DE3000521A1 - Substanz mit interferon induzierender aktivitaet sowie verfahren zu ihrer herstellung - Google Patents

Description

Andrejewski, Honke & Partner Patentanwd

3Q.0052

walte

Diplom-Physiker

Dr. Walter Andrejewski

Diplom-Ingenieur

Dr.-Ing. Manfred Honke

Diplom-Physiker

Dr. Karl Gerhard Masch

Anwaltsakte:

8l6/to+th.

4300 Essen 1, Theaterplatz 3, Postf. 100254

7. Januar 1980

Patentanmeldung KITASATO KENKYUSHO (The Kitasato Institute) 9-1t Shirokane 5-chome, Minato-ku, Tokyo-to, Japan

Substanz mit Interferon induzierender Aktivität sowie Verfahren zu ihrer Herstellung.

Bei Interferon, welches nachstehend auch als IP oder als virushemmender Paktor bezeichnet wird, handelt es sich um eine Substanz, welche auf tierische Zellen einwirken kann, um das Wachstum eines Virus zu hemmen, wobei es sich um eine von der Zelle entsprechend der Virusinfektion freigegebene Proteinart handelt-Die vir.ozide Aktivität von IP ist in Bezugv auf eine Tierspezies spezifisch, jedoch unspezifisch in Bezug auf eine Virusspezies

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und kann unter für ihre Induzierung unterschiedlichen Bedingungen ; schwanken. Es ist auch bekannt, daß das Wachstum bestimmter tie- j rischer tumorartiger Viren durch IP unter bestimmten Bedingungen | stark gehemmt werden kann.

Eine Substanz, welche zur Induzierung von IF auf tierische Zellen | einwirken kann, wird als Interferon induzierende Substanz bezeich« net. Eine derartige Substanz ist daher von Interesse für-Vorbeu- i gungsmaßnahmen und für die Behandlung verschiedener menschlicher und tierischer Erkrankungen durch Virusinfektion. Allerdings wurden in der Praxis bisher verschiedene bekannte derartige Substanzen niemals für einen derartigen Zweck verwendet, da gewisse schwerwiegende Schäden auftragen. So ist beispielsweise in der US-Patentschrift 3 583 893 (1971) eine doppelsträngige Ribonucleinsäure als Interferon induzierende Substanz offenbart, welche unter Verwendung eines Mikroorganismus hergestellt wird, wobei im Hinblick auf den Stand der Technik darauf hingewiesen wird, daß viele Substanzen wie Bakterien, Viren, Polysaccharide, mitogene Wirkstoffe, Indotoxine und dgl. die Interferonbildung stimulieren, daß jedoch keine für den Routinegebrauch von Interesse ist, und zwar unter anderem wegen der Giftigkeit, der Antigenwirkung und wegen der Infektiösitat. Weitere bekannte Interferon induzierende Substanzen sind beispielsweise in den US-Patentschriften 3 773 924 und 3 884 845 sowie in der japanischen Offenlegungsschrift Kokai Koho 121919/78 beschrieben. Diese Interferon induzierenden Substanzen sind jedoch nicht aus Pflanzen isoliert und man weiß auch, daß aus Mikroorganismen isolierte Interferon induzierende Substanzen im allgemeinen wegen ihrer hohen Giftigkeit für therapeutische Zwecke unvorteilhaft sind.

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Beispiele bekannter mitogener Mittel sind Phytoheinaglutinin (Wheelock, Science, 14? QlO (1965), Pokeweed Mitogen (Friedman et al, Proc.Soc.Exp.Biol.Med., _125:901 (1967) und Concanavalin A (Willen et al. Cell.Immunol., 6:110 (1973)^ welche jeweils aus Geweben zweier in Amerika als "kidney bean" und als "horse beanj bekannter Bohnenarten und aus einer unter dem Namen Pokeweed bekannter Pflanze isoliert wurden. Infolge ihrer extrem niedrigen Aktivität, Interferon zu induzieren, wurde jedoch kein erfolgreicher Versuch gemacht, diese mitogenen Mittel zu Präventivzwecken und zum Heilen verschiedener menschlicher und tierischer Krankheiten infolge VirusInfektionen zu verwenden.

Man kennt auch andere Interferon Induzierende Substanzen^, welche aus Geweben höherer Pflanzen isoliert werden. So geben beispielsweise Kumazawa, Kojima et al (japanische Offenlegungsschrii't Kokai Koho 52107/78) an, daß eine Interferon Induzierende Substanz, von welcher angenommen wird, daß es sich um eine Art von hydropolymerem Saccharid handelt, welche als Hauptbestandteile Hexose (48$), Protein (5$) und Uronsäure (40$) enthält und ein Molekulargewicht von mehr als 10 000 besitzt, aus der Wurzel von Angellica acutiloba Kitagawa (in Japan bekannt als Tokl) durch Extraktion mit heißem Wasser isoliert wird, sodaß eine extrahierte Lösung entsteht, welche der Dialyse unterworfen wird. Dem entstandenen Rückstand wird Azeton zugesetzt, um ein Präzipitat zu erhalten, welches dann gefriergetrocknet wird. In diesem Fall kann, falls gewünscht, die extrahierte Lösung durch Konzentration j unter vermindertem Druck oder durch Verwendung siner Diaflo-Membrane und anschließende Dialyse auf eine geeignete Menge aufgefüllt werden. Als Nächstes beschreiben Kojima und Tamamura

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(japanische Offenlegungsschrift Kokai Koho 99313/7&) eine Inter- \ feron induzierende Substanz mit einem Molekulargewicht von mehr j

als 20 000 (in der Hauptsache mehr als 100 000), welche als Hauptbestandteil eine 1-5 gebundene Glukose (Hexose: mehr als 90$) j enthält, welche dadurch hergestellt wird, daß die Wurzelrinde | eines Maulbeerbaumes wie beispielsweise Morus alba Linne (in Japan als Maguwa bekannt·) oder Morus bombycis Koizdumi (in Japan bekannt

als Yamaguwa) mit heißem Wasser extrahiert wird, der extrahierten ^! Lösung ein organisches Lösungsmittel zugesetzt wird, um ein Präzipitat zu erhalten, und diesem Präzipitat eine geringe Wassermenge zugesetzt wird, die Lösung der Dialyse zur Herstellung eines Rückstandes unterworfen wird und dieser Rückstand dann gefriergetrocknet wird. Dabei kann die Lösung nach der Extraktion und/oder vor der Dialyse erforderlichenfalls durch Konzentration unter vermindertem Druck oder durch Verwendung einer Diaflo-Membrane auf eine geeignete Menge aufgefüllt werden.

Diese beiden Interferon induzierenden Substanzen haben eine geringe Giftigkeit und können leicht hergestellt werden. Der billige und reichlich vorhandene Vorrat der Pflanzengewebe, aus denen die Interferon induzierende Substanz erhalten wird, kann jedoch infolge der fortgesetzten Verwendung dieser Pflanzengewebe über viele Jahre hinweg als Quelle der traditionellen Sino-japanischen Drogen zu Ende gehen.

Die Erfindung hat sich die Aufgabe gestellt, eine Interferon induzierende Substanz mit ausgezeichneten Eigenschaften zu schaffen und ein Verfahren zu ihrer Herstellung zu verwirklichen.

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Die Erfindung basiert auf der Peststellung, daß eine Substanz, welche aus dem Gewebe verschiedener Pflanzen isoliert wurde, welche zum Genus Artemisia der Familie Compositae und ihren Varianten gehören, bei geringer Giftigkeit ausgezeichnete Interferon induzierende Aktivität zeigt. Außerdem kann die aktive Substanz aus den Pflanzengeweben leicht und preiswert isoliert werden.

Gemäß einem Merkmal der Erfindung ist eine Substanz mit Interferon induzierender Aktivität, welche in der Form von amorphem weißlichem Pulver stabil ist, dadurch gekennzeichnet, daß sie in praktisch reiner Form nachstehende physikalisch-chemische Merkmale aufweist:

1) Elementaranalyse:

H: 7/4 + 0,4 #,_C: 45,6 + 0,4 %, N: IJ,5 ± 0,4 %, P: 2,8 + . Q3 #

2) Molekulargewicht:

Ca. 100 000 bis ca. j5 000 000 (hauptsächlich ca. 500 000 bis ca. 1 000 000) .

bestimmt durch Ultrazentrifugieren mit einer Spinco Model E Analytical Ultrazentrifuge (Handelsprodukt der Beckman Instrument Inc., USA), Ultrafiltrieren mit einem Amicon Ultrafilter mit Amicon XM 50, XM lOOA und XM J500-Membranen (Handelsprodukte der Amicon Corp., USA) und UK 50-, UK 100- und UK j500-Membranen (Handelsprodukte der Toy ο Roshi K.K., Tokyo) und Gel-filtrieren mit Sephadex G-200 (Handelsprodukt der Phrmacia Fine Chemical AB, Schweden).

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J>) Schmelz- oder Zersetzungspunkt: Schmelzpunkt unbestimmt. Verkohlt bei etwa 220⁰C.

4) Ultraviolett-Absorptionsspektrum:

Siehe Pig.l (bestimmt in O,1N NaOH), welches in Wasser oder IN NaOH im wesentlichen unverändert ist.

5) Infrarot-Absorptionsspektrum:
Siehe Fig.2 (durch KBr-Methode).

6) Löslichkeit in verschiedenen Lösungsmitteln:

Löslich in Wasser, leicht löslich in wässrigen Lösungen von Natriumhydroxid, Kaiiumhydroxid und Ammoniumhydroxid, im wesentlichen unlöslich in Methanol, Äthanol, Propanol, Azeton, Chloroform und Diäthyläther.

7) Farbreaktion:

Positiv in Ninhydrinreaktion und Dittmer-Reaktion. Negativ in Folin's Reagens und Elson-Morgan-Reaktion.

8) Natur:
Sauer.

9) Chemische Hauptbestandteile:
a) Aminosäuren: (+ O,β %)

Asparaginsäure 9,5 % Serin 4,7 % Prolin 3,1 %

Threonin 4,9 Glutaminsäure 8,4 Glycin 10,2

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Alanin	11,2 £	Valin	6,9 %
Isoleucin	.-.MJi.	Leucin	7,8 #
Tyrosin	Spuren	Phenylalanin	2,9 %
Ammoniak	12,1 #	Lysin	6,2 %
Histidin	1,8*	Arginin	5,3 %
b) Zuckert
Nicht feststellbar.

Die vorhandenen Aminosäuren wurden durch Hydrolyse mit 6N HCl bei 110°C in einer Zeitspanne von 48 h in vaouo und durch nachfolgende Analyse mit Technicon Amino Acid Autoanalyzer Type NC-I (Handelsprodukt, der Technicon Corporation, USA) und der Zucker wurde durch Hydrolyse mit 0,IN Schwefelsäure bei 80°C während einer Zeitspanne von 20 min bezw. mit IN Schwefelsäure bei 100⁰C in einer Zeitspanne von 2 h und anschließende Analyse mit Technicon Sugar Autoanalyzer Type N-I (Handelsprodukt der Technicon Corporation, USA) bestimmt.

10) Optisches Drehvermögen:

|⁶> +37° bis +79° (+76° im Durchschnitt) (c=0,W in 0,IN NaOH).

Biologische Merkmale:

1. Interferon induzierende Aktivität;

Proben der Interferon induzierenden Substanz der Erfindung wurden verwendet, um Interferon in den Zellen und im Serum von Testtieren zu induzieren. Die Aktivität des entstandenen Interferon

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wurde durch die im Versuch 1_ beschriebene Methode bestimmt. Die Resultate dieser Bestimmung gibt Tabelle 1 wieder, welche zeigt, daß die Interferon induzierende Aktivität positiv ist.

Tabelle 1

Konzentration der Probe (/Ug/ml)	10	1,0	2	0,1
Aktivität (in vitro)	P-IOO	>1OO	93
	Tabelle

0,01

Aktivität (in vivo

Kaninchen 1 Kaninchen 2

Blutentnahme in (h) nach Verabreichung 0 12 4 6

55
25

480
230

95
50

Tabelle 2 zeigt die nach der Methode, welche nachstehend im Versuch 1 beschrieben werden soll, bei zwei Kaninchen erhaltenen
Resultate, aus denen sich ergibt, daß die Aktivität ihren Maximalwert zwei Stunden nach Verabreichung erreicht. Durch die im Versuch 1 beschriebene Methode wurde auch bestätigt, daß Interferon im Körper des Testtieres durch die Wirkung der erfindungsgemäßen Interferon induzierenden Substanz induziert wurde.

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2. Stabilität der Interferon induzierenden Aktivität:

Proben von jeweils 1 mg der erfindungsgemäßen Interferon induzierenden Substanz wurden in Wasser (jeweils 1 ml) gelöst und bei 1OO°G für eine gegebene Zeitspanne oder bei einer gegebenen Temperatur für lh erhitzt. Jede Probe wurde dann in gleicher Weise wie im Versuch 1 beschrieben (in vitro-Methode) behandelt und man ι erhielt die in den Tabellen 3 und 4 wiedergegebenen Resultate, ; welche zeigen, daß die erfindungsgemäße Interferon induzierende Substanz gegenüber Hitzeeinwirkung sehr stabil ist.

Heiztemperatur (⁰C)

Tabelle 3

IP-Aktivität bei einer Konzentration der Probe von ( /Ug/ml)

10

1,0

0,1

Unbehandelt

37

80

100

>100 >100 >100 >100 >ioo

•>ioo

>100 >100 >100 ^100

70 75 73 70 75

Erwärmungszeit: 1 h.

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Tabelle

Erwärmungszeit (h)	IF-Aktivität bei	1,0	Probe von	einer
	Konzentration der	>100	0,	( /ug/ml)
	10	>1OO	'70	1 0,01
Unbehandelt	>100	>100	75	< 10
1 1	>1OO	>100	73	< 10
4	>1OO	>1QO	65
8	>100	30	<1O
24	>1OO

Heiztemperatur: 100 C.

J. Akute Giftigkeit:

Männliche und weibliche Mäuse (ddy-Stammj 5 Wochen altj Gewicht 20+1 g; jede Gruppe bestehend aus 10 Mäusen) wurden als Testtiere verwendet. Eine physiologische Lösung von Natriumchlorid, welche die erfindungsgemäße Interferon induzierende Substanz enthielt, wurde den Mäusen verabreicht (ip. oder oral), um die LD,-_n-Werte, von 1 g/kg (ip.) und über 5 g/kg (oral) zu ermitteln. Es ergab sich kein bemerkenswerter Unterschied zwischen den männlichen und weiblichen Mäusen.

4. Anti-Tumor Aktivität:

Mäuse (ddy-Stamm; 5 Wochen alt; Gewicht 20+_l g; jede Gruppe bestehend aus 10 Mäusen) wurden als Testtiere verwendet. In die Achselhöhle eines jeden Testtieres wurde eine Probe von S-l8o Sarcoma solid Tumor (2x2x2 mm) oder Ehrlich ascites tumor (2,5x10

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i Zellen) geimpft. Nach 24 Stunden wurde die Interferon induzierende Substanz der Erfindung (0,2 mg) in Wasser gelöst und jeder Maus
oral verabreicht. Die Verabreichung erfolgte einmal täglich und
wurde I^ Tage lang durchgeführt. Ein bemerkenswerter Anti-Tumor-Effekt wurde beobachtet. ■

Aus den vorgenannten Merkmalen wurde festgestellt, daß es sich i bei der erfindungsgemäßen Interferon induzierenden Substanz um \ \ eine Substanz handelt, welche ein Molekulargewicht von etwa
¹ 100 000 bis etwa 5 000 000 (hauptsächlich etwa 500 000 bis etwa

1 ι

I 1 000 000) besitzt, wobei angenommen wird, daß es sich um eine ; j proteinartige Substanz handelt, welche Phosphorsäure enthält.

j I

¹ Diese Substanz entspricht auch der weitgehend anerkannten Defl- !

; I

j nition irgendeiner Interferon induzierenden Substanz, da sie , I Interferon in tierischen Zellen oder Serum in vivo oder in vitro i I induziert, welches mit 0,08$ Trypsin bei 37⁰C für 2 h inaktiviert
i wird, wobei außerdem die Aktivität der induzierten Substanz in | Bezug auf tierische Spezies spezifisch, Jedoch in Bezug auf Virus-Spezies unspezifisch ist. Daraus ergibt sich, daß die erfindungs- ^{: !} . i

i gemäße Substanz nicht nur eine neuartige Interferon induzierende ! ! Substanz ist, sondern daß es sich auch um eine neue Substanz an ι 1 sich handelt, da keine Substanz mit den gleichen physikalisch- ι

j I

ι chemischen und biologischen Merkmalen wie die erfindungsgemäße
Interferon induzierende Substanz bisher in der einschlägigen
Literatur beschrieben wurde.

J Bei den in der einschlägigen Literatur beschriebenen mitogenen j ! Mitteln mit Interferon induzierender Aktivität (z.B. Phytohäma- ^: ! glutinin, Pokeweed-mitogen und Concanavalin A) handelt es sich I

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beispielsweise um Proteintypen mit Molekulargewichten von über 100 000, welche eine sehr schwache Interferon induzierende Aktivität besitzen, welche bei Erwärmung auf 56⁰C für 5 h inaktiviert wird. Demgegenüber besitzt die erfindungsgemäße Interferon induzierende Substanz andersartige chemische Bestandteile, eine hohe Wärmestabilität selbst bei 100°C für mehrere Stunden und ausgezeichnete Interferon induzierende Aktivität.

Die aus der Tokiwurzel (Angellica acutiloba Kitagawa) isolierte bekannte Interferon induzierende Substanz hat zwar auch ein hohes Molekulargewicht (mehr als 100 000) und ihre Interferon induzierende Aktivität wird nicht inaktiviert, wenn sie auf 100⁰C für 1 h erhitzt wird. Ihre chemischen Bestandteile (Hexose:48$, Uronsäure:4o$, Protein:5$) und das Infrarot-Absorptionsspektrum unterscheiden sich jedoch von den entsprechenden Werten der erfindungsgemäßen Interferon .induzierenden Substanz. Die aus der Maulbeerbaum-Wurzelrinde isolierte bekannte Interferon induzierende Substanz enthält als aktiven Hauptbestandteil eine 1-3 gebundene Glukose (Hexose:96$) und hat ein Molekulargewicht von mehr als 20 000 (hauptsächlich mehr als 60 000), sodaß auch diese Substanz sich von der erfindungsgemäßen Substanz unterscheidet. Außerdem ist die mitogene Aktivität, welche in den bekannten Interferon induzierenden Substanzen gefunden wird, welche von bakteriellem Endotoxin und höheren Pflanzen herstammt, bei der erfindungsgemäßen Interferon induzierenden Substanz sehr schwach.

Verschiedene Pflanzen, welche zum Genus Artemisia gehören und als Ausgangsstoff für das Produkt der Erfindung verwendet werden können, enthalten beispielsweise Absinthin, Anabasinthin, Artemi-

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setin, Paraffin, Cineol, Semicarbazon, 1-camphor, Sesquiterpen, ! Cadinen, Caryophyllen, Sequiterpenalkohol, Artemisia-keton, Isoartemisia-keton, (X -pinen, Camphen, Bornol, Cuminaldehyd, Phenol, Essigsäure, Buttersäure, Hexanol, Benzylalkohol, Methyl- j butyrat, Cuminal, Caryophyllenoxid, Pentacosan, Artemisiaalkohol., ^! /3-pinen, Capillen, Capillon, Santonin, ex -thujon, Monogynin, j Mibulacton, Cerylalkohol, Carnaubasäure, Hentriacontan, Ricosanol,, Vitamine A, B, C, D und andere niedermolekulare Substanzen, wel- ' ehe sieh insgesamt von der erfindungsgemäßen IF-induzierenden j Substanz in Bezug auf die physikalisch-chemischen und biologi- J sehen Merkmale unterscheiden und keine IF-induzierende Aktivität .

aufweisen. I

Die physikalisch-chemischen Merkmale der bekannten in den US-Patentschriften 3 773 924 und J 884 845 sowie der japanischen Offenlegungsschrift Kokai Koho I21919/78 beschriebenen Interferon induzierenden Substanzen entsprechen nicht den Merkmalen der erfindungsgemäßen Interferon induzierenden Substanz.

Die erfindungsgemäße Interferon induzierende Substanz ist von potentiellem Interesse als Medikament zur Verhinderung und zur Behandlung verschiedener Krankheiten, welche durch Viren verursacht werden, wie beispielsweise tierische tumorartige Viren, da ihre Interferon induzierende Aktivität im Vergleich mit bekannten, aus Pflanzengeweben isolierten Interferon induzierenden Substanzen ausgezeichnet ist und da sie gegen tierische Tumor-Viren aktiv ist. Außerdem ist ihre Giftigkeit sehr gering, wenn sie oral an Menschen und Tiere verabreicht wird.

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In verfahrensmäßiger Hinsicht schlägt die Erfindung ein Verfahren zur Herstellung einer Substanz mit Interferon induzierender Aktivität vor, welches dadurch gekennzeichnet ist, daß diese aktive Substanz aus dem Gewebe einer Pflanze des Genus Artemisia der Familie Compositae oder einer Variante derselben, welche diese aktive Substanz enthält, extrahiert wird und die aktive Substanz aus dem dadurch erhaltenen Extrakt gewonnen wird.

Die für das erfindungsgemäße Verfahren geeigneten Pflanzen wachsen in vielen Ländern der Erde in großem Umfange wild oder werden angepflanzt und können auf natürliche oder künstliche Weise die ! verschiedensten Varianten wie Mutanten und Hybriden bilden. Es ! soll etwa ^0, 120 bezw. 60 Spezies in Japan und China, USA bezw. Europa geben, wobei einige dieser Pflanzen seit vielen Jahren z.B. als Nahrungsmittel, Volksdroge oder Rohstoff für die Arzneimittelherstellung verwendet werden. Soweit bekannt, ist jedoch bisher nirgends darüber berichtet worden, daß die Gewebe dieser Pflanzen eine Substanz mit Interferon induzierender Aktivität enthalten.

Alle zum Genus Artemisia gehörenden Pflanzen können für die Zwecke der Erfindung verwendet werden, wenn sie die aktive Substanz der Erfindung enthalten. Nachstehende Pflanzen sind lediglich als Beispiel angegeben:

Artemisia princeps Pamp.;

A. Maritima L.;

A. montana Pamp.;

A. japonica Thun.;

A. stolonifera Komar.j

A. absinthium L.; A. kurramensis Qaz; A. feddei Le" ν. et Van. A. keiskeana Miq.; A. monophylla Kitam.;

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A. stelleriana Bess.; A. vulgaris L.j A. vallesiaca All.; A. ludoviciana Nutt. A. tridentata Nutt. A-. caudata Michx.; A. frigida Willd.; A. campestris L.; und deren Varianten.

A. capillaris Thun.j

A. abrotanum L.;

A. dracunculus L.j

A. arbuscula Nutt.j

A. filifolia Torr.;

A. lindleyana Bess.;

A. biennis Willd.

A. molinieri Quez

Die vorgenannten botanischen Namen sind folgenden Druckschriften entnommen: "Yakuyo Shokubutus Dai Jiten" herausgegeben von Kariyone und Kimura und veröffentlicht von Hirokawa Shoten, Tokyo (1974); "Saishin Yakuyo Shokubutsu" von Kariyone und Kimura und veröffentlicht von Hirokawa Shoten, Tokyo (1978); "Flora of Japan" von Oui und veröffentlicht von Shibundo, Tokyo (1965); "North American Flora", herausgegeben von P.A. Rydberg und veröffentlicht von The New York Botanical Garden, New York (1916), "illustrated Flora of the.Pacific States", vol. IV der Stanford University Press, CA. (I965), "Flora Europaea", vol. 4 herausgegeben von T.G. Tutin u.a. und veröffentlicht von Cambridge University Press, London (I976), und "The Flora of Canada", von H.J. Scoggan und veröffentlicht vom National Museum of Canada, Ottawa (1979)»

j Für das erfindungsgemäße Verfahren können alle Gewebe der Pflanzen verwendet werden. Es können jedoch zusätzliche Arbeitsgänge zur Entfernung der Erde erforderlich sein. Sowohl die Blätter wie die Stengel der Pflanzen enthalten im wesentlichen die gleiche Menge der aktiven Substanz der Erfindung, und die in verschiedenen Geweben einer Pflanze enthaltenen Mengen der aktiven Substanz

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bleiben vor und nach der Blühperiode im wesentlichen unverändert. Zwecks besserer Konservierung und Extrahierung wird vorzugsweise getrocknetes Material verwendet, wenn es auch möglich ist, frisches Material zu verwenden. Zum Trocknen kann jedes gewünschte Verfahren wie beispielsweise Naturtrocknung, Trocknung mit Heißluft usw. angewendet werden. Erforderlichenfalls kann das Material vor der Verwendung auch mit Wasser gewaschen werden.

Die Extraktion kann bei irgendeiner passenden Temperatur, beispielsweise zwischen Raumtemperatur bis zum Siedepunkt der Extraktionsmischung, mit Wasser erfolgen. Da die aktive Substanz der Erfindung besonders in Wasser unter alkalischen Bedingungen (z.B. pH 7-10) löslich ist, wird vorzugsweise der pH-Wert des Wassers vor der Verwendung beispielsweise mit einer geeigneten Pufferlösung wie Natriumhydroxid, Kaliumhydroxid oder Ammoniumhydroxid eingestellt. Die Extraktion kann während einer beliebigen Zeitspanne, gewöhnlich 1-5 Tage bei Raumtemperatur, erfolgen, wobei diese Zeitspanne abgekürzt werden kann, wenn die Temperatur der Extraktion erhöht wird. So kann beispielsweise die Extraktion während einer Zeitspanne von 30 min bis 6 h bei 45-8o°C unter Umrühren erfolgen. Erfindungsgemäß kann man den Hauptteil der im Ausgangsmaterial enthaltenen aktiven Substanz extrahieren (in einigen Fällen mehr als 90$). Allerdings sollte die Anwendung einer übermäßig hohen Temperatur vermieden werden, da hierdurch die Menge an unerwünschten Verunreinigungen wie Pigmenten, niedermolekularen Substanzen usw., die im Extrakt auftreten, erhöht werden kann. Man kann erforderlichenfalls dem extrahierenden Wasser auch einen geeigneten antiseptischen Wirkstoff zusetzen. Die Extraktion kann kontinuierlich oder intermittierend erfolgen, und es kann jedes zweckmäßig erscheinende Verhältnis zwischen dem extrahierenden Wasser und dem Rohmaterial angewendet werden.

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Alternativ ist es auch möglich, die erfindungsgemäße aktive Substanz aus dem Pflanzengewebe mit einem hydrophilen organischen Lösungsmittel wie beispielsweise Methanol, Äthanol, Propanol, Butanol, Azeton und dgl. in irgendeiner zweckmäßigen Menge beispielsweise von 20 bis 80$ zu extrahieren. In diesem Pail kann die Extraktionszeit und die Temperatur beispielsweise 4 h bis 2 Tage bei 4o bis 8o°C betragen. Vorzugsweise erfolgt jedoch die Extraktion mit Wasser, da dies einfacher, sicherer und preiswerter durchgeführt werden kann. Hierbei kann die Extraktion, falls gewünscht, durch Verwendung eines hydrophilen organischen Lösungsmittels trotz der Unlöslichkeit des reinen Produktes der Erfindung in derartigen Lösungsmitteln durchgeführt werden. Die Extraktion unter Verwendung hydrophiler organischer Lösungsmittel kann beispielsweise dann durchgeführt werden, wenn die extrahierte Lösung eine Mischung oder einen Komplex von Substanzen wie beispielsweise Fettsäuren, Steroiden, Proteinen, Mono- oder Polyxacchariden und dgl. enthält. Wenn auch nicht beabsichtigt ist, sich auf theoretische Betrachtungen festzulegen, so darf doch angenommen werden, daß die Extraktion mit derartigen organischen Lösungsmitteln durch die Pufferwirkung ermöglicht wird.

Aus der extrahierten Lösung wird in üblicher Weise der Pflanzenrest entfernt, beispielsweise durch Filterung, Pressen, Zentrifugieren und dgl. Anschließend werden unerwünschte Verunreinigungen wie Pigmente und niedermolekular-gewichtige Substanzen von der entstehenden überstehenden Flüssigkeit (supernatant).entfernt, um die - Gewinnung der aktiven Fraktion zu ermöglichen« Für diesen Zweck geeignete bevorzugte Verfahren werden nachstehend angegeben.

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2Z -vf-

! A) Die überstehende Flüssigkeit wird durch Ultrafilterung fraktioniert, beispielsweise mittels einer geeigneten Membrane, um Substanzen zurückzuhalten, welche ein Molekulargewicht von mehr als 100 000 besitzen, da die erfindungsgemäße aktive Substanz, welche in den Fraktionen vorhanden ist, ein Molekulargewicht von etwa 100 000 bis etwa j5 000 000 (hauptsächlich etwa 500 000 bis etwa 1 000 000) besitzt. Die Ultrafilterung kann unter geeignetem Druck von beispielsweise 0,1 bis 5 kg/cm mittels einer Membrane durchgeführt werden, welche Substanzen mit einem Molekulargewicht von mehr als 100 000 oder 200 000 zurückhalten kann. Die aktiven Fraktionen werden aufgefangen und zusammengefaßt und dann gefriergetrocknet, wobei man braune Pulver enthält.

B) Die überstehende Flüssigkeit wird konzentriert, wenn gewünscht unter vermindertem Druck, und wird mit einem hydrophilen organischen Lösungsmittel wie beispielsweise Methanol, Äthanol, Propanol, n-butanol, Azeton und dgl. bei einer zweckmäßig erscheinenden Konzentration von beispielsweise 40-70 w/v % behandelt, wobei Präzipitate entstehen, welche die aktive Substanz enthalten. Diese Präzipitate werden dann gefriergetrocknet und man erhält ein braunes Pulver.

C) Anstelle des organischen Lösungsmittels kann man der überstehenden Flüssigkeit auch ein Ammoniumsalz wie beispielsweise Ammoniumchlorid, Ammoniumsulfat, Cetylmethylammoniumbromid und dgl. oder ein anorganisches Metallsaltz wie beispielsweise Zinkchlorid, Kupferchlorid und dgl. bei einer zweckmäßigen Konzentration von beispielsweise 20 bis 50 w/v % zusetzen, wobei Präzipitate entstehen, welche dann z.B. unter Verwendung einer· Dialyse-

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Membrane oder eines Ultrafilters, welche Substanzen mit einem :

Molekulargewicht von 5000 bis 10 000 zurückhalten können, ent- I salzt und gefriergetrocknet werden. Man erhält wiederum ein

braunes Pulver. ■

■ - . ι

Es ist möglich, den Hauptteil der im Ausgangsmaterial enthalte- j nen aktiven Substanz zu gewinnen, und zwar in einigen Fällen
über 90$· Dabei ist die Menge an Verunreinigungen, welche im i

braunen Rohpulver enthalten sind, bei Durchführung der Methode J (A) am geringsten, welche auch einfach durchgeführt werden kann. : Außerdem hat sich bestätigt, daß jegliche bemerkenswerte Neben- j wirkung vermieden werden kann, selbst wenn eine große Menge des
nach der Methode (A) erhaltenen Rohpulvers oral an Menschen und
Tiere verabreicht wird, sodaß dieses Rohpulver für orale Verabreichung ohne weitere Reinigung verwendet werden kann. Es ist
darauf hinzuweisen, daß bestimmte Pflanzen des Genus Artemisia
seit vielen Jahren in Japan und China als Nahrungsmittel und als
Volksdroge verwendet werden.

Falls gewünscht, kann das auf diese Weise erhaltene Rohpulver
noch weiter gereinigt werden, und zwar beispielsweise durch
Säulenchromatographie unter Verwendung eines geeigneten Wirkstoffes für die Gel-Filterung oder eines Ionentauschers. Im erstgenannten Fall kann die Elution mit Wasser durchgeführt werden^,
wenn es auch möglich ist, eine geeignete Pufferlösung zu verwenden. Im letztgenannten Fall kann die Elution mit einer geeig- ; neten Pufferlösung durchgeführt werden. Bevorzugte Wirkstoff für \ die Gel-Filterung sind beispielsweise Sephadez G-50 bis G-200^ ; Sepharose 2B bis 6B, Sephacryl S-200 oder S-300 (Handelsprodukte ■ der Pharmacia Fine Chemicals AB, Schweden), Bio-Gel P-J50 bis j

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2H

P-J500, Bio-Gel A (Handelsprodukte der Bio-Rad Laboratories Ltd., USA), Sagavac (Handelsprodukt der Saravac Laboratories Ltd., U.K. und dgl. Bevorzugte Wirkstoffe für die Ionentauscher-Behandlung sind beispielsweise YAE-Sephadex A-25 und A-50 (Cl"-Forra), CM-Sephadex C-25 und C-50 (Na⁺-Form), SP-Sephadex C-25 und C-50 (Na⁺-Form), DEAE-Sephacel (Cl"-Form), DEAE-Sepharose C1-6B (Cl"-Form), CM-Sepharose CL-βΒ (Na⁺-Form) (Handelsprodukte der Pharmacia Fine Chemicals AB, Schweden) und dgl.. Für die Reinigung kann man auch eine geeignete Anionen- oder Kationenaustauschzellulose verwenden. Das auf diese Weise erhaltene Produkt kann bestimmte Verunreinigungen enthalten, obwohl seine Interferon induzierende Aktivität für praktische Zwecke ausreicht. Falls gewünscht, lassen sich die Mengen an Verunreinigungen durch Kombination der vorgenannten Behandlungen weiter herabsetzen.

Eine erfindungsgemäße pharmazeutische Zusammensetzung ist im wesentlichen dadurch gekennzeichnet, daß sie als aktiven Bestandteil eine erfindungsgemäße Substanz der vorbeschriebenen Art zusammen mit einem pharmazeutischen Träger oder Exzipienten enthält. Die Zusammensetzung oder Mischung kann in geeigneter Form für orale, rektale oder parenterale Verabreichung dargeboten werden. So kann beispielsweise die Zusammensetzung oder Mischung für orale Verabreichung fest oder flüssig sein und die Form von Körnern, Tabletten, überzogenen Tabletten, Kapseln, Syrup, Emulsionen, Suspensionen oder Tropfen haben und Träger oder Exzipienten aufweisen, wie sie allgemein in der pharmazeutischen Technik verwendet werden. So können beispielsweise geeignete Tablettier-Exzipienten aus Laktose, Kartoffel- und löslichen Stärken und Magnesiumstearat bestehen.

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Für die parenterale Verabreichung kann der Träger aus einer sterilen parenteral verträglichen Flüssigkeit wie beispielsweise sterilem Wasser oder einem parenteral verträglichen öl wie beispielsweise Arachis-Öl in Ampullen bestehen. Für die Rektal-Verabreichung eignen sich Zäpfchen, wobei der Träger aus einem dafür geeigneten Grundstoff besteht. Vorzugsweise wird die Zusammensetzung oder Mischung in Einsatzmengen formuliert, von denen jede eine feststehende Dosis des aktiven Bestandteils liefern kann. Tablette, beschichtete Tabletten, Kapseln, Suppositorien und Ampullen sind Beispiele geeigneter Formen von Einsatzmengen.

Schließlich schafft die Erfindung noch eine Interferon induzierende Substanz der vorstehend beschriebenen Art in ihrer Verwendung als Medikament.

Die beiliegenden Figuren 1 und 2 zeigen das Ultraviolett-Absorptionsspektrum bezw. das Infrarot-Absorptionsspektrum der aktiven Substanz der Erfindung.

Die Erfindung wird nachstehend anhand einiger Ausführungsbeispiele des weiteren beschrieben, wobei diese Beispiele keinerlei Einschränkung der Erfindung bedeuten.

Beispiel 1

Zunächst wurden getrocknete Blätter (ά kg) von Artemisia princeps Pamp. mit Wasser gewaschen und in 20 1 Wasser bei Raumtemperatur 3 Tage lang stehengelassen, um die Extraktion durchzuführen.

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Anschließend wurde das Ganze mit 6000 U/min 20 min lang zentri- j fugiert, um den Rückstand zu entfernen, welcher zweimal mit Wasser gewaschen wurde, wobei jeweils 5 1 Wasser verwendet wurden.

Die Waschflüssigkeit wurde mit der überstehenden Flüssigkeit zusammengeschüttet. Der Feststoffgehalt der kombinierten Lösungen betrug 138,735 g (Tockenbasis). Die kombinierten Lösungen wurden durch Ultrafilterung mittels eines Ultrafilters (Model UD-6, Han- j delsprodukt der Bio Engineering K.K., Tokyo) mit einer UK-200-

j Membrane (Handelsprodukt 'der Toyo Roshi K.K., Tokyo) fraktioniert, um Substanzen mit einem Molekulargewicht von über 200 000 bei einem Druck von 3 kg/cm festzuhalten, wobei sich ein Rückstand ergab, welcher dann nach Gefriertrocknung ein braunes Pulver,

j und zwar 8,813 g, ergab. Zu Vergleichszwecken wurde die gleiche Behandlung mit einer Membrane durchgeführt, um Substanzen mit einem Molekulargewicht von mehr als 100 000 zurückzuhalten, wobei sich 19,676 g an braunem Pulver ergaben. Zum Vergleich wurde die gleiche Behandlung mit einer XM lOOA-Membrane durchgeführt, um Substanzen mit einem Molekulargewicht von mehr als 100 000 zurückzuhalten. Dabei entstanden 20,835 g braunes Pulver.

In der zweiten Stufe, der Reinigung, wurden 1,5g des ersten Rohpulvers in 5 ml Wasser gelöst und in eine Säule (4,5 χ 70 cm) übergeleitet, welche mit'Sephadex G-200 (einem Wirkstoff für die Gel-Filterung) angefüllt war. Die Elution wurde mit 600 ml Wasser durchgeführt und die ausfließende Flüssigkeit wurde in Fraktionen von jeweils 3 ml aufgeteilt. Die Fraktionen 27-60 wurden aufgefangen und zusammengeschüttet und das Ganze dann gefriergetrocknet^ wobei ein weißliches Pulver (220 mg) entstand.

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-yf-

In der dritten Stufe (weitere Reinigung) wurde dieses Pulver (100 mg) in einer 0,1M tris-HCl-Pufferlösung (5 ml; pH 7,0; 1=0,01) gelöst und in eine Säule (2,5 χ 70 cm) gefüllt, welche mit DEAE-Sephadex Ä-50 (Ionentauscher) angefüllt war. Eine 0,1M ί tris-HCl-Pufferlösung (300 ml; pH 9,0, welche 0,5M NaCl enthielt) j wurde für die Elution verwendet und die ausfließende Flüssigkeit i
in Fraktionen von jeweils 3 ^mi aufgeteilt. Die Fraktionen 15 bis 30 wurden aufgefangen und zusammengeschüttet und das Ganze dann gefriergetrocknet, wobei man ein weißliches amorphes Pulver (62,7 mg) erhielt, welches geringe Mengen an Verunreinigungen enthielt und im wesentlichen die gleiche Interferon induzierende Aktivität besaß wie das zuerst erhaltene weißliche Pulver. Das Endprodukt hatte die vorbeschriebenen physikalisch-chemischen Merkmale und sein hoher Reinheitsgrad wurde durch Ultrazentrifugieren und Elektrophorese bestätigt.

Zu Vergleichszwecken wurden die Interferon induzierenden Aktivitäten der in den einzelnen Stufen dieses Beispiels erhaltenen Substanz in gleicher Weise bestimmt wie im nachstehend erläuterten Versuch 1 (in vitro-Methode), wobei sich nachstehende Resultate ergaben;

Tabelle 5

Stufe Probe (nach)

Aktivität bei einer Konzentration der Probe von ( /ug/ml)

1,0

0,1

1	Extraktion	>100
1	Ultrafilterung	>100
2	Gel-Filterung	>100
3	Ione ntaus ehe r-B eha ndlung	>100
	(Endprodukt)

88	■< 10
>100	93
>100	>100

030030/0691

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Beispiel 2

Es wurde in gleicher Weise wie im Beispiel 1 vorgegangen, wobei jedoch Artemisia capillaris Thun in der Weise extrahiert wurde, daß man die Blätter bei Raumtemperatur 2 h lang in Wasser stehen ließ, dem Wasser IN Natriumhydroxid zusetzte, um den pH-Wert auf 8,5 einzustellen, und dann bei 65⁰C weitere 2 h lang nochmals extrahierte. Die physikalisch-chemischen Merkmale des Endproduktes (6o,2 mg) waren im wesentlichen die gleichen wie bei dem Endprodukt, welches im Beispiel 1 erhalten wurde.

Beispiele 3-26

Die Blätter, Stengel und Saatkörner der in nachstehender Tabelle ' 6 angegebenen getrockneten Pflanzen wurden unabhängig voneinander

wie im Beispiel 1 behandelt. Die in der zweiten Stufe aller Beispiele erhaltenen Produkte wurden unabhängig voneinander in gleicher Weise wie nachstehend im Versuch 1 (in vitro-Methode) behandelt, um ihre Interferon induzierenden Aktivitäten zu bestimmen. Die Resultate zeigt nachstehende Tabelle 6. Die physikalisch-chemischen Merkmale der Endprodukte der Beispiele 3-26 waren im wesentlichen die gleichen wie die des Endproduktes aus dem Beispiel 1.

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. ,. , " "' ".. ." 30100:52

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Tabelle 6 A = Saat; B = Stengel; C = Blätter

Nr. Artemisia Gewebe IF-Aktivität bei einer Konzentration der Probe von ( /Ug/ml) j

10 1,0 0,1

1 A. prlnceps Pamp.

^l 00
>100
>100

>100 >100 >100

2	A.	capillaris Thun.	A	>100	>100	8o
			otd	>100 >1OO	>100 ^100	90 85
5	A.	absinthium L.	A	>1OO	>100	60
			otd	>100	> 100 >100	90 92
4	A.	maritima L.	A	>100	>100	55
			FQO	>100 ?100	>100 >100	8o 85
5	.A.	kurramensis Qaz.	A	>100	>100	8o
			B C	>100 >100	>100 >100	COOC OVJl
6	A.	montana Pamp.	A	> 100	?100	90
			otd	>100 >100	>100 >100	VDVD VJlVJI
7	A.	feddei	A	>1OO	> 100	70
	Le*	v. et Van.	otd	>1OO >100	> 100 > 100	75 70

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-X-

! Nr.

Tabelle 6 (Fortsetzung) A = Saat; B = Stengel; C = Blätter

Artemisia

Gewebe IF-Aktivität bei einer Konzentration der Probe von (/Ug/ml)

10 1,0 0,1

A. japonica Thun.

A
B
C

^100
>100
>100

>100 >100 >100

90 95

A. keiskeana Miq. A

>100
>100

>100 >100 >100

90 90 85

A. stolonifera
Komar.

A
B
C

>100
>100
>100

>100 >100

60 75 70

A. monophylla
Kitam.

A B C

>100
>100
>100

-100 >100 >100

55 70 70

A. stelleriana
Bess.

>100
>100
>100

>100 >100

90 85 90

A. vulgaris L.

>100
>100
>100

^ 100 ;>100 >100

98 99

A. abrotanum L. A

>100

>100 > 100 >100

90 93 95

03003Ö/0699

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Tabelle 6 (Fortsetzung) !

A = Saat; B = Stengel; C = Blätter ;

Nr. Artemisia Gewebe IF-Aktivität bei einer Konzen- :

tration der Probe von ( /Ug/ml) j

10 1,0 0,1 I

15	-	16	A. campestris L.	A	>1OO	> 100	70
		B C	>100 >100	>100 > 100	93 95
17	A. vallesiaca All.	A
		B C	>1OO	> 100 > 100	92 99
18	A. molinieri	A
	Quo z.	B C	>1OO >100	> 100 > 100	νονό ONVJl
19	A. dracunculus L.	A
		B C	>1OO >100	>100 > 100	97 95
20	A. ludoviciana	A
	Nutt.	B C	>100 > 100	>100 > 100	92 95
21	A. arbuscula	A
	Nutt.	B C	>1OO >1OO	>100 >100	ONVD OO ON
A. tridentata	A	> 100	>100	90
Nutt.	B C	> 100 > 100	> 100 >100	93 95

03003Q/G893

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Tabelle 6 (Portsetzung)
A = Saat; B = Stengel; C = Blätter

Nr. Artemisia

Gewebe IF-Aktivität bei einer Konzentration der Probe von (/Ug/ml)

10 1,0 0,1

22	A. filifolia	A	>100 >100	- >100 > 100	.88 94
	Torr.	B C
23	A. caudata	A	^100 > 100	> 100 >1OO	93 95
	Michx.	B C
24	A. lindleyana	A	> 100 >1OO	> 100 > 100	96 97
	Bess.	B C
25	A. frigida	A	> 100 >100	> 100 >100	98 95
	Willd.	B C
26	A. biennis	A	>1OO >1OO	>100 >100	89 90
	Willd.	B C

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j/.

Jit?

Versuch 1

Bestimmung der IF-Induktion mit IF-induzierender Substanz und IF-Bestimmung: (siehe Y. Kojima's Bericht in Kitasato Arch. Med., !

a) IF-Induktion (in vitro):

Ein Kaninchen (Gewicht etwa 1 kg; Neu Seeland Weiß; SPF) wurde durch Herzpunktur getötet und Milz, Knochenmark und Lymphknotenzellen entnommen und zu einer Zellsuspension kombiniert, welche die vermischten Zellen (lO'Zellen) enthielt. Die Masse wurde dann in Proben von jeweils 1 ml aufgeteilt. Vier Proben wurden unabhängig voneinander mit 10, 1,0, 0,1 oder 0,01 yug/ml eines Endproduktes versetzt, welches in gleicher Weise wie im Beispiel 1 beschrieben hergestellt worden war. Die Proben wurden dann 24 h lang bei 25°C gezüchtet und anschließend zentrifugiert. Die entstehenden überstehenden Flüssigkeiten wurden jeweils als Probe verwendet, um die induzierte Interferon-Aktivität zu bestimmen.

b) ' IF-Induktion (in vivo):

Das Endprodukt vom Beispiel 1 (1 mg) wurde in 2 ml Wasser gelöst und in die Ohrvene eines Kaninchens (Gewicht etwa 1 kg; Neu Seeland Weiß; SPF) injiziert. 1, 2, 4 und 6 h nach der Injektion wurde eine Blutprobe von jeweils 2 ml den Testtieren entnommen und das Serum einer jeden Probe wurde vom Blut isoliert und als Probe zur Bestimmung der Aktivität des induzierten Interferon verwendet.

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3 Oi Q; 0:5:21

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c) Bestimmung der IF-Aktivität:

In beiden Methoden (a) und (b) wurde Vesicular-stomatitis-Virus als bedrohlicher Virus eingesetzt, um die Aktivität des induzierten Interferon auf nachstehende Weise zu bestimmen. Eine Einschicht-Kultur der belegten Zellen (lined cells) RK-13 von Kaninchen wurde in eine Flachschale gefüllt und derselben eine vorgegebene Menge der Probe der durch die vorgenannten Methoden (a) oder (b) erhaltenen Lösung zugesetzt. Die Kultur wurde bei 37 C über Nacht unter Zusatz von Vesicular stomatitis Viren als Krankheitsviren bebrütet. Die Interferon-Aktivität wurde aufgrund des Reduktionsverhältnisses von Platten (plaques) bestimmt. Die Einheit der Interferon-Aktivität wird durch eine reziproke Zahl der höchsten Verdünnung der Probe ausgedrückt, welche zur Reduzierung der Zahl von Platten auf 50$ erforderlich ist.

Versuch 2: Definition der Interferon induzierenden Substanz:

Es bestätigte sich, daß die nach den Methoden (a) und (b) hergestellten Proben das Wachstum des Vesicular stomatitis-Virus und des Vaccinia-Virus in den RK-13-belegten Zellen von Kaninchen der gleichen Spezies hemmen, nicht jedoch das Wachstum des Vaccinia -Virus in L-Zellen von Mäusen unterschiedlicher Spezies. Außerdem wurden ihre IF-Aktivitäten nach 2-stündiger Behandlung mit 0,08$ Trypsin bei 37°C inaktiviert. Diese Fakten zeigen, daß die aktive Substanz der Erfindung eine Interferon induzierende Substanz ist.

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Versuch J>:

Im Beispiel 1 wurde die Elektrophorese bei 4⁰C in herkömmlicher Weise durchgeführt, wobei eine im Handel erhältliche Einrichtung (Model AE-2, Handelsprodukt der Toyo Kagaku Sangyo K.K., Tokyo), eine Polyacrylamid-Gel-Platte (Dicke 3 ^mm) ^und eine 0,j5M Borsäure-Pufferlösung (pH &Λ) verwendet wurden. Das entstehende Einzelband zeigte, daß das geprüfte Endprodukt einen hohen Reinheitsgrad hatte.

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Claims (1)

1. Andrejewski, Honke & Partner, Patentanwälte in Essen

   -αϊ-

   Patentansprüche:

   1. Substanz mit Interferon induzierender Aktivität, welche als amorphes weißliches Pulver stabil ist, dadurch gekennzeichnet, daß sie nachstehende physikalischschemischen Merkmale aufweist:

   1) Elementaranalyse:

   H: 7,4 + 0,4 %, C: 45,6 + 0,4 %_s N: 13,5 + 0,4 %, P: 2,8 + o,3 %

   2) Molekulargewicht:

   Ca. 100 000 bis ca. 300 000 (hauptsächlich ca. 500 000 bis ca. 1 000 000), bestimmt durch Ultrazentrifugieren, Ultrafiltrieren und Gel-filtrieren.

   3) Schmelz- oder Zersetzungspunkt: Schmelzpunkt unbestimmt. Verkohlt bei etwa 220⁰C.

   4) Ultraviolett-Absorptionsspektrum: Siehe Pig.l (bestimmt in 0,1N NaOH).

   5) Infrarot-Absorptionsspektrum: Siehe Fig.2 (durch KBr-Methode).

   6) Löslichkeit in verschiedenen Lösungsmitteln:

   Löslich in Wasser, leicht löslich in wässrigen Lösungen von Natriumhydroxid, Kaiiumhydroxid und Ammoniumhydroxid, im wesentlichen unlöslich in Methanol, Äthanol, Propanol, Butanol, Azeton, Chloroform und Diäthyläther.

   ~~ 030030/0699

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   7) Farbreaktion:

   Positiv in Ninhydrinreaktion und Dittmer-Reaktion. Negativ in Polin's Reagens und Elson-Morgan-Reaktion.

   8) Natur: : (+0,6 %) 4,7 % Threonin 4,9 % Sauer. Asparaginsäure 9,5 % 3,1 % Glutaminsäure 8,4 % Serin 11,2 % Glycin 10,2 % Prolin 4,6 % Valin 6,9 % 9) Chemische Hauptbestandteile: Alanin Spuren Leucin 7,8 <?o a) Aminosäuren Isoleucin 12,1 % Phenylalanin 2,9 % Tyrosin 1,8 % Lysin 6,2 % Ammoniak Arginin 5,3 % Histidin

   b) Zucker:

   Nicht feststellbar.

   10) Optisches Drehvermögen:

   M p⁶ = +37° bis +79° (+76° im Durchschnitt) (c = 0,47 % in O,1N NaOH).

   2. Substanz nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß sie in im wesentlichen reiner Form die Merkmale gemäß Anspruch 1 aufweist.

   030030/0699

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   J5. Verfahren, zur Herstellung einer Substanz mit Interferon j induzierender Aktivität, dadurch gekennzeichnet, daß diese aktive Substanz aus einer Pflanze des Genus Artemisia und deren diese aktive Substanz enthaltenden Varianten extrahiert wird und aus dem erhaltenen Extrakt die Substanz gewonnen wird.

   4. Verfahren nach Anspruch J> Pflanze ausgewählt wird aus

   Artemisia princeps Pamp.;

   A. Maritima L.;

   A. montana Pamp.;

   A. japonica Thun.j

   A. stolonifera Komar.;

   A. stelleriana Bess.;

   A. vulgaris L.j

   A. vallesiaca All.;

   A. ludoviciana Nutt.;

   A. tridentata Nutt.;

   A. caudata Michx.;

   A. frigida Willd.;

   A. campestris L.;

   und deren Varianten.

   dadurch gekennzeichnet, daß die

   A. absinthium L.;

   A. kurramensis Qaz;

   A. feddei Löv. et Van.;

   A. keiskeana Miq.;

   A. monophylla Kitam.;

   A. capillaris Thun.;

   A. abrotanum L.;

   A. dracunculus L.;

   A. arbuscula Nutt.;

   A. filifolia Torr.;

   A. lindleyana Bess.;

   A. biennis Willd.;

   A. molinieri Quez.

   5. Verfahren nach Anspruch 3, dadurch gekennzeichnet, daß die Extraktion mit Wasser durchgeführt wird.

   6. Verfahren nach Anspruch 5> dadurch gekennzeichnet, daß die Extraktion bei einem pH-Wert von 7-10 durchgeführt wird.

   0 30030/0689

   30ΧΓ052Τ

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   7· Verfahren nach Anspruch 3, dadurch gekennzeichnet, daß die i Extraktion mit einem hydrophilen Lösungsmittel durchgeführt wird, welches im wesentlichen unfähig ist, die aktive Substanz zu lösen. ' ■

   8. Verfahren nach Anspruch j5, dadurch gekennzeichnet, daß zur Gewinnung eine überstehende Flüssigkeit (supernatant) gebildet wird und diese durch Ultrafilterung in Fraktionen fraktioniert wird, welche die aktive Substanz enthalten.

   9. Verfahren nach Anspruch 8, dadurch gekennzeichnet, daß die Ultrafilterung mittels eines Ultrafilters durchgeführt wird, durch welchen Substanzen mit einem Molekulargewicht von mehr als 100 000 abfilterbar sind.

   10. Verfahren nach Anspruch 3* dadurch gekennzeichnet, daß zur Gewinnung eines überstehende Flüssigkeit (supernatant) gebildet wird und dieser ein hydrophiles organisches Lösungsmittel zugesetzt wird, welches unfähig ist, die aktive Substanz zu lösen, wodurch Fraktionen erzielbar sind, welche die aktive Substanz enthalten.

   11. Substanz mit Interferon induzierender Aktivität, dadurch gekennzeichnet, daß sie nach dem Verfahren gemäß einem der Ansprüche 3 bis 10 hergestellt ist.

   12. Pharmazeutische Zusammensetzung, dadurch gekennzeichnet, daß sie als aktiven Bestandteil eine Interferon induzierende Substanz gemäß Anspruch 11 in Verbindung mit einem Träger oder Exzipienten enthält.

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