C abgekühlt. Nach der weiteren Zugabe von 1,54 g Dicyclohexylcarbodiimid wurde die gemischte Lösung in diesem gekühlten Zustand 2 Stunden lang stehen gelassen und dann über Nacht bei 25°C gerührt. Der dabei entstandene Niederschlag wurde abfiltriert und das Lösungsmittel wurde unter vermindertem Druck abdestilliert.

Die erhaltene ölige Substanz wurde erneut in 20 ml Dioxan gelöst und zu dieser Lösung wurde 5 ml einer wäßrigen Lösung von 1,55 g (S)-Argininhydrochlorid und 2,07 ml Triäthylamin innerhalb eines Zeitraums von 30 Minuten zugegeben, dann ließ man die Mischung bei Raumtemperatur über Nacht reagieren und anschließend destillierte man das Lösungsmittel unter vermindertem Druck ab. Der Rückstand wurde durch Säulenchromatographie mit Silicagel H vom Typ 60 unter Verwendung einer n-BuOH/AcOH/H₂O (4 : 1 : 1)-Mischung als Entwicklungslösungsmittel gereinigt, wobei man das N-tert.-Butyloxycarbonyl-(2RS, 3RS)- 3-amino-2-hydroxy-4-o-chlorphenylbutanoyl-(S)argininhydrochlorid in Form eines öligen Produkts erhielt.

Dieses ölige Produkt wurde in 10 ml eisgekühlter 4 n Chlorwasserstoffsäure/ Dioxan und 10 ml Trifluoressigsäure gelöst, dann 1 Stunde lang bei Raumtemperatur gerührt und unter vermindertem Druck eingeengt. Die dabei erhaltene Substanz wurde mit wasserfreiem Äther versetzt und stehen gelassen, bis sie sich verfestigt hatte. Nachdem das Produkt mit Äther gewaschen und filtriert worden war, erhielt man (2 RS, 3RS)-3-Amino-2-hydroxy- 4-o-chlorphenylbutanoyl-(S)arginindihydrochlorid in einer Ausbeute von 1,09 g [α] = +0,7° (c = 1,1, AcOH), Rf 0,07 (gemessen unter Verwendung einer Silicagel 60 F₂₅₄-Platte einer Dicke von 0,25 mm und einer n-BuOH/AcOH/H₂O (4 : 1 : 1)-Mischung als Entwicklungslösungsmittel).

Die Elektrophorese (AVICEL®, 5 mA, 800 Volt, 10 Min., pH 1,6, HCOOH : AcOH : H₂O = 25 : 75 : 900) dieses Produktes ergab einen einzelnen Fleck mit dem Ninhydrin- und Sakaguchi-Reagens.

Analyse für C₁₆H₂₄O₄N₅Cl · 2 HCl · H₂O:
ber.:C 40,27; H 5,87; N 14,69% gef.:C 40,02; H 6,19; N 14,11%.

Claims

1. Dipeptide der allgemeinen Formel worin R ein Wasserstoffatom, eine Hydroxygruppe, eine Alkylgruppe mit 1 bis 4 Kohlenstoffatomen oder ein Halogenatom bedeutet, sowie deren pharmazeutisch verträgliche Säureadditionssalze und optische Isomeren.

2. (2S, 3R)-3-Amino-2-hydroxy-4-phenylbutanoyl-(S)-arginin.

3. (2S, 3R)-3-Amino-2-hydroxy-4-p-hydroxyphenyl-butanoyl-(S)-arginin.

4. (2RS, 3RS)-3-Amino-2-hydroxy-4-p-methylphenyl-butanoyl-(S)-arginin.

5. (2RS, 3RS)-3-Amino-2-hydroxy-4-o-chlorphenyl-butanoyl-(S)-arginin.

6. Verfahren zur Herstellung der Dipeptide gemäß Ansprüchen 1 bis 5, dadurch gekennzeichnet, daß man in an sich bekannter Weise eine (2S, 3R)- oder (2RS, 3RS)-Aminosäure der allgemeinen Formel worin R die voranstehend angegebenen Bedeutungen hat, X und Y ein Wasserstoffatom oder eine Aminoschutzgruppe bedeuten, oder ein reaktionsfähiges Derivat davon mit (S)-Arginin kondensiert und erforderlichenfalls nach der Entfernung der Schutzgruppe in ein pharmazeutisch verträgliches Säureadditionssalz überführt.

7. Arzneimittel, enthaltend ein Dipeptid nach einem der Ansprüche 1 bis 5 in Kombination mit üblichen Trägern und/oder Hilfsstoffen.