DE3022111A1 - Verfahren und vorrichtung zum messen der elektrophoretischen beweglichkeit von zellen - Google Patents

Verfahren und vorrichtung zum messen der elektrophoretischen beweglichkeit von zellen

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DE3022111A1
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Description

National Research Development Corporation
London SWlE 6SL, Großbritannien
Verfahren und Vorrichtung zum Messen der elektrophoretischen Beweglichkeit von Zellen
Die Erfindung betrifft ein Verfahren und eine Vorrichtung zum Messen der elektrophoretisehen Beweglichkeit von Zellen.
Ein Test zum Bestimmen bösartiger Krankheiten oder Geschwülste wird als histologischer elektrophoretischer Beweglichkeitstest (MEM) bezeichnet (vgl. Field & Caspary, Lancet ii 1337 (197O), "British Medical Journal" ii 613 (1971); Pritchard et al, Lancet ii 627 (1972), "British Journal of Cancer", 27.1 (1973)).
Die elektrophoretische Beweglichkeit wird durch
Messen der Zeit bestimmt, die eine gewählte Zelle in
einer Lösung (z. B. KC1) benötigt, um zwei Linien in ei-
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nem bekannten und festen Abstand entfernt unter dem Einfluß
$ einer Potentialdifferenz zwischen zwei Elektroden in der
Lösung zu kreuzen. Die fortschreitende Bewegung der Zelle wird durch ein Mikroskop allein oder mittels einer Fernsehkamera und eines Monitors beobachtet; Zellen im Brennpunkt in der ortsfesten Schicht werden beliebig für eine Messung gewählt, und die Potentialdifferenz wird gewöhnlich für die Hälfte der Messungen umgekehrt, um die Richtung von Wanderungseffekten zu entfernen. Die Zeitnahmen werden durch einen Bediener vorgenommen, der eine Uhr startet und anhält. Der Mittelwert von möglichst vielen Zeitnahme-Paaren (eine Zeitnahme in jeder Bewegungsrichtung) wird durch die Gleichung
T -T
1OO(-|—-) = % Verzögerung
bzw.verlangsamung oder Abnahme, wobei T1 die mittlere Zeit für eine Probe ohne Zusatz und T„ die mittlere Zeit für eine Probe mit dem Zusatz eines Antigens oder Abwehrstoffes ist, bestimmt.
Die Bestimmung der Beweglichkeit von Hand ist langwierig und fehleranfällig durch einen ermüdeten Bediener.
Ein Verfahren zum automatischen Messen der Geschwindigkeit von Teilchen in einem Fluid besteht in der Verwendung einer Laser-Doppler-Geschwindigkeitsmessung, bei der die Doppler-Verschiebung der von sich bewegenden Teilchen reflektierten Laserstrahlung gemessen wird, um die Teilchengeschwindigkeit anzuzeigen. Dieses Verfahren ist jedoch aufwendig, und befriedigende Ergebnisse sind schwierig zu erzielen.
Es ist daher Aufgabe der Erfindung, ein Verfahren und eine Vorrichtung der eingangs genannten Art anzugeben, die
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t insbesondere einfach arbeiten, wenig fehleranfällig sind
ι und in kurzer Zeit befriedigende Ergebnisse hervorbringen.
■| Diese Aufgabe wird bei einem Verfahren bzw. einer
,; Vorrichtung der eingangs genannten Art erfindungsgemäß
|| durch die im Patentanspruch 1 bzw. 2 angegebenen Merkmale gelöst.
In einer Ausführungsform eines Korrelators wird jede abgetastete Zeile verarbeitet, um die Anzahl der erfaßten Zellen entlang dieser Zeile anzuzeigen, und es wird eine Digital-Zahl erzeugt. Ein Bildfeldrahmen wird dann durch eine Reihe von Digital-Zahlen dargestellt. Zwei oder mehr derartiger Reihen werden kreuzzugeordnet oder -korreliert, um die Lxldverschiebung zu liefern.
In einer vereinfachten Ausführungsform wird jede Zeile abgetastet, um zu zeigen, ob eine Zelle erfaßt ist oder nicht, und ein einziger logischer 1-Impuls wird für jede Zeile erzeugt. Keine erfaßten Zellen führen dazu, daß eine logische Null erzeugt wird. Somit wird ein Bildfeldrahmen durch eine Reihe von logischen 1 und 0 dargestellt. Zwei derartige Reihen werden kreuzzugeordnet, um die Bildverschiebung zu liefern.
Bei der Erfindung wird also die elektrophoretische Beweglichkeit von Zellen in einer Lösung gemessen, indem ein elektrisches Potential an eine Zelle gelegt wird. Lrine Zeilenabtastkamera liefert einen Bildfeldrahmen durch Zeilenabtasten der Zelle in einer Richtung senkrecht zur Zellenbewegung. Zwei derartige Bildfeldrahmen werden zugeordnet, um die Zellbeweglichkeit in dem Intervall zwischen
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den beiden Rahmen zu bestimmen. Jede abgetastete Zeile wird verarbeitet, um die erfaßten Zellen anzuzeigen, jj es wird eine Digital-Zahl erhalten. Ein Rahmen wird so durch eine Reihe von Zahlen dargestellt, die zugeordnet werden können. Alternativ und einfacher wird jede Zeile abgetastet, und das Vorliegen jeder erfaßten Zelle wird durch eine logische 1 dargestellt, so daß ein Bildfeldrahmen durch eine Reihe von logischen 1 und O für eine Zuordnung mit späteren Reihen wiedergegeben wird. Eine Integration einer aufeinander folgenden Beweglichkeitsmessung verbessert die beobachteten Ergebnisse. Eine Markierungs-Einsteckeinheit liefert eine sichtbare Marke auf einem Femsehschirm, um Zellen anzuzeigen, die erfaßt wurden.
Nachfolgend wird die Erfindung anhand der Zeichnung näher erläutert. Es zeigen:
Fig. 1 eine Darstellung einer elektrophoretischen Kammer,
Fig. 2 einen Schnitt eines Teiles der Kammer cLs1" "&*n - 1 -
Fig. 3 ein Blockschaltbild einer Vorrichtung zum Messen der Zellbeweglichkeit innerhalb der Kammer der Fig. 1 und 2,
Fig. 4 den Verlauf von Spannungen in Abhängigkeit von der Zeit,
Fig. 5a Korrelations- und integrierte Korre- und 5b lationsfunktionen in Abhängigkeit von einer Video-Zeilenzeit,
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Fig. 5c den Verlauf einer Wahrscheinlichkeitsdichtefunktion einer Bildbewegung , und
Fig. 6 eine Darstellung von Zellen innerhalb einer Kammer, wie diese auf einem Video-Monitor zu sehen sind.
Wie in den Fig. 1 und 2 gezeigt ist, hat eine elektro phoretische Vorrichtung eine Glaskammer 1 mit einem flachseitigen Mittenteil 2, zwei Elektroden 3, 4 an beiden Enden und zwei Membranen 5, 6, die die in eine Salzlösung 7 eingetauchten Elektroden von einer Probe 8 von Blutzellen in einer Lösung (z. B. KC1) trennen. Die Probe 8 wird in die Kammer 1 durch Rohre 9, 10 eingeführt, die durch Absperrorgane oder Hähne 11 p 12 gesteuert sind.
Wenn ein elektrisches Potential zwischen die Elektroden 3, 4 gelegt wird, wandern Zellen von einem Ende der Kammer 1 zum anderen.
Diese Bewegung wird beobachtet und durch die in Fig. 3 gezeigte Vorrichtung gemessen. Die Kammer wird durch eine Zexlenabtastkamera 15, ζ. B. eine Fernseh-Video-Kamera, beobachtet und über eine Markierungs-Einsteckeinheit 32 auf einem Fernseh-Monitor 16 angezeigt. Das erhaltene BiIa ist in Fig. 6 dargestellt, in dem Zellen als dunkle Punkte 18 oder von einem dunklen Ring umgebene hellgefärbte Punkte IQ βbh5nfri" devon ZU sehen Sind; eilf wp~\nhe*r Hpitp dps Rrfinnpunktes die Zelle liegt. Die hellen oder Lichtpunkte 19 in einem Ring sind von Interesse und weisen auf der Seite eine elektronisch erzeugte hellgefärbte Rechteck-Marke 20 auf (wird weiter unten näher erläutert), um das Aufbauen oder Einstellen der Vorrichtung zu unterstützen.
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Ein Zelldetektor 21 erzeugt eine Reihe von logischen Eins und Null, die eine Erfassung von Zellen in einem BiIdfeldrahmen in der folgenden Weise darstellen.
Die Fernsehkamera 15 erzeugt eine Anzeige durch Rasterabtasten von Zellen in der Kammer 2 in einer Reihe von Zeilen in üblicher Weise, z. B. zwei Halbbilder von 312 1/2 verflochtenen Zeilen. Die Richtung der Zeilenabtastung ist senkrecht zur Zellbewegung. Das Ausgangssignal der Kamera 15 ist eine Folge von sich ändernden Amplitudensignalen, die aufeinander folgende Zeilen des anzuzeigenden Bildes darstellen. Eine Gesamtzahl von 256 benachbarten Zeilen (aus 625) wixd gewählt, um einen einzigen Rahmen zu bilden. Wenn die Kamera 15 eine Zeile abtastet, weist ihr Vidikon-i^usgangssignal zwei Formen abhängig vom Typ der abgetasteten Zelle auf, d. h. von einem dunklen Punkt (unerwünscht) oder einem hellen Punkt in einem dunklen Ring (erwünscht) . Das Vidikon-Ausgangssignal für einen Teil einer Zeile ist in Fig. 4a gezeigt, wo ein dunkler Punkt 18 einen einzigen vorherrschenden Spitzenwert (Signal i) und ein heller Punkt 19 in einem dunklen Ring einen doppelten Spitzenwert (Signal ii) aufweisen. Die beiden Zeilensignale entsprechend Fig. 4a (i) und (ii) werden durch einen Differenzierer 22 geschickt, um jeweils in Fig. 4b (i), (ii) dargestellte Signale zu erzeugen. Fig. 4b (i) weist einen negativen Spitzenwert auf, während Fig. 4b (ii) einen positiven Spitzenwert hat, dem ein negativer Spitzenwert folgt.
Das Ausgangssignal vom Differenzierer 22 wird aufgespalten und durch einen negativen Schwellenwert-Detektor 2 3 und einen positiven Schwellenwert-Detektor 24 geschickt. Das Ausgangssignal des negativen Schwellenwert-Detektors triggert ein Monoflop 25, dessen Ausgangsimpuls (eine logische 1) von kurzer Zeitdauer ist. Das Ausgangssignal des positiven Schwellenwert-Detektors 24 triggert ein Monoflop 26, dessen Ausgangsimpulslänge so eingestellt ist, daß sie
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die erwartete Zeit zwischen positiven und negativen übergängen des Zeilensignales darstellt. Die Ausgangssignale beider Monoflops 25 und 26 verlaufen zu einem UND-Gatter 27, dessen Ausgangssignal ein Monoflop 28 triggert, dem ein Flipflop 29 foJqt. Dies ist in Fig. 4d dargestellt, wo die Ausgarigs£:igi\._.le der Monoflops 25, 26, 28 und des UND-Gatters 27 für die beiden Signale (i) und (iii angegeben sind, C^o in den Fig. 4a, b, c gezeigt sind.
Wenn so das Ausgangssignal des Differenzieren 22 zu einem negativen Schwellenwert führt, dem eine positive Schwellenwert-Erfassung folgt, wie dies in Fig. 4c (i) dargestellt ist, so liegt keine Übereinstimmung am UND-Gatter 27 vor, und es wird kein Signal vom Monoflop 28 zum Flipflop 29 gespeist. Wenn jedoch das Ausgangssignal des. Differenzierers 22 zu einem positiven Wert führt, dem eine negative Schwellenwert-Erfassung folgt, wie dies in Fig. 4c (ii) angegeben ist, so liegt eine Übereinstimmung am UND-Gatter 27 vor, die zu einem logischen 1-Impuls vom Monoflop 28 führt, um das Flipflop 29 in seinen logischen 1-Zustand zu bringen. Wenn eine erwünschte Zelle auftritt (ein heller Punkt oder Fleck in einem dunklen Ring), ist deshalb für jede abgetastete Zeile das Ausgangssignal des Flipflops 29 eine logische 1 unabhängig davon, wieviele erwünschte Zellen auf der Zeile sind. Am Ende jedes Zeilensignales setzt ein Zeilensynchronisierimpuls von der Fernsehkamera 15 über eine Synchronisiertrennstufe 31 das Flipflop 29 auf Null zurück. Die Synchronisiertrennstufe 31 liefert auch einen Zeilensyrchronisierimpuls und ei-— — — V"» — t- —- — ——---— _^ -^ — _ -ΐ _■! — -^ ■! — _ ... "I _. _*> _— _» Τ.Γ«-~ «..β ^* ~l —* Λ— *^ ν Ο Γ\ IXCXX XVCLIIXUCrilOy XXOXlJ. UIiIS J- CL J-1UJ*/U-L.O 6UlU IWiO-CJ-Mi-VJ. -»v ·
Das Ausgangssignal vom Flipflop 2^ ist so eine logische Eins und Null für jede Zeile im Rahmenbild, und diese Reihe von logischen Eins und Null wird in den Kreuz-
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korrelator 30 für eine KreuzZuordnung mit einer zweiten Reihe von logischen Eins und Null geschickt/ die einen späteren Bildfeldrahmen darstellen.
Die Ausgangssignal-Länge des Monoflops 28 ist auf eine ausreichende Länge eingestellt, daß sie eine sichtbare rechteckförmige hellgefärbte Morke 20 erzeugt, wenn über die Markierungs-Einsteckeinheit 32 zum Fernsehmonitor 16 ein Signal gespeist ist. Somit folgt jeder erfaßten Zelle 19 auf der gleichen Zexj.3 eine sichtbare Marke 20 und bestätigt einem Bediener, daß die Schwellenwert-Pegel und die Zeitnahme richtig vorgenommen wurden.
Der Kreuzkorrelator 30 kann hartverdrahtet sein, z. B. ein Verzögerungsglied/ dem zwei Sätze von Schieberegistern folgen, oder ladungsgekoppelte Einrichtungen (CCD) und Multiplizierer. Alternativ kann ein Mikroprozessor, z. B. der COSMAC-Mikroprozessor der Firma RCA verwendet werden. Das Mikroprozessor-System arbeitet aufgrund eines gespeicherten Programmes, das in einem Festwertspeicher (ROM) gehalten ist, es nimmt die Flipflop-Ausgangsdaten an und speichert diese in einer geordneten Anordnung in einem Speicher mit wahlfreiem Zugriff (RAM). Auf Befehl von einem Rahmensynchronisierimpuls werden 256 derartiger Datenelemente (die einen Rahmen darstellen) abgespeichert. Der Mikroprozessor zählt dann eine gewählte Anzahl von Rahmen (die durch den Bediener aufgrund einer erwarteten Bildverschiebung festgelegt ist), bevor eine Annähme Von anderen 128 Zeilen von Daten in seinen Speicher mit wahlfreiem Zugriff (256 und 128) zur Vereinfachung gewählt wird, um + eine Fernsehzeile in einer Auflösung von 128 Zeilen, d. h. ungefähr 2 % (mehr oder weniger kann gewählt werden), zu ergeben.
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Zwei lineare Anordnungen von Daten, die aus einer Mehrzahl von logischen Null und einigen Eins bestehen, die Zellstellungen darstellen, werden nun abgespeichert. Diese beiden Anordnungen werden elementweise über 128 Elementen entsprechend allen Elementen der zweiten Anordnung verglichen, und die Anzahl, mit der eine Eins in beiden Anordnungen erfaßt wird, wird durch den Mikroprozessor angesammelt. Die so erzeugte Zahl stellt einen Kreuzkorrelationskoeffizienten dar. Die relative Verschiebung der beiden Anordnungen wird dann durch ein Element indiziert, und der Prozeß wird wiederholt. Dies wird fortgesetzt, bis 128 angeglichene Zahlen aus den 128 relativen Verschiebungen gebildet wurden.
Die Liste der Zahlen wird dann untersucht, um die größte Zahl festzulegen, und die Indexstellung dieses Spitzenwertes v/ird notiert/ wobei diese die wahrscheinlichste Bildverschiebung vom Datenwert einer Nullverschiebung ist. Eine positive oder eine negative Verschiebung hängt von der Polarität der vorliegenden Potentialdifferenz ab. Das Ergebnis kann in der in Fig. 5a gezeigten Weise vorliegen, und es kann auf einer Anzeigeeinheit 33, z. B. einem Oszilloskop oder einer sichtbaren Anzeigeeinheit, angezeigt werden.
Ein anderer Rahmen oder eine Anzahl von anderen Paaren von Rahmen kann in der gleichen Weise verarbeitet und durch einen Integrierer 34 gesammelt werden, um den Rauschabstand zu verbessern,, bevor der Spitzenwert gesucht wird. Fig. 5b zeigt die Integration von 30 Bildfeldrahmenpaaren.
Eine auf diese Weise bestimmte Bildverschiebung wird in eine Wahrscheinlichkeitsdichtefunktion (Fig. 5c) von Verschiebungen addiert, die im Mikroprozessor-RAM gespei-
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chert sind/ bis eine (durch den Bediener gewählte) merkliche Anzahl der gleichen Verschiebung gesammelt wurde, wobei dieses dann als eine Anzahl η von Fernsehzeilen einer Bildverschiebung abgegeben wird, die aus anderen Rahmen N berechnet sind, und wenn jede Fernsehzeile kalibriert ist, um einen bekannten Abstand von d Meter in der elektrophoretischen Zeile darzustellen, dann kann die Geechwindigkeit einer Bildverschiebung und damit die Geschwindigkeit der Zellen berechnet werden aus:
nd
V = — m/s
20 · 1O~3(N + 2) + 64 · 1O~6n
mit 20-10 = eine Fernsehrahmenzeit, und 64 · 10~6 = eine Fernsehzeilenzeit für ein 50 Hz-System
(verschieden vom amerikanischen 60 Hz-System)
In einer Abwandlung wird das Flipflop durch einen Zähler ersetzt, der eine Digital-Zahl liefert, die für jede abgetastete Zeile die erfaßten Zellen darstellt. Der Korrelator kann eine Zeile oder mehrere der Zeilen mit einer späteren Zeile oder einer Anzahl von Zeilen zuordnen oder korrelieren.
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Claims (1)

  1. Ansprüche
    Verfahren zum Messen der elektrophoretisehen Beweglichkeit von Zellen,
    - Anlegen eines elektrischen Potentiales an eine Lösung
    (8) in einer elektrophoretischen Kammer (1),
    - Abtasten eines Teiles der Kammer (1) Zeile für Zeile, um einen ersten Bildfeldrahmen zu erzeugen,
    - Abtasten, um eine Zeit T später einen zweiten Bildfeldrahmen zu erzeugen,, und
    - Kreuzzuordnen dsr beiden Bildfeldrahmen, um die Bildbewegung in der Zeit T und damit die Zellbeweglichkeit mehrerer Zellen in der Lösung (8) zu bestimmen.
    Vorrichtung zum Messen der elektrophoretischen Beweglichkeit von Zellen, mit
    - einer elektrophoretischen Kammer (1) mit zwei beabstandeten Elektroden (3, 4) zum Anlegen eines elektrischen Potentiales an eine Lösung (8), die Zellen enthält und von den Elektroden (3, 4) durch Membrane (5, 6) getrennt ist,
    gekennzeichnet
    durch
    - eine Zeilenabtastkamera (15) zum Erzeugen von Signalen, die Bildfeldrahmen der Zellen innerhalb der Lösung (8) darstellen, und
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    - einen Korrelator (30) für Kreuzzuordnungssignale, die zeitbeabstandete Bildfeldrahmen darstellen, um eine mittlere Zellbeweglichkeit zu liefern-
    3. Vorrichtung nach Anspruch 2 ,
    gekennzei chnet uurch
    - eine Einrichtung (22, 23, 24, 25, 26, 27) zum Verarbeiten jeder 2.^Ie einer Abtastung von der Kamera (15), um zu eizeugen eine die Anzahl der erfaßten Zellen in dieser Zeile darstellende Digital-Zahl für eine ',tiordnung mit einer Zeile von einer späteren Abtastung, um eine Zellbeweglichkeit anzuzeigen.
    4. Vorrichtung nach Anspruch 2,
    gekennzeichnet durch
    - eine Einrichtung (22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29) zum Verarbeiten jeder Zeile einer Abtastung von der Kamera (15), um anzuzeigen das Vorliegen von einer Zelle oder von mehreren erfaßten Zellen in dieser Zeile und um zu liefern wenigstens einen Teil eines durch eine Reilie von logischen 1 und O dargestellten Bildfeldrahmens für eine Zuordnung mit einer späteren Reihe, um die Zellbeweglichkeit anzuzeigen.
    5. Vorrichtung nach Anspruch 2,
    gekennzeichnet durch
    - eine Markierungs-Einsteckeinheit (32) zum Erzeugen einer sichtbaren Marke auf einem Fernsehschirm (16) neben jeder erfaßten Zelle.
    6. Vorrichtung nach Anspruch 2,
    gekennzeichnet durch
    - einen Integrierer (34) zum Integrieren der Ergebnisse zahlreicher Beweglichkeitsergebnisse.
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    7. Vorrichtung nach Anspruch 4,
    gekennzeichnet durch
    - einen Differenzierer (22), Schwellenwert-Pegel-Detektoren (23, 24), Monoflops (25, 26), ein UND-Gatter (27), ein Monoflop (28) und ein Flipflop (29).
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DE3022111A 1979-06-14 1980-06-12 Verfahren und vorrichtung zum messen der elektrophoretischen beweglichkeit von zellen Withdrawn DE3022111A1 (de)

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