DE2855433A1

DE2855433A1 - Testmittel und anzeiger zum nachweis von harnsaeure

Info

Publication number: DE2855433A1
Application number: DE19782855433
Authority: DE
Inventors: Eppie S Chang
Original assignee: Miles Laboratories Inc
Current assignee: Bayer Corp
Priority date: 1978-02-13
Filing date: 1978-12-21
Publication date: 1979-08-16
Also published as: DE2855433C2; AU514609B2; JPS584916B2; JPS589697A; JPS6180B2; IT7947953A0; IT1114497B; GB2014155B; FR2417105B1; JPS54121199A; FR2417105A1; US4230798A; AU4415479A; CA1093440A; JPS5841835B2; GB2014155A; JPS585190A

Description

HOFFMANN · ΕΓΓΙΖΕ <£ PASTNSR

PATENTANWÄLTE 2655433

DR. ING. E. HOFFMANN [1930-Wi) . DIPL-IN G. W.EITLE . D R. RER. MAT. K. HOFFMANN . DIPL.-ING. W. LEHN

DIPL.-ING. K. FOCHSLE · DR. RER. NAT. B. HANSEN ARABELIASTRASSE 4 (STERNHAUS) . D-SOOO MONCH EN 81 · TELEFON (089) 911087 · TELEX 05-29619 (PATHE)

31 526 m/wa

MILES LABORATORIES INC., ELKHART, INDIANA / USA

Testmittel und Anzeiger zum Nachweis von Harnsäure

Die Erfindung betrifft ein Testmittel und einen Anzeiger zum Nachweis von Harnsäure, sie betrifft insbesondere einen vereinheitlichten Reagenztest zur Bestimmung von Harnsäure in einer flüssigen Probe und stellt somit einen in der Diagnostik anwendbaren Test dar.

Im Metabolismus des Primaten findet eine konstante endogene Umwandlung von aufgenommenen Nukleoproteinen zu Purinen und Pyrimidinen statt. Die Purine erfahren dann durch einen

909833/0546

katabolischen Prozess eine weitere Deaminierung und Teiloxidation zu Harnsäure, die beim Menschen in der Regel im Urin ausgeschieden wird. Auf diese Weise liegt im menschlichen Blut und Urin immer eine nominale Konzentration an Harnsäure vor.

Im allgemeinen hat die Aufnahme von purinhaltiger Nahrung auf den Gehalt an Harnsäure im Blutserum keinen Effekt, mit Ausnahme bei einer unzureichenden Leistung der Niere, z.B. bei Nierenversagen, wobei in diesem Falle die Konzentration erhöht ist. Bei bestimmten anderen pathologischen Zuständen, die nicht mit der Nahrungsaufnahme von purinhaltiger Nahrung in Verbindung stehen, z.B. bei Urämie und Gicht, liegt eine abnormale Zunahme der im Blutserum vorhandenen Harnsäuremenge vor. Ausserdem wird die Konzentration der Harnsäure im Serum bei solchen Zuständen erhöht, die mit einer exzessiven Zerstörung von Leukozytenkernen in Verbindung stehen, wie z.B. bei Leukämie und Lungenentzündung.

Ein Serumharnsäuretest wird deshalb als geeignetes Hilfsmittel bei der Diagnose der voranstehend genannten Zustände angesehen und dient in einigen Fällen zur Unterscheidung zwischen nahe verwandten abnormen Zuständen, z.B. bei Gicht und Arthritis. Die Gicht ist durch eine abnormale Zunahme der Harnsäure im Blutserum gekennzeichnet, während siclv im Falle von Arthritis keine Zunahme ergibt. Es ist deshalb wünschenswert, einen einfachen und ökonomischen Test zur Verfügung zu stellen, der eine genaue und spezifische Bestimmung der im Blutserum enthaltenen Harnsäurekonzentration erlaubt .

Harnsäure liegt im allgemeinen im Blutserum in Mengen von etwa

909833/0546

2*55433

0,7 bis etwa 6,0 mg/100 ml Blutserum vor und wird im allgemeinen als Milligrammprozent (mg%) angegeben. Bei den vorstehend aufgezählten abnormalen Zuständen erreicht der Harnsäuregehalt im Blutserum oft Werte von 10 mg% und darüber.

Es ist eine Reihe von Verfahren zur Bestimmung von Harnsäure im Blutserum bekannt. Unter den häufig angewandten bekannten Methoden sind die cholorimetrischen Verfahren unter Verwendung von Blutfiltraten zu nennen. Einige dieser Verfahren nutzen die Ausfällung von Harnsäure im Blutfiltrat, z.B. als Silbersalz, und die Bildung eines chromogenen Adduktes durch Reaktion mit einem Phosphorwolframat oder einem Arsenowolframat. Bei anderen Methoden, die vom Blutfiltrat ausgehen, erfolgt eine direkte Behandlung des Filtrates mit Wolframsäure in Gegenwart einer Cyanid-Hamstoff-Lösung unter Entwicklung einer Farbe, die dann mittels üblicher Methoden gemessen wird, um die Harnsäurekonzentration quantitativ zu bestimmen.

In letzter Zeit wurden Verfahren vorgeschlagen, die eine katalysierte Oxidation der Harnsäure zu Allantoin und Wasserstoffperoxid umfassen. Diese Oxidation wird im allgemeinen in Gegenwart von atmosphärischem Sauerstoff durchgeführt, wobei ein Material mit üricaseaktivität verwendet wird, und die Reaktion bei oder nahe pH 9 erfolgt. Bei diesen Verfahren kann ein Spektrofotometer verwendet werden, um das Verschwinden des charakteristischen Harnsäurespektrums während der Umwandlung zu Allantoin und Wasserstoffperoxid zu bestimmen. Nach einer anderen Methode wird das in stöchiometrischen Mengen während des Abbaus der Harnsäure gebildete Wasserstoffperoxid colorimetrisch bestimmt. Hierzu wird beispielsweise auf die US-PSen 3 349 006 und 3 335 069 der Anmelderin hingewiesen.

909833/0546 - 9 -

-a- 28S5433

Beimenzymatischen Umwandlungstest, bei welchem die gebildete Menge an Wasserstoffperoxid direkt proportional der im Blutserum vorliegenden Harnsäuremenge ist, wird das Wasserstoffperoxid mittels eines Farbumschlages nachgewiesen, der durch Oxidation einer farbbildenden Substanz in Gegenwart einer peroxidativ wirkenden Substanz erfolgt. Diese Reaktion erfolgt bei saurem pH. Ein Catalaseinhibitor, wie Natriumazid oder Natriumcyanid, war in der Regel erforderlich, um eine Zerstörung des Peroxids durch Catalase zu verhindern. Die erhaltene Farbe wird dann visuell mit Standardproben verglichen oder elektronisch gemessen, um eine quantitative Bestimmung der in der Testlösung vorliegenden Harnsäure zu erlauben.

Die französische Anmeldung 72/31 557 offenbart eine völlig unterschiedliche enzymkatalysierte Reaktion, bei der Catalase und aldehydfreies Methanol zusammen mit Uricase zu der Probe (die auf pH 8 gepuffert ist) zugegeben werden,worauf 3-Methyl-2-benzothiazolinon-hydrazon (gepuffert auf pH 3) und FeCl^ in HCl unter Blaufärbung zugegeben werden.

US-PS 3 862 885 (Kano) beschreibt ein Verfahren zur Bestimmung von Harnsäure, wobei die Bildung von Wasserstoffperoxid mit einer Uricase aus Mikroben zusammen mit einem Catalaseinhibitor (auf pH 5,5 bis 7,0 gepuffert) erfolgt und das gebildete Peroxid in Gegenwart eines anionischen oberflächenaktiven Mittels, eines Chromogens und Peroxidase (pH 4,0 bis 7,0) bestimmt wird.

Von Gochman und Schmitz wurde in Clin. Chem. 17 (1971), Seite 1154, die Verwendung von S-Methyl^-benzothiazolinon-hydrazon-Hydrochlorid mit N,N-Dimethylanilin unter Bildung eines Azofarbstoffindikators bei der automatisierten Bestimmung von Harnsäure berichtet.

909833/0546 * " ¹⁰ "

2055433

Trotz dieser Beiträge auf diesem Gebiet hatten die genannten Verfahren den Nachteil, dass eine Reihe von separaten Schritten erforderlich war, die im allgemeinen in flüssiger Phase durchgeführt wurden. Es wurde als nicht möglich angesehen, gekoppelte Reaktionen unter gleichzeitiger Verwendung von tierischer Üricase und Peroxidase durchzuführen, und zwar aufgrund der !Competition zwischen Harnsäure und dem Chromogen, die beide durch HoO^ in Gegenwart von Peroxidase oxidert werden, sowie aufgrund des drastischen Unterschiedes im pH-Optimum der beiden verwendeten Enzyme. Nach den bekannten Verfahren, bei denen die beiden Reaktionen beim gleichen oder nahezu beim gleichen pH-Wert durchgeführt wurden, trat der weitere Nachteil auf, dass bestimmte Substanzen der Reaktionskomponenten, wie z.B. üricase tierischen Ursprungs, die zwar überlegene Eigenschaften aufweisen, jedoch aufgrund der Tatsache, dass sie als eine Komponente des Peroxidasesystems innerhalb des für die Reaktion erforderlichen pH-Bereiches nicht reaktionsfähig sind, nicht verwendet werden können.

Aus diesen Grunde war es bisher nicht möglich, die Testmittel· zur Bestimmung von Harnsäure in einen stabilisierten, vereinheitlichten Reagenztest einzubauen.

Aufgabe der vorliegenden Erfindung ist es, ein vereinheitlichtes Testmittel, wie z.B. eine Zusammensetzung oder einen Anzeiger zur Bestimmung von Harnsäure in Körperflüssigkeiten zur Verfügung zu stellen.

Ausserdem ist es Aufgabe der Erfindung, eine Harnsäure-Testzusammensetzung und einen Anzeiger, der für Untersuchungen einer grossen Anzahl von Proben besonders gut geeignet ist, zu schaffen.

909833/0546

2*55433

Ausserdem ist es Aufgabe der Erfindung, einen Anzeiger zur Verfügung zu stellen, mit dem in einem Operationsschritt der Harnsäuretest durchgeführt werden kann, wobei dieser Anzeiger über längere Zeit hin stabil ist.

Eine weitere Aufgabe der Erfindung ist es, einen verbesserten Test zum Nachweis von Harnsäure zu schaffen. Diese Aufgabe wird erfindungsgemäss durch Inkorporierung einer neuen gereinigten Substanz tierischen Ursprungs mit Urikaseaktivitat, die frei an pH-empfindlichen Verunreinigungen mit einem Molekulargewicht von unter 6.000 ist, gelöst.

Gemäss der Erfindung wird ein vereinheitlichtes Testmittel, wie z.B. eine Zusammensetzung oder ein Anzeiger, die in diesen verwendete gereinigte üricase, eine Methode zur Herstellung des Anzeigers und ein Verfahren zur Bestimmung von Harnsäure mit demselben zur Verfügung gestellt. Insbesondere wird die vorstehende Aufgabe dadurch gelöst, dass in Testmitteln zum Nachweis von Harnsäure unter Verwendung einer Substanz mit Uricaseaktivität, mindestens einem Chromogen und einer peroxidativ wirksamen Substanz, zur Verbesserung derselben eine Uricase-aktive Substanz tierischen Ursprungs, die frei an pH-empfindlichen Verunreinigungen mit einem Molekulargewicht von unter 6.000, verwendet wird. Die Testmittel können in Form einer Zusammensetzung vorliegen, die darüber hinaus mindestens ein Kopplungsreagenz und mindestens ein Stabilisierungsreagenz umfassen kann. Gewünschtenfalls können die Zusammensetzungen in einen Träger, wie eine Tablette oder Matrix, unter Bildung eines Anzeigers inkorporiert werden. Die Substanz mit Uricaseaktivität wird durch Fraktionierung von tierischen Standard-Uricasepräparationen gereinigt, um niedermolekulare Verunreinigungen zu entfernen; diese gereinigte Uricase ist über einen pH-Bereich stabil, der bis zu diesem Zeitpunkt unerreichbar war, was wiederum einen vereinheitlichten Test gewährleistet.

909833/054 6

- 12 -

Die gereinigte Uricase-aktive Substanz tierischen Ursprungs, die in der oben beschriebenen Zusammensetzung eine kritische Komponente darstellt, wird durch Fraktionierungsreinigung von im Handel erhältlichen tierischen üricasepräparationen, wie sie z.B. von Miles Research Products, Miles Laboratories Inc., Elkhart, Indiana, 46514, erhalten werden können, gewonnen. Verunreinigungen, die gegenüber pH-Änderungen empfindlich sind und die ein verhältnismässig niederes Molekulargewicht aufweisen (unterhalb etwa 6.000) werden entfernt. In überraschender Weise wird durch diesen einfach erscheinenden Reinigungsprozess eine Uricase-aktive Substanz gewonnen, die über einen pH-Bereich von etwa 6,8 bis etwa 7,5 stabilisiert ist, wodurch die vereinheitlichte, enzymkatalysierte Harnsäure-Testzusammensetzung, die über eine Vielzahl von Reaktionssystemenverfügt, welche innerhalb eines einzigen Satzes von Reaktionsparametern ihre Punktion ausüben, ermöglicht wird.

Tierische Uricase stellt ein Cuproprotein (ein konjugiertes Metallprotein) dar. Es wird angenommen, dass Cu einen Teil des katalytischen Zentrums des Enzyms darstellt. Die Struktur der kupferhaltigen Komponente des aktiven Zentrums kann schematisch wie folgt dargestellt werden:

Enzym Cu

-OH

-O₂H

Aufgrund der Cuproproteinnatur des Enzyms wird dieses schnell, jedoch reversibel, durch eine Vielzahl von Agentien, die gleichzeitig eine Reduktion von Cu⁺⁺ und eine Komplexierung

- 13 -

909833/05

2655433

der Cu -Ionen bewirken, inhibiert. Aus diesem Grunde wird die Uricase bevorzugt durch Dialyse gegen einen Puffer mit einer niederen Metallbindungskonstante gereinigt.

Nach einer bevorzugten Ausführungsform wird das Enzym gegen Lösungen dialysiert, die Puffer mit niederen Metallkonstanten, wie Tris-(hydroxymethyl)-aminomethan (TRIS), Piperazin-N,N'-bis-(2-äthansulfonsäure) (PIPES), N-Tris-(hydroxymethyl)-methyl-2~aminoäthansulfonsäure (TES) und Phosphatpuffer.

Harnsäure wird enzymatisch durch Uricase zu Allantoin und Wasserstoffperoxid bei etwa pH 7 oxidiert. Die Stöchiometrie der Enzymreaktion wird, ungeachtet von Puffer oder pH-Wert, in Gleichung (1) angegeben, d.h. es erfolgt ein Transfer eines Elektronenpaares vom Urat-Monoanion auf Sauerstoff, wodurch sich eine instabile saure Zwischenverbindung (1-Carboxy-2,4,6,8-tetraazabicyl-^3,3,0/-octa-4-en-3,7-dion) und Wasserstoffperoxid ergibt.

C₅N₄O₃H₃' +O_{2 +} H₂O = C₅N₄O₄H₃" + H^ (1)

Das intermediäre Produkt ist eine stärkere Säure (niedrigerer pK) als Harnsäure (pK = 4,5, im Vergleich zu pK = 5,75 für Urat; pK~ = 11,5 im Vergleich zu pK- = 10,3 für ürat) und

++ lässt sich unter Bildung von Metallchelaten mit Kupfer (Cu ) und Kobalt (Co ) stabilisieren. In Gegenwart von hochgereihigtem Enzym werden bei pH 7,0 stöchiometrische Mengen an Allantoin, Wasserstoffperoxid und CO₂ gebildet. Das Wasserstoffperoxid wird dann mit den Chromogenen in Gegenwart von Peroxidase unter Bildung eines roten Komplexes umgesetzt. Die chemischen Gesamtreakticnen des Testes sind folgende:

- 14 909833/05A6

pH-stabi]e

Harnsäure + O₀ + H₀O > Allantoin + CO₀ + H₀O (2)

Δ c, ptl / (U Δ Δ

^2^2 ⁺ 3-Alkyl-2-benzothiazolinon-hydrazon + Kopplungsreagenz Farbkomplex +H₃O (3)

In dem vorliegenden System werden die Schwierigkeiten der !Competition zwischen Harnsäure und dem Chromogen sowie des drastischen Unterschiedes im pH-Optimum der Enzyme im weiteren dadurch gelöst, dass ein starkes Reduktionsmittel, ein Hydrazon und ein extrem empfindliches Kopplungsmittel, das darüber hinaus als ein Uricaseaktivator dient, verwendet werden. Die chromogenen Reaktionen unter Verwendung von z.B. 3-Methyl-2-benzothiazolinon-hydrazon (MBTH) und Primachindiphosphat (PDP) werden se lematisch im nachfolgenden Diagramm A dargestellt:

909833/0 5 48

2655433

Diagramm A

=N-NH₂ + H₂O₂

2H₂O

CH₃

MBTH

CH₃

CH₃CH(CH₂)3NH₂
NH

CH₃O

: 2H₃PO₄

PDP

CH₃CH(CH₂) 3NH₂

NH

CH ,0

CH₃

roter Komplex

- 16 -

909833/0546

2*55433

Der Klarheit willen werden in der folgenden Beschreibung spezifische Definitionen verwendet, doch sollen sich diese Definitionen lediglich auf besondere Ausführungsformen der Erfindung, die diese mittels Beispielen erläutern, beziehen, ohne den Umfang der Erfindung in irgendeiner Weise zu beschränken.

Die im Handel erhältliche Uricasepräparation wird nach einer bevorzugten Ausführungsform durch ein Verfahren gereinigt, welches die Fraktionierung der Üricasepräparation unter Entfernung von Molekülen mit einem Molekulargewicht von unterhalb 6.000 umfasst. Dies kann durch verschiedene Methoden bewirkt werden, wie z.B. durch Dialyse, Säulenchromatografie, Gelsedimentation und dergleichen.

Die Hydrazone stellen Kondensationsprodukte eines Hydrazins mit einem Aldehyd oder Keton dar und enthalten die Gruppierung C=NNH-. Viele Hydrazone sind in der Lage, eine oxidative Kopplung mit bestimmten aromatischen Aminen oder Hydroxynaphthalinsulfonaten unter Bildung einer gefärbten Verbindung bzw. eines gefärbten Komplexes durchzuführen. Unter diesen Hydrazonen sind zu nennen 3-Methyl-2-benzothiazolinon-hydrazon, N-Methyl-pyridon-4-hydrazon, N-Methyl-pyridon-2-hydrazon, N-Methyl-chinolinon-2-hydrazon, Methyl-chinolinon-4-hydrazon, N-Methyl-2-benzothiazolinon-hydrazon, N-Methylthiazolinon-2-hydrazon, N-Methyl-4-phenylthiazolinon-2-hydrazon, N-Methyl-oxazolinon-2-hydrazon, N-Methyl-benzoxazolinon-2-hydrazon, 1,3-Dimethylbenzimidazolinon-2-hydrazon und 2-Hydrazinobenzothiazol.

In einer bevorzugten Zusammensetzung wird ein 3-(C₁-C₄-Alkyl)-2-benzothiazolinon-hydrazon-Chromogen, wie 3-Methyl-2-benzothiazolinon-hydrazon (MBTH) als Chromogen verwendet. Diese

- 17 -

909833/0548

_₁₇_ 2*55433

Hydrazone sind starke Reduktionsmittel. Das Hydrazon wird in benzolischer Lösung bei Konzentrationen von etwa 0,05 mg% bis etwa 0,2 mg% verwendet.

Beispiele für geeignete Kopplungsreagenzien, die in Kombination mit dem chromogenen Hydrazon verwendet werden können, sind folgende:

(1) Verbindungen der allgemeinen Formel:

R₇ R₁

worin X ein Kohlenstoffatom, Stockstoffatom oder Schwefelatom darstellt; R- Wasserstoff, OH, Amino, Alkylendiamin oder Aminoalkanol bedeutet oder sich mit R„ unter Bildung von NHCh₂CHOHCH₂ verbindet, wobei R₃ Wasserstoff ist? R₃ und R₃, die gleich oder verschieden sein können, Wasserstoff oder SO₃H bedeuten; R₄ Wasserstoff, OH, NHCH(CH₃)CH₂CH₂CH₂Nh₂ oder SO₃H darstellt; R₅ Wasserstoff, SO₃H oder Acetamino bedeutet;

R, Wasserstoff oder OCH₀ darstellt und R„ Wasserstoff, OH b 01

oder NH₂ bedeutet, sowie deren Saureadditionssalze, wie z.B. die Phosphate.

(2) Verbindungen der allgemeinen Formel R-CH₂R, worin jeweils R Dimethylanilin, Hydroxyphenyl, Benzothiazol oder Benzophenon bedeutet.

(3) Thiamin oder dessen Säureadditionssalz.

90983 3/0546

(4) Methylphenylpropandiamin; und

(5) Phenothiazin.

Bevorzugte Kopplungsreagenzien umfassen Primachindxphosphat (PDP)/ Chromotropsäure und 4,4'-Methylen-bis-(N,N'-dimethylanilin) (MBDMA). Das Kopplungsreagenz wird in wässrigen Lösungen von etwa 1,0 mg% bis etwa 5,0 mg% verwendet.

Die Zusammensetzung kann darüber hinaus stabilisierende Agentien enthalten, wobei Carboxymethylzellulose (CMC) und PoIyoxyäthylenäther von Fettalkoholen (BRIJ, hergestellt von ICI United States INC. Wilminton, Delaware, 19897) besonders geeignet sind.Diese liegen in wässrigen Lösungen in einer gesamten
Konzentration von etwa 0,5 mg% bis etwa 5,0 mg% vor.

Eine Lösung,, die die erfindungsgemässe Zusammensetzung enthält, kann zum Nachweis von Harnsäure verwendet werden, indem diese Lösung zu einer Probe einer Körperflüssigkeit, wie z.B. Urin, zugegeben wird. Es bildet sich der chromophore
Komplex mit der sich ergebenden Farbveränderung. Die erfindungsgemässe Zusammensetzung wird jedoch in vorteilhafterer Weise in Form einer festen Präparation und vorzugsweise in Anzeigern, die speziell unter Berücksichtigung einer leichten Handhabung und hoher Zuverlässigkeit konstruiert sind, verwendet .

Gemäss der Erfindung wird ein Anzeiger hergestellt, der einen inerten Träger und in diesem inkorporiert eine Zusammensetzung gemäss der Erfindung, wie sie oben beschrieben und in den Beispielen angegeben wird, umfasst. Der inerte Träger kann in Form einer saugfähigen oder nicht-saugfähigen Trägermatrix

- 19 -

909833/0546

oder in Tablettenform oder einer anderen üblichen Form vorliegen.

Die Bezeichnung Trägermatrix bezieht sich auf saugfähige und nicht-saugfähige Matrizes, die in physiologischen oder anderen Flüssigkeiten unlöslich sind und ihre strukturelle Einheit in denselben beibehalten. Geeignete saugfähige Matrizes umfassen Papier, Zellulose, Holz, synthetische Harzvliese, Glasfasern, vliesartige Stoffe oder Gewebe und dergleichen. Nicht-saugfähige Matrizes umfassen organoplastische Materialien, wie Polypropylen. Zur leichteren Handhabung kann die Matrix mit einem unlöslichen Trägerelement, das z.B. aus Polystyrol bestehen kann, verbunden sein.

In alternativer Weise kann der inerte Träger die Form einer gepressten oder gegossenen Tablette, welche die üblichen Trägermaterialien, wie Disintegrationsstoffe, Füllmaterialien und Schmiermittel, enthält, annehmen.

Der erfindungsgemässe Anzeiger weist, wie dies in den Beispielen gezeigt wird, einen hohen Grad an Stabilität auf. Diese Stabilität kann noch weiter verbessert werden, indem Komponenten der Zusammensetzung auf einem Substrat getrennt werden oder indem das Endprodukt in geeigneter Weise in einer Folie, einem Behälter, der ein Wasserabsorptionsmittel enthält, oder dergleichen abgepackt wird. Die physikalische Trennung der Komponenten kann durch Drucken, durch Einkapselung einer oder mehrerer Komponenten, durch Verwendung einer separaten Matrix oder eines separaten Substrates für verschiedene Komponente, durch Anordnung inkompatibler Komponenten auf einander gegenüberliegenden Seiten des Substrates und dergleichen erreicht werden. Erfindungsgemäss ist auch eine Methode

9098 3 3/0546

2355433

zur Herstellung eines Harnsäure-Testanzeigers vorgesehen, welche die Imprägnierung, das Drucken oder ein beliebiges anderes Inkontaktbringen des inerten Trägers mit. der erfindungsgemässen Zusammensetzung umfasst. Wenn der Träger mit der Zusammensetzung in flüssiger Form imprägniert wird, so wird dieser daraufhin einem Trocknungsschritt unterworfen.

Die Erfindung stellt darüber' hinaus ein Verfahren zur Verwendung der Zusammensetzung oder des Anzeigers zur Bestimmung von Harnsäure in einer flüssigen Probe zur Verfügung. Die Probe wird getestet, indem die Zusammensetzung oder der Anzeiger mit der Probe in Kontakt gebracht wird und eine etwaige Parbveränderung beobachtet bzw. ausgewertet wird. Bei Verwendung eines Anzeigers, welcher über eine saugfähige Trägermatrix verfügt, tritt die Probe in die Matrix ein und die Farbänderung kann auf derselben beobachtet werden. Zusätzlich zum visuellen Vergleich können verschiedene instrumentelle Methoden angewandt werden, um eine etwaige Farbveränderung zu bestimmen, wodurch die Genauigkeit des Testes erhöht wird, indem einer subjektiven Farbbestimmung durch das menschliche Auge vorgebeugt wird.

Die Aktivität der Enzympräparation wird als Anzahl der Aktivitätseinheiten pro Milligramm des Trockengewichtes bestimmt. Die Enzymkomission der International Union of Biochemistry hat eine internationale Einheit (I.E.) der Enzymäktivität als 1 Mikromol ( nmol) Substrat definiert, das pro Minute unter spezifischen Bedingungen des pH-Wertes und unter Temperaturkontrolle umgesetzt wird.

Die Beziehung zwischen % Reflektionsvermogen (% R), wie sie in den Beispielen angegeben wird, und der Konzentration des absorbierenden Stoffes (Harnsäure) wird durch die Kubelka-Monk-Gleichung gegeben, welche zusammen mit einer detaillierten

909833/0546

2055433

Diskussion über Reflektionsspektrofotometrie von G. Kortümi in "Reflectance Spectroscopy, Springer-Verlag New York Inc., 1969, angegeben wird. In der durch die Kubelka-Monk-Gleichung definierten Beziehung nimmt der %-R-Wert mit zunehmender Harnsäurekonzentration ab und umgekehrt. Daher korrelieren die Ablesungen, entsprechend der Gleichung, invers mit den nachgewiesenen Harnsäurekonzentrationen. Sämtliche Ablesungen wurden, wenn dies nicht anders angegeben ist, bei 530 Nanometer vorgenommen.

Reflektionsmessungen können durch die im Handel erhältlichen Spektröfotometer, wie z.B. Beckman DK-2 Spektrofotometer, Beckman Instruments Inc., Fullerton, Calif. 92634, oder Spektrocolorimeter SCF-1, Israel Electro-Optical Industry Ltd. (in den USA durch Broomer Research Corporation, Plainwell, Long Island, N.Y. 11803 vertrieben), erhalten werden.

Die nachfolgenden Beispiele dienen der Erläuterung und sollen keine Einschränkung des Erfindungsumfanges darstellen. Der Fachmann auf diesem Gebiet wird in der Lage sein, Variationen, Substitutionen oder Änderungen in den Bestandteilen und Parametern, sofern dies wünschenswert ist, vorzunehmen.

Beispiel I

Eine gereinigte Uricase-aktive Substanz gemäss der Erfindung, die tierischen Ursprungs ist, wurde wie nachfolgend beschrieben hergestellt.

5 Milliliter (ml) Uricase (Boehringer Mannheim GmbH, Mannheim Bundesrepublik Deutschland), mit einer Aktivität von 9 IE/ml,

909833/0546

2S55433

wurde in einen Dialysierschlauch aus Spektrapor-Membran (Sprectrum Medical Industries, Los Angeles, Calif. 60916), die für Moleküle mit einem Molekulargewicht von unter 6.000 durchlässig ist, eingeschlossen. Die Uricase wurde unter Rühren gegen 0,5 molares (M) TRIS bei einem pH von 7,0 18 Stunden lang bei 4°C dialysiert.

Zu Beginn der Untersuchungen" wurde das minimale Volumen des für die Dialyse des Enzyms ausreichenden Puffervolumens bestimmt. 1 ml Uricase wurde gegen 20 ml, 50 ml, 100 ml und 1000 ml Puffer dialysiert. Sämtliche der dialysierten Uricaseproben wurden bestimmt und die Ergebnisse zeigten keinen signifikanten Unterschied der Enzymaktivitäten in den verschiedenen Puffervolumen (Tabelle 1).

Tabelle 1

aktivität von uricase, die in verschiedenen puffervolumen dialysiert wurde

Puffervolumen	Aktivität der dialysierten Uricase I.E./ml
20 ml 50 ml 100 ml 1000 ml ■ ,	6,5 6,2 6,4 6,5

Aufgrund der obigen Ergebnisse scheint es, dass der Endpunkt der wesentlichen Reinigung zur Entfernung von Verunreinigungen

09833/0546

2355433

auch mit einem so kleinen Puffervolumen wie 20 ml erreicht wird.

Beispiel II

Es wurden Streifen in einem zweimaligen Tauchprozess hergestellt, wobei üricase verwendet wurde, die gegen verschiedene Puffer, wie sie in Tabelle II angegeben sind, dialysiert wurde.

Die erste Tauchlösung wurde durch Vereinigung von 0,5 ml Uricase (3,0 I.E./ml), die gegen den jeweils angegebenen Puffer dialysiert wurde, 0,5 ml stabilisierendem Agens (1,5 mg% CMC und 0,8 mcf% Polyoxyathylenäther von aliphtischem Alkohol (BRIJ 35), 0,06 ml Meerrettichperoxidase und 0,1 ml (3,75 mg%) des Kopplungsreagens PDP, jeweils in destilliertem Wasser bereitet.Die zweite Tauchlösung wurde hergestellt durch Auflösung von 5.0 mg des Chromogens MBTH in 10 ml Benzol.

Streifen aus Whatman ET 31 Filterpapier (Whatman Inc., Clifton, N.J. 07014) von der Grosse 2,54 cm χ 10,16 cm, wurden jeweils mit der ersten Tauchlösung bis zur Sättigung imprägniert, 30 Minuten lang bei 50⁰C getrocknet, dann mit der zweiten Tauchlösung gesättigt, wiederum getrocknet und auf eine Grosse von 5,1 mm χ 10,2 mm zur Herstellung der erfindungsgemässen Testmittel bzw. Teststreifen zugeschnitten.

Die auf diese Weise hergestellten Teststreifen wurden dann in drei Gruppen aufgeteilt. Zwei dieser Gruppen wurden jeweils 24 bzw. 72 Stunden lang einer Wärmeeinwirkung bei 60°C ausgesetzt. Auf die dritte Gruppe erfolgte überhaupt keine Wärmeeinwirkung (0); diese Gruppe diente als Kontrolle.

- 24 909833/0546

2*55433

Die genannten Teststreifen wurden daraufhin untersucht, indem 0,03 ml aliquote Teile von Serumproben, die die in Tabelle II aufgeführten Mengen an Harnsäure enthielten, aufgetragen und die sich ergebende Farbveränderung beobachtet wurde. Ablesungen in %R wurden nach 120 Sekunden an den frisch hergestellten Streifen vorgenommen.

Tabelle II

	Zeit !(Stunden)	2	4	Harnsäure 6	(mg%) 8	10
	0	38,6	30,7	28,9	23,0	25,0
TRIS	24	44,8	35,6	30,0	30,0	26,3
	72	43,4	40,1	34,7	32,3	27,9
	0	39,0	33,7	31,1	28,5	26,5
PIPES	24	38,1	34,5	30,3	27,2	24,4
	72	35,4	35,6	31 ,0	29,2	28,8
	0	33,8	31,2	29,1	25,7	25,6
TES	24	34,3	31 ,0	. 28,5	27,1	24,2
	72	33,2	35,0	29,1	26,6	26,3

Die Ergebnisse in Tabelle II zeigen bei zunehmender Harnsäurekonzentration eine inkrementale Abnahme der prozentualen Reflektionsstärke (%R); diese Beziehung wird in der Kubelka-Monk-Gleichung definiert. Dies wiederum zeigt an, dass jeder der untersuchten Puffer gut dazu geeignet ist, die gereinigte Uricase-aktive Substanz herzustellen.

909833/0546

Beispiel III

Es wurde der Effekt der endgültigen Testempfindlichkeit bei pH-Variation des·Dialysepuffers untersucht.

Dazu wurden Teststreifen wie in Beispiel II hergestellt, wobei die Uricase gegen Phosphatpuffer, der auf die verschiedenen in Tabelle III angegebenen pH-Werte eingestellt war, dialysiert worden war. Die erhaltenen Ergebnisse, ausgedrückt in %R, sind in Tabelle III wiedergegeben.

Tabelle III

	PH	2,0	4,0	Harnsäure	(mg%)	10,0
		19,4	13,8	6,0	8,0	9,3
6	,8	19,5	14,3	12,4	10,7	9,2
7	,0	19,0	13,5	11,5	10,2	9,2
7	,5		8,1	10,3

Die Ergebnisse zeigen bei zunehmender Harnsäurekonzentration eine wachsende Abnahme. Dies indiziert, dass Uricase, die gegen einen Puffer mit einem pH-Wert von mindestens etwa 6,8 bis mindestens etwa 7,5 dialysiert wurde, eine hohe Empfindlichkeit im Nachweis von Harnsäure aufweist»

Ergebnisse, die mit Uricase erhalten wurden, welche gegen TRIS-, PIPES- und TES-Puffer dialysiert worden war, weisen eine pH-Stabilität der Uricase im selben Bereich auf.

909833/0546

2*55433

Beispiel IV

Es wurden Teststreifen bzw. Testmittel nach dem nachfolgend beschriebenen Verfahren hergestellt, wobei die in Tabelle IV aufgeführten Kopplungsreagenzien anstelle von PDP verwendet wurden.

0,2 g MBTH wurden in einem Gemisch aus 50 ml Methanol und 10 ml H₀O gelöst. Zu 6 ml dieser MBTH-Lösung wurden 0,02 g des jeweiligen Kopplungsreagenz, 0,5 ml 200 mg% Peroxidase und 0,1 ml dialysierte üricase (6 I.E./ml) unter Bildung einer Lösung der erfindungsgemässen Zusammensetzung zugegeben.

Die auf diese Weise hergestellte Reaktionslösung wurde durch Vereinigung von 0,2 ml derselben mit 0,01 ml Harnsäure getestet. Die mit den verschiedenen Kopplungsreagenzien beobachteten Reaktionen bei 5 mg%-und 10 mg%-Konzentration Harnsäure sind in Tabelle IV wiedergegeben.

- 27 -

909833/0546

2SSS433

Tabelle IV

Kopplungsreagenz	Harnsäure (mg%)	beobachtete Reaktion
Chromotropsäure	5	purpur
	10	purpur
p-d-Methylamino- benzaldehyd	5	keine Reaktion
	10	keine Reaktion
MBDMA	5	blassblau
	10	blassblau
Bis-(4-hydroxyphenyl)- methan	5	keine Reaktion
	10	keine Reaktion
Primachindiphosphat	5	helle Rotfärbung
	10	helle Rotfärbung
Iminodibenzyl	5	keine Reaktion
	10	keine Reaktion

Wie aus Tabelle IV hervorgeht, sind Chromotropsäure, MBDMA und Priraachindiphosphat als Kopplungsreagenzien in der Zusammensetzung gemäss der Erfindung wirksam, wohingegen andere Verbindungen, nämlich para-d~Methyiamino-benzaldehyd, Bis-(4-hydroxyphenyl)-methan und Iminodibenzyl nicht geeignet sind.

Weitere geeignete Kopplungsverbindungen umfassen Naphthyläthylendiamin, Naphthylaminoäthanol, Hydroxytetrahydrobenzochinolin, Phenothiazin, Η-Säure (S-Amino-1-naphtol-6-sulfonsäure),

909833/0546

- 28 -

2355433

1-Hydroxy-2-naphthalin-sulfonsäure, 1-Hydroxy-3-naphthalinsulfonsäure, i-Amino-2-naphthalin-sulfonsäure und 6-Acetamino-1-hydroxy-naphthalin-sulfonsäure.

Beispiel V

Es wurden 20 klare Serumproben mit unbekanntem Harnsäuregehalt bestimmt, wobei Teststreifen verwendet wurden, die mit dem nachfolgenden Einmal-Tauchverfahren hergestellt worden waren. Die Ergebnisse wurden mit Testen verglichen, die mit dem Standard-Phosphowolframat-Verfahren nach Carroll et al, Clinical Chemistry 17, 158 (1971) durchgeführt wurden.

10 ml destilliertes Wasser, das 0,3 mg% 3-Methyl-2-benzothiazolinon-hydrazon (MBTH), 0,15 mg% Peroxidase, 0,075 mg% Primachin-diphosphat (PDP) und 1,0 mg% Carboxymethylzellulose enthielt, wurden mit 10 ml 0,5 molarem (M) TRIS von pH 7,O, welches die gereinigte Uricase-aktive Substanz tierischen Ursprungs gemäss der Erfindung mit einer Aktivität von 3,0 I.E./ml enthielt, vereinigt.

Streifen aus Whatman Filterpapier von der Grosse 2,54 cm χ 10,16 cm wurden mit jeweils 1 ml dieser Lösung imprägniert, bei 50 C 30 Minuten lang getrocknet und zu Testanzeigern bzw. Teststreifen von der Grosse 5,1 mm χ 10,2 mm zugeschnitten. Diese Anzeiger wurden mittels einem doppelseitigen Klebeband auf längliche Polystyrol-Trägerelemente zur leichteren Handhabung aufgebracht.

Die Teststreifen wurden untersucht, indem je 0,05 ml einer Serumprobe auf den jeweiligen Teststreifen aufgebracht wurden und die sich entwickelnde Farbe nach 10 Sekunden und daraufhin

909833/0546

- 29 -

2*55433

nochmals nach 5 Minuten abgelesen wurde. Sämtliche Ablesungen erfolgt auf einem Arnes Reflektionsmeter (ARM) (Arnes Company, Division of Miles Laboratories, Inc., Elkhart, Indiana 46514) mit einem gelbgrünen Filter (Edmund Scientific Company, Barrington, N.J. 08007). Der Unterschied (^) in ARM-Einheiten zwischen den Ablesungen nach 5 Minuten und 10 Sekunden wurde genutzt, um die Anzeigeschwankungen der von Hand hergestellten Teststreifen zum Vergleich mit den Untersuchungsergebnissen jeder Probe durch das Standard-Phosphorwolframat-Verfahren auf ein Minimum zu reduzieren, wobei die jeweiligen Ergebnisse der entsprechenden Probe in Tabelle V wiedergegeben werden.

Tabelle V

Probe	Referenzwert (mg% Harnsäure)	ARM-Einheiten ^₁
1	2,5	37
2	3,4	41
3	3,5	48
4	3,9	44
5	4,2	49
6	4,3	56
7	4,5	50
8	4/7	57
9	4,8	50
1O	5,5	60
11	5,6	59
12	5,6	50
13	5,8.	54
14	6,0	70

909833/0546

Fortsetzung Tabelle V

15	7,0	71
16	8,3	70
17	8,6	91
18	9,0	88
19	9,5	80
20	10,0	86

Die Ablesungen in ARM-Einheiten variieren nach einer linearen Beziehung in Abhängigkeit von der vorliegenden Konzentration in mg% Harnsäure. Die erhaltenen Ergebnisse zeigen, dass die beschriebenen Untersuchungen mit der Referenzbestimmungsmethode korrelieren und gegenüber Unterschieden im Harnsäurespiegel sehr empfindlich sind. Diese Empfindlichkeit geht besonders bei der deutlichen Zunahme der Ablesungen zwischen Beispielen hervor, die sich nur leicht in ihrer Harnsäurekonzentration unterscheiden.

Beispiel VI

Nach verschiedenen Formulierungen wurden in einem Zweimal-Tauchverfahren, das nachfolgend beschrieben wird, Testmittel zum Harnsäurenachweis hergestellt.

Die erste Tauchlösung wurde durch Vereinigung von O,5 ml dialysierter Uricase-aktiver Substanz (1,3 I.E./ml) mit einer wässrigen Lösung aus 0,1 ml (3,75 mg%) PDP, 0,06 ml (1,5 mg%) Peroxidase und 0,5 ml (1,5 mg%) CMC und 0,8 mg% BRIJ hergestellt.

909833/0546

.31- 2655433

Ein Bogen Whatman Filterpapier wurde bis zu dessen Sättigung mit der obigen Tauchlösung imprägniert und bei 60 C 10 Minuten lang getrocknet. Der Bogen wurde dann bis zur Sättigung mit 10 ml 0,05 mg% MBTH in Benzol imprägniert, bei 60 C 10 Minuten lang getrocknet und zu den erfindungsgemässen Teststreifen von der Grosse 5,1 mm χ 10,2 mm zugeschnitten.

Diese Teststreifen wurden untersucht, indem 0,03 ml der Probe, welche Harnsäurekonzentrationen von 2, 4, 6, 8 und 10 mg% enthielten, aufgetragen und nach 120 Sekunden die Reflektionsstärke beobachtet wurde. Dabei wurden Ablesungen von 39,3, 34,7, 29,4, 26,9 und 25,8 %R erhalten. Diese Ablesungen bestätigen die reciproke Beziehung, wie sie durch die Kubelka-Monk-Gleichung definiert wird, auf die auch schon im vorhergehenden hingewiesen wurde, und zeigen die gute Empfindlichkeit gegenüber unterschiedlichen Konzentrationen an Harnsäure.

Daraufhin wurden Teststreifen nach dem vorangehend beschriebenen Verfahren hergestellt, wobei jedoch PDP-Konzentrationen von 1,0, 2,0 und 5,0 mg%, anstelle von 3,75 mg%, verwendet wurden. Die auf diese Weise hergestellten Teststreifen bzw. Testanzelger wurden wie oben untersucht. Bei den %R-Ablesungen nach 120 Sekunden ergibt sich keine signifikante Veränderung der beobachteten Empfindlichkeit in Abhängigkeit der unterschiedlichen Konzentrationen des Kopplungsreagenz PDP, das in den Streifen verwendet wurde.

Ausserdem wurden Teststreifen wie oben angegeben hergestellt, wobei jedoch das Stabilisierungsagens CMC in einer Konzentration von 0,5 und 2,4 mg% anstatt von 1,5 mg%, verwendet wurde. Die auf diese Weise hergestellten Streifen bzw. Anzeiger wurden

909833/0546

wie oben untersucht und es konnte festgestellt werden, dass auch diese Harnsäure mit grosser Empfindlichkeit nachweisen.

Ausserdem wurden Streifen wie oben angegeben hergestellt, wobei jedoch das Chromogen MBTH in Konzentrationen von 0,01, 0,10 und 0,20 mg%i anstelle von 0,05 mg%, verwendet wurde. Die auf diese Weise hergestellten Testanseiger wurden wie oben untersucht und zeigten ebenfalls eine ausgezeichnete Empfindlichkeit gegenüber Harnsäurekonzentrationen.

Ausserdem wurden Anzeiger hergestellt, wobei Peroxidase in Konsentrationen von 0,5, 1,0, 5,0 und 20 mg%, anstelle von 1,5 mg%, verwendet wurde. Wenn diese wie oben angegeben getestet wurden, so konnte jeder Anzeiger, der auf diese Weise hergestellt worden war, mit der gleichen Empfindlichkeit wie in dem Testanzeiger mit 1,5 mg% Peroxidasekonzentration, zwischen den Harnsäurekonzentrationen unterscheiden.

Zudem wurden Teststreifen wie oben angegeben hergestellt, wobei Uricase-aktive Substanzen mit einer Aktivität von 0,8 und 1,8 I.E./ml, im Gegensatz zu 1,3 I.E./ml, verwendet wurden. Nach der oben angegebenen Untersuchung konnte keine Veränderung der Sensitivität beim Nachweis von Harnsäure als Ergebnis der Verwendung von Peroxidase mit unterschiedlicher Aktivität festgestellt werden.

909833/0546

Claims

HOFFMANN · BITLJE «fc PARTNER PAT Ii N TAN WALT 13 2 B § 5 4 3 3 DR. ING. E. HOFFMANN (1930-1970) · DIPL.-I NG. W.EITLE · D R. RER. NAT. K. HO FFMANN · Dl PL.-ING. W. LEH N DIPl.-ING. K. FOCHSLE · DR. RER. NAT. B. HANSEN ARABELLASTRASSEMSTERNHAUS) · D-8000 MÖNCHEN 81 · TELEFON (089) 911087 · TELEX 05-29519 (PATH E) 31 526 m/wa MILES LABORATORIES INC., ELKHART, INDIANA / USA Testmittel und Anzeiger zum Nachweis von Harnsäure PATENTANSPRÜCHE

1. Testmittel zum Nachweis von Harnsäure, wobei das Testmittei eine Substanz mit Uricaseaktivität, mindestens ein Chromogen und eine peroxidativ wirksame Substanz umfasst, dadurch gekennzeichnet , dass die Substanz mit Uricaseaktivität eine Uricase tierischen Ursprungs darstellt, die frei von pH-empfindlichen Verunreinigungen mit einem Molekulargewicht von unter etwa 6.000 ist.

2. Testmittel nach Anspruch 1, dadurch gekennzeich net, dass die Substanz mit Uricaseaktivität im pH-Bereich von etwa 6,8 bis etwa 7,5 stabil ist.

9Q9833/054R

- 2 ORIGINAL INSPECTED

_₂_ 2055433

3. Testmittel nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, dass das Chromogen ein Hydrazon darstellt.

4. Testmittel nach Anspruch 3, dadurch gekennzeichnet, dass das Hydrazon ein 3-(C. -C₄~Alkyl)-2-benzothiazolinon-hydrazon ist.

5. Testmittel nach Anspruch 4, dadurch ge-kennzeichn e t , dass das 3- (C. -C-Alkyl) -2-benzothiazolinon-hydrazon die Verbindung 3-Methyl-2-benzothiazolinon-hydrazon darstellt.

6. Testmittel nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, dass es ausserdem mindestens ein Kopplungsreagenz
enthält.

7. Testmittel nach Anspruch 6, dadurch gekennzeichnet, dass das Kopplungsreagenz eine Verbindung der allgemeinen Formel

worin X ein C-, N- oder S-Atom darstellt, R. Wasserstoff,
OH, Amino, Alkylendiamin oder Aminoalkanol bedeutet, oder
mit R₂ unter Bildung von NHCH₂CHOHCh₂ verbunden ist, wobei
R₀ Wasserstoff ist; R₀ und R-,, die gleich oder verschieden
sein können, H oder SO₃H bedeuten; R₄ Wasserstoff, OH, NHCH-(CH₃)CH₂CH₂CH₂NH₂ oder SO₃H darstellt; R₅ Wasserstoff,
SO₃H oder Acetamino bedeutet; R_p Wasserstoff oder OCH₃ darstellt und R₇ Wasserstoff, OH oder NH₂ bedeutet, sowie
deren Säureadditionssalze, insbesondere die Phosphate;

909833/0 54 S -3-

2655433

Verbindungen mit der allgemeinen Formel R-CH₃-R, worin jedes R Dimethylanilin, Hydroxyphenyl, Benzothiazol oder Benzophenon bedeutet,

Thiamin oder dessen Säureadditionssalze, Methylphenylpropandiamin und
Phenothiazin darstellt.

8. Testmittel nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, dass es ausserdem mindestens ein Stabilisierungsmittel enthält.

9. Testmittel nach Anspruch 8, dadurch gekennzeichnet, .dass das genannte Stabilisierungsmittel Carboxymethylzellulose und/oder einen Polyoxyäthylenäther eines Fettalkohols darstellt.

10. Substanz tierischen Ursprungs mit Uricaseaktivität zur Bestimmung von Harnsäure in einer Probe, dadurch g e k e η η zeichnet , dass die Uricase-aktive Substanz frei von pH-empfindlichen Verunreinigungen mit einem Molekulargewicht von unter etwa 6.000 ist.

11. Anzeiger zur Bestimmung von Harnsäure in einer Probe, dadurch gekennzeichnet , dass dieser einen Träger und in diesem inkorporiert das Testmittei nach Anspruch 1 umfasst.

12. Anzeiger nach Anspruch 11, dadurch gekennzeichnet , dass der Träger eine saugfähige oder nicht-saugfähige Matrix darstellt.

909833/0546

-4- 20S5433

13. Anzeiger nach Anspruch 11, dadurch gekennzeichnet, dass der Träger eine Tablette darstellt.

14. Verfahren zur Gewinnung der gereinigten Substanz tierischen Ursprungs mit Uricaseaktivität nach Anspruch 10, dadurch gekennzeichnet , dass mittels Fraktionierung aus einer Uricase tierischen Ursprungs Bestandteile mit einem Molekulargewicht von unter 6.000 entfernt werden.

15. Verfahren nach Anspruch 14, dadurch gekennzeichnet, dass die Fraktionierung durch eine Dialyse erreicht wird.

16. Verfahren nach Anspruch 15, dadurch gekennzeichnet, dass gegen einen Puffer dialysiert wird, der eine niedrige Metallbindungskonstante aufweist.

17. Verfahren zur Herstellung eines Anzeigers zur Bestimmung von Harnsäure in einer Probe, dadurch ge kennzeich net, dass man

eine Uricase tierischen Ursprungs dialysiert, um Bestandteile mit einem Molekulargewicht vori unter 6.000 zu entfernen ,

eine Zusammensetzung herstellt, welche die dialysierte Uricase zusammen mit 3-(C₁-C.-Alkyl)-2-benzothiazolinonhydrazon, eines der Kopplungsreagenzien der Verbindungen Primachindiphosphat, Chromotropsäure und 4,4'-Methylenbis-(N,N-dimethyl-anilin) und eine peroxidativ wirksame Substanz umfasst, und

909833/0548

_₅_ 26S5433

eine TrägermaLrix mit der auf diese Weise hergestellten Zusammensetzung inkorporiert.

18. Verfahren nach Anspruch 17, dadurch gekennzeichnet, dass der Schritt zur Inkorporierung der Trägermatrix mit der Zusammensetzung die folgenden Teilschritte umfasst:

Imprägnieren der Trägermatrix mit einer Lösung der Zusammensetzung, und

Trocknen der imprägnierten Matrix.

19. Verfahren zur Bestimmung von Harnsäure in einer Probe, dadurch gekennzeichnet , dass man

die zu untersuchende Probe mit dem Testmittel nach Anspruch

I in Kontakt bringt, und

eine auftretende Farbveränderung beobachtet bzw. bewertet.

20. Verfahren zur Bestimmung von Harnsäure in einer Probe, dadurch gekennzeichnet , dass man

die zu untersuchende Probe mit dem Anzeiger nach Anspruch

II in Kontakt bringt, und

eine auftretende Farbveränderung beobachtet bzw. bewertet.

909833/0546