DE69013134T2

DE69013134T2 - Extrakte von acanthospermum hispidum-pflanzen.

Info

Publication number: DE69013134T2
Application number: DE69013134T
Authority: DE
Inventors: Klaus Eichmann; Manuel Modolell
Original assignee: Merck Patent GmbH
Current assignee: Merck Patent GmbH
Priority date: 1989-07-28
Filing date: 1990-07-27
Publication date: 1995-02-16
Anticipated expiration: 2010-07-28
Also published as: JPH04500820A; DE3925109A1; EP0436690A1; ES2061053T3; US5256416A; EP0436690B1; AU635553B2; AU6073690A; DE69013134D1; ATE112489T1; CA2035031A1; DE3925109C2; WO1991001741A1

Description

Die Erfindung betrifft einen Extrakt von Acanthosperxnum hispidum-Pflanzen, der wasserlösliche Bestandteile mit einem Molekulargewicht > 2000 enthält.
Die Erfindung betrifft weiterhin die Verwendung des Acanthospermum hispidum-Extrakts als Arzneimittel. Die Erfindung betrifft außerdem die Verwendung von Extrakten von Acanthospermum hispidum-Pflanzen zur Immunmodulation (Beeinflußung des Immunzustands) von Säugetieren, als Mittel gegen Strahlenkater sowie für Prophylaxe und Therapie von durch Viren und Retroviren bedingten Krankheiten bei Säugetieren, und für die Tumortherapie.
Die Erfindung betrifft schließlich ein Verfahren zur Herstellung eines Extrakts von Teilen der Acanthospermum hispidum-Pflanze und zur Trennung ihrer Inhaltsstoffe aufgrund deren Molekulargewicht.
Bei Acanthospermum hispidum (compositae) handelt es sich um eine aus Südamerika stammende Pflanze, die jetzt in der ganzen Welt in den Tropen verbreitet ist. In der traditionellen Medizin haben westafrikanische Eingeborenenstämme Arcanthospermum hispidum (A.h.) zur Herstellung von Tee (-extrakt) verwendet, der bei der Behandlung von Gelbsucht verwendet werden kann. A.h. wird weiterhin bei der Behandlung von Herpes labialis verwendet, wobei der Saft der Blätter auf die betroffene Stelle getupft wird.
Die therapeutische Wirkung dieser Extrakte (sowie die Wirkung des aus den Blättern gewonnenen Safts) bei der Behandlung von Herpes labialis besteht in einer Schmerzlinderung innerhalb von ein bis drei Stunden nach der Anwendung, Verkürzung des Heilungsvorgangs auf zwei bis drei Tage sowie Verlängerung des Rezidivzeitraumes. Wird dieses Naturheilmittel innerhalb der ersten paar Stunden nach Auftreten der Symptome verabreicht, so unterdrückt es im Normalfall vollständig jegliche Bildung von Lesionen. Der Extrakt ist auch gegen Herpes genitalis wirksam.
Eine Aufstellung der Inhaltsstoffe von A.h. findet sich in der Monographie "The Biology and Chemistry of the Compositae", von V.R. Heywood, J.B. Harborne und B.L. Turner (Herausgeber), Academic Press, London, New York, San Francisco, 1977. Melampolide, Galaktoside und Acetylene wurden aus A.h. von der Gruppe F. Bohlmann in Berlin isoliert und ihre chemische Struktur wurde aufgeklärt. (Phytochemistry, 1979, Band 18, Seiten 625- 630; Planta Medica, 1986, Seiten 154-155; Phytochemistry, 1976, Band 15, Seiten 1776-1778). Die etherischen Öle dieser Pflanze wurden auf ihre mikrobielle und antimykotische Wirkung hin untersucht (S.R. Jain et al., Planta Medica, 1972, Band 22, Seite 136; und S.R. Jain und A. Kar, Planta Medica, 1971, Band 20, Seite 118) Toxikologische Untersuchungen zur Verwendung von A.h. als Futterpflanze wurden von B. Ali und I. Adam bei Ziegen und Mäusen durchgeführt (J. Comp. Pathology, 1978, Band 88, Seiten 443-448 und Seiten 533-544).
Acanthospermum hispidum bzw. ein Extrakt dieser Pflanze ist bis heute nicht allgemein verwendet worden, da eine mündliche Verabreichung aufgrund der Giftigkeit einiger Inhaltsstoffe nicht möglich ist.
Aufgabe der Erfindung ist daher die Bereitstellung einer ungiftigen, jedoch therapeutisch wirksamen Arcanthospermum hispidum-Zubereitung. Dieses Ziel wird durch die überraschende Erkenntnis erreicht, daß durch Entfernen der niedermolekularen Bestandteile aus dem Acanthosperum hispidum-Extrakt die Giftwirkung des Extrakts verschwindet.
Ein Gegenstand der Erfindung ist daher die Bereitstellung eines Extrakts von Acanthospermum hispidum-Pflanzen, der wasserlösliche Bestandteile dieser Pflanze mit einem Molekulargewicht von > 2000 enthält.
Ein weiterer Gegenstand der Erfindung ist die Bereitstellung dieses Extrakts von Acanthospermum hispidum-Pflanzen zur Verwendung als Arzneimittel, insbesondere als Immunmodulator, als Mittel gegen Strahlenkater, bei der Prophylaxe und Therapie von Viruskrankheiten bzw. durch Retroviren bedingten Krankheiten bei Säugetieren und bei der Tumortherapie.
Wäßrige Extrakte von Acanthospermum hispidum sind als erfindungsgemäße Extrakte bevorzugt. Andere Extraktionsmittel, wie z.B. Ethanol, Chloroform, Isopropanol, Benzin usw. sind jedoch ebenfalls verwendet worden. Im folgenden wird die Erfindung anhand eines wäßrigen Extrakts erörtert und veranschaulicht. Unter dem Begriff "wäßriger Extrakt" ist ein im wesentlichen wäßriger Extrakt zu verstehen, d.h. der Extrakt kann geringe Mengen eines nichtwäßrigen Lösungsmittels, wie z.B. nicht inehr als 10, vorzugsweise nicht mehr als 5 Vol.-%, bzw. einer wasserlöslichen Verbindung, wie z.B. Salze, Zucker, wie Glucose, oder Säuren, wie Ascorbinsäure, enthalten, solange dies sich nicht auf den im wesentlichen wäßrigen Charakter des Extrakts auswirkt.
Zur Gewinnung des Extrakts werden frische oder getrocknete Blätter von Acanthospermum hispidum in Wasser suspendiert, wobei das Wasser gegebenenfalls einen oder mehrere der vorstehend erwähnten Zusatzstoffe enthalten kann, und die Suspension wird bei einer Temperatur zwischen 4ºC und 100ºC, vorzugsweise bei Raumtemperatur, homogenisiert. Die unlöslichen Bestandteile werden zuerst durch Zentrifugation und Filtration abgetrennt. Überstand und Filtrat werden jeweils gefriergetrocknet, um flüchtige Substanzen aus dem Extrakt zu entfernen.
Das Produkt wird anschließend in destilliertem Wasser gelöst, zentrifugiert, um unlösliche Bestandteile zu entfernen, und einer Behandlung zur Entfernung der niedrigmolekularen Bestandteile unterzogen. Es wird vorzugsweise eine Stunde lang bei 100.000 g zentrifugiert und gegen phosphatgepufferte physiologische Kochsalzlösung (PBS) dialysiert. In einer weiteren Ausführungsform werden die niedermolekularen Bestandteile mittels Ammoniumsulfatfällung abgetrennt. Durch diese Schritte wird garantiert, daß Bestandteile mit einem Molekulargewicht von < 2.000 aus dem Extrakt entfernt werden. Die unten beschriebenen biologischen Wirkungen sind in der makromolekularen Fraktion enthalten.
Die Enzymbehandlung des Extrakts mit Trypsin, Chymotrypsin, Pronase, Amyioglucosidase oder DNase hat keinen Einfluß auf die Wirkung des Extrakts. Auch Hitze (5 Minuten bei 100ºC) zerstört seine Wirkung nicht, wohl aber Säurehydrolyse oder Perjodat-Oxidation Der Anteil an Aminosäuren ist äußerst gering, nämlich ungefähr 0,2%. Der Extrakt enthält die folgenden Zucker: Rhamnose, Fucose, Ribose, Arabinose, Xylose, Mannose, Glucose und Galactose.
Der erfindungsgemäße wäßrige Extrakt (der im folgenden als "A.h.-Extrakt" bezeichnet wird) weist eine Reihe von biologischen Wirkungen auf:

1. Direkte antivirale und antiretrovirale Wirkung:

Dies wurde bei VSV (Vesicular Stomatitis Virus), MHV3 (Mäuse-Hepatitusvirus 3) und HIV (Human Immune Deficiency Virus) nachgewiesen.
VSV und HIV wurden mit A.h.-Extrakt inkubiert und anschließend mit Mäuse-Fibroblasten-Zellkulturen (VSV) bzw. MT4-Zellen (HIV) titriert, um die virusneutralisierende Wirkung des A.h.-Extrakts zu messen.
Die Ergebnisse dieser Tests zeigen, daß sogar mit stark verdünnten A.h.-Extrakten eine dauerhafte Neutralisierung der Viren erreicht wird. Die mögliche Verwendung von A.h.-Extrakt bei der Therapie infizierter Subjekte wurde an Mäusen getestet, die mit MHV3 infiziert worden waren und denen verschiedene Dosen A.h.-Extrakt entweder subkutan oder oral verabreicht wurden. Im Vergleich zu Kontrollmäusen, die auf gleiche Weise infiziert worden waren, denen jedoch kein A.h.-Extrakt verabreicht worden war, wurde nach Verabreichung von A.h.-Extrakt über einen Zeitraum von fünf Tagen eine wesentlich höhere Überlebensrate beobachtet.

2. Positiver Einfluß auf den Immunzustand von Säugetieren:

Dies wurde bei Human- und Mäusezellkulturen durch Zugabe von A.h.-Extrakt nachgewiesen.
Zusätzlich zur virusneutralisierenden Wirkung wurde ein positiver Einfluß auf den Immunzustand beobachtet. Tests wurden außerdem in verschiedenen Systemen durchgeführt.
Um zu prüfen, ob die Proliferation von B-Lymphozyten induziert werden konnte, wurden Mäusemilzzellen (CBF) mit verschiedenen Mengen an A.h. inkubiert. Die Proliferation der Milzzellen wurde mit ³H-Thymidin oder mit alkaliner Phosphatase bestimmt.
In den überständen der Milzzellkulturen wurde nach 5 Tagen die IgM-Konzentration gemessen, wodurch die Stimulierung der IgM-Synthese in Mäuse-Milzzellkulturen bestimmt wurde. In weiteren Tests wurden Mäuse-Knochenmarkmakrophagen (KMM) verwendet, um die Stimulierung der Sauerstoffradikalbildung und die Induktion der Proliferation von reifen Knochenmarkmakrophagen zu messen. Die Stimulierung der Sauerstoffradikalbildung in menschlichen Granulozyten und die Induktion der Proliferation peripherer Humanlymphozyten wurden in analogen Tests untersucht. In allen Fällen wurde eine deutlich stimulierende und induzierende Wirkung von A.h.-Extrakt auf die Zellkulturen beobachtet.
Die Induktion der Interferonbildung in Mäuse- Knochenmarkmakrophagen konnte nachgewiesen werden. Zu diesem Zweck wurden Knochenmarkmakrophagen mit verschiedenen Verdünnungen des A.h.-Extrakts eine Stunde lang inkubiert und, nachdem die Zellen gewaschen worden waren, wurden sie weitere 24 Stunden ohne A.h.-Extrakt kultiviert. In den überständen dieser Kulturen wurde Interferon durch Neutralisierung von Viren nachgewiesen. Bei dem System handelte es sich um Stomatitis-Mäusevirus.

3. Therapie von Strahlenkater:

Dies wurde an Mäuse-Knochenmarkmakrophagen durchgeführt, die mit einer Weichstrahlenquelle bestrahlt worden waren. Die deutlich erhöhte überlebensrate von mit A.h.-Extrakt behandelten Zellen im Vergleich zu unbehandelten Zellen wurde durch Reduktion eines Farbstoffs bestimmt.

4. Therapeutische Antitumorwirkung:

Dies wurde anhand der Wirkung auf Mäuse-Meth-A-Fibrosarcom belegt.
Da die Versuche zur Wirkung des A.h.-Extrakts zeigten, daß sowohl spezifische als auch unspezifische Abwehrmechanismen des Organismus stimuliert wurden, fand man überraschenderweise, daß A.h.-Extrakte über eine sehr starke tumorhemmende Wirkung verfügen, die erfolgreich in vivo an tumortherapeutischen Modellen geprüft worden ist. Bei dem Prüfmodell handelte es sich um ein methylcholanthren-induziertes, transplantierbares Mäuse-Fibrosarcom (Meth A-Fibrosarcom, induziert von L. Old am Sloan Kettering Institute for Cancer Research in New York, U.S.A).
Zu diesem Zweck wird eine bestimmte kleine Menge Tumorzellen intrakutan in den Mittelbauch von Inzucht- Mäusen injiziert, die mit dem Fibrosarcom genetisch kompatibel sind. Dieser Tumor zeigt bei allen Mäusen einheitliches, relativ schnelles Wachstum und verursacht bei Nichtbehandlung innerhalb von fünf Wochen den Tod der Tiere. Die Größe des Tumors kann leicht festgestellt werden, da sich dieser direkt unter der Haut befindet und daher von außen leicht gemessen werden kann.
Im Versuch wurden Meth-A-Fibrosarcomzellen CBF1- Mäusen intrakutan in den geschorenen Mittelbauch injiziert. Am 3., 5. und 7. Tag nach Implantation des Tumors wurden A.h.-Extrakte subkutan in die Nähe der Leistenlymphknoten injiziert. Am 7., 14., 21. und 28. Tag nach Induktion der Tumore wurden die Tumorumfänge gemessen und die Tumormasse bestimmt. Am Versuchsende wurde die Anzahl der geheilten Tiere bestimmt.
Die Therapie mit A.h.-Extrakt verzögert zunächst das Tumorwachstum, reduziert anschließend die Tumormasse und führt schließlich beim Großteil der Tiere zum Abstoßen des Tumors. Die Extrakte ergaben eine Regressionsrate von bis zu 100%, d.h. alle behandelten Tiere wurden geheilt. Bei Langzeitbeobachtung über mehrere Monate zeigten die geheilten Mäuse keinen Rückfall.
Besonders interessant ist, daß das Abstoßen des Tumors zu einem Zeitpunkt stattfindet, zu dem die Therapie bereits beendet ist. Dies zeigt, daß A.h.-Extrakt über eine therapeutische Langzeitwirkung verfügt.
Die beigefügten Abbildungen zeigen:
Fig. 1: die antivirale Wirkung von A.h.-Extrakt gegen Mäuse-VSV, veranschaulicht an L929-Fibroblasten. Jeder Punkt zeigt den Titer der einzelnen Kulturen mit und ohne A.h.-Extrakt.
Fig. 2: die an MT4-Zellen gemessene Antiretrovirus-Wirkung von A.h.-Extrakt gegen HIV. HI-Viren werden von A.h.-Extrakt bis zu einer Verdünnung von 1:400 neutralisiert.
Fig. 3: Proliferationsinduktion von B-Lymphozyten von Mäuse-CBF-Milzzellen. Die Proliferation wird mit ³H- Thymidin oder mit alkaliner Phosphatase bestimmt.
Fig. 4: Stimulierung von Mäuse-Knochenmarkmakrophagen. Dies wird durch Umwandlung von kurzlebigen Sauerstoffradikalen in Lichtimpulse bestimmt. Die Sauerstoffradikale werden von Lucigenin oder Luminol aufgenommen.
Fig. 5: Proliferationsinduktion reifer Mäuse- Knochenmarkmakrophagen, Messung durch Induktion von ³H- Thymidin.
Fig. 6: Therapie von Strahlenkater an Mäuse- Knochenmarkmakrophagen. Die Lebensfähigkeit wird photometrisch (570 nm) durch Reduktion von MTT (3-(4,5- Dimethyl-thiazol-2-yl)-3,5-diphenyltetrazoliumbromid) getestet. Knochenmarkmakrophagen werden mit verschiedenen Dosen einer Weichstrahlenquelle (60KV, 25 mA) bestrahlt. Eine Stunde nach Bestrahlung wird A.h.-Extrakt zugegeben. Nach verschieden langer Inkubation der Kulturen mit A.h.- Extrakt bzw. Kontrollen ohne A.h.-Extrakt werden die Zellen mit 10 ul MTT-Lösung (5 mg/ml) vermischt und die Extinktion wird bestimmt.
Fig. 7: Tumortherapeutische Wirkung von A.h.- Extrakt bei Mäuse-Meth-A-fibrosarcom. Die induzierte Tumormasse wird am 7., 14., 21. und 28. Tag nach Induktion des Tumors und Injektion von A.h.-Extrakt bestimmt. Die Säule rechts gibt die Anzahl der geheilten Tiere und die Gesamtzahl der Versuchstiere an.
Fig. 8: Stimulierung der Sauerstoffradikalbildung in Humangranulozyten. Die Messung entspricht dem in Fig. 4 angegebenen Verfahren.
Fig. 9: Proliferationsinduktion peripherer Humanlymphozyten nach Verabreichung von A.h.-Extrakt. Es wurde der Einbau von ³H-Thymidin gemessen.

Die Beispiele veranschaulichen die Erfindung.

Beispiel 1

Herstellung von Acanthospermum hispidum-Extrakt aus frischen Blättern.
a. Ein kg frisch gepflückter Acanthospermum hispidum-Blätter wird zweimal mit 5 Liter destilliertem Wasser gewaschen. Die abgetropften Blätter werden mit 1 Liter destilliertem Wasser vermischt, in einen Homogenisierapparat überführt (z.B. Warring Blendor) und homogenisiert, bis die Blattstücke eine Größe von unter 1 mm² erreicht haben. Die während des Verfahrens herrschende Innentemperatur sollte nicht über 30ºC betragen. Die Blattmasse wird 20 Minuten bei 6.000 g zentrifugiert. Der Überstand wird durch ein Whatman-Filter Nr. 1 filtriert und gefriergetrocknet.
Die Ausbeute beträgt ca. 30 g. Dieser Rohextrakt kann trocken bei 4ºC bis zur weiteren Verwendung aufbewahrt werden.
b. Sechs g Rohextrakt werden mit 300 ml destilliertem Wasser vermischt, wobei man eine trübe Lösung erhält. Die Mischung wird bei 100.000 g eine Stunde bei 4ºC ultrazentrifugiert. Der Überstand wird anschließend 12 Stunden bei 4ºC gegen 4 x 10 l destilliertes Wasser dialysiert. Der Dialyseextrakt wird entweder bei 20ºC tiefgekühlt oder gefriergetrocknet. Die Ausbeute beträgt ca. 1,2 g.
c. Zur Ammonsulfatfällung werden 100 ml Dialyseextrakt bei 0ºC langsam unter ständigem Rühren mit 13,24 g Ammonsulfat (Endkonzentration 1 M) versetzt. Mit einer 25%-igen Ammoniaklösung wird der pH auf 7,2 eingestellt. Bei 0ºC läßt man weitere 30 Minuten rühren und einen Niederschlag bilden. Dann wird 10 Minuten bei 3000 g zentrifugiert (4ºC). Der Überstand (1 M) wird aufbewahrt, und das Sediment zum Waschen wieder in 10 ml 1 M Ammonsulfatlösung aufgenommen. Man zentrifugiert wieder 10 Minuten lang bei 3000 g (4ºC), und der Waschüberstand wird verworfen. Man löst Sediment 1 M in 30 ml destilliertem Wasser. Überstand 1 M wird langsam unter ständigem Rühren bei 0ºC mit 13,24 g Ammonsulfat (Endkonzentration 2 M) versetzt. Der pH wird mit einer 25%-igen Ammoniaklösung auf 7,2 eingestellt, und man fällt weitere 30 Minuten bei 0ºC aus. Man zentrifugiert 10 Minuten lang bei 3000 g (4ºC). Überstand 2 M wird aufbewahrt. Sediment 2 M wird wieder in 5 ml 2 M Ammonsulfatlösung aufgenommen und wieder 10 Minuten lang bei 3000 g zentrifugiert (4ºC). Der Waschüberstand wird verworfen. Sediment 2 M wird in 20 ml destilliertem Wasser gelöst. Sediment 1 M, Sediment 2 M und überstand 2 M werden jeweils 4 x 12 Stunden bei oac gegen 10 l destilliertes Wasser dialysiert, und die Dialysate werden gefriergetrocknet. Man erhält: ungefähr 200 mg Sediment 1 M; ungefähr 50 mg Sediment 2 M; ungefähr 95 mg Überstand 2 M.

Beispiel 2

Herstellung von Acanthospermum hispidum-Extrakt aus getrockneten Blättern.
200 g luftgetrocknete Blätter werden im Schneidgranulator zerkleinert. Zum Quellen mischt man die zerkleinerten Blätter mit 1 l destilliertem Wasser und rührt 18 Stunden bei 4ºC. Die Mischung wird im Homogenisierapparat (z.B. Warring Blendor) 3 x 60 Sekunden homogenisiert. Man erhitzt 10 Minuten im Wasserbad auf 100ºC. Anschließend wird zentrifugiert und gefriergetrocknet wie in Beispiel 1. Die weitere Aufarbeitung erfolgt wie für Beispiel 1, Punkt b und c beschrieben. Man erhält ungefähr 3,5 g Rohextrakt, ungefähr 0,75 g Dialyseextrakt, ungefähr 5 mg Sediment 1 M, ungefähr 55 mg Sediment 2 M und ungefähr 85 mg überstand 2 M.

Beispiel 3

Proliferation von Mäuse-Milzzellen in der Anwesenheit von A.h.-Extrakten.
Unter Sterilbedingungen werden Inzucht-Mäusen (z.B. CBF1,C3H, Balb/c) Milzzellen entnommen. Mit einem lose sitzenden Potter-Homogenisierapparat wird eine Zellsuspension hergestellt. Die Milzzellen werden erst zentrifugiert (5 Minuten bei 700 g und 4ºC) und anschließend im Gewebekulturmedium (DMEM) wieder aufgenommen. Das Medium enthält die folgenden Zusätze: 10% fötales Kälberserum, 50 uM 2-Mercaptoethanol, 5 ug Streptomycin/ml und 100 I.E. Penicillin/ml.
Die Zellzahl wird auf 5.000.000/ml eingestellt.
Jeweils 0,2 ml Zellsuspension wird in ein Näpfchen in Mikrotiterplatten (mit flachem Boden) überführt. Anschließend werden jeweils 10 ul der verschiedenen A.h.- Extraktlösungen (sterilfiltriert) zugegeben. Die Mikrotiterplatten mit den Zellkulturen werden in einem begasten Brutschrank (37ºC, 10% CO&sub2;, 98% relative Luftfeuchtigkeit) verschieden lang je nach Test inkubiert. Zur Bestimmung der B-Zellenproliferation an verschiedenen Tagen werden Parallelkulturen angesetzt. Dies ist deshalb erforderlich, da die Kulturen beim Erntevorgang nach Zugabe von ³H-Thymidin zerstört werden. Zur Bestimmung der Zellproliferation werden die Mikrotiterplatten 10 Minuten lang bei Raumtemperatur bei 700 g zentrifugiert. Die Zellsedimente werden mit jeweils 200 ul frischem Kulturmedium (inklusive der obengenannten Zusatzstoffe) und 0,2 uCi ³H-Thymidin vermischt.
Die Zellen werden weitere 6 Stunden in einem begasten Brutschrank inkubiert und anschließend mit einem im Handel erhältlichen Erntegerät (z.B. Skatron-Zellenerntegerät) geerntet. Die Radioaktivität in der Zell-DNA wird mit einem im Handel erhältlichen β-Scintillationszähler bestimmt.
Die Ergebnisse eines Versuchs nach Beispiel 3 sind aus Tabelle I ersichtlich. Die Zellen wurden 4 Tage inkubiert, bevor die Proliferation gemessen wurde. Die Proliferation wird als Prozentsatz in bezug auf die Kontrolle angegeben. Die Zahl in Klammern gibt die ³H-Impulse pro Minute in der Kontrolle an. Jede Kultur wurde mit 10 ug A.h.-Extrakt versetzt. Tabelle I Extrakte: Kontrolle Dialysat

Beispiel 4

Stimulierung der IgM-Synthese in Milzzellkulturen durch A.h.-Extrakte.
Es werden die Immunglobuline der Klasse M (IgM) bestimmt, da hauptsächlich diese Antikörperklasse in vitro gebildet wird. Die Kulturen werden auf Mikrotiterplatten wie in Beispiel 3 beschrieben hergestellt. Nach fünf tägiger Inkubation (37ºC, 10% CO&sub2;, 98% relative Luftfeuchtigkeit) wird fünf Minuten lang bei Raumtemperatur bei 700 g zentrifugiert.
100 ul werden von jedem Überstand entnommen und auf eine neue, für den Mäuse-IgM-ELISA-Test vorbehandelte Mikrotiterplatte aufgetragen. Als Indikatorreagenz verwendet man ein mit alkaliner Phosphatase gekuppeltes Anti-Mäuse- IgG-Antiserum (Ziege). Die in ug/ml angegebenen Mengen an Antikörper sind aus Tabelle II ersichtlich. Tabelle II (Dialysat) IgM

Beispiel 5

Proliferation von Mäuse-Makrophagen durch A.h.- Extrakte.
Die Makrophagen werden in vitro nach dem Metcalf- Verfahren gezüchtet. Hierfür werden Knochenmarkzellen aus dem Oberschenkelitnochen einer Maus isoliert und in einem Kulturmedium (DMEM), das 30% Fibroblasten-Kulturüberstand aus Zellinie L929 und 5% Pferdeserum enthält, kultiviert. Durch diese Zusätze werden die Mutterzellen zur Proliferation angeregt und differenzieren ausschließlich zu Makrophagen. Nach 10-tägiger Bebrütung bestehen diese Kulturen lediglich aus reinen Makrophagen, die keine Proliferationserscheinungen mehr aufweisen. Werden A.h.- Extrakte zugesetzt, so beginnen sie sich überraschenderweise neuerlich zu teilen, ohne daß dabei Dedifferenzierung stattfindet. Diese Proliferation wird folgendermaßen bestimmt:
Man vermischt 20.000 Makrophagen mit 200 ul Kulturmedium (wie in Beispiel 3 angegeben) und füllt damit jedes Näpfchen von Mikrotiterplatten. Dazu werden nun jeweils 10 ul der verschiedenen A.h.-Extrakte gegeben. In einem begasten Brutschrank wird die Mischung 4 Tage lang inkubiert und anschließend bei Raumtemperatur zentrifugiert (700 g/5 Minuten). Falls erwünscht werden die Überstände zum Nachweis von Interferon aufbewahrt. Jeweils 200 ul Kulturmedium und 0,2 uCi ³H-Thymidin werden auf die Zellen pipettiert. Es wird weitere 24 Stunden im begasten Brutschrank inkubiert. Die die Kulturen enthaltenden Mikrotiterplatten werden bei -20ºC gefroren, um die an der Kulturflasche haftenden Makrophagen zu entfernen, und dann aufgetaut, und die Radioaktivität der Zell-DNA wird wie in Beispiel 3 gemessen.

Beispiel 6

Nachweis der Induktion von Interferon durch A.h.- Extrakte in der Mäuse-Knochenmarkmakrophagenkultur.
Man vermischt 100.000 Makrophagen mit 200 ul Kulturmedium (DMEM; wie in Beispiel 3 beschrieben) und füllt jedes Näpfchen von Mikrotiterplatten mit der Mischung.
Die Mischung wird eine Stunde lang mit verschiedenen A.h.-Verdünnungen inkubiert. Die Zellen werden einmal mit Kulturmedium gewaschen und weitere 24 Stunden in der Abwesenheit von A.h.-Extrakt kultiviert. Die überstände werden anschließend zum Nachweis von Interferon abpipettiert.
Der Nachweis basiert auf der Neutralisierung des Mäuse-Vesicular-Stomatitis-Virus. Dieses Virus kann Mäuse-Fibroblasten (Zellinie L929) infizieren und sie durch Virusproliferation und -sekretion zerstören. Diese zytopathologische Wirkung kann unter dem Mikroskop beobachtet werden.
Hierzu werden 100 ul Kulturmedium auf Mikrotiterplatten mit 20.000 L929-Zellen beimpft.
Jeweils 100 ul Makrophagen-Kulturüberstand bzw. A.h.- Extrakte (verdünnt mit 100 ul Medium) als Kontrolle werden zugegeben.
Die Mikrotiterplatten werden in einem begasten Brutschrank 24 Stunden inkubiert (37ºC, 10% CO&sub2;, 98% relative Luftfeuchtigkeit).
Jedes Näpfchen wird mit 10 ul (entsprechend 7.000 infektiösen Einheiten) des Vesicular-Stomatitis-Virus (VSV) versetzt.
Es wird weitere 48 Stunden im begasten Brutschrank inkubiert.
Die Zellzerstörung (zytopathische Wirkung) bzw. deren mögliche durch Interferon verursachte Inhibierung in der Kultur wird mikroskopisch ausgewertet.
Die Ergebnisse solch eines Versuchs sind aus Tabelle III ersichtlich. Negative Vorzeichen bedeuten Zellzerstörung (zytopathische Wirkung), positive Vorzeichen deren Inhibierung durch die Anwesenheit von Interferon. Tabelle III A.h.-Extrakt (ug/Kultur) IF

Beispiel 7

Stimulierung der Bildung von Sauerstoffradikalen in Mäuse-Knochenmarkmakrophagen
Makrophagen aus dem Knochenmark werden in Teflon- Beuteln nach dem Metcalf-Verfahren (siehe Beispiel 5) gezüchtet. Die Messung erfolgt durch Umwandlung der äußerst kurzlebigen Sauerstoffradikale in Lichtimpulse. Hierfür verwendet man Substanzen wie z.B. Lucigenin oder Luminol, die als Rezeptoren für Sauerstoffradikale dienen. Aufgrund des Oxidationsvorgangs werden Photonen gebildet, die mit im Handel erhältlichen Geräten gemessen werden (Bioluminat, Hersteller: Berthold). Die Testzubereitung wird folgendermaßen hergestellt:
200.000 Knochenmarkmakrophagen werden in 0,2 ml DMEM ohne Phenolrot und NaHCO&sub3; mit 50 mM Hepes als Puffer eine Stunde lang bei 37ºC inkubiert. Die Messungen werden nach Zugabe von 0,2 ml DMEM, 10 ul Lucigeninlösung (11,6 uMol), und 10 ul der entsprechenden A.h.-Verdünnung (1 mg/ml) vorgenommen.

Beispiel 8

Therapie von Strahlenkater in Mäuse-Knochenmarkmakrophagen.
Mäuse-Knochenmarkmakrophagen werden mit einer Weichstrahlenquelle (60 KV, 25 mA) bestrahlt. Die Lebensfähigkeit der Zellen wird durch Reduktion von MTT (3- (4,5-Dimethyldiazol-2-yl)-3,5-diphenyltetrazoliumbromid) bestimmt. Pro Näpfchen werden 100.000 Knochenmarkmakrophagen inkubiert.
Eine Stunde nach der Bestrahlung wird der A.h.- Extrakt zugegeben. Nachdem die Zellen verschieden lang kultiviert wurden, werden sie mit 10 ul MTT-Lösung (5 mg/ml) vermischt, die Platten werden 4 Stunden bei 37ºC inkubiert und dann zentrifugiert, das Kulturmedium wird entfernt, und die Tetrazoliumblau-Kristalle werden in 100 ul Isopropanol/0,04 M HCl gelöst.
Die Farbe wird mit einem Mikrotiter-Photometer bei 570 nm bestimmt.

Beispiel 9

Tumortherapeutische Wirkung auf Mäuse-Meth-A- Fibrosarcom.
CBF1-Mäuse werden jeweils intrakutan mit 50.000 Meth-A-Fibrosarcomzellen in den geschorenen Mittelbauch injiziert. Am 3., 5. und 7. Tag nach der Implantation des Tumors wird 1 mg A.h.-Extrakt subkutan in die Nähe der Leistenlymphknoten injiziert.
Am 7., 14., 21. und 28. Tag nach der Tumorinduktion werden die Tumordurchmesser bestimmt. Da Tumoren nicht in völlig runder Form wachsen, werden der kleinste und der größte Durchmesser mit einer Schublehre bestimmt. Die Tumormasse wird nach der Formel
berechnet, was dem Rauminhalt eines halben Ellipsoids entspricht.

Beispiel 11

Proliferationsinduktion periphärer menschlicher Blutlymphozyten (PBL) durch A.h.-Extrakte.
20 ml heparinisiertes Vollblut (5 I.E. Heparin/ml) werden mit 60 ml physiologischer Kochsalzlösung verdünnt.
Man bringt 5 ml einer Ficoll-Isopaque-Lösung (Dichte 1,17) in Zentrifugenröhrchen ein und überschichtet es mit 5 ml verdünnten Bluts.
Es wird 30 Minuten lang bei 23ºC und 1700 g zentrifugiert. Die Zellen zwischen der unteren Phase (Ficoll- Isopaque) und der oberen Phase (verdünntes Plasma) werden abpipettiert. Anschließend verdünnt man die Zellen mit dem 10-fachen Volumen einer physiologischen Kochsalzlösung. Man zentrifugiert 10 Minuten bei Raumtemperatur und 700 g und verwirft den Überstand.
Das Zellsediment wird zweimal mit 10 ml einer physiologischen Kochsalzlösung wieder aufgenommen und wie oben beschrieben zentrifugiert. Dann wird das Zellsediment mit DMEM + fötalem Kälberserum + Zusätzen (siehe Beispiel 3) vermischt und auf eine Konzentration von 500.000 Zellen/ml eingestellt.
Jedes Näpfchen von Mikrotiterplatten (mit flachem Boden) wird mit 0,2 ml Zellsuspension (100.000 PBL pro Näpfchen) gefüllt.
Jeweils 10, 5, 2,5 und 0 ug der A.h.-Extraktlösungen werden in die Näpfchen gegeben. Die Mikrotiterplatten mit den Zellkulturen werden vier Tage lang im begasten Brutschrank inkubiert (37ºC, 10% CO&sub2;, 98% relative Luftfeuchtigkeit).
Die Kulturen werden bei 10 Minuten bei Raumtemperatur bei 700 g zentrifugiert und die Überstände verworfen.
Die Zellsedimente werden mit jeweils 200 ul Kulturmedium + Zusätze + 0,2 uCi ³H-Thymidin vermischt.
Nachdem die Zellen weitere 24 Stunden im begasten Brutschrank inkubiert wurden, werden sie geerntet, und die Radioaktivität in der Zell-DNA wird wie in Beispiel 3 beschrieben bestimmt.

Beispiel 11

Direkte Antiviruswirkung gegen Vesicular- Stomatitis-Virus (VSV).
0,5 ml VSV mit einem Titer von 2 x 10 infektiösen Partikeln/ml werden mit 2,5 mg A.h.-Extrakt in Hepesgepuffertem DMEM eine Stunde lang bei 23ºC inkubiert. Dieser Ansatz und die entsprechende Kontrolle ohne A.h.- Extrakt werden mit DMEM logarithmisch verdünnt (1:2, 1:4, 1:8, 1:16, usw.). Die L929-Fibroblastenkulturen auf Mikrotiterplatten (5 x 10&sup4; Zellen/Näpfchen) werden mit 10 ul der jeweiligen Verdünnung versetzt. Nach 48-stündiger Inkubation bei 37ºC und 98% Luftfeuchtigkeit unter 10% CO&sub2; wird die zytopathische Wirkung bestimmt. Fig. 1 zeigt die niedrigsten Verdünnungen mit negativem Wert.

Beispiel 12

Direkte Antiviruswirkung gegen MHV3.
0,5 ml einer MHV3-Virussuspension mit einem Titer von 2,5 x 10³ infektiösen Partikeln/ml wird mit verschiedenen Mengen an A.h.-Extrakt nach Tabelle IV in Hepes-gepuffertem DMEM eine Stunde lang bei 23ºC inkubiert. L929-Kulturen auf Mikrotiterplatten werden mit 10 ul des jeweiligen Ansatzes versetzt und 24 Stunden inkubiert (Zellenzahl: 5 X 10&sup4;/Näpfchen, Inkubationsbedingungen: 37ºC, 10% CO&sub2;, 98% Luftfeuchtigkeit). Die erhaltenen Plaques werden unter dem Mikroskop anhand von acht Parallelkulturen bestimmt. Tabelle IV A.h. (ug/Kultur) Plaques/Kultur

Beispiel 13

Direkte antiretrovirale Wirkung gegen HIV.
Zellen der T-Zellinie MT4 werden mit HIV-1 (Titerverdünnung 1:200) mit oder ohne A.h.-Extraktverdünnung (10 ul/Näpfchen) auf einer Mikrotiterplatte infiziert.
Die Verdünnung des A.h.-Extrakts bis zu welcher HIV-1 neutralisiert wird, wird bestimmt.

Claims

1.Extrakt von Acanthospermum hispidum-Pflanzen, enthaltend wasserlösliche Bestandteile dieser Pflanze mit einem Molekulargewicht > 2000, wobei Bestandteile mit einem Molekulargewicht von < 2000 aus dem Extrakt entfernt worden sind.

2. Extrakt nach Anspruch 1 zur Verwendung als Arzneimittel.

3. Extrakt nach Anspruch 1 zur Verwendung als Immunmodulator.

4. Extrakt nach Anspruch 1 zur Verwendung als Antitumormittel.

5. Extrakt nach Anspruch 1 zur Verwendung in der Behandlung von Strahlenkater.

6. Extrakt nach Anspruch 1 zur Verwendung in der Prophylaxe und Therapie von Viruskrankheiten bei Säugetieren.

7. Extrakt nach Anspruch 1 zur Verwendung in der Prophylaxe und Therapie von Retroviruskrankheiten bei Säugetieren.

8. Verwendung von Extrakten von Acanthospermum hispidum-Pflanzen zur Herstellung einer pharmazeutischen Zusammensetzung zur Stimulierung der Immunmodulation.

9. Verwendung des Extrakts nach Anspruch 1 zur Herstellung einer pharmazeutischen Zusammensetzung für die Tumortherapie.

10. Verwendung von Extrakten von Acanthospermum hispidum-Pflanzen zur Herstellung einer pharmazeutischen Zusammensetzung zur Behandlung von Strahlenkater.

11. Verwendung des Extrakts nach Anspruch 1 zur Herstellung einer pharmazeutischen Zusammensetzung für die Prophylaxe und Therapie von Viruskrankheiten bei Säugetieren.

12. Verwendung von Extrakten von Acanthospermum hispidum-Pflanzen zur Herstellung einer pharmazeutischen Zusammensetzung für die Prophylaxe und Therapie von Retroviruskrankheiten bei Säugetieren.

13. Verfahren zur Herstellung des Extrakts nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß man Teile von Acanthospermum hispidum-Pflanzen mit Wasser extrahiert und dann die Inhaltsstoffe mit einem Molekulargewicht von < 2000 von dem Extrakt abtrennt.

14. Verfahren nach Anspruch 13, dadurch gekennzeichnet, daß man grüne Blätter der Pflanze für die Extraktion verwendet.

15. Verfahren nach Anspruch 13, dadurch gekennzeichnet, daß man getrocitnete Blätter der Pflanze für die Extraktion verwendet.

16. Verfahren nach Anspruch 13, dadurch gekennzeichnet, daß man die Extraktion bei einer Temperatur zwischen 4ºC und 100ºC durchführt.

17. Verfahren nach Anspruch 13, dadurch gekennzeichnet, daß man die Bestandteile mit einem Molekulargewicht von < 2000 vom Extrakt mittels Dialyse abtrennt.

18. Verfahren nach Anspruch 13, dadurch gekennzeichnet, daß man die Bestandteile mit einem Molekulargewicht von < 2000 vom Extrakt mittels Ammonsulfatfällung ab trennt.