DE3019895A1

DE3019895A1 - Plasmaexpander

Info

Publication number: DE3019895A1
Application number: DE19803019895
Authority: DE
Inventors: Toshiji Igarashi; Kunji Naito; Keiichi Nomura
Original assignee: Eisai Co Ltd; Hayashibara Biochemical Laboratories Co Ltd
Current assignee: Hayashibara Seibutsu Kagaku Kenkyujo KK
Priority date: 1979-05-25
Filing date: 1980-05-23
Publication date: 1980-11-27
Also published as: IT8022285A0; SE456316B; SE8003850L; JPS6049164B2; FR2458286B1; GB2052975A; DE3019895C2; GB2052975B; JPS55157513A; IT1130734B; US4370472A; FR2458286A1

Description

HOFFMANN · EITjuJE &

DR. ING. E. HOFFMANN (1930-1976) · DIPL.-I NG. W.EITLE · DR. RER. NAT. K. HOFFMANN - DIPL.-fNG. W. LEHN

DIPL.-ING. K. FDCHSLE · DR. RER. NAT. B. HANSEN ARABELLASTRASSE 4 (STERN HAUS) · D-8000 MONCH EN 81 . TELEFON (089) 911087 · TELEX 05-296T9 (PATHE)

33 521 o/wa

1. EISAI CO., LTD., TOKYO / JAPAN.

2. "HAYASHIBARA BIOCHEMICAL LABORATORIES INCORPORATED,

OKAYAMA-SHI / JAPAN

Plasmaexpander

Die Erfindung betrifft einen Plasmaexpander, dessen kolloidale Komponente aus raffiniertem (gereinigtem) Pullulan mit einer speziell begrenzten Molekulargewichtsverteilung im Bereich von 30.000 bis 90.000 besteht.

Der erfindungsgemässe Plasmaexpander ist zur Vermeidung und Behandlung von Blutungen geeignet.

Der erfindungsgemässe Plasmaexpander kann wiederholt durch intravenöse Injektion einem Patienten mit grosser Sicherheit zugeführt werden, weil das darin enthaltene Pullulan nach der Infusion metabolisiert und im Körper in einem

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solchen Masse zersetzt wird, dass es vollständig durch die Nieren wieder ausgeschieden wird.

Die Nützlichkeit von Plasmaexpandern für die Behandlung von Wunden und bei chirurgischen Eingriffen hat in letzter Zeit zugenommen/ weil immer das Risiko einer möglichen Serumhäpatitis, die durch Bluttransfusion verursacht wird, besteht, und weil Blutkonserven für eine Transfusion oft auch nur begrenzt verfügbar sind. -

Die im Handel erhältlichen Plasmaexpander bestehen aus kolloidalen Bestandteilen, wie modifizierter Gelatine, Dextran oder Hydroxyäthy!stärke, die als "HES" bezeichnet wird.

Die Anforderungen an die kolloidalen Substanzen in Plasmaexpandern sind die folgenden:

(a) Sie sollen eine Molekülargrösse haben, die einen ausreichenden kolloidalen osmotischen Effekt sicherstellt.

(b) Sie sollen in wässriger Lösung einen kolloidalen osmotischen Druck und eine Viskosität in der gleichen Grössenordnung wie Plasma haben.

(c) Sie sollen für den Körper so wenig fremd wie möglich sein und keine toxischen Eigenschaften haben. Beim Einlagern in die Körperorgane und Gewebe sollen sie keine Störungen verursachen und sie sollen aus dem Körper durch Metabolismus und/oder Zersetzung wieder ausgeschieden werden.

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(d) Sie sollen eine ausreichend lange Zeit und

in einerKonzentration im Blut bleiben, um die gewünschte therapeutische Wirkung zu erzielen.

(e) In wässriger Lösung sollen sie keine pyrogenen oder alergischen Reaktionen verursachen. Sie sollen auch keine Überempfindlichkeit durch antigene Eigenschaften verursachen.

(f) Sie sollen keine Agglutination oder Lysis von Erythrocyten verursachen oder die Leukocyten zerstören. Sie sollen im wesentlichen mit den Blutgruppen verträglich sein. '

(g) Sie sollen schliesslich metabolisiert und aus dem Körper in einer solchen Weise ausgeschieden werden, dass sie keine verzögerte Wirkung auf die Funktionen der Körperorgane ausüben, auch nicht nach wiederholter Verabreichung.

Die bisher bekannten Plasmaexpander erfüllen nicht alle die vorerwähnten Bedingungen, weil sie nicht nur als Plasmaexpander wirken, sondern aufgrund einer Akkumulation im Körper während längerer Zeiträume ohne Metabolismus auch toxisch sind.

Die Nachteile der bisher bekannten Plasmaexpander sind insbesondere die folgenden:

(a) Die physikalischen und chemischen Eigenschaften von modifizierter Gelatine sind ungenügend und weil grössere Mengen davon bei einer therapeutischen Verabreichung innerhalb von 2 bis 3 Stunden durch die Nieren ausgeschieden

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werden, dauert die erwünschte plasmaexpandierende Wirkung nicht lange genug an.

(b) Bei der Verwendung von im Handel erhältlichen Dextranzubereitungen als Plasmaexpander, wie Dex-70, das Dextran mit einem Durchschnittsmolekular.gewicht von etwa 70.000 enthält, besteht das Risiko einer Thrombose, weil diese Zubereitung dazu neigt, eine Agglutination von roten Zellen und von Blut in den Gefässen zu verursachen. · . .

(c) Dex-40, eine andere Dextranzubereitungen, die Dextran mit einem Durchschnittsmolekulargewicht von rund 40.000 enthält, wird derzeit sehr häufig angewendet. Aufgrund ihrer kleinen Molekülgrösse wird sie jedoch leicht durch die Harnwege ausgeschieden und leitet dadurch eine osmotische Diurese ein. Deshalb besteht bei wiederholter Verabreichung die Neigung, dass eine osmotische Nephritis auftritt.

Cd)- HEß soll die Molekularanteile mit unterschiedlichen Molekulargrössen enthalten. Nach der Infusion werden die Bestandteile mit kleineren Molekulargewichten leichter durch die Nieren ausgeschieden, während die Bestandteile mit sehr grossen Molekulargrössen unverändert im Blut verbleiben und dadurch Nierenschäden eintreten können.

Es besteht daher ein Bedürfnis nach neuen Plasmaexpandern, die die gewünschten therapeutischen Eigenschaften ohne die unerwünschten Nebenwirkungen haben. Durch gründliche Untersuchungen, insbesondere von Pullulan, wurde nun

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überraschenderweise gefunden, dass Pullulan mit einem mittleren Molekulargewicht (Mw) im Bereich von 30.OOO bis 90.000 ein ausserordentlich wirksamer und sicherer Plasmaexpander ist.

Pullulan mit dem vorerwähnten Molekulargewicht zeigt bei einer Infusion in den Körper in Form einer wässrigen Zubereitung in einer Konzentration von 4 bis 1O % (w/v) eine bemerkenswerte plasmaexpandierende Wirkung mit fast keiner Akkumulation im Körper. In diesem Zusammenhang ist festzuhalten, dass Pullulan mit den vorerwähnten verhältnismässig grossen Molekulargrössen etwas schwieriger durch die Glomeruli der Nieren ausgeschieden wird, aber enzymatisch im Körper metabolisiert wird.

Pullulan wird im allgemeinen durch Kultivierung von Aureobasidium pullulans in einem Nährmedium, welches Zuckersubstanzen, die sich von Stärke ableiten, enthält ,durch de-: ren Hydrolyse gebildet. Das so- erhaltene Pullulan ist ein ob -Glukan mit breiter Molekulargewichtsverteilung und besteht aus Maltotrioseeinheiten, die in o(/~1 ,6-Stellung durch Kopf-an-Schwanz-Bindung verbunden sind.

Das spezielle Pullulan mit der vorerwähnten engen Molekulargewichtsverteilung gemäss der Erfindung kann erhalten werden, indem man entweder während der Kultivierung des Aureobasidium pullulans in dem zuckerhaltigen Nährmedium die Bedingungen überwacht, wie dies in der japanischen Patentveröffentlichung 42199/76 beschrieben wird. Man erhält es auch durch Teilhydrolyse von üblichem Pullulan, das eine Vielzahl von Molekulargewichten, die oberhalb oder unterhalb des erfindungsgemässen liegen, enthält,

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wobei man für die Hydrolyse eine Säure, wie Salzsäure, Schwefelsäure, Oxalsäure oder eine ähnliche Säure verwendet. Weiterhin erhält man es durch eine Teilungsmethode, bei welcher_:übliches Pullulan mit einem wassermischbaren organischen Lösungsmittel, wie Methanol, Äthanol, Aceton oder Isopropanol fraktioniert wird, und schliesslich kann man ein übliches Pullulan durch Absorption ehromatografiseh trennen oder auch durch Ultrafiltration.

Die Fraktionierung von rohem Pullulan durch Behandlung mit einem wassermischbaren organischen Lösungsmittel ist gegenüber den anderen Methoden wegen ihrer Einfachheit besonders empfehlenswert.

Diese Methode wird einfach durchgeführt, indem man eines der vorerwähnten wassermischbaren organischen Lösungsmittel zu einer 5 bis 20 %-igen wässrigen Lösung handelsüblichen Pullulans. gibt, das z.B. eine Molekulargewichtsverteilung hat, die breiter ist als das gereinigte Pullulan gemäss der Erfindung, wobei man eine wässrige Mischung erhält, die ungefähr 20 bis 50 % (v/v) des organischen Lösungsmittels enthält. Der untere Teil der Säule der wässrigen Mischung wird verworfen und der obere Teil wird gewonnen" und zu der gewonnenen wässrigen Mischung gibt man das gleiche Lösungsmittel wie zuvor hinzu und zwar in einer ausreichenden Menge, um eine wässrige Mischung zu erhalten, die annähernd 40 bis 70 % (v/v) des organischen Lösungsmittels enthält. Aus der wässrigen Mischung wird dann schliesslich der untere Teil gewonnen, der das gewünschte Pullulan enthält.

Indem man eine der vorerwähnten Methoden für die Fraktionierung

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von. rohem Pullulan anwendet, kann man Pullulanfraktionen mit den höheren Molekulargewichten in dem Bereich der vorliegenden Erfindung selektiv isolieren und für die. Zwecke der Erfindung sammeln. Dies ist wesentlich, denn ein Pullulan mit einem Molekulargewicht von unterhalb 30.000, das der unteren Grenze des vorerwähnten Bereiches entspricht, bleibt bei intravenöser Verabreichung im Blutkreislauf nur eine beschränkte Zeit und übt auch nur eine kurze plasmaexpandierende Wirkung aus, während Pullulan mit einem Molekulargewicht oberhalb 90.000, also entsprechend der oberen Grenze des vorher erwähnten Molekulargewichtsbereiches bei intravenöser Verabreichung dazu neigt, im kardiovaskulären System eine nicht erwünschte physikalische Belastung zu erzeugen. Keiner dieser Nachteile tritt jedoch auf, wenn man Pullulanfraktionen mit dem speziellen Molekulargewichtsbereich für die Infusion verwendet.

Man kann pharmazeutische Zubereitungen gemäss der Erfindung für intravenöse Infusionen mit einem Gehalt von annähernd 4 bis 10 % (w/v) an der vorerwähnten spezifischen Pullulanfraktion herstellen, indem man z.B. das Pullulan in isotonischem Wasser unter Bildung einer wässrigen Lösung löst, die das Pullulan in der vorerwähnten Konzentration enthält, worauf man dann die Lösung sterilisiert. · . " .

Ähnliche pharmazeutische Zubereitungen erhält man entweder, indem man gleichzeitig das. spezifische Pullulan in einer bestimmten Wassermenge und einem isotonischen Mittel löst, wobei beide in solchen Mengen angewendet werden, die den im vorhergehenden Absatz angegebenen entsprechen, oder indem man zuerst Pullulan und dann das isotonische

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Mittel in einem bestimmten Wasservolumen löst oder umgekehrt, wobei beide Substanzen in äquivalenten Mengen angewendet werden, um die vorerwähnten Konzentrationen zu erzielen. In beiden Fällen werden die gebildeten wässrigen Lösungen dann sterilisiert.

Als isotonische Mittel für die vorerwähnten Zwecke können Natriumchlorid, Ringer's-Lösung, zu der Essigsäure gegeben wurde, Glukose, Natriumchlorid im Gemisch mit Glukose, Sorbit, Xylit und dergleichen erwähnt werden.

Bei der Herstellung der vorerwähnten therapeutischen Zusammensetzungen ist es empfehlenswert, Pyrogen aus dem spezifischen Pullulan durch Behandeln mit Aktivkohle zu entfernen. ■

Nachfolgend werden Untersuchungen über die Toxizität bei dem spezifischen, erfindungsgemäss verwendeten Pullulan beschrieben.

Verschiedene Zubereitungen, die in der vorerwähnten Weise hergestellt worden waren und die bestimmte Mengen an gereinigten Pullulanfraktionen in physiologischer Kochsalzlösung in einer Konzentration von 4 bis 10 % (w/v) enthielten) wurden getrennt in die aurikularen Venen von Kaninchen in Mengen von 30 bis 40 ml/kg in einem Zeitraum von 20 bis 60 Minuten eingeleitet. Dabei wurden keine merklichen Unregelmässigkeiten im Blutdruck oder im Herzschlag der Versuchstiere festgestellt.

Bei einem analogen Tierversuch, bei dem man Infusionszubereitungen verwendete , die Pullulanfraktionen mit einem

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mittleren Molekulargewicht von etwa 90.000 enthielten, wurde dagegen eine merkliche Äbnormalität im Blutdruck bei den Versuchstieren festgestellt.

Bei einem weiteren Tierversuch, bei dem man zwei Gruppen von Kaninchen verwendete, die jeweils aus 5 Tieren bestanden und bei denen man jeweils 40 ml/kg von zwei Zubereitungen der Pullulanfraktionen in Konzentrationen von 6 % (w/v) in physiologischer Kochsalzlösung einleitete und zwar einmal täglich während 7 aufeinanderfolgenden Tagen, enthielt eine Zubereitung gereinigtes Pullulan mit einem Mw von 33.000 und die andere gereinigtes Pullulan mit einem Mw von 40.000. Als Ergebnis des Versuches wurde festgestellt, dass keines der Tiere eine verminderte Nahrungs- oder Wasseraufnahme oder andere Anzeichen für Toxizität, wie ein Körpergewichtsverlust, zeigte.

Die wünschenswerten therapeutischen Wirkungen der die spezielle Pullulanfraktion enthaltenden Zubereitungen werden nachfolgend aufgrund von pharmakologischen Untersuchungen und anhand der Zeichnungen näher erläutert, worin bedeuten:

Fig. 1-1 eine grafische Darstellung der Veränderung

im Verlaufe der Zeit des Polysaccharidgehaltes ; im Serum der Kaninchen, denen 30 ml/kg

des jeweiligen Plasmaexpanders einmal täglich an 7 aufeinanderfolgenden Tagen verab-' reicht worden war.

Fig. 1-2 ist eine grafische Darstellung der Veränderungen im Verlaufe der Zeit der hämatokritischen Werte des Blutes von Kaninchen, -

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* denen 30 ml/kg des jeweils bezeichneten Plasmaexpanders -, der der gleiche wie in Fig. T-T war, einmal täglich während 7 aufeinanderfolgenden Tagen verabreicht wor- > ._-,- den war.

Pig. 2 zeigt den Verdünnungsgrad (%) im Ablauf

JV der Zeit mit den angegebenen verschiedenen - ■"'■■; ν Plasmaexpandern im Blut von Kaninchen, denen 40 ml/kg des Pläsmaexpanders einmal' täglich während 7 aufeinanderfolgender Tage verab-. . reicht worden war. ·

Fig. 3 zeigt die Molekülargewichtsverteilung von

drei speziellen Pullulanen, die für die Tierversuche verwendet wurde, um den Molekularabbau und/oder die Zersetzung im Körper zu untersuchen. Die verwendeten Puliulane hatten die jeweils angegebenen speziellen Molekulargewichte.

Fig. 4 ist eine grafische Darstellung der Moleku- : largewichtsverteilung der im 24-Stunden-Urin

enthaltenen Polysaccharide, und zwar bei Kaninchen, denen die drei speziellen Pullu-. . lanzubereitungen jeweils infusioniert wurden.

Fig. S-I und 5-2 zeigengrafisch die Menge der Polysaccharide als Molekularabbau- und -zersetzungsprodukte von echten Pul-40 und Dex-40, die - beide ein Mittelmolekulargewicht von 40.000

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haben, wobei diese Substanzen mit Hilfe von Nierenhomogenat und Lungenhomogenat von Ratten kultiviert wurden. Ein Blindtest für die Kontrolle ist in diesen Figuren gleichfalls eingezeichnet worden.

Fig. 6 und 7 zeigen grafisch Fraktionierungseluierungskurven, die bei Sephadex G5O-Säulen (Durchmesser 0,9 cm, Länge-10 cm) von Polysacchariden, die bei der vorerwähnten Kultivierung von Pul-40 und Dex-40 erhalten wurden. Die Beziehung zwischen der Fraktionszahl und der angenommenen Molekulargrösse wird durch "d" gezeigt. Ebenfalls sind in diesen Figuren die Ergebnisse eines Blindversuches als Kontrolle gezeigt. .

Fig. 8 zeigt grafisch die Veränderung der hämato-

kritischen Werte im Blut von Kaninchen, denen jeweils 40 ml/kg von vier bestimmten Plasmaexpanderzubereitungen gegeben.wurden und zwar einmal täglich während 7 aufeinanderfolgenden Tagen, im Ablauf der Zeit (Tage).

Fig. 9 zeigt grafisch die Veränderungen von Plasmaglutamyloxalotransaminase (GOT)-Werten im. Blut von Kaninchen, denen vier bestimmte PlasmaexpanderZubereitungen in einer Menge von 40 ml/kg einmal täglich während 7 aufeinanderfolgenden Tagen gegeben worden waren, im Ablauf der Zeit (Tage). Gleichzeitig wer- ;- den auch die Ergebnisse von Blindversuchen in der Figur gezeigt.

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Die Werte in den Fig. 1 bis 9 wurden durch die nachfolgenden pharmakologisehen Versuche gewonnen:

(a) Versuche hinsichtlich der Wirkung des Plamsaexpanders aufgrund ihrer Zurückhaltung im Körperblut.

Zwei 5 % (w/v) Pullulanzubereitungen in physiologischer Kochsalzlösung wurden hergestellt, von denen die eine raffiniertes Pullulan mit einem mittleren Molekulargewicht von 50.OOG (Pul-50) enthielt, während die andere raffiniertes Pullulan mit einem Mw von 85.000 (Pul-85) enthielt.

Gleichzeitig wurden für Vergleichszwecke eine 6 %-ige (w/v) Dextranzubereitung und eine 1Q %-ige (w/v) HES-Zubereitung hergestellt, beide auch in einer physiologischen Kochsalzlösung, wobei die erstere Dextran mit einem Mw von 40.000 (Dex-40) und die letztere HES mit einem Mw von 200.000 (HES-200) enthielt.

Vier Kaninchengruppen, wobei jede Gruppe aus drei männlichen Tieren mit einem Durchschnittskörpergewicht von 2,7 kg bestand, wurden die vorerwähnten vier Zubereitungen jeweils einzeln eingespritzt. Die Infusionen wurden mit jeweils 75 ml der jeweiligen Zubereitung während 20 Minuten durch die aurikularen Venen bei den jeweiligen Tieren vorgenommen.

Nach Beendigung der Infusionen wurde den Tieren periodisch Blut entnommen und der Polysaccharidgehalt und die hämatokritischen Werte im Serum des Blutes wurden bestimmt.

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Die Bewertung des Polysaccharidgehaltes wurde nach der bekannten Ausfällungsmethode in Äthanol als Fällungsini ttel vorgenommen.

In Fig. 1-1 sind die jeweiligen Daten für die verschiedenen Polysaccharidgehalte .(%) mit dem Ablauf der Zeit (Stunden) aufgetragen, wobei die jeweiligen Werte unmittelbar nach Beendigung der Infusion 20 Minuten lang als Standardwerte von "100 %" angegeben sind. Ein Vergleich der Kurven zeigt, dass der Kurvenverlauf bei den Infusionen mit der 5 % Pul-50 und Pul-85 Zubereitung sehr ähnlich denen sind, die man mit der 6 % Dex-40 und 10 % HES-200 Zubereitung erhalten hat.

In Fig. 1-2 werden andererseits die jeweiligen Daten, die man bei den mit der Blutzentrifuge erhaltenen Werten im Ablauf der Zeit (Stunden) erhielt grafisch dargestellt, wobei die Werte 20 Minuten nach Beendigung der jeweiligen Infusion der vier Zubereitungen gemessen worden sind.

Die Erniedrigung der Hämatokrit-Werte (Blutzentrifugenwerte) wenn die Polysaccharide im Blut verbleiben, z.B. durch Infusion eines Plasmaexpanders, zeigt die Erhöhung der Blutplasmamenge im Blut an.

Aus den Daten in Fig. 1-2 bezüglich der mit der Blutzentrifuge gemessenen Werte wird ersichtlich, dass die plasmaexpandierende Wirkung durch die beiden 5 %-igen Pullulanzubereitungen ebenso wie bei der Dex-40 und 10 % HES-200 Zubereitung 6 Stunden nach Beendigung der Infusion anhielt mit einem Ansteigen, entsprechend ungefähr einer 7 %-igen Expansion des Plasmas auf Basis der Plasmawerte, die man vor den Infusionen gemessen hatte.

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(b) Untersuchungen über die Äusscheiäungsfähigkeit der Plasmaexpander nach der Infusion in einem Körper.

Es wurde bestätigt, dass die Ausscheidung der infusionierten kolloidalen Substanzen in den Plasmaexpandern durch die Nierenkanä.le_/ die nach einer gewissen Zeit nach Beendigung der Infusion stattfindet, hauptsächlich von der Grosse des Molekulargewichtes der kolloidalen Substanzen abhängt.. ;

.Aufgrund dieser Überlegungen wurde der nachfolgende Versuch durchgeführt# um das Ausscheidungsverhalten des infusiönierten Plasmaexpanders aus dem Körper zu untersuchen und zwar der beiden Pullulanzubereitungen, die jeweils Pul-33 bzw. Pul-40 enthielten und der anderen beiden Zubereitungen als Kontrolle, die jeweils Dex-40 und HES-200 enthielten. Die in den ersten beiden Zubereitungen enthaltenen Pullulane hatten engere Molekulargewichtsverteilungen, insbesondere gegenüber HES-2OÖ.

Pul-33 mit einem Mw von 33.00 und Pul-40 mit einem Mw von 40,000 wurden getrennt in physiologischen Kochsalzlösungen gelöst, unter Bildung einer 6 %-igen Pul-33 bzw. einer 6 %-igen Pul-40 Zubereitung.

In gleicher Weise wurden in physiologischen Kochsalzlösungen eine 10 %-ige Dex-40 und eine 6 %-iges HES-200 Zubereitung hergestellt. Das verwendete Dex-40 hatte ein Mw von 40.000 und das verwendete HES-200 .einen Mw von 200.000.

Zwanzig, männliche Kaninchen wurden in vier Gruppen von jeweils fünf Tieren unterteilt, wobei jedes Tier.ein

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Durchschnittskörpergewicht von 2,6 kg hatte.

Den Tieren einer jeden Gruppe wurde getrennt eine der vorerwähnten vier Zubereitungen in einer Dosis von 40 ml/kg einmal täglich während 7 aufeinanderfolgenden Tagen intravenös verabreicht. Während und nach der Infusionszext wurde das Blut periodisch von den Tieren entnommen und der Gehalt an in den Blutseren enthaltenen Polysacchariden wurde durch Zugabe von Äthanol durch Ausfällen bestimmt. Die Ergebnisse dieser Versuche wurden ausgedrückt als Verdünnungs-oder Verbrauchsgrad (%) , bezogen auf die ursprünglichen Mengen an Polysaccharid in den Seren,, die denen der wesentlichen Bestandteile in den jeweils verab- ^s reichten Zubereitungen entsprechen. Die Werte für die berechneten Verdünnungen sind grafisch in Fig. 2 aufgezeichnet.

Aus Fig. 2 wird ersichtlich, dass 24 Stunden nach der Beendigung der Gesamtinfusion bei Pul-33 eine etwa 95 %-ige Verdünnung vorlag und bei Pul-40 eine etwa 85 %-ige Verdünnung. Ähnliche Verdünnungsgrade wurden im Verlauf der gesamten Infusionen beobachtet, wobei eine 100 %-ige Verdünnung nach 8 Tagen nach der letzten Infusion bei beiden Pullulanen festgestellt wurde. ■

Dagegen wird aus Fig. 2 ersichtlich, dass während der gesamten Infusion bei Dex-40 eine etwa 65 bis 67 %-ige Verdünnung der infusionierten Mengen eintrat und dass selbst nach 15 Tagen nach der letzten Infusion nur eine etwa 80 %-ige Verdünnung vorlag.

Weiterhin ist erkennbar, dass bei den infusionierten HES-200

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ein schlechterer Verbrauch, nämlich eine etwa 50 bis 55 %-ige Verdünnung im Laufe der Infusionen und nur eine etwa 50 %-ige Verdünnung nach 36 Tagen nach der letzten Infusion stattfand.

Ausser den vorerwähnten Untersuchungen wurde bestätigt, dass in den im Verlauf der vorerwähnten Infusionen von den jeweiligen Kaninchen im ausgeschiedenen Urin festgestellten Mengen an Polysaccharid bei den Kaninchen, die die"HES-200 Zubereitung erhalten hatten nur etwa 50 % der Menge an Polysaccharid entsprach, die aus den Urinen der Tiere gewonnen wurde, denen Pul-33 und Pul-40 Zubereitungen bzw. die Dex-4Ö Zubereitung verabreicht worden 'waren. . .

Aus diesen Tatsachen lässt sich eine überlegene Ausscheidungsfähigkeit für die gereinigten Pullulane, wie Pul-33 und Pul-40, im Vergleich zu den bekannten Plasmaexpandern, wie Dex-40 und HES-200 feststellen.

(c) Molekularabbau und Zersetzung von Pullulan.

(I) Untersuchungen über den Molekularabbau und die Zersetzung von Pullulan, das Kaninchen infusioniert wurde.

Jeweils 100 ml von drei 5 %-igen (w/v) Zubereitungen, die jeweils in einer physiologischen Kochsalzlösung als Pullulanfraktionen mit mittleren Molekulargewichten von : 33.000, 50.000 bzw. 85.000 enthalten waren, wurden Kaninchen mit einem Durchschnittskörpergewicht von 3 kg während 20 Minuten infusioniert. Der 24 Stunden nach der Infusion ausgeschiedene Urin wurde bei den Tieren jeweils einzeln gesammelt. Aus den Urinen wurden die Proteine

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entfernt und die Polysaccharide darin wurden durch Zugabe des 5-fachen Volumens an Aceton zu dem jeweiligen Urin ausgefällt und gesammelt.

Die Molekulargewichtsverteilung der drei Pullulanfraktionen in den drei erwähnten Pullulanzubereitungen werden in Fig. 3 gezeigt, wogegen die Molekulargewichtsverteilung der aus den Urinen gewonnenen Polysaccharide in Fig. 4 gezeigt wird. -

Aus Fig. 4 wird erischtlich, dass der Kurvenverlauf untereinander unabhängig von der Grosse der Durchschnittsmolekulargewicht-ebei den ursprünglichen Pullulanfraktionen sehr gleich ist und weiterhin, dass die meisten Polysaccharide Molekulargewichte von weniger als 6Ό.Ο0Ο aufwiesen.

Aus diesen Untersuchungen wird ersichtlich, dass die raffinierten Pullulanfraktionen _r wie die vorerwähnten, allmählich im Körper zu Polysacchariden mit verhältnismässig kleinen Molekulargewichten aufgebaut werden, die dann leicht durch die Nierenkanäle in den Urin abgegeben werden.

(II) Untersuchungen über den Metabolismus und die Zersetzung von raffiniertem Pullulan mit Hilfe von aus den Körperorganen isolierten Geweben.

Der Metabolismus und die Zersetzung des raffinierten Pullulans, wie sie durch aus Körperorganen isolierten Geweben verursacht werden, wurden unter Verwendung von raffiniertem pulverförmigen Pullulan mit einem Mw 40.000 (Pul-4O) und pulverförmigern Dex-4O zum Vergleich untersucht. Beide pulvrige Substanzen wurden einzeln mit einem

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50?%-Igen (w/v) Nierenhomogenat vermischt und andererseits mit einem 25 %—igen (w/y) Lungenhomogenat. Diese Homogenate waren aus den Organen von Ratten hergestellt worden. Vier Mischungen wurden 24 Stunden bei 37 C inkubiert. Gegen Ende der Inkubierung betrug die Menge an Polysacchariden in den Inkubationsmischungen 0,5 % (w/v). Dann wurden aus den inkubierten Mischungen die abgeschiedenen Proteine entfernt und die entstehenden vier klaren überstehenden Schichten wurden in jeweils fünf Aliquote aufgeteilt.

Zu vier Aliquoten der jeweils fünf Aliquoten wurde jeweils 1 ml einer Äthanol:Wasser-Mischung im Anteil (v/v) von 45:55;, 55:45, 65:35 bzw. 75:25 in dieser Reihenfolge zugegeben. Diese fünf Aliquote wurden von einem der vorerwähnten vier klaren überstehenden Schichten gebildet. Die gewählte überstehende Schicht wurde mit Hilfe des NIerenhomogenäts aus der vorerwähnten Inkubierung von Pul-40 gewonnen. Zu' dem verbleibenden Aliquot wurden 2 ml absoluter Äthanol anstelle einer der vorerwähnten Äthanol: Wasser-Mischungen gegeben.

Alle-die in den fünf Aliquoten gebildeten Niederschläge und die darin enthaltenen Polysaccharide waren voneinander verschieden und wurden mittels einer Zentrifuge getrennt und gewonnen. In der Zentrifuge v/urde eine Mutterlauge des Aliquots, zu dem 2 ml absolutes Äthanol gegeben worden war, gewonnen und bis zur Trockne verdampft, um den Rückstand zu gewinnen, der zusätzliches Polysaccharid enthalten könnte. Der erhaltene Rückstand wurde dann zu den Hauptniederschiägen, die man beim Zentrifugieren der jeweiligen Aliquote erhalten hatte, gegeben.

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Die Menge an Polysaccharid in dem jeweiligen Niederschlag wurde quantitativ durch die Anthron-Schwefelsäure-Methode bestimmt»

Die gleiche Verfahrensweise wie die zuvor beschriebene wurde mit den fünf anderen Aliquoten der überstehenden Schichten, die aus der mittels Lungenhomogenat von Pul-4Ö erhaltenen Inkubierung stammten, durchgeführt.

Die erzielten Ergebnisse, zusammen mit denen zuvor mit . der anderen Pul-40 Inkubierung mit Hilfe von Nierenhomogenat erzielten, werden grafisch in Fig.. 5-1 gezeigt.

Verfahrensweisen,- die den vorerwähnten gleich waren, wurden zwei Ansätzen aus den fünf.Aliquoten, die durch getrennte Aufteilung der beiden überstehenden Schichten gewonnen worden waren, unterworfen, wobei die eine . aus der Dex-40 Inkubierung mit Hilfe von Nierenhomogenat stammte und die andere aus der Dex-40 Inkubierung mit Hilfe von Lungenhomogenat, wobei jedoch vier Äthanol: Wasser-Mischungen aus (v/v) 80:20, 85:15, 90:10 und 95:5 Anteilen anstelle der vorerwähnten für die Inkubierung von Pul-40 erwähnten Äthanol : Wasser-Mischungen verwendet wurden.

Die Äthanol:Wasser-Mischungen mit überwiegenden Äthanolgehalten, im Gegensatz zu den Äthanol:Wasser-Mischungen die bei der Pul-40 Inkubation verwendet worden waren, wurden bei der Dex-40 Zubereitung verwendet, weil man Mischungen mit einem derartig höheren Äthanolgehalt benötigte, um aus den überstehenden Schichten aus den beiden Dex-40 Inkubierungsmischungen eine vollständige Ausfällung zu erhalten.

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Die durch quantitative Untersuchungen schliesslich erhaltenen Mengen an Polysacchariden für Dex-40 werden grafisch in Fig. 5-2 gezeigt.

Aus Fig. 5—1 geht hervor, dass zwar die Mengen an Polysacchariden, die man nach der Inkubierung von Pul-40 erhielt, mit den Mengen an Polysacchariden übereinstimmen, die man bei einem Blindversuch als Kontrolle bei der Inkubierung erhielt (wobei der Blindversuch in einer reinen physiologischen Kochsalzlösung mit 0,9 % Konzentration an Pul-40 durchgeführt worden war), dass aber die Mengen an Polysacchariden, die man nach einer 24-stündigen Inkubie— rung im Anschluss an die Zugabe von Äthan.ol:Wasser-Mischungen mit einem verhältnismässig niedrigen Äthanolgehalt erhielt, erheblich geringer sind.

Zu Fig. 5-1 ist weiterhin zu bemerken, dass die Menge an Polysaccharid, dier aus dem Niederschlag gewonnen wurde_r durch durch Zugabe von 2 ml absolutem Äthanol zu der überstehenden Flüssigkeit der Pul-40 Inkubierungsflüssigkeit mit Hilfe des Nierenhomogenats erhalten worden war, einer etwa 10 %-igen Verdünnung entspricht, und dass eine etwa 40 %-ige Verdünnung im Falle der Pul-40 Inkubierung erzielt wird, die mit Hilfe des Lungenhomogenats gewonnen worden war, wobei beide Berechnungen auf die Mengen an Polysaccharid, erhalten gemäss dem Blindtest als Kontrolle für Pul-40, beruhen.

Aus diesen Tatsachen lässt sich schliessen, dass das spezifische erfindungsgemässe Pullulan mit Hilfe von Gewebeenzymen metabolisiert wird und dass es schliesslich über Glukose in gasförmiges Kohlendioxid abgebaut wird.

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Wenn dagegen Dex-40 unter den gleichen Bedingungen wie bei der Inkubierung von Pul-40 inkubiert wurde,, fand nahezu kein Metabolismus oder keine Zersetzung statt. Es liegt fast kein merklicher Unterschied zwischen den Mengen an Polysacchariden vor, die bei der Behandlung mit den spezifischen Äthanol:Wasser-Mischungen erhalten worden waren, wobei alle Äthanolgehalte oberhalb 80 % hatten, bzw. bei der Behandlung mit absolutem Äthanol (siehe Fig. 5-2). .

Aufgrund der Molekulargewichtsverteilungen der jeweils aus den vorerwähnten Inkubierungsflüssigkeiten von Pul-40 und Dex-40 gewonnenen Polysacchariden, die aufgrund der Daten der fraktionierten Eluierung der Polysaccharide durch eine Säule mit Sephadex G50 (Handelsname) gemessen wurden, kann man annehmen, dass der Molekularabbau hauptsächlich nur im Falle der Inkubierung von Pul—4O stattfand (vgl. Fig. 6 im Zusammenhang mit Pul-40 und Fig. 7 im Zusammenhang mit Dex-40)»

Diese Untersuchungen stützen die Annahme, dass das Pullulan gemäss der Erfindung im Körper durch Metabolismus und Zersetzung abgebaut wird.

Ähnliche Phänomene des Metabolismus und der Zersetzung wurden auch festgestellt, wenn Pullulan mit Leberhomogenat und mit Serum von Ratten inkubiert wurde.

(d) Untersuchungen mit chronischer Verabreichung von gereinigtem Pullulan.

Die Sicherheit bei einer andauernden chronischen Verabreichung

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von gereinigtem Pullulan im Vergleich zu der Sicherheit, die man mit den bekannten Plasmaexpandern erzielt/ wurde durch Untersuchungen an männlichen Kaninchen festgestellt.

Zur Durchführung dieser Untersuchungen wurden vier Zubereitungen aus zwei 6 %-igen Pullulanzubereitungen von Pul-33 und Pul-40, einer 10 %-igen Dex-40 Zubereitung und einer 6 %-igen HES-200 Zubereitung verwendet. Diese Zubereitungen waren die gleichen wie die unter (b) zuvor verwendeten für die "Untersuchungen über die Ausscheidungsfähigkeit des in den Körper infusionierten Plasmaexpanders".

Weiterhin wurde eine reine physiologische Kochsalzlösung hergestellt, die die gleiche war wie bei den vorher erwähnten Zubereitungen. ■ . . ' ·

Intravenöse Infusionen der obigen Zubereitungen und der reinen Kochsalzlösung als Kontrolle wurden 7 Tage lang in einer Dosierung von 40 ml/kg/Tag während 60 Minuten · jedem der in fünf Gruppen aufgeteilten Kaninchen verabreicht, wobei jede Gruppe aus fünf Tieren bestand und jedes Tier ein Durchschnittskörpergewicht von 2,6 kg hatte.

Während und 24 Stunden nach den Infusionen wurden die Blutzentrifugenwerte des den Kaninchen entnommenen Blutes gemessen und die Werte sind in Fig. 8 angegeben.

Aus Fig. 8 wird ersichtlich, dass die Blutzentrifugenwerte leicht und kontinuierlich im Verlauf der Infusion bei beiden Pullulanzubereitungen absanken. Die Werte, die denen der zu Beginn der Infusionen gemessenen entsprachen, wurden jedoch nach verhältnismässig kurzer Zeit nach

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Beendigung der Infusionen wieder erreicht.

Im Gegensatz zu diesen mit den gereinigten Pullulanen erzielten Wirkungen bei den Blutzentrifugenwerten ergaben beim sich beim Infusionieren von Dex-40 und HES-2OO Zubereitungen erhebliche und schnelle Senkungen der Blutzentrifugenwerte. Aber nicht nur dies war beachtlich, sondern auch, dass es 35 Tage dauerte, um nach Beendigung der Infusionen die Blutzentrifugenwerte wieder auf die ursprünglichen zu bringen.

Die Unterschiede bei den verschiedenen Arten der Blutzentrifugenwerte, die bei Infusion der vorerwähnten Zubereitungen gefunden wurden, zeigen somit, dass die.spezifischen Pullulane nahezu vollständig innerhalb 24 Stunden aufgrund des Metabolismus und der Zersetzung ausgeschieden wurden, . während Dexr-40 und HES-200 akkumulierten und noch 24 . Stunden nach den Infusionen im Blut waren.

Man kann daher daraus schliessen, dass das gereinigte Pullulan,wie gemäss der vorliegenden Erfindung angegeben, bei der Verwendung zur Behandlung von Blutungen völlig sicher ist.

Die grafische Darstellung in Fig. 9 zeigt weiterhin die Veränderungen der Serum-Glutanyloxarotransaminasewerte, d.h. der GOT-Werte bei Tieren, denen die vorher erwähnten Zubereitungen in der vorher angegebenen Art verabreicht worden waren. Die GOT-Werte gelten allgemein als ein Mass für das Anzeichen eines Cytotoxizität der Leberzellen.

Aus der Fig. 9 geht hervor, dass bei chronischer Verabreichung

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von Pul-33 un'd Pul-40 Zubereitungen und HES-200 Zubereitungen keine merklichen Veränderungen in den GOT-Werten gemessen werden, verglichen mit den Werten, die man als Kontrolle durch eine Vergleichsinfusion aus reiner physiologischer Kochsalzlösung erhält (wobei diese die gleiche war, wie sie in den drei erwähnten Zubereitungen verwendet worden war), wobei die ersteren Werte allerdings etwas unterhalb den Werten der Kontrolle lagen. Dagegen wird eine merkliche Erhöhung der GOT-Werte bei einer wiederholten Infusion von Dex-40 Zubereitungen festgestellt.

In diesem Zusammenhang bleibt festzustellen, dass das Albumin:Globulin-Verhältnis im Falle der Infusion von Dex-40 Zubereitungen erheblich erniedrigt war aufgrund einer Erhöhung der Globulinwerte, während andererseits die Albuminwerte abnahmen. Dieses Symptom, das für eine Leberschädigung spricht, wird immer bei pathologischen Untersuchungen . von .Körperorganen in die Untersuchung einbezogen.

Die bei diesen pathologischen Untersuchungen verwendeten Tiere wurden nach den Untersuchungen getötet um weitere pathologische Untersuchungen der Organe vorzunehmen. Die Ergebnisse der mikroskopischen Untersuchungen sind in der nachfolgenden Tabelle angegeben, wo die Zeichen -, +, x, ++ und +++ für die Bedeutung des Ausmasses der untersuchten pathologischen Veränderungen, wie Necrosis der Leberzellen, Vacuolenbildung in den Nierentuben und fibrotischen Veränderungen im Herzmuskel.

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TABELLE

3019835

Tage ·. seit Beinfusionierte endigung der Zubereitung Infusion Leber Niere Herz Lunge Milz

Kochs al?jLö-

sunrr 15

(Kontrolle) ~o

29 I4-3

Pul-33 15 22

• ■:" 7

15 PUI-J4.O 22.

29 I4.3

15

Dex-l^O 22 29

15

HES-200 22 29 1+3

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Anmerkung: — keine Veränderung

+ sehr geringe Veränderung

+ geringe Veränderung

++ merkliche Veränderung

.... +++ beachtliche Veränderung

Es wurden keine merklichen pathologischen Veränderungen gegenüber dem Kontrollversuch bei den Organen der Tiere festgestellt, denen die Pul-33 und Pul-40 Zubereitungen infusiert worden waren, mit der Ausnahme von einem weissen Niederschlag, der ebenso wie in der Kontrolle vorkam, an der Peripherie der Leber.

Dagegen wurden bei Organen von Tieren, denen Dex-40 Zubereitungen infusiert worden waren, eine Reihe toxischer Anzeichen festgestellt/ z.B. ein Anstieg des Gewichtes, Atrophy der Leberzellen und eine Ausbreitung von myokardialer Fibrosis in der Leber, Vacuolenbildung in den Nierentuben und blasenförmige Tumore in der Lunge.

Gewisse toxische Anzeichen wurden auch in den Organen von Tieren festgestellt, denen HES-2OO Zubereitungen infusioniert worden waren, wie eine Farbänderung (Verblassung), dunkelweisse Ablagerungen an der Peripherie, ein Anstieg und wolkiges Anschwellen der Zellen, wobei diese Veränderungen alle in der Leber beobachtet wurden. Ausserdem wurde auch eine Abscheidung von Polysacchariden in den erweiterten Nierentuben festgestellt.

Nachfolgend werden Ausführungsformen der Erfindung zur Isolierung der gereinigten Pullulanfraktionen und der

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Herstellung von therapeutischen Zubereitungen, die die gereinigten Pullulanfraktionen enthalten,beschrieben.

(a) Isolierung der gereinigten Pullulanfraktionen,

Beispiel 1

Eine 10 %-ige (w/v) wässrige Lösung von üblichem Pullulan (Produkt der Hayashibara Biochemical Laboratories Inc., Okayama) wurde durch Auflösungen von 200 g des Pullulans in Wässer hergestellt. Der pH der Lösung wurde durch Zugabe von Salzsäure auf etwa 2 eingestellt. Diese Lösung wurde 2 Stunden bei etwa 80°C .gehalten, um eine Teilhydrolyse des Pullulans zu bewirken und anschliessend wurde die Lösung mit Natriumhydroxid neutralisiert und das Ganze gekühlt. ' ■■-'■-:- .

Die Lösung wurde dann mit einer ausreichenden Menge Methanol versetzt, bis zu einer Konzentration von 40 % (v/v) wodurch sich die Lösung in zwei Schichten teilte. Nach Entfernung der unteren Schicht wurde die obere Schicht wiederum mit frischem Methanol vermischt bis zu einer Endkonzentration an Methanol von 45 % (v/v) und die dabei gebildete untere Schicht Wurde gesammelt. Während dieses Verfahrens wurde die Temperatur bei 30°C gehalten.

Das in den gesammelten wässrigen Lösungen enthaltene Methanol wurde abdestilliert. Die zurückbleibende wässrige Pullulanlösung wurde mit Aktivkohle entfärbt, mit Ionenaustauschern der H- und 0H-Form deionisiert und schliesslich

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durch ein Membranfilter filtriert. Das Filtrat, das die gereinigte Fraktion mit einem Mw von 50.000 enthielt, wurde durch Verdampfen konzentriert. Der feste Rückstand wurde getrocknet und pulverisiert und ergab etwa 90 g pyrogenfreies weisses Pullulan.

Beispiel 2

Eine 20 %-ige (w/v) wässrige Pullulanlösung, die durch Auflösen von 2OO g handelsüblichen Pullulans in Wasser hergestellt worden war, wurde wie im vorhergehenden Beispiel einer Teilhydrolyse unterworfen * Zu der neutralisierten wässrigen Lösung wurde- eine ausreichende Menge Äthanol gegeben, bis man eine 50 %-ige (v/v) Konzentration an Äthanol erhielt, wobei sich zwei Schichten bildeten. Die untere Schicht wurde entfernt und die obere Schicht würde mit frischem Äthanol bis zu einer Endkonzentration von Äthanol von 70 % (v/v) versetzt und die'neu gebildete untere Schicht wurde gesammelt, dabei wurde die Temperatur bei 40°C gehalten. .

Die nachfolgenden Schritte waren die gleichen wie in Beispiel 1. Man erhielt ein pulverförmiges Pullulan mit einem Mw von 33.000 in einer*Ausbeute von etwa 70 g, das pyrogenfrei war.

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Beispiel 3

Eine 5 %-ige (w/v) wässrige Pullulanlösung, die durch Auflösen von 200 g handelsüblichem Pullulan in Wasser hergestellt worden, war, wurde wie in Beispiel 1 teilhydrolysiert und die erhaltene wässrige Lösung wurde in gleicher Weise wie in Beispiel 1 neutralisiert.

Zu der Lösung wurde eine ausreichende Menge Aceton gegeben um eine 20 %-ige (v/v) Konzentration an Aceton z_u er- geben, worauf die Lösung sich in zwei Schichten teilte. Nach Entfernung der unteren Schicht wurde die obere Schicht mit frischem Aceton bis zu einer Konzentration von 45 % (v/v) Aceton versetzt und die untere neu gebildete Schicht wurde gesammelt. Während dieser Verfahrensweise wurde die Temperatur bei 30⁰C gehralten.

Die nachfolgenden Schritte wurde wie in Beispiel. 1 durchgeführt. Man erhielt eine gereinigte pyrogenfreie, pulverförmige Pullulanfraktion mit einem Mw von 85.000 in einer Ausbeute von 80 g.

(b) Herstellung von therapeutischen Pullulanzubereitungen

Beispiel 1

60 g gereinigtes Pullulan mit einem Mw von 40.000 wurden in 1 1 physiologischer Kochsalzlösung gelöst. Die wässrige Lösung-wurde filtriert und das Filtrat wurde mit 0,05 g

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Aktivkohle verrührt. Die Mischung wurde nochmals filtriert zur Entfernung der verbrauchten Aktivkohle. Die wässrige LösunganPullulan wurde dann sterilisiert.

Beispiel 2

50 g gereinigtes Pullulan mit einem Mw von 60.000 wurden in 11 physiologischer Kochsalzlösung gelöst und die wässrige Lösung wurde filtriert. Das Filtrat wurde mit 0,05 g Aktivkohle versetzt und dann zur Entfernung der verbrauchten Aktivkohle filtriert und das Filtrat wurde dann sterilisiert.

Beispiel 3

Ein Gemisch aus 50 g raffiniertem Pullulan mit einem Mw von 60.000, 50 g Glukose und 9 g Natriumchlorid wurde zu destilliertem Wasser gegeben und das Ganze mit einer entsprechenden Menge destilliertem Wasser auf 1 1 aufgefüllt. Die erhaltene wässrige Pullulanlösung wurde dann wie in Beispiel 1 beschrieben weiterbehandelt.

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Claims

HOFFMANN · EITLE & PARTNER

PATENTANWÄLTE 3 U I 3 Q W

DR. ING. E. HOFFMANN (1930-197«) . DIPL.-ING. W.EITLE · DR. RER. NAT. K. HOFFMANN · DIPL.-ING. W. LEHN

DIPL.-ING. K. FDCHSLE · DR. RER. NAT. B. HANSEN ARABELLASTRASSE 4 (STERNHAUS) . D-8000 MONCH EN 81 · TELEFON (089) 911087 · TELEX 05-29619 (PATHE)

. 33 521 o/wa

T. ElSAI CO.-, LTD., TOKYO / JAPAN
2.HAyASHIBARA BIOCHEMICAL LABORATORIES INCORPORATED, ;: OKÄYÄMA-SHI "■/ JAPAN

Plasmaexpander

P A T E N T A N S P R Ü C H E

1. Plasmaexpander, enthaltend als wesentlichen Bestandteil ein raffiniertes (gereinigtes) Pullulan mit einem Durchschnittsmolekulargewicht im Bereich von 30.000 bis 90,000.

2. Plasmaexpander gemäss Anspruch 1. dadurch g e k.-e η η ζ e i c h η e t , dass er als wesentlichen Bestandteil 4 bis 10 % gereinigtes Pullulan mit einem Durchschnittsmolekulargewicht im Bereich von 30.000 bis 90.000 enthält.

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Plasmaexpander gemäss Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet / dass er wie folgt hergestellt worden ist:

(1) Herstellen einer wässrigen Lösung eines
üblichen Pullulans mit einer Durchschnittsmolekulargewichtsverteilung, die breiter als der Bereich von 30.000 bis 90.000 ist, durch Auflösen des Pullulans in Wasser;

(2) Zugabe eines wassermischbaren organischen Lösungsmittels in einer Menge, die ausreicht zur Herstellung einer wässrigen Mischung, die 20 bis 50 % (v/v) des organischen Lösungsmittels enthält, unter Trennung der entstandenen Mischung in zwei Schichten;

(3) Gewinnung der oberen Schicht;

(4) Zugabe eines weiteren Teils des organischen Lösungsmittels aus Stufe (2) zu der Schicht aus Stufe (3) in einer Menge die ausreicht, eine Konzentration in der wässrigen Mischung von 40 bis 70 % (v/v) an
organischem Lösungsmittel zu ergeben, unter Trennung der Mischung in zwei Schichten;

(5) Gewinnung der unteren Schicht;

(6) Isolierung von gereinigtem Puululan mit
einem durchschnittlichen Molekulargewicht im Bereich von 30.000 bis 90.000 aus der gemäss Stufe (5) gewonnenen Schicht;

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(7) Auflösen des gereinigten Pullulans in isotonischein Wasser unter Erhalt einer 4 bis 10 % (w/v) Pullulan enthaltenden wässrigen Lösung; und

(8) Sterilisieren der wässrigen Lösung.

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