DE2823750A1

DE2823750A1 - Verfahren zur trennung von lipoiden der endotoxine von bakterien, insbesondere von bordetella pertussis

Info

Publication number: DE2823750A1
Application number: DE19782823750
Authority: DE
Inventors: Gerard Ayme; Ladislas Prof Szabo
Original assignee: Institut Merieux SA
Current assignee: Institut Merieux SA
Priority date: 1977-05-31
Filing date: 1978-05-31
Publication date: 1978-12-21
Also published as: DE2823750B2; JPS5437817A; FR2393065A1; GB1601870A; US4242270A; FR2393065B1; DE2823750C3

Description

Dipl. Ing. Hans-Jürgen Müller

Dr. rer. nat. TLoinas Berendt /ι _{Dr Be/le}

Dr.-Ing.HansLeyh *f Dr.Be/le

Lucile-Grahn-Straß.38 D8Möndien80

Institut Merieux, Lyon (Frankreich)

Verfahren zur Trennung von Lipoiden der Endotoxine von Bakterien, insbesondere von Bordetella Pertussis

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Die Erfindung betrifft ein Verfahren zur Trennung von Lipoiden von Endotoxinen von Bakterien, insbesondere des Endotoxins von Bordetella Pertussis (Keuchhusten) sowie die verschiedenen erhaltenen Lipoidfraktionen und ihre Verwendung in Arzneimitteln.

Die der Erfindung zugrunde liegenden Arbeiten zeigen, daß nach dem erfindungsgemäßen Verfahren erhaltene Fraktionen biologisch aktive Stoffe darstellen, die insofern unterschiedlich zu bekannten Fraktionen sind, daß sie eine Wirksamkeit als Adjuvans aufweisen und eine nicht spezifische Wirkung auf die Immunität ausüben.

Insbesondere hat sich als Tatsache ergeben, daß bestimmte Fraktionen toxisch und fibererzeugend sind, während andere Fraktionen diese Eigenschaften nicht aufweisen.

Durch die der Erfindung zugrunde liegenden Arbeiten kann ferner bewiesen werden, daß es tatsächlich Lipoidfraktionen von Endotoxinen sind, die für die biologische Wirksamkeit verantwortlich sind, welche von Gram-negativen Bakterien hervorgebracht werden.

Dennoch wurden bisher im Fall anderer Gram-negativer Bakterien die biologischen Wirkungen einheitlich einem einzigen Makromolekül zugeschrieben, das als Lipoid A bezeichnet wurde, gemäß der Terminologie von 0. Westphal.

Überraschenderweise wurde festgestellt, daß die biologische Aktivität nicht einheitlich in diesem Makromolekül lokalisiert ist.

Die Erfindung erlaubt es, bestimmte Lipoidfraktionen von Endotoxinen von Bordetella Pertussis zu entgiften, aber bestimmte biologische Eigenschaften dieses Endotoxins zu bewahren oder sogar zu verbessern, insbesondere die Adjuvans-

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- 6 Aktivität.

Diese Fraktionen erlauben daher eine Verwendung auf dem pharmazeutischen Gebiet zur Verstärkung der Wirkung von Vaccinen aus Bakterien und Viren, zur Verstärkung der Abwehrkräfte des Organismus und zur Bekämpfung verschiedener infektiöser Krankheiten, die durch Bakterien hervorgerufen werden (Salmonella, Pseudomonas, Staphylokokken, Klebsieila) sowie solcher, die durch Viren hervorgerufen werden, insbesondere den Virus von Semliki Forest und der Encephalomyocarditis.

Andererseits zeigen diese Fraktionen eine Wirkung gegen Krebskrankheiten (Ehrlich Ascites und Lymphom YC8).

Die EEfindung hat ein Auftrennungsverfahren von verschiedenen Lipoidfraktionen aus Endotoxinen von Bakterien zum Ziel, insbesondere des Endotoxins von Bordetella Pertussis (Keuchhusten), das dadurch gekennzeichnet ist, daß man in einer Hauptstufe eine Hydrolyse des gegebenenfalls gereinigten Endotoxins mittels einer organischen Säure bei einem pH-Wert zwischen 2 und 4 durchführt und anschließend die überstehende Flüssigkeit alltrennt und den Rückstand gefriertrocknet, wobei das aus dem Rückstand erhaltene Produkt als Produkt A bezeichnet wird.

Gemäß einer ersten Variante dieses Verfahrens wird das in der genannten Weise erhaltene Produkt A anschließend einer Extraktion unterworfen, die einerseits zu einem Extrakt (Produkt X) und andererseits zu einem Rückstand (Produkt B) führt, wobei das Produkt X mit einem gegenüber dem eingangs verwendeten Lösungsmittel unterschiedlichen Lösungsmittel extrahiert wird und wobei ein neuer Extrakt (Produkt Xl) und ein Rückstand (Produkt X2) erhalten werden.

Nach einer zweiten Variante des Verfahrens können die anderen Lipoidfraktionen durch Hydrolyse des genannten Produkts B

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- 7 unter stärkeren Bedingungen erhalten werden.

Gemäß dieser Variante wird das Produkt B einer sauren Hydrolyse bei einem pH-Wert gleich oder kleiner als 1 mit Hilfe von Salzsäure unterworfen. Nach der Abtrennung der überstehenden Flüssigkeit wird der Rückstand gefriergetrocknet (Produkt Z) und, falls erwünscht, einer anschließenden Extraktion unterworfen, wobei einerseits ein Extrakt (Produkt Zl) und andererseits ein Rückstand (Produkt Z2) erhalten werden.

Gemäß einer bevorzugten Ausführungsform des Verfahrens wird das Produkt Z2 gegebenenfalls durch Extraktion mit Hilfe eines Lösungsmittels und Entfernung des Rückstands in gereinigtem Zustand erhalten.

Die unterschiedlichen Stufen des Verfahrens sind in dem folgenden Schema dargestellt.

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ENDOTOXIN B.P.

Reinigung

ENDOTOXIN B.P. (gereinigt)

a) Hydrolyse CF₃ COOH

pH : 2,4.,__

b) Zentrifugierung

PRODUKT A j (gefriergetrocknet)

überstehende Flüssigkeit

j E

Rückstand

Extraktion Toluol/Methanol

Extrakt

Produkt B

Cfc

Produkt X

b) Zentrifugierung

überstehende Flüssigkeit

Rückstand

a) Hydrolyse
(HCl O,25n)

Rückstand

Extraktion

Methanol

Extrakt

Produkt Z'

rodukt X2

Produkt Xl

Extraktion Hexan Extrakt

Produkt

L·

Produkt Zl

Das Endotoxin von Bordetella Pertussis, dessen Herstellung an sich bekannt ist, kann nach den in der Literatur beschriebenen Verfahren erhalten werden, wobei insbesondere auf folgende Publikationen verwiesen wird: Biochem. J. 74, Seite 398 409 (1960), Japan J. Microbiol 14, Seite 1 - 8 (1970), Canad. J. Microbiol 19, Seite 231 - 237 (1973).

Die Reinigung des Endotoxins kann nach unterschiedlichen an sich bekannten Methoden erfolgen. Gemäß der Erfindung ist diese Reinigung fakultativ und kann gegebenenfalls durch eine Reihe von Extraktionen mit Hilfe verschiedener Lösungsmittel erreicht werden, insbesondere einer anfänglichen Extraktion mit Chloroform, gefolgt durch eine Extraktion mit einem Gemisch aus Toluol und Methanol im Verhältnis 1 : 1 und schließlich mit Methanol. Eine derartige Reinigung erlaubt die Entfernung von 1 - 2 % löslicher Bestandteile.

Wie bereits erwähnt erfolgt die Hydrolyse des Endotoxins unter schonenden Bedingungen bei einem pH-Wert zwischen 2 und 4, vorzugsweise beim pH-Wert 2,4 mittels einer organischen Säure, vorzugsweise mit Hilfe von Trifluoressigsäure, wobei die Hydrolysendauer 50 bis 150 Stunden bei einer Temperatur von 40 - 60⁰C beträgt.

Nach dem Zentrifugieren wird die überstehende Flüssigkeit eliminiert und der Rückstand wird gefriergetrocknet und bildet das Produkt A.

Gemäß einer ersten Variante wird das Produkt A einer Extraktion mit Hilfe eines organischen Lösungsmittels, vorzugsweise eines Lösungsmittelgemisches, wie einem Gemisch aus Toluol und Methanol im Verhältnis 1 : 1 unterworfen. Der erhaltene Rückstand stellt das Produkt B dar und das extrahierte Gemisch nach der Verdampfung des Lösungsmittels führt zum Produkt X, das gleichfalls einer neuen Extraktion mit Hilfe von Methanol unterworfen wird, wobei einerseits ein Rückstand (Produkt X2) und andererseits nach dem Verdampfen des Extrakts ein Produkt Xl

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erhalten wird.

Gemäß einer zweiten Variante des Verfahrens wird das Produkt B aus dem Extraktionsrückstand des Produkts A einer sauren Hydrolyse mittels Salzsäure bei einem pH-Wert gleich oder unterhalb 1 unterworfen, bei einer Temperatur von etwa 100 C und über eine Zeitdauer von etwal5 - 60 Minuten.

Nach dem Abzentrifugieren und Eliminieren der überstehenden Flüssigkeit wird der Rückstand, gegebenenfalls nach dem Waschen mittels einer Salzsäure 0,25n und mittels Wasser erneut zentrifugiert, wobei der gefriergetrocknete Rückstand das Produkt Z bildet.

Das Produkt Z ergibt nach Extraktion mittels Hexan einerseits nach dem Verdampfen des Lösungsmittels einen Extrakt (Produkt Zl) und andererseits einen Rückstand (Produkt Z2), wobei gemäß einer Variante dieses Verfahrens diese Produkte in gereinigter Form durch Extraktion vorzugsweise mittels eines Gemisches von Lösungsmitteln, wie einem Gemisch von Toluol und Methanol im Verhältnis 1 : 1 und Eliminierung des Rückstands erhalten werden können.

In der folgenden Beschreibung beziehen sich die Hinweise auf das Produkt Z2 auf das gereinigte Produkt.

Es versteht sich, daß die verschiedenen Stoffe zu unterschiedlichen Lipoidfraktionen des Endotoxins von Bordetella Pertussis führen und bestimmten Modifikationen oder Varianten unterliegen können, ohne daß vom Erfindungsgedanken abgewichen wird.

Die erste Stufe bzw. Hauptstufe, die das wesentlichste Kennzeichen des erfindungsgemäßen Verfahrens ist, besteht in der schonenden Hydrolyse, die am Endotoxin, das gegebenenfalls zuerst gereinigt worden war, durchgeführt wird.

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Die Erfindung ist aber auch auf das neue industrielle Produkt gerichtet, nämlich die unterschiedlichen Fraktionen, die nach dem erfindungsgemäßen Verfahren erhalten werden, insbesondere auf die Produkte A, B, X, Xl, X2, Z, Zl und Z2.

Als Erläuterung des erfindungsgemäßen Verfahrens wird im folgenden ein Beispiel über die Auftrennung der verschiedenen Lipoidfraktionen des Endotoxins von Bordetella Pertussis gegeben.

Beispiel

Es werden 5,5 g Endotoxin von Bordetella Pertussis (BP35-Stamm 1414 Phase I) einer Reihe von Extraktionen unterworfen mit dem Ziel der Reinigung.

Das Endotoxin wird zunächst einer Extraktion mit 100cm Chloroform unterworfen. Nach dem Eliminieren des Extrakts

wird der Rückstand erneut einer Extraktion mit 2 χ 100 cm eines Lösungsmittelgemisches aus Toluol und Methanol im Verhältnis 1 : 1 unterworfen. Wie vorher wird der Extrakt eliminiert und der Rückstand wird erneut einer Extraktion unter-

worfen unter Verwendung von 100 cm Methanol als Lösungsmittel.

Der erhaltene Rückstand von 5,345 g besteht aus dem gereinigten Endotoxin. Die beschriebene Extraktionsreihe gestattet die Eliminierung von etwa 75 mg löslicher Bestandteile.

Es wird das gereinigte Endotoxin auf einen geeigneten Rezipienten gebracht und hierzu 1360 cm'
gegeben (pH-Wert des Milieus 2,43).

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pienten gebracht und hierzu 1360 cm Trifluoressigsäure

Das Gemisch wird 115 Stunden lang auf 50 C gehalten.

Nach dem Abkühlen wird mittels einer Zentrifuge MSE Typ MR 25

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mit 3000 U/min 20 Minuten lang zentrifugiert. Die überstehende Flüssigkeit, die hauptsächlich aus Polysacchariden zusammengesetzt ist, wird eliminiert. Der Rückstand wird gefriergetrocknet und stellt 3,422 g Produkt A dar.

Gewinnung der Fraktionen X, Xl und X2 und der Fraktionen

B, Z, Zl und Z2

Das Produkt A (3,422 g) wird einer Extraktion unter Verwen-

3
dung von 4 χ 100 cm eines Losungsmittelgemisches aus

Toluol und Methanol im Verhältnis 1 : 1 unterworfen. Nach dem Eliminieren des Lösungsmittels unter vermindertem Druck werden 226,8 mg eines Extrakts (Produkt X) erhalten, und der Rückstand der Extraktion stellt das Produkt B (3,180 g)

(1) Gewinnung der Fraktionen Xl und X2.

Das Produkt X in der Menge von 226,8 mg wird mit 100 cm Methanol extrahiert, wobei nach dem Verdampfen des Lösungsmittels unter vermindertem Druck das Produkt Xl (100,2 mg) erhalten wird. Der Rückstand der Extraktionjvon 107,2 mg stellt das Produkt X2 dar.

(11) Gewinnung der Fraktionen Z, Zl und Z2

Die oben gewonnenen 3,180 g Produkt B werden in einen geeigneten Behälter gebracht und einer Hydrolyse in Gegenwart von 1600 cm Salzsäure 0,25n bei einer Temperatur von 100°C 30 Minuten lang unterworfen.

Nach dem Abkühlen wird zentrifugiert und die überstehende Flüssigkeit, die die Polysaccharidsubstanzen enthält, eliminiert. Der Rückstand wird gegebenenfalls nach Waschen mit 0,25n-Salzsäure und mit Wasser erneut unter den gleichen Bedingungen zentrifugiert und der erhaltene Rückstand gefriergetrocknet, wobei 1,23 g Produkt Z erhalten werden.

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Nach Extraktion des Produkts Z mittels 100 cm Hexan und Eliminieren des Lösungsmittels unter vermindertem Druck wird das Produkt Zl (50,45 mg) erhalten. Der Extraktionsrückstand

wird einer Extraktion mit 100 cm eines Lösungsmittelgemisches aus Toluol und Methanol im Verhältnis 1 : 1 unterworfen. Nach der Eliminierung des Lösungsmittels unter vermindertem Druck werden 823 mg Produkt Z2 erhalten.

Biologische Auswertung der erhaltenen verschiedenen Fraktionen 1) Fiifbererzeugende Kraft und Toxizität

Die Säugetiere sind gegenüber Endotoxinen empfindlich, jedoch hängt die Empfindlichkeitsreaktion davon ab, auf welche Weise das Mittel verabreicht wird, welche Spezies Tier verwendet wird, welches Individuum behandelt wird und von der verwendeten Dosierung. Eine schwache Dose kann beim Tier höchstens leichte Krankheitserscheinungen wie eine Temperaturerhöhung oder einen Gewichtsabfall hervorrufen. Eine stärkere Dosis des Endotoxins kann schwere Krankheitserscheinungen hervorrufen, wie das Schwartzmann-Phänomen und kann zum Tode des Tieres führen.

a) Fifbererzeugende Wirkung

Die fibererzeugende Wirkung von verschiedenen Fraktionen kann für jedes Produkt an drei Hasen getestet werden. Die Resultate sind durch die Summe der Temperatursteigerungen (£ At ) ausgedrückt .

Es ist festzustellen, daß ein Produkt als fibererzeugend einzustufen ist, wenn die Größe£At ^- 1,5 ist (gemäß der europäischen Pharmacopoe).

Die Ergebnisse sind in folgender Tabelle dargestellt:

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Produkte , _.

Dosis 2 Kg ml kg A B X Xl X2 Z Zl Z2

intravenös

5 6,65 5 2 4,3 1,2 0,75 1,1

Die Ergebnisse zeigen, daß das Produkt Z und die daraus resultierenden Fraktionen (Produkte Zl und Z2) nur wenig oder gar nicht fM>ererzeugend sind, während die anderen Fraktionen Fieber hervorrufen.

Bezüglich der injizierten Dosis sind die stärker fibererzeugenden Fraktionen sehr wenig von einem Vergleichsendotoxin verschieden, welches aus Escherichia coli in einer Dosis von 1 (*g kg angewendet wird und einen Wert ^At = 1,35 hat.

b) Gewichts-Gewinn-Test bei Mäusen (MWGT)

Der Test MWGT besteht darin, daß man einigen Gruppen Mäusen, die voll ausgewachsen sind,(12 - 14 g) intraperitoneal unterschiedliche Dosierungen der Versuchsprodukte verabreicht. Eine Kontrollgruppe wird mit physiologischer Kochsalzlösung gespritzt. Die einzelnen Mäuse werden am Tage der Injektion (JO), danach jede Gruppe am ersten Tag (JI), am dritten Tag (J3) und am siebten Tag (J7) anschließend gewogen. Für jede Dosis wird für jedes Produkt die Variation der Gewichte hinsichtlich der Kontrollgruppe als Funktion der Zeit aufgezeichnet und die entsprechenden Kurven werden gezeichnet und hieraus die Flächenwerte (Ä S) bestimmt.

Hieraus wird die Dosis D des Produkts bestimmt, welche einem Wertes gleich Null entspricht. Diese Dosis reicht nicht aus, eine Störung der Gewichtskurve bei den durch das

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Produkt in_,okulierten Tieren bezüglich der Kontrollgruppe hervorzurufen.

In der folgenden Tabelle sind die Dosierungen(D ), die bei den verschiedenen Produkten erhalten wurden, wiedergegeben.

Produkte A B X Xl X2 Z Zl Z2 D -,g/Maus 6 21 61 183 48 58 58 68

Die erhaltenen Ergebnisse zeigen, daß die Produkte A und B bei den sehr schwachen Dosierungen toxisch sind und daß das Produkt XI das am wenigsten toxische ist.

c) Schwartzmann-Phänomen

Die SChwartzmann-Reaktion ist eine Blutungs-Nekrose bestimmter Organe, die nach der Injektion eines Endotoxins beim Tier oder beim Menschen beobachtet wird, die durch eine erste Endotoxin-Injektion 6-48 Stunden vorher sensibilisiert worden waren. Die nekrotische Reaktion kann lokal in der Haut sein, wenn die erste Dosis des Endotoxins in die Haut und die zweite Dosis intravenös gespritzt worden ist.

Die Reaktion ist dann generalisiert, wenn die beiden Injekitmen intravenös vorgenommen werden. Die Reaktion kann mit zwei Endotoxinen ohne verwandte Antigene erhalten werden.

Bei der folgenden Untersuchung erfolgte die erste Injektion intradermal (die Injektion der verschiedenen aus dem Produkt A erhaltenen Fraktionen) und die zweite Injektion erfolgte Stunden später intravenös (diese letztere Injektion erfolgte mit einem Vergleichsendotoxin).

In der folgenden Tabelle sind die Werte der nekotischen Reaktion (+) bzw. die negative Reaktion (-) wiedergegeben.

809851/0736 - ™ -

Produkte A B X Xl X2 Z Zl Z2

Nekrotische

Reaktion +++ +++

Die Analyse der Ergebnisse zeigt eine Auftrennung der biologischen Eigenschaften bei dem Niveau der Produkte X, X2 einerseits und der Produkte Z, Z2 andererseits. Die Produkte X, X2 haben eine pyrogene Wirkung und sind Schwartzmannpositiv während die Produkte Z und Z2 nicht pyrogen sind und keine nekrotische Reaktion beim Schwartzmann-Test ergeben.

2. Nicht-spezifische Immunisierungswirkung

Die unterschiedlichen erhaltenen Fraktionen gemäß dem erfindungsgemäßen Verfahren wurden in folgender Weise geprüft:

Es wurden Mäuse mit einem mittleren Gewicht von 20 g intra— peritoneal mit verschiedenen Dosierungen von jedem zu prüfenden Produkt injiziert. Nach einem Zeitzwischenraum von drei Tagen bei den bakteriellen Proben und von einem Tag bei den Virusproben wurden auf dieselbe Weise eine letale bakterielle Dosis (I) oder Virusdosis (II) verabreicht mit der Ausnahme der Probe beim Virusstamm SF oder bei der subkutanen Injektion .

Die in folgender Tabelle dargestellten Ergebnisse sind ausgedrückt hinsichtlich der Prozentzahl der überlebenden Mäuse. Es wurden folgende Antigene verwendet:

(I) Salmonella typhi: ST. Pseudomanas aeruginosa: PA.

(II) Virus der Encephalomyocarditrs: EMC. Virus "Semliki Forest" : SF.

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Ver- Test- Dose A B X Xl X2 Z Zl Z2 suchs- dosis
antigen

ST DE : 0 % 1/1 90 90 90 40 100 80 40 70

DE/5:10 1/4 30 60 20 0 40 20 0 30

DE/25:80 1/16 10 0 10 0 0 30 0 0

PA DE : 0 % 90 70 60 0 60 0 0 10

DE/5:20 0 20 10 0 10 0 0 0

DE/25:90 0000 0 00 0

EMC DE ί 25% 1/1 90 100 70 70 100 80 70

SF DE : 10 1/1 90 90 80 40 100 50 50 70

DE = Versuchsdosis.

1/1, 1/4 und 1/16: Verdünnung auf das Vierfache bzw. Sechzehnfache, hinsichtlich der stärksten Dosis 1/1 von 200 f/g je Maus.

Die erhaltenen Ergebnisse bei den Versuchsmäusen zeigen, daß die Proben, die aus den Bakterien efhalten wurden, schwerwiegendere Wirkungen hatten und wesentlich signifikantere Werte zeigen als die Proben aus den Viren. Die Mäuse, welche die Versuchsdosierungen erhielten, überlebten nicht während im Falle der Virusproben ein bestimmter Prozentsatz der Mäuse am Leben blieb.

Die Ergebnisse zeigen, daß das Produkt X2 in der Lage ist, einen totalen Schutz zu gewähren.

Die wiedergegebenen Ergebnisse zeigen ebenfalls die signifikanten Unterschiede der biologischen Eigenschaftender

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Produkte X2 und Z2. Diese Ergebnisse scheinen die Auftrennung zu belegen, die hinsichtlich der biologischen Eigenschaften bei der fibererzeugenden Wirkung und bei der nekrotischen Wirkung der Fraktionen Z2 und X2 beobachtet wurden.

3. Adjuvans-Aktivität:

Die Adjuvans-Aktivität kann durch die Dosis gemessen werden, durch welche eine Erhöhung der Antikörperbildung bewirkt wird, Der Antikörper-Titer wird in jedem Fall durch die Technik der passiven Hämagglutination bewirkt. Hierbei wird der Antikörper-Titer durch den umgekehrten Wert der äußersten Verdiinnung ausgedrückt, durch welche man noch eine positive Reaktion beobachten kann. Bei den verschiedenen Produkten wird eine Erhöhung der Antikörper als Antwort auf eine Injektion einer Grippevaccine (Vaccine A und B) bei Mäusen gemessen. Es wird die minimale Dosis der Vaccine gemessen, durch welche noch eine spezifische Antikörper-Reaktion des Grippevirus erhalten wird, die noch mit der passiven Hämagglutinationstechnik aufspürbar ist. Dieses Maß stellt den Kontrollwert dar. Es wird bei Mäusen diese Minimaldosis (Kontrollwert) der Vaccine (A oder B) injiziert und das Produkt, das man zu testen wünscht. Die beiden Produkte, nämlich die Vaccine und das Adjuvans, werden in der Spritze gemischt und danach gleichzeitig injiziert. 21 Tage nach der Injektion wird der gebildete Antikörper—Titer bestimmt.

Die Ergebnisse sind durch den Kehrwert der äußersten Verdünnung ausgedrückt. Die injizierten Dosierungen der unterschiedlichen Fraktionen betragen 200 Ug je Maus.

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τ · · · ,. ντο. · ι Titer

Injiziertes Material

bei Mäusen Vaccine A Vaccine B

Physiologische ^ 20 < 20
Kochsalzlösung

Antigen allein 201 101

A 806 320

B 506 400

X 1613 640

XI 1280 160 X2 806 506 Z 806 201 Zl 806 400 Z2 806 201

Bei den Grippevaccinen A und B zeigen die angegebenen Ergebnisse, daß die Lipoidfraktionen X und Xl eine stark erhöhte Adjuvans-Aktivität hervorbringen, die derjenigen des Endotoxins überlegen ist. Die Produkte Z, Zl, Z2 zeigen die gleiche Adjuvans-Aktivität wie das Endotoxin. Wie jedoch in der Tabelle angegeben, sind die Produkte weder toxisch noch schwach toxisch.

Hinsichtlich der Vaccine B ist die Adjuvans-Aktivität der verschiedenen Produkte noch schwächer. Indessen sind die Produkte X und X2 hinsichtlich der Adjuvans-Aktivität die stärksten.

4. Tumor-Wirkung

Die verschiedenen gemäß dem erfindungsgemäßen Verfahren erhaltenen Fraktionen wurden in folgender Weise hinsichtlich der

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Tumor-Wirkung geprüft:

Es wurden Mäuse mit einem Gewicht von 16 - 18 g intraperitoneal mit 400 i^g jedes Versuchsprodukts injiziert. 4 Stunden

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später wurden auf gleiche Weise 10 Tumorzellen vom Ehrlich-

Ascites Tumor (EA) oder des Lymphoms YC8 injiziert.

Die Tiere wurden 2 Monate beobachtet und es wurden die überlebenden Tiere bei Zeitablauf aufgezeichnet.

Es wurden die folgenden Ergebnisse erhalten,ausgedrückt in mittlerer Überlebensdauer.

Tumor Kontrolle A B X Xl X2 Z Zl Z2

EA 21 Tage ^65 61 60 765 ;>65 >65 ;

YC8 26 Tage 35 27 40 62 33 55 49 28

Die dargestellten Ergebnisse beziehen sich auf die Aktivität der Produkte gegen die Entwicklung des Tumors.

Aus den Ergebnissen kann gefolgert werden, daß die Produkte X, Xl und X2 pyrogen, Schwartzmann-positiv (ausgenommen Produkt Xl) sind und eine Adjuvans—Aktivität aufweisen, die sehr hoch ist, und Mäusen eine nicht-spezifische Immunität verleihen während die Produkte Z, Zl und Z2 nicht pyrogen sind, Schwartzmann-negativ sind und eine Adjuvans-Aktivität im üblichen Rahmen des Produkts aufweisen und eine sehr schwache nicht-spezifische Immunitätswirkung zeigen.

Die Erfindung bezieht sich weiterhin auf Arzneimittel, die Produkte enthalten, die nach dem erfindungsgemäßen Verfahren hergestellt worden sind. Bezüglich der Adjuvans-Aktivität

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der unterschiedlichen Produkte, die bei den Fraktionen mehr oder weniger wesentlich ist, können diese Fraktionen bei Vaccinen gebraucht werden, um diese Wirkung zu verstärken. Vorzugsweise benutzt man Fraktionen, die eine überlegene Adjuvans-Aktivität aufweisen, insbesondere die Produkte X, Xl und X2.

Gleicherweise können die Produkte A, B, Z, Zl und Z2 gut verwendet werden, bei denen die Adjuvans-Aktivität weniger ausgeprägt ist, da bei bestimmten dieser Produkte und insbesondere bei den Produkten Z, Zl und Z2 keine pyrogenen Wirkungen auftreten und diese nur schwach toxisch sind.

Die Dosen der Produkte hängen von der Tierspezies oder von deren Nutzbarmachung für eine Vaccine für den Menschen ab. Die Antigendosis für jede Vaccine in der notwendigen Quantität soll ausreichen, bei der in Betracht genommenen Spezies, ein zufriedenstellendes Immunitätsniveau sicherzustellen.

Andererseits gestatten die bemerkenswerten Stimulationseigenschaften für die Immunitätsfunktionen gegenüber bakteriellen oder Virusinfektionen und gegenüber Tumorprozessen, daß die Produkte X und X2 (und in gleicher Weise A und B) als immunostimulierende Arzneimittel verwendet werden.

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Claims

Patentansprüche

1. Verfahren zur Trennung von verschiedenen Fraktionen von Endotoxinen von Bakterien, insbesondere des Endotoxins von Bordetella Pertussis, dadurch gekennzeichnet, daß man in einer Hauptstufe eine schonende Hydrolyse des Endotoxins, das gegebenenfalls gereinigt worden ist, mittels einer organischen Säure bei einem pH-Wert zwischen 2 und 4 durchführt und die überstehende Flüssigkeit abtrennt und den Bodensatz gefriertrocknet, welchen man als Produkt A isoliert.

2. Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß man als organische Säure Trifluoressigsäure verwendet.

3. Verfahren nach jedem der Ansprüche 1 und 2, dadurch gekennzeichnet, daß man die Hydrolyse bei einer Temperatur zwischen 40 und 60 C über einen Zeitraum von 50 bis 150 Stunden durchführt.

4. Verfahren nach den vorhergehenden Ansprüchen, dadurch gekennzeichnet, daß man das gemäß Anspruch 1 erhaltene Produkt A einer Extraktion unterwirft, welche einerseits zu einem Extrakt (Produkt X) und andererseits zu einem Rückstand (Produkt B) führt, wobei man das Produkt X mit einem anderen Lösungsmittel extrahiert, als in der vorhergehenden Extraktion verwendet worden war, und den gewonnenen neuen Extrakt (Produkt Xl) und einen Rückstand (Produkt X2) isoliert.

5. Verfahren nach Anspruch 4, dadurch gekennzeichnet, daß man das Produkt B einer Hydrolyse mit einer Säure bei einem pH-Wert gleich oder kleiner als 1 mit Hilfe von Salzsäure unterwirft und daß man nach Abtrennen von der überstehenden Flüssigkeit den Bodensatz gefriertrocknet und diesen (Produkt Z) gegebenenfalls einer weiteren Extraktion unterwirft und den Extrakt (Produkt Zl) sowie den Rückstand (Produkt Z2) isoliert.

809851/0736 " ³ "

JNSPECTED

-X-

6. Verfahren nach jedem der Ansprüche 1 bis 4, dadurch gekennzeichnet, daß man das Produkt A durch Extraktion mit Hilfe eines Gemisches aus Toluol und Methanol im Verhältnis 1 : 1 gewinnt.

7. Verfahren nach jedem der Ansprüche 1 bis 4, dadurch gekennzeichnet, daß man das Produkt X durch Extraktion mit Hilfe von Methanol gewinnt.

8. Verfahren nach Anspruch 5, dadurch gekennzeichnet, daß man die Hydrolyse von Produkt B bei einer Temperatur von etwa 100 C über einen Zeitraum von etwa 30 Minuten durchführt.

9. Verfahren nach Anspruch 5, dadurch gekennzeichnet, daß man das Produkt Z mit Hilfe von Hexan extrahiert.

10. Verfahren nach Anspruch 5, dadurch gekennzeichnet, daß man das Produkt Z2 durch Extraktion mittels eines Gemisches von Toluol und Methanol im Verhältnis 1 : 1 reinigt.

11. Die Produkte A, B, X, Xl, X2, Z, Zl und Z2, hergestellt nach einem der in den Ansprüchen 1 bis 10 beschriebenen Verfahren.

12. Die Produkte X, Xl, X2 nach Anspruch 11, dadurch gekennzeichnet, daß sie eine erhöhte Adjuvans-Aktivität besitzen und Mäusen eine nicht-spezifische Immunität verleihen.

13. Produkte Z, Zl und Z2 nach Anspruch 11, dadurch gekennzeichnet, daß sie eine vom Endotoxin unterschiedliche Adjuvans-Aktivität aufweisen und eine schwache nicht-spezifische Immunität gegenüber Mäusen bewirken.

14. Arzneimittel, dadurch gekennzeichnet, daß es eins oder mehrere der Produkte A, B, X, Xl, X2, Z, Zl oder Z2 enthält, die nach einem der Ansprüche I bis 10 erhalten worden sind, oder daß es eine Mischung dieser Produkte enthält.

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15. Arzneimittel nach Anspruch 14, dadurch gekennzeichnet, daß es die Wirkung einer Vaccine verstärkt, daß es die Abwehrkraft des Organismus verstärkt und daß es die Bekämpfung
verschiedener Infektionskrankheiten erlaubt.

16. Vaccine, dadurch gekennzeichnet, daß sie eine ausreichende Menge mindestens eines Produkts der Gruppe, ausgewählt aus den Produkten X, Xl und X2 und Gemische davon enthält.

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