FR2459473A1 - Procede et appareil de mesure de la mobilite electrophoretique des cellules - Google Patents
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Abstract
L'INVENTION CONCERNE LA MESURE DE LA MOBILITE ELECTROPHORETIQUE DE CELLULES EN SOLUTION. ELLE SE RAPPORTE A UN APPAREIL DANS LEQUEL UNE CAMERA 15 DE TELEVISION BALAIE UNE CHAMBRE D'ELECTROPHORESE SUIVANT DES LIGNES EN FORMANT DES IMAGES. CHAQUE LIGNE BALAYEE EST TRAITEE AFIN QU'ELLE INDIQUE LES CELLULES DETECTEES. DEUX IMAGES SONT CORRELEES ET PERMETTENT LA DETERMINATION DE LA VITESSE DES CELLULES DANS LA SOLUTION. DES MESURES SUCCESSIVES DE MOBILITE PEUVENT ETRE INTEGREES AFIN QUE LES RESULTATS SOIENT AMELIORES. UN CIRCUIT 32 INTRODUIT UNE ETIQUETTE A COTE DE CHAQUE CELLULE DETECTEE. APPLICATION A LA MESURE DES MOBILITES ELECTROPHORETIQUES POUR LA DETECTION DES MALADIES MALIGNES.
Description
La présente invention concerne un procédé et un appareil de mesure de la
mobilité électrophorétique
cdes cellules.
Un test utilisé pour la détection des mala-
dies malignes est le test de mobilité électrophorétique des macrophages, et il est décrit dans la littérature, par exemple dans les articles de Field & Caspary, Lancet ii 1337 (1970), British Medical Journal ii 613 (1971); et de Pritchard et al, Lancet ii 627 (1972),
British Journal of Cancer 27.1 (1973).
La mobilité électrophorétique est détermi-
née par mesure du temps qu'il faut à une cellule choisie, dans une solution (par exemple de KCl),pour recouper deux traits séparés par une distance fixe et connue, sous l'action d'une différence de potentiels appliquée
entre deux électrodes placées dans la solution. La pro-
gression de la cellule est observée au microscope, soit seul, soit associé à une caméra et un moniteur de télévision; des cellules dont l'image est focalisée et présentes dans une couche fixe, sont choisiesde façon aléatoire pour la mesure et la différence de potentiels est habituellementinversée pour la moitié des mesures afin que les effets de migration n'aient pas un sens préférentiel. Les mesures de temps sont effectuées par un opérateur qui met en route et arrête un chronomètre. La moyenne d'un nombre aussi important que possible de paires de mesures de temps (une pour
chaque sens de déplacement) est formée d'après la for-
T -T1
mule 100( T) qui donne le pourcentage de ralentis-
sement, T2 étant le-temps moyen correspondant à un
échantillon lorsqu'un antigène est ajouté, et T1 cor-
respondant au temps moyen en l'absence d'une telle ad-
dition. La détermination manuelle de la mobilité est fastidieuse et peut être sujette à des erreurs dues
à la fatigue de l'opérateur.
Un procédé de mesure automatique de la vi-
tesse de particules dans un fluide met en oeuvre la vélocimétrie Doppler à laser dans laquelle le décalage Doppler des radiations du laser réfléchies par les par- ticules mobiles est mesuré et représente la vitesse des
particules. Malheureusement, cette technique est co-
teuse et l'obtention de résultats satisfaisants est difficile. L'invention concerne un procédé de mesure de la mobilité électrophorétique de cellules, comprenant l'application d'un potentiel électrique à une solution placée dans une chambre d'électrophorèse, le balayage ligne par ligne d'une partie de la chambre afin qu'une première image soit formée, le balayage d'une seconde image un temps T plus tard, et la corrélation mutuelle des deux images afin que le déplacement de l'image pendant le temps T et en conséquence la mobilité de plusieurs cellules présentes dans la solution soient
déterminés.
L'invention concerne aussi un appareil de mesure de la mobilité électrophorétique de cellules, comprenant une chambre d'électrophorèse ayant deux
électrodes distantes destinées à appliquer un poten-
tiel électrique à une solution contenant des cellules et séparée des électrodes par des membranes, une caméra à balayage par lignes destinée à former des signaux représentant des images des cellules présentes dans la solution, et un circuit destiné à
assurer la corrélation mutuelle des signaux représen-
tant des images séparées au cours du temps, afin
qu'une mobilité moyenne des cellules soit déterminée.
Dans un mode de réalisation de circuit de corrélation, chaque ligne balayée est traitée afin qu'elle indique le nombre de cellules détectées le
long de cette ligne, et un nombre est ainsi formé.
Une image est alors représentée par une série de nombres. Deux ou plusieurs de ces séries subissent
alors une corrélation mutuelle qui indique le dépla-
cement de l'image.-
Dans un mode de réalisation plus simple, chaque ligne balayée est traitée afin qu'elle indique si une cellule est détectée ou non, et une impulsion unique correspondant à un niveau logique 1 est formée
pour chaque ligne. L'absence de cellule détectée pro-
voque la création d'une impulsion de niveau logique zéro. Ainsi, une image est représentée par une série
de uns et de zéros. Deux séries subissent une corré-
lation mutuelle qui indique le déplacement de l'image.
D'autres caractéristiques et avantages de
l'invention ressortiront mieux de la description qui
va suivre, faite en référence aux dessins annexés sur lesquels: - la figure 1 est une coupe schématique d'une chambre d'électrophorèse; - la figure 2 est une coupe d'une partie de la chambre de la figure 1; - la figure 3 est un diagramme synoptique d'un appareil de mesure de la mobilité des cellules dans la chambre des figures 1 et 2; - les figures 4a à 4d sont des formes d'onde représentant la variation de tensions en fonction du temps; - les figures 5a et 5b représentent les fonctions non intégrée et intégrée de corrélation en fonction du temps le long d'une ligne vidéo; - la figure 5c est un graphique représentant la fonction densité de probabilité de mouvement de
l'image; et -
- la figure 6 est une photographie repré-
sentant des cellules dans une chambre, sur un moniteur
vidéo.
Comme indiqué sur les figures 1 et 2, un appareil d'électrophorèse comporte une chambre 1 formée de verre ayant une partie centrale 2 à côtés plats, deux électrodes 3, 4 placées aux deux extrémités
et deux membranes 5, 6 séparant les électrodes, im-
mergées dans une solution saline 7, de l'échantillon 8 de cellules sanguines en solution (par exemple dans KCl).Un échantillon 8 est transmis à la chambre 1 par des tuyauteries 9, 10 sous la commande de robinets
11, 12.
Lorsqu'un potentiel électrique est appliqué entre les électrodes 3, 4, les cellules migrent d'une
première extrémité de la chambre 1 à l'autre.
L'appareil représenté sur la figure 3 observe et mesure ce déplacement. La chambre est observée par une caméra 15 à balayage par lignes,par exemple une caméra vidéo de télévision, et elle est présentée par
l'intermédiaire d'un circuit 32 d'introduction d'éti-
quettes, sur un moniteur 16 de télévision. L'image obtenue est représentée sur la figure 6 qui indique les cellules sous forme de points sombres 18 ou de points 19 de couleur claire,entourés par un anneau sombre, suivant le côté auquel se trouve la cellule par rapport au plan de focalisation. Les points clairs 19
placés dans un anneau sont intéressants et une étiquet-
te rectangulaire 20 de couleur claire, créée électro-
niquement (comme décrit en détail dans la suite) est
placée afin qu'elle facilite le réglage de l'appareil.
Un détecteur 21 de cellules crée une série de signaux logiques 1 et 0 représentant la détection
des cellules dans une image, de la manière suivante.
La caméra 15 de télévision forme un affichage par balayage par trame des cellules présentes dans la chambre 2 suivant une série de lignes, de manière bien connue, par exemple avec deux trames entrelacées de 312,5 lignes. La direction de balayage des lignes est perpendiculaire au mouvement des cellules. Le signal de sortie de la caméra 15 est un train de signaux
d'amplitude variable, représentant les lignes consé-
cutives de l'image à présenter. 256 lignes adjacentes au total (sur 625) sont choisies pour la formation d'une image unique. Lorsque la caméra 15 balaie une ligne, le signal de sortie de son tube "Vidicon" est de deux formes suivant le type de cellule ba- layée, c'est-à-dire suivant qu'il s'agit d'un point sombre (type indésirable) ou d'un point clair dans un anneau sombre (type voulu). Le signal de sortie du tube de la caméra, pour une partie d'une ligne, est représenté sur la figure 4a sur laquelle un point sombre 18 est représenté par la courbe i, sous forme
d'un seul pic fondamental, et un point clair 19 com-
pris dans un anneau sombre est représenté par la cour-
be ii, avec deux pics. Les deux signaux de ligne de
la figure 4a sont transmis à un circuit 22 de dif-
férentiation qui forme les signaux représentés res-
pectivement par les courbes i et ii sur la figure 4b.
La courbe i de la figure 4b présente un pic négatif suivi par un pic positif alors que la courbe ii de la figure 4b représente un pic positif suivi d'un
pic négatif.
Le signal du circuit 22 de différentiation est divisé et transmis par un détecteur 23 de seuil
négatif et un détecteur 24 de seuil positif. Le si-
gnal de sortie du détecteur 23 déclenche un circuit monostable 25 dont l'impulsion de sortie (à l'état logique 1) a une courte durée. Le signal de sortie du détecteur 24 déclenche un circuit monostable 26 dont la longueur de l'impulsion de sortie est réglée afin qu'elle corresponde au temps prévu entre les
transitions positive et négative du signal de ligne.
Les signaux de sortie des deux circuits monostables et 26 parviennent à une porte intersection 27
dont le signal de sortie commande un circuit mono-
stable 28, suivi d'un basculeur 29. La figure 4d représente ces diverses opérations, les références 24, 25 et 28 désignant les signaux des différents circuits monostables 24, 25 et 28 et les courbes 27 et 29 représentant les signaux de la porte intersection 27 et du basculeur 29 respectivement, comme indiqué pour les signaux i et ii des figures 4a, 4b et 4c. La figure 4c représente la détection des seuils. Ainsi, si le signal de sortie du circuit 22 de différentiation fait apparaître un seuil négatif suivi par la détection d'un seuil positif comme indiqué
par la courbe i de la figure 4c, il n'y a pas coinci-
dence à la porte intersection 27 et aucun signal
n'est transmis par le circuit monostable 28 au bascu-
leur 29. Cependant, lorsque le signal de sortie du circuit 22 fait apparaître un seuil positif suivi de la détection d'un seuil négatif, comme indiqué sur la courbe ii de la figure 4c, il y a coïncidence à la porte intersection 27 et une impulsion à l'état logique 1 est transmise par le circuit monostable 28
et provoque la mise à un du basculeur 29. En consé-
quence, pour chaque ligne balayée, lorsqu'une cellu-
le voulue apparaît (un point clair dans un anneau sombre), le basculeur 29 transmet un signal à l'état logique 1 quel que soit le nombre de cellules cherchées dans la ligne. A la fin de chaque signal de ligne, une impulsion de synchronisation de ligne provenant de la caméra 15 de télévision par l'intermédiaire d'un circuit 31ide séparation de synchronisation,
remet le basculeur 29 à zéro. Le circuit 31 de sépa-
ration transmet aussi une impulsion de synchronisa-
tion de ligne et une impulsion de synchronisation
de trame au circuit 30 de corrélation.
Le signal de sortie du basculeur 29 est ainsi à l'état logrque un et à l'état logique zéro pour chaque ligne de l'image, et la série de uns et de zéros est transmise à un circuit 30 de corrélation mutuelle avec une seconde série de signaux un et
zéro représentant une image ultérieure.
La longueur du signal de sortie du circuit monostable 28 est réglée afin qu'elle suffise pour que,
lorsqu'elle est transmise par un circuit 32 d'intro-
duction d'étiquettes au moniteur 16 de télévision, elle forme une étiquette rectangulaire visible de couleur claire 20. Ainsi, chaque cellule détectée 19 est suivie sur la même ligne par une étiquette visible et elle donne à un opérateur une confirmation du
réglage convenable des seuils et de la synchronisation.
Le circuit 30 de corrélation mutuelle peut être de type câblé, par exemple comprenant un circuit à retard suivi de deux jeux de registres à décalage ou de dispositifs à couplage par charge et de circuits multiplicateurs. Dans une variante, un microprocesseur,
par exemple du type "RCA Cosmac" peut être utilisé.
Le système à microprocesseur met en oeuvre un program-
me mémorisé contenu dans une mémoire morte, il reçoit les données de sortie du basculeur et il les conserve suivant un arrangement ordonné, dans une mémoire à accès direct. A la suite d'un ordre correspondant à une impulsion de synchronisation d'image, 256 de ces éléments de données (représentant une image) sont extraits. Le microprocesseur compte alors un nombre choisi d'images (déterminé par l'opérateur d'après le déplacement prévu de l'image) avant d'accepter 128 autres lignes de données dans sa mémoire à accès direct (les nombres 256 et 128 sont choisis par raison de commodité afin qu'ils donnent une résolution de - 1 ligne de télévision sur 128, soit une précision d'environ 2 %, des chiffres plus grands ou plus petits
pouvant aussi être choisis).
Deux arrangements linéaires de données com-
prenant une majorité de zéros logiques avec quelques uns, représentant les positions des cellules, sont alors extraits. Ces deux arrangements sont comparés élément
par élément, pour les 128 éléments, et ils correspon-
dent à tous les éléments du second arrangement; le
nombre de détections de uns dans les deux arrange-
ments est accumulé par le microprocesseur. Le nombre ainsi formé représente un coefficient de corrélation mutuelle. Le déplacement relatif des deux arrangements
est alors changé d'un élément et le processus recom-
mence. L'opération est poursuivie jusqu'à ce que 128 nombres cumulés aient été formés après 128 déplacements relatifs. La liste de nombres est alors étudiée afin que le nombre le plus grand soit identifié, et la
position de cette valeur maximale est notée et repré-
sente le déplacement le plus probable de l'image par rapport à une référence correspondant à un déplacement nul. Le déplacement est positif ou négatif suivant la polarité fixée par la différence de potentiels. Le résultat peut être tel que représenté sur la figure 5a, et il peut être affiché sur un ensemble 33 d'affichage,
par exemple un oscilloscope ou un dispositif d'afficha-
ge visible.
Une autre paire d'images ou un certain nom-
bre d'autres paires d'images peuvent être traités de la même manière et accumulés par un intégrateur 34 afin que le rapport signal/bruit soit amélioré avant la détermination de la valeur maximale. La figure 5b
représente l'intégration pour 30 paires d'images.
Un déplacement d'image déterminé de cette
manière est ajouté sous forme d'une fonction de den-
sité de probabilité des déplacements conservés dans la mémoire à accès direct du microprocesseur (voir figure 5c) jusqu'à ce qu'un nombre significatif (choisi par l'opérateur) ait été cumulé pour le même décalage, ce nombre étant alors transmis sous forme d'un nombre
n de lignes de télévision de déplacement d'image,cal-
culé pour un écart de M images; si chaque ligne de télévision est étalonnée afin qu'elle représente une distance connue égale à d mètre, dans la cellule d'électrophorèse, la vitesse de déplacement de l'image et en conséquence la vitesse des cellules peuvent être calculées d'après la formule V -3 nd6 m/s x 10 (N+2) + 64 x 10 n dans laquelle 20.10-3 s est la durée d'une image de télévision et 64.10-6 s est la durée d'une ligne de télévision dans le cas d'un système fonctionnant à
Hz (différent du système à 60 Hz utilisé dans cer-
tains pays).
Dans une variante, le basculeur est remplacé par un compteur qui transmet un nombre représentant les
cellules détectées pour chaque ligne balayée. Le cir-
cuit de corrélation peut alors assurer la corrélation
d'une ou plusieurs lignes avec une ou plusieurs li-
gnes ultérieures.
Claims (7)
1. Procédé de mesure de la mobilité électropho-
rétique de cellules, caractérisé en ce qu'il comprend l'application d'un potentiel électrique à une solution placée dans une chambre d'électrophorèse, le balayage ligne par ligne d'une partie de la chambre afin qu'une première image soit formée, le balayage de la chambre
un temps T plus tard afin qu'une seconde image soit for-
mée, et la corrélation mutuelle des deux images afin que le déplacement de l'image pendant le temps T et en conséquence la mobilité de plusieurs cellules dans la
solution,soient déterminés.
2. Appareil de mesure de la mobilité électropho-
rétique de cellules, eu type qui comprend une chambre
(1) d'électrophorèse contenant deux électrodes dis-
tantes (3, 4) destinées à appliquer un potentiel élec-
trique à une solution contenant des cellules et séparée
des électrodes par des membranes (5, 6), ledit appa-
reil étant caractérisé en ce qu'il comprend une caméra
(15) à balayage par lignes destinée à former des si-
gnaux représentatifs des images des cellules dans la solution, et un circuit (30) de corrélation mutuelle des signaux représentant des images espacées au cours du temps afin qu'une mobilité moyenne des cellules soit
déterminée.
3. Appareil selon la revendication 2, caracté-
risé en ce qu'il comporte un dispositif destiné à traiter chaque ligne de balayage de la caméra afin qu'elle forme un nombre représentant le nombre de cellules détectées dans cette ligne qui est destinée
à être corrélée avec une ligne d'un balayage ulté-
rieur pour l'indication de la mobilité des cellules.
4. Appareil selon la revendication 2, caracté-
risé en ce qu'il comprend un dispositif de traitement de chaque ligne de balayage de la caméra afin que la présence d'une ou plusieurs cellules détectées dans cette ligne soit indiquée, une partie au moins d'une il
image étant représentée par une série de signaux logi-
ques un et zéro, destinée à être corrélée à une série
ultérieure pour l'indication de la mobilité des cellu-
les.
5. Appareil selon la revendication 2, caracté-
risé en ce qu'il comprend un circuit (32) d'introduc-
tion d'étiquettes destiné à placer un repère visible
sur un écran de télévision à proximité de chaque cel-
lule détectée.
6. Appareil selon la revendication 2, caracté-
risé en ce qu'il comprend un circuit (34) destiné à
intégrer les résultats de nombreuses mesures de mo-
bilité.
7. Appareil selon la revendication 4, caracté-
risé en ce qu'il comprend un circuit (22) de diffé-
rentiation, des détecteurs (23, 24) de niveaux de seuil,
deux circuits monostables (25, 26), une porte inter-
section (27), un circuit monostable (28) et un bascu-
leur (29).
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