DD133469B1

DD133469B1 - Verfahren zur messung der elektrophoretischen beweglichkeit von teilchen

Info

Publication number: DD133469B1
Application number: DD20093277A
Authority: DD
Inventors: Klaus Friedel; Ehrhard Dammann; Hans-Joachim Pohl; Wolfgang Schuett; Hans-Ludwig Jensen
Original assignee: Klaus Friedel; Ehrhard Dammann; Pohl Hans Joachim; Wolfgang Schuett; Jensen Hans Ludwig
Priority date: 1977-09-08
Filing date: 1977-09-08
Publication date: 1980-12-10
Also published as: DD133469A1; DE2834568A1; GB2006428A; GB2006428B; DE2834568B2; SU940040A1; DE2834568C3

Description

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«Anwendungsgebiet der Erfindung^

Die Erfindung betrifft ein Verfahren zur Messung der elektrophoretischen Beweglichkeit von Teilchen, bei dem an eine in einer Elektrophoresekammer befindliche Flüssigkeit sprobe eine Spannung angelegt wird und bei mikroskopischer Betrachtung, vorzugsweise des mittels einer Videokamera aufgenommenen und mittels eines Monitors reproduzierten Videobildes der Probe, die Zeit gemessen wird, in v/elcher ein jeweils ausgewähltes Partikel der Probe eine vorbestimmte Distanz zwischen zwei gewählten Marki erungen durchwand ert.

Char akt erlst ik_ der_b ek g^ten^tochnischen^Lösungerx^ Es ist bereits ein Verfahren und eine Vorrichtung bekannt (Hannig-, X.; Wirth·, ti«; Meyer, B.-M.j Zeiller, K.; "Theoretical and Experimental Investigations of the Influence of Mechanical and Elektrokinetic Variables on the Efficiency of the Method", Hoppe Seyler's Z. Physiol. Chem., Bd. 356), mittels der eine große Zahl von Zellen oder Partikeln, die als Strahl kontinuierlich in einen laminaren Pufferstrom gegeben und nach Ablenkung in einem senkrechten elektrischen Feld in einer endlichen Zahl von Gofäßen aufgefangen, mengenmäßig erfaßt und für v/eitere Untersuchungen verwendet werden können« Die Bestimmung der

elektrophoretischen Beweglichkeit der Partikel erfolgt über die Auslenkung der zu untersuchenden Partikel in einen konstanten LaminarstrGa.

Die Nachteile des Verfahrens bzw. der Anordnung liegen in der erforderlichen hohen Konstanz des Paffer- und Probenstroms, in dem geringen Probendurchsatz sowie in der Verwendung eines niederionischen Puffers, der die mehrmalige Untersuchung einschränkt»

Weiter ist ein Verfahren zur Bestimmung der elektrofihoretisehen Beweglichkeit von einzelnen Partikeln aus der Boppierverschiebunjs der Frequenz des an den Partikeln gestreuten Laserlichtes bekannt (Uzgiris, E. E, (1972) Optics Сопштоп б) ,

Der bei dieses Verfahren aufzubringende Aufwand zur Analyse des gestreuten Laserlichtes (Vielkanalanalysator etc) ist sehr hoch«

Außerdem ist; ein Verfahren bekannt (Vransky, V. TC; "Die Zellelektrophorese", Portschritte der experimentellen und theoretischen Biophysik, Band 18), bei dem die elektrophoretische Beweglichkeit von einzelnen mikroskopisch kleinen Partikeln durch Zeitmessung ermittelt wird. An die Piassigkeitsprobe in einer Elektrophoresekammer wird eine Spannung angelegt. Mittels mikroskopischer Betrachtung der Probe wird manuell (z. 3» mit Stoppuhr) die Zeit gemessen, die ein betrachtetes ausgewähltes Teilchen zum Durchwandern einer bestimmten vorgewählten Wegstrecke benötigt.

Nachteilig ist, die subjektive Fehlerbehaftung des Keßergebnisses durch den Zeitnehmer. Diese subjektive Beeinflussung erfolgt einerseits durch die visuelle Betrachtung und manuelle Zeitnahme, andererseits durch die dem Beobachter überlassene Entscheidung über die Auswahl der zu untersuchenden Teilchen zur Zeitmessung. Zur Reduzierung des auftretenden subjektiven Meßfehlers sind Keßreihen notwendig, aus denen der Hittelwert gewonnen werden muß, wodurch der Zeitaufwand der Messungen ansteigt-« Gleichermaßen ist der hohe

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bedienungstechnische Aufwand von Nachteil.

Siel der Erfindung ist die Erhöhung der Genauigkeit der elektrophoretischen Messung sowie die Senkung des teehnisch-ökonomischen bzw. zeitlichen und Ъedienungstechnischen Aufwandes«

Bariegung des Wesens der Srfindung:

Der Erfindung liegt die Aufgabe zugrunde, mit möglichst einfachen Mitteln ein Verfahren zur zeitlichen Messung der elektrophoretisehen Beweglichkeit einzelner ohne subjektive Beeinflussung auf ausgewählte elektrophoretisch auswertbarer Teilchen zn schaffen, das eine genaue Zeitmessung der Bewegung der Teilchen ohne subjektive Keßfehler beinhaltet. Diese Aufgabe wird bei einem Verfahren zur Messung der elektrophoretischen Beweglichkeit von Teilchen, bei dem an eine in einer Elektrophoresekammer befindliche Probe eine Spannung angelegt, die Probe mikroskopisch betrachtet, videotechnisch aufgenommen, auf einem "Monitor abgebildet und die Zeit gemessen wird, in welcher ein jeweils ausgewähltes Teilchen der Probe eine vorb estinrote Distanz durchwandert, erfindungsgemäß dadurch gelöst, daß das bei der videotechnischen Aufnahme der Probe erzeugte BAS-Signal nach Durchlaufen einer Filterkette und nach anschließender Digltalsisierung durch Vergleich mit einer einstellbaren Referenzspannung mit Impulsen logisch verknüpft wird, die gleichzeitig zum Monitor gelangen und von denen einer durch Zeitverzögerung aus dem Bildsynchr-олішриіэ des BkB-Signals nnä die anäeren zwei Impulse durch unterschiedliche Zeitvex'zögerung aus dem Zeilensynchroniiripuls des BAS-Signals gewonnen werden, und daß das erste der durch die logische Verknüpfung entstandenen Signale, die jeweils bei gleichzeitigen Erscheinen eines der beiden zeitverzögerten Zeilensynchronimpulse, des zeitverzögerten Bildsynchronimpuls es und eines Impulses des digitalisierten ВАЗ-Signals auftreten einen Zählvor-

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gang auslöst, den ein weiteres durch die logische Verknüpfung erzeugtes Sig-nal stoppt.

Es ist vorteilhaft, wenn ab Beginn des Zählvorganges der durch einen zeitverzögerten Zeilensynchronimpuls verursacht wurde, j ed ear zeitverzögorte Zeilensynchronimpuls dieser Zeitverzögerung und bei Beendigung des Zählvorganges jeder zeitverzögerte Zeilensynchronimpuls unterdrückt v/ird. Es ist weiterhin vorteilhaft, wenn die zwei Zeitverzögerungen des jeweils zeitverzögerten Zeilensynchronimpulses sowohl gemeinsam als auch einzeln eingestellt werden.

Außerdem ist es noch vorteilhaft, wenn die Zeitverzögerung und die Impulsdauer des zeitverzögerten BiIdsynchronimpulses eingestellt werden.

Von Vorteil ist auch, wenn die aus den Bild- und Zeilensynchronimpulsen erzeugten Signale den Monitor hell dunkel steuern unü als vertikale sowie horizontale Markierungslinien erscheinen.

Vorteilhaft ist weiterhin, wenn die Zählimpulce digital erfaßt und ausgewertet werden. Aus den Video-Synchron-

2.0 impulsen werden durch Zeitverzögerung periodische Signale erzeugt, die auf dem Monitorbild einen einstellbaren, rechteckförmigen Bildausschnitt darstellen, v/elcher der Zeitmessung zugrunde gelegt v/ird, d. h. es wird, sofern sich ein elektrophoretisch auswertbares Teilchen der zu analysierenden Probe innerhalb dieses BiIdausschnittes bewegt, die Zeit gemessen, die das Teilchen zum Durchwandern von einer vertikalen Begrenzung des Bildausschnittes zur anderen benötigt. Die Zeitmessung erfolgt durch Start und Stop eines ZählVorganges, dessen Zählimpulse digital erfaßt und [email protected] bearbeitet werden können. Start und Stop des ZählVorganges v/erden durch die logische Verknüpfung, der zeitverzögert en Video-Synchronimpulse mit dem digitalisierten BAS-Signal der videotechnischen Aufnahme der Probe ausgelöst. Um au gewährleisten, daß Start und Stop des Zählvorganges an unterschiedlichen vertikalen

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Begrenzungen des Bild aus schnitt es auf dem T.ionitor verursacht werden, werden diejenigen zeitverzögerten Zeilensynchronimpulse, die den Zählvorgang ausgelost haben, vom Beginn der Zählung ab unterdrückt. Durch einen Abgleich der Referenzspannung beim Vergleich mit dem БАЗ-Signal zur Digitalisierung wird eine Auswahl derjenigen Teilchen der Probe bewirkt, die zur elektrophoretischen Auswertung herangezogen werden.

Xusführungsb eispielj

Sie Erfindung soll nachstehend anhand einer in der Zeichnung dargestellten Anordnung zur Durchführung des erfindungsgemäßen Verfahrens näher erläutert werden. Eine Videokamera 1 ist über einen Trennverstärker 2 und über einen Modulator 3 niit einen Monitor 4 verbunden. Glei™ chermaßen steht die Videokamera 1 über dem Trennverstärker 2, eine Filterkette 5 und einen mit einer Referenzspannung U ·_ρ versehenen Komparator б mit einem ersten Eingang eines- UND-Gliedes 7 in Verbindung, dessen zweiter Eingang mit dem Ausgang eines ODER-Gliedes 8 gekoppelt ist, Ein Eingang des ODER-Gliedes 8 ist mit dem Ausgang eines UND-Gliedes 9, der andere Eingang des ODEH-GIiedes 8 mit dem Ausgang eines UHI)-GIi ed es 10 verbunden. Sin weiterer Ausgang des Trennverstärkers 2 ist über ein Amplitudensieb 11 auf einen Impulsverteiler 12 geführt, dessen erster Ausgang mit einem Multivibrator 13 gekoppelt ist, dessen Ausgang mit zwei weiteren MuItivibratoren 14, 15 in Verbindung steht» der zweite Ausgang des Impulsverteilers 12 ist über zwei in Reihe geschaltete Multivibrator ren 16, 17 mit je einem Eingang der UlTD-Glieder 9_S 10 verbunden« Der Ausgang des Multivibrators 14 ist auf einen zweiten Eingang des UND-Gliedes 9, auf einen Eingang des Modulators 3, auf einen ersten Eingang eines ODER-Gliedes 18 sowie auf einen ersten Eingang eines UND-Gliedes 19 geführt. In gleicher Y/еізе besteht eine Kopplung des Ausgangs des Multivibrators 15 mit einem

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zweiten Eingang des UND-Gliedes 10, mit einem v/eiteren Eingang des Modulators 3, mit einem zweiten Eingang des ODER-Gliedes 18 sowie mit einem ersten Eingang eines UND-Gliedes 20. Der Ausgang des Multivibrators 17 ist gleichfalls mit dem Modulator 3 und der Ausgang des UND-Gliedes 7 mit je einem Eingang der ШТЕ-Glieder 19, 20 verbunden. Das UiTB-Glied 13 ist ausgangs sei tig mit dem Rücksetzeingang eines Flip-Flop 21, das UITD-Glied hingegen mit dem Rücksetzeingang eines Flip-Flop 22 gekoppelt.

Der Ausgang des Flip-Flop 21 ist auf einen dritten Eingang des UND-Gliedes 9 geführt, der Ausgang des Flip-Flop 22 auf einen dritten Eingang des UND-Gliedes 10, Das ODER-Glied 18 sowie das UKD-GIied 7 sind ausgangsseitig mit je einem Eingang eines UND-Gliedes 23 verbunden, dessen Ausgang auf einen Rücksetzeingang eines Flip-Flop 24 geführt ist. Die Detzeingünge der Flip-Flops 21, 22 und 24 sind an einen 3 t euer eingang E₀J, gelegt. Der Ausgang- des UND-Gliedes 7 ist mit ,Ie einem Eingang zweier UND-Glieder 25, 26 verbunden. Ein zweiter Eingang des UlJD-GIiedes 25 ist mit einem ersten Ausgang und ein zweiter Eingang des UND-Gliedes 26 ist mit einem zweiten Ausgang des Flip-Flop 24 gekoppelt. Die Ausgänge der UND-Glieder 25, 26 sind auf zwei Eingänge eines Flip-Flop 27 geführt, dessen Ausgang mit einem Eingang eines UKD-Gliedes 28 in Verbindung steht. Der Ausgang des UND-Gliedes 28·, an dessen zweiten Eingang ein Taktgenerator 29 angeschlossen ist, ist mit einem Zähler 30 verbunden,

Die Videokamera 1, die das Videobild einer zu analysierenden flüssigen teilchenenthaltenden Probe, die агга Gründen der Übersichtlichkeit nicht in der Zeichnung dargestellt ist, für die Abbildung auf dem Bildschirm des Monitors 4 aufnimmt, liefert ein BAS-Signal, dessen Signal-Rausch-Verhältnis in der Filterkette 5 verbessert

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wird. Dieses BAS-Signal wird im Komparator 6 digitalisiert , indem es mit der Referenzspannung U^ verglichen wird, so daß die digitalen BAS-Impuise am U'TD-Glied 7 erscheinen. Im Amplitudensieb 11 v/erden aus dem. in der Trennstufe 2 abgetrennten Videosignal die Synchronimpulse gewonnen und in dem nachfolgenden Impulsverteiler 12 in Bildsynchronimpuls (BSI) und Zeilensynchronimpuls (ZSI) getrennt. Der Z3I wird im Multivibrator 13 zeitverzögert. An den Multivibrator 13 schließen sich die beiden TJultivibratoren 14, 15 mit unterschiedlichen'Verzögerungszeiten an, so daß an den Ausgängen der Multivibratoren 14, 15 jeweils zeitlich nacheinander zwei zeitverzögerte periodische Zeilensynchronimpulse anliegen, die über den Modulator 3 den Monitor 4 hell-dunkel tasten und auf dem Bildschirm des Monitors als zwei vertikale Markierungen sichtbar sind, Die Lage dieser Markierungen ist durch Variation der Zeitverzögerung des LIuIt!vibrators geneinsam und d\irch Variation der Zeitverzögerungen der r.fultivibratoren 14, 15 einzeln veränderbar. Diese vertikalen Markierungen begrenzen die Distanz, die der Zeitmessung für die Teilchen in der su analysierenden Probe zugrunde gelegt wird.

Der Bildsynchronimpuls (B3I) am Ausgang.des Impuls-Verteilers 12 wird durch die Multivibratoren 16, 17 sweimal zeitverzögert, so daß am Ausgang des Multivibrators 17 ein zeitverzögerter periodischer Bildsynchronimpuls (BSI) entsteht, dessen vordere Impulsflanke zeitlich durch den Multivibrator 16 und dessen hintere Impulsflanke zeitlich durch den Multivibrator 17 bestimmt wird. Der zeitversögerte BSI bewirkt ebenfalls über den Modulator 3 und die Hell-Dunkel-Steuerung des Monitors 4 auf dessen Bildschrim eine horizontale Markier rung deren Breite von der Zeitverzögerung des Multivibrators 17 abhängig ist. Durch Variation der Zeitverzögerung durch den Multivibrator 16 kann der Abstand der

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oberen Begrenzungslinie der horizontalen Markierung vom oberen Bildrand des Monitors 4 eingestellt werden. Die drei Markierungen auf dem Bildschirm des Monitors 4 stellen somit einen rechteckigen beliebig einstellbaren Bildausschnitt dar, der zur erfindungsgemäßen Zeitmessung eines Teilchens der Probe verwendet wird, d. h. es wird die Zeit gemessen, die ein ausgewähltes Partikel für das Durchwandern des genannten Bildausschnittes zwischen den zwei vertikalen Markierungen benötigt. Die Zeitmessung erfolgt jedoch nur, wenn sich das Teilchen innerhalb des auch horizontal begrenzten Bildausschnittes bewegt. Die Auswahl, welche Teilchen z, B. durch ihre Größe und Helligkeit elektrophoretisch auswertbar sind, erfolgt durch den Abgleich der Referenzspannung ^u _ref '^De^ der Digitalisierung des BAS-Signals im Komparator 6.

Die in der Zeichnung dargestellte Anordnung wird

durch einen Impuls am Steuereingang E . mit dem Setzen

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der Flip-Flops 21, 22, 24 in Bereitschaft zur Messung gesetzt, was bedienungstechnisch nach Vorbereitung der zu analysierenden Probe erfolgen kann. In dieser Bereitschaf tsstellimg der Anordnung entsteht durch die Verknüpfung der m-TD-Glieder 7, 9, 10 sowie des ODER-Gliedes am Ausgang des ШШ-Gliedes 7 ein Impuls, wenn gleichzeitig der zeitverzöge-rte BSI, einer der beiden zeitverzöger™ ten Zeilensynchronimpul.se sowie ein Impuls des digitali- sierten BAS-Signals auftreten. In diesen Pail wird über das durch den gesetzten Flip-Flop 24 entriegelte UTTD-Glied 25 vom Ausgangsimpuls des UND-Gliedes 7 das Flip-Flop 27 gesetzt, welches die aus dem UND-Glied bestehende Torschaltung entriegelt, so daß die Zählfrequenz des Taktgenerators 29 in den Zähler 30 eingezählt wird« Der nächste unter der obengenannten Bedingung am Ausgang des ÜID-G-Iiedes 7 erscheinende Impuls oetzt über das ODER-Glied 18 sowie das UHD-GIied 23 das Flip-Flop 24 zurück, welches über das UND-Glied 26

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das Flip-Flop 27 rücksetzt. Durch diese Rüclcsetzung de8 Plip-Flops 27 wird das !MD-Glied 28 gesperrt, der Zählvorgang des Zählers 30 wird abgebrochen« Der Zählerstand des Zählers 30 wird digital erfaßt und rechentechniach auf die gewünschte Zeitmessung bezogen ausgewertet. Durch einen erneuten Impuls an Steuereingang E„^ wird die An-Ordnung für die nächste Messung wiederum in Bereitschaft versetzt.

Der Zählvorgang des Zählers 30 wird bei ubersch.re.ite^i einer der beiden vertikalen Markierungen durch ein ausgewähltes Teilchen der zu analysierenden Probe gestartet, Шт zu verhindern, daß der Zählvorgang des Zählers 30 abgebrochen wird, indes ein Teilchen der Probe diejenige vertikale Markierung überschreitet, die ein Starten des Zählers 30 bewirkt hat, wird ab Beginn des Zählvorganges Oilier weitere zeitverzögerte ZSI der entsprechenden Zeitverzögerung unterdrückt. Zu diesem Zweck dient die Verknüpfung des Ausgangs des ШШ-Gliedes 7 mit den Ausgängen der Multivibratoren 14, 15 in den ÜKD-Glieaern 19, 20 und den nachgeschalteten Flip-Flops 21, 22, die mit den UND-Gliedern 9, 10 in Verbindung stehen. Der für den Beginn des Zählvorganges am Ausgang des .UND-Glieöes 7 entstehende Impuls setzt entweder über das UND-Glied 19 das Flip-Flop 21 zurück, oder über das UKD-Glied 20 wird das Flip-Flop 22 rückgesetzt. Welcher der beiden Flip-Flops 21, 22 rückgesetzt wird, ist davon abhängig, ob ein zeitverzögerter ZSI am Ausgang des Multivibrators 14 oder des Kult!vibrators 15 den Zählvorgang ausgelöst hat, d, h. welche vertikale Markierung auf dem Bildschirm des Monitors 4 von einem Teilchen der Probe überschritten worden ist» Je nach Rücksetzen des Flip-Flops 21 oder 22 wird das UUD-. Glied 9 oder das ШГО-Glied 10 gesperrt, d. h. derjenige periodische zeitverzögerte ZSI des Multivibrators 14 oder 15, der den Zählvorgang ausgelöst und ein Setzen

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der Flip-Plops 21 oder 22 sowie 27 bewirkt hat, kann am Ausgang des UTiD-Sliedes 7 keinen Impuls zum Abbrechen des ZählVorganges des Zählers 30 erzeugen. Ein Stoppen des Zählers 30 ist sonit nur durch den anderen zeitverzögerten ZSI віа Eingang eines der nicht durch einen der beiden Flip-Flops 21, 22 gesperrten UliD-Glieder 9, bei gleichzeitigem Vorhandensein des zeitverzögerten BSI sowie eines Impulses des digitalisierten ВАЗ-Signals mögiich,

Den KuItivibratoren 14, 15 sind zur Impulsformung der zeitverzögerten Zeilensynchronimpulse in der Zeichnung nicht dargestellte Impulsformerstufen nachgeschaltet.

Das erfindungsgemäße Meßverfahren ist nicht nur auf die Zeitmessung bei der Anwendung zur Messung der elektrophoretischen Beweglichkeit von in einer flüssigen Probe befindlichen Teilchen beschränkt«

Claims

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Er f i ndu ώ ^s a η sp ru eh

1. Verfahren zur Messung der elektrophoretischen Beweglichkeit von Teilchen, bei aera an eine in einer Elektropboresekammer befindliche Probe eine Spannung angelegt, die Probe mikroskopisch betrachtet, videotechnisch aufgenommen, auf einem Monitor abgebildet und die Zeit geraessen wird, in welcher die jeweils ausgewählten Teilchen der Probe eine vorbestimmte Distanz durchwandern, dadurch gekennzeichnet, daß das bei der videotechnischen Aufnahme der Probe erzeug- ^q Ѣ2 BAS~Signal gefiltert, bei wählbarem Scbvjellvjert digitalisiert und anschließend mit drei gleichseitig zum Monitor gelangenden Impulsen logisch verknüpft tfird, von denen einer durch Zeitverzögerung aus dem Bildsynchronimpuls des BAS-Signals und die anderen z^ei Impulse durch untererschiedliche Zeitverzögerung aus dem Zeilensynchronimpuls des BAS-Signals und die anderen zwei Impulse durch unterschiedliche Zeitverzögerung aus dem Zeilonsynchronimpuls des BAS-Signals gewonnen werden, und daß dos erste der durch die logische Verknüpfung entstandenen Signale, die jeweils bei gleichseitigen] Erscheinen eines der beiden zeitverzögerten Zeilensynchronimpulse, des zeitverzögerten BildsyncLronimpulses und eines Impulses des digitalisierten BAS-Signals auftreten.einen Zählvorgang auslöst, den ein weiteres durch die logische Verknüpfung erzeugte ε Signal stoppt.
2. Verfahren nach Punkt 1, dadurch gekennzeichnet, daß ab Beginn des Zählvorganges der durch einen zeitverzögerten Zeilensynchronimpuls verursacht wurde» jeder zeitverzögerte Zeilensynchronimpuls dieser Zeitverzögerung

OQ und bei Beendigung des Zählvorganges jeder zeitverzögerte Zeilensynchronimpuls unterdrückt wird«
3. Verfahren nach Punkt 1, dadurch gekennzeichnet, daS die zvjei Zeitverzögerungen ds3 jeweils zeitverzögerten Zeileiisyncbronimpulses sowohl gemeinsam als auch einzeln

oc; eingestellt werden*

Hierzu iSsita Zeichnungen