JPS5841835B2 - 試料中の尿酸測定に用いる精製された動物起源ウリカ−ゼ活性物質の製造方法 - Google Patents

Description

【発明の詳細な説明】 本発明は一般に臨床試験の分野に関する。

さらに詳しくは、液体試料中の尿酸測定に用いる精製さ
れた動物起源ウリカーゼ活性物質の製造方法に関する。

哺乳動物の代射においては、摂取された核蛋白質がプリ
ンおよびピリミジンに内因的に＝定に変化する。

このプリンは異化作用過程によりさらに脱アミノ化およ
び部分酸化されて尿酸になり、これは通常人体では尿中
に***される。

従って、ごく少量の濃度の尿酸が人間の血液および尿中
に常に存在する。

プリンを含有する食物を摂取しても、濃度が上昇するよ
うな腎臓め機能低下の場合を除いて、血清中の尿酸含有
量に影響を与えない。

プリンを含有する食物の摂取に関係しないある他の病的
状態、例えば***または痛風では、血清中の尿酸の量
の異常な増加が見られる。

また、血清中の尿酸は白血病および肺炎等の白点球核の
過剰な破壊に関係する状態で上昇する。

血清中の尿酸の試験は前述の状態を診断し、いくつかの
場合には、非常に関係の深い異常な状態、例えば肺炎と
関節炎を区別する助けとして役に立つと認識されている
。

肺炎は血清中の尿酸の異常な増加により特徴づけられる
が、関節炎はそのような増加を示さない。

それゆえ、血清中の尿酸濃度を正確に特定して測定する
簡単かつ経済的な試験手段を提供することが望まれる。

尿酸は正常時には、血清１ｏｏｒｒＬｌ当り約０．７〜
約６．０１１１９（通常■％として報告されている）の
量で血清中に見られる。

上述した異常な状態では、血清中の尿酸含量は１０■％
またはそれ以上の値にしばしば達する。

従来技術は血清中の尿酸を測定するための多くの方法を
開示している。

より広範に用いられている方法のなかには血液のＦ液を
利用する発色法がある。

これらの方法のいくつかは血液のｐ液からの尿酸の析出
（例えば銀塩として）およびリンタングステン酸塩また
は砒タングステン酸塩との反応による色原体付加物の生
成に依存する。

血液１液を利用する他の方法は、尿酸濃度の定量的評価
のための従来の技術を用いて測定される色を生じさせる
ためにシアン化尿素溶液の存在下、Ｐ液をタングステン
酸で直接処理することに依存する。

極（最近では、尿酸のアラントインと過酸化水素への触
媒酸化を包含する方法が提案されている。

この酸化は大気中の酸素の存在下で通常行なわれ、かつ
ウリカーゼ活性を有する物質を利用する。

この反応はｐＨ９またはその付近で起こる。

このような方法では、尿酸がアラントインと過酸化水素
に転換する間に尿酸の特徴的スペクトルの消滅を測定す
るために、分光光度計を用いることができる。

もう１つの方法は尿酸のこのような分解時に生成した化
学量論量Ｏ過酸化水素を測定するために比色手段を利用
しており、例えばアルバウム（Ａ ｌｂａｕｍ ）特許
番号第３３４９００６号およびワヒテル（Ｗａｃｈｔｅ
ｒ ）特許番号第３３３５０６９号（いずれも本出願人
に譲渡されている）に記載されている。

酵素転換試験において、生成する過酸化水素が血清中に
存在する尿酸の量に比例する場合、過酸化水素は、過酸
化活性を有する物質の存在下で呈色する物質の酸化によ
り生じた色の変化によって測淀される。

この反応は酸性ｐＨで起る。ナトリウムアジドまたはシ
アン化ナトリウム等のカタラーゼ防止剤は過酸化物のカ
タラーゼ分解を防止することを通常要求されている。

次いで得られた色を目で標準と比較するかまたは、電気
的に測定して試験する流体中に存在する尿酸の定量的評
価が得られる。

仏国特許７２／３１５５７号は基本的に異なる酵素触媒
反応を開示しており、そこではアルデヒドを含まないメ
タノールおよびカタラーゼをウリカーゼと共に試料（ｐ
Ｈ８に緩衝）に添加し、３メチル−２−ベンゾチアゾリ
ノンヒドラゾン（ｐＨ３に緩衝）および塩酸に溶解した
塩化第二鉄を添加すると青色に呈色することが開示され
ている。

カーノー（Ｋａｎｏ）特許番号第３８６２８８５号は、
微生物起源ウリカーゼおよびカタラーゼ防止剤（ｐＨ５
，５〜７．０に緩衝）により過酸化水素を発生させ、蔭
イオン界面活性剤、色原体およびペルオキシダーゼ（ｐ
Ｈ４，０〜７．０）の存在下発生した過酸化物を測定す
ることによる尿酸の測定方法を開示している。

ゴツホマン（Ｇｏｃｈｍａｎ ） とシュミット（Ｓ
ｃｈｍｉｔｚ ） は、「クリニカル・ケミストリー
」（Ｃｌ１ｎ、 Ｃｈｅｍ ）第１７巻、１１５４ペー
ジ（１９７１）において、３−メチル−２−ベンゾチア
ゾリノンヒドラゾン−塩酸塩をＮ−Ｎ−ジメチルアニリ
ンと共に用いてアゾ色素指示薬を形成させる尿酸の自動
測定法を報告している。

この分野においてこれまでの研究者の貢献にもかかわら
ず、これらの方法は、液相で通常行なう一連の別々の操
作を要するという欠点を持っていた。

動物ウリカーゼおよびペルオキシダーゼを同時に用いる
組合せの反応は、尿酸と色原体が競合するため、すなわ
ち両者がペルオキシダーゼの存在下で過酸化水素により
酸化されるためと用いる２つの酵素の最適ｐＨが著るし
く異なるために不可能と考えられていた。

両反応を同じｐＨまたは非常に近いｐＨで行なう従来技
術のシステムでは、最高の効率特性を示す動物起源ウリ
カーゼ等の使用可能なある反応成分は、この反応に要求
されるｐＨ範囲内でペルオキシダーゼ生成系の成分とし
て機能しないためにここでは用いることができないとい
う欠点がある。

このように安定化された統一的な試薬試験において、尿
酸測定用手段を包含することは以前は不可能であった。

本発明の第１の目的はｐＨ感受性の妨害物質を含有しな
い新規な精製された動物起源ウリカーゼ活性物質の製造
方法を提供することである。

本発明の第２の目的は体液中の尿酸測定用組成物または
用具等に適用して有用な精製された動物起源ウリカーゼ
活性物質の製造方法を提供することである。

本発明の他の目的および充分な理解が以下の記載および
好ましい実施態様に向けられた特許請求の範囲を参照す
ることによって得られるであろう。

本発明の動物起源ウリカーゼ活性物質の製造方法は、約
６０００未満の分子量を有する成分を分別によって動物
起源ウリカーゼから除去することを特徴とするものであ
る。

本発明の製造方法は、前記分別操作が透析により達成さ
れることが好ましく、更に、前記透析操作が低金属結合
定数を有する緩衝液に対して行なわれることが好ましい
。

更に、本発明に従えば、精製されたウリカーゼをその中
に用いた組成物または用具等の統一的な試験手段、試験
用具の製造方法およびそれを用いる尿酸の測定方法が提
供される。

即ち、ウリカーゼ活性物質、少なくとも１つの色原体お
よび過酸化活性物質からなる尿酸の検出用試験手段にお
いて、ウリカーゼ活性物質が約６０００未満の分子量を
有するｐＨ感受性妨害物質を含有していない動物起源ウ
リカーゼであることを特徴とする試験手段が提供される
。

この試験手段は少なくとも１つのカップリング剤および
少なくとも１つの安定剤をさらに包含することができる
組成物の形を採ることができる。

この組成物を錠剤またはマトリックス等の担体に任意に
包含して試験用具を得ることができる。

本発明の製造方法により得られる動物起源ウリカーゼ活
性物質を使用することにより、以前は達成されなかった
ｐＨ範囲に亘って安定であり、且つ、統一的な試験が可
能となる。

上述の組成物の成分である精製された動物起源ウリカー
ゼ活性物質は、例えばインヂアナ４６５１４、エルクハ
ートのマイルスーラボラトリーズ・インコーホレーテッ
ドのマイルス・リサーチ・プロダクツ（Ｍｉｌｅｓ
Ｒｅ５ｅａｒｃｈ Ｐｒｏｄｕｃｔｓ １Ｍ１ｌｅｓ
Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ Ｉｎｃｌ、Ｅ １ｋｈ
ａｒｔ 。

Ｉｎｄｉａｎａ ４６５１４ ）より商業的に入手可
能な動物ウリカーゼ製品を分別精製することにより調製
される。

ｐＨの変化に感受性があり、約６０００未満の比較的低
分子量の妨害物質が除去される。

驚くべきことに、この−見簡単な精製方法によって生成
されたウリカーゼ活性物質は、約６．８〜約★★７．５
のｐＨ範囲に亘って安定であり、かくして、単一の反応
のパラメーターの下で機能する多くの゛反応系を有する
統一された酵素触媒尿酸試験組成物の調製を可能にする
。

動物ウリカーゼは銅蛋白（複合金属蛋白）であり、Ｃｕ
２＋ は酵素の触媒位置の一部であると信じられている
。

活性位置の銅を含む部分の構造は以下に図式的に示され
ている。

すなわち、酵素の銅蛋白の性質は、Ｃｕ２＋ イオンの
瞬間的な還元とＣｕ＋イオンの錯体形成を可能にする種
々の試薬によって酵素が急速であるが可逆的に抑制され
るようにする。

それゆえウリカーゼは低い金属結合定数を有する緩衝液
に対して透析することにより精製することが好ましい。

好ましい実施態様においては、トリス（ヒドロキシメチ
ル）−アミノメタン（ＴＲＩＳ） 、ピペラジン−Ｎ
−Ｎ’−ビス（２−エタンスルホン酸）（ＰＩＰＥＳ）
、Ｎ−トリス−（ヒドロキシメチル）メチル−２−アミ
ノエタンスルホン酸（ＴＥＳ）およびリン酸塩緩衝液等
の低い金属結合定数を有する緩衝液を含んでいる溶液に
対して酵素を透析する。

尿酸をウリカーゼによって約ｐＨ７でアラントインと過
酸化水素に酵素的に酸化する。

緩衝液またはｐＨにかかわらず、本来の酵素反応の化学
量論は式〔■〕： により与えられる。

すなわち尿酸塩のモノアニオンから酸素への電子対の伝
達により不安定な酸中量体（１−カルボキシ−２・４・
６・８−テトラアザビシクロ〔３・３・０〕−オクタ−
４−エン−３・７−ジオン）および過酸化水素が得られ
る。

この中間体生成物は尿酸より強い酸（より低いｐＫ ）
であり（尿酸塩のｐＫ＝５．７５に対して尿酸ｐＫ＝４
．５、尿酸塩のｐＫ２＝１０．３に対して尿※※酸ｐＫ
２＝１１．５ ）、銅（Ｃｕ２＋）およびコバルト（Ｃ
ｏ”）と金属キレートを形成させることにより安定化す
ることができる。

ｐＨ７，０で極度に精製された酵素の存在下では、アラ
ントイン、過酸化水素および二酸化炭素の化学量論量が
生成される。

次いで過酸化水素がペルオキシダーゼの存在下で色原体
と反応して赤い錯体を与える。

この試験の全般的化学反応は以下のようである。

この系では、尿酸および色原体との間の競合の難点およ
び酵素の最近ｐＨの極度の相異の難点が強い還元剤、ヒ
ドラゾンおよび非常に感受性があり、さらにウリカーゼ
の活性物質として働くカップリング剤を用いることによ
ってさらに克服され※※る。

例えば３−メチル−２−ベンゾチアゾリノンヒドラゾン
（ＭＢＴＨ）およびプリマキンニリン酸塩（ＰＤＰ）
を用いる色原体反応が以下のように図式Ａに図式的に
表わされている。

図式Ａ 特定のことばが明確にするために以下の記載に用いられ
ているが、 これらのことばは代表的な説 明のために選ばれた本発明の特別の実施態様のみを言及
しようとするものであり、本発明の範囲を限定あるいは
制限しようとするものではない。

市販のウリカーゼ製品は、好ましい実施態様において、
そのウリカーゼ製品を分別して約６０００未満の分子量
を有する分子を除くことを特徴とする透析方法によって
精製される。

ヒドラゾンはヒドラジンとアルデヒドまたはケトンとの
縮合生成物であり、ＣＨＮＨ２基を含有する。

多くのヒドラゾンはある芳香族アミンまたはヒドロキシ
ナフタレンスルホン酸塩と酸化的にカップリングして呈
色物質を形成する。

このヒドラゾンとしては、とりわけ、３−メチル−２−
ベンゾチアゾリノンヒドラゾン、２−ヒドラジノベンゾ
チアゾール、Ｎ−メチル−ピリドン−４−ヒドラゾン、
Ｎ−メチル−ピリドン−２−ヒドラゾン、Ｎ−メチル−
キノリノン−２−ヒドラゾン、メチル−キノリノン−４
−ヒドラゾン、Ｎ−メチル−２−ベンゾチアゾリノンヒ
ドラゾン、Ｎ−メチル−チアゾリノン−２−ヒドラゾン
、Ｎ−メチル−４−フェニルチアゾリノン−２−ヒドラ
ゾン、Ｎ−メチル−オキサシリノン−２−ヒドラゾン、
Ｎ−メチル−ベンズオキサシリノン−２−ヒドラゾンお
よび１・３・−ジメチルベンズイミダゾリノン−２−ヒ
ドラゾンが挙げられる。

組成物の好ましい実施態様では、３−メチル−２−ベン
ゾチアゾリノンヒドラゾン（ＭＢＴＨ）等の３ （ｃｔ
〜Ｃ４アルキル）−２−ベンゾチアゾリノンヒドラゾン
・色原体が色原体として用いられる。

このようなヒドラゾンは強い還元剤である。このヒドラ
ゾンは約０．０５■％から約０．２■％の濃度でベンゼ
ン溶液中で用いられる。

色原体ヒドラゾンと組合わせて用いることができるカッ
プリング剤の代表例は下記の通りである。

（１）一般式： （式中、Ｘは炭素原子、窒素原子またはイオウ原子を表
わし、Ｒ２は水素原子、水酸基、アミノ基、アルキレン
ジアミン基またはアミノアルカノール基を表わすかまた
はＲ２が水素原子の場合にＲ２トー緒になってＮＨｃＨ
２ｃＨｏＨｃＨ２となるものを表わし、Ｒ２およびＲ３
は同一または異なっていてもよく、水素原子または亜硫
酸基を表わし、Ｒ４は水素原子、水酸基、ＮＨＣＨ（Ｃ
Ｈ３）ＣＨ２ＣＨ２ＣＨ２ＮＨ２、または亜硫酸基を表
わし、Ｒ６は水素原子、亜硫酸基またはアセトアミノ基
を表わし、Ｒ６は水素原子またはメトキシ基を表わし、
Ｒ７は水素原子、水酸基またはアミノ基を表わす。

）を有する化合物およびそのリン酸塩等の酸付加塩 （２）一般式： （式中、それぞれのＲはジメチルアニリン、ヒドロキシ
フェニル、ベンゾチアゾールまたはベンゾフェノンを表
わす。

）を有する化合物（３）チアミンまたはその酸付加塩 （４）＃ルフェニルプロパンシアミン （５）フェノチアジン 好ましいカップリング剤としては、プリマキンニリン酸
塩（ＦＤＰ ） 、クロモトロープ酸および４−４７−
メチレンビス（Ｎ −Ｎ’−ジメチルアニリン）（ＭＢ
ＤＭＡ ）が挙げられる。

カップリング剤は約１．０９％〜約５．０■％の水溶液
で用いられる。

この組成物はさらに有利に選択された安定剤、カルボキ
シメチルセルロース（ＣＭＣ） および脂肪族アルコ
ールのポリオキシエチレンエーテルＣＢＲＩＪ：登録商
標、アイシーアイ・ユナイテッド・スティソ・インコー
ホレーテッド、ウイルミングトン、プラウエア１９８９
７（ＩＣＩ ＵｎｉｔｅｄＳ ｔａｔｅｓ Ｉ ｎｃ
、、Ｗｉｌｍｉｎｇｔｏｎ、 Ｄｅｌａｗａｒｅ１９
８９７）社製〕を含むことができる。

これらは総濃度的０．５１ｎ９％〜約５．０１ｎ９％で
水溶液中に存在する。

本発明に従った組成物を含んでいる溶液は、尿等の体液
試料に添加することによって尿酸を検出するために用い
ることができる。

結果として色の変化を伴なう発色錯体が形成される。

しかしながら、この組成物は溶液としてよりもむしろ固
体製品の形で、また好ましくは使い易さと信頼性のため
に設計された用具でより有利に用いられる。

本発明の特徴として、不活性担体およびその不活性担体
に包含される上述の実施例で説明されるような本発明に
従った組成物よりなる用具が作成される。

この不活性担体は吸収性または非吸収性の担体マトリッ
クスの形を採ることができるかまたは錠剤または他の通
常の形を採ることができる。

この担体マトリックスということばは生理的液体または
他の液体と接触される場合、不溶性であり、その構造全
体を維持する吸収性または非吸収性のマトリックスのこ
とをいう。

用いることができる好適な吸収性マトリックスとしては
、紙、セルロース、木、合成樹脂フリース、ガラス繊維
、不織布および織布等が挙げられる。

非吸収性マトリックスとしてはポリプロピレンのような
有機プラスチック材料が挙げられる。

使い易くするために、そのマトリックスをポリスチレン
製の支持部材のような非溶解性支持部材と組合わせるこ
とができる。

また、この不活性担体は崩壊剤、充填剤および潤滑剤の
ような通常の担体材料を含んでいる圧縮成形または型成
形した錠剤の形にすることができる。

本発明に係る試験用具は実施例に示されているように高
度な安定性を示す。

この安定性は基質上にある組成物の成分を分離し、最終
製品を箔、乾燥剤を含んでいる容器等に装填することに
よりさらに改良することができる。

印刷、■またはそれ以上の成分のカプセル包装、異なっ
た成分に対して別々のマトリックスまたは基質の使用、
基質の両側へ共存できない成分の配置などによって成分
を物理的に分離することができる。

さらに本発明の特徴として、不活性担体を本発明に係る
組成物で含浸、プリントまたは他の方法で接触すること
によりなる尿酸試験用具を調製する方法も提供される。

担体が液状の組成物で含浸される場合には、担体は次い
で乾燥工程を受ける。

さらに本発明によれば、上記処理により得られる組成物
または用具と試料を接触させ、色のある変化を観察する
ことによってこの試料を試験することができる。

吸収性担体マトリックスを有する型の用具を用いる場合
には、この試料をマトリックスに入れてその上の色の変
化を観察する。

視覚による比較に加えて、生じたある色の変化を測定す
るために種々の器具を用いる方法により行なうことがで
き、このようにして人間の目による主観的な色の測定を
不要にすることにより試験の精度を向上させる。

酵素製品の活性は乾燥重量■当りの活性単位数によって
測定される。

国際生化学連合の酵素委員会（Ｔｈｅ Ｃｏｍｍ１ｓｓ
ｉｏｎ ｏｎ Ｅｎｚｙｍｅｓ ｏｆ ｔｈｅＩｎｔｅ
ｒｎａｔｉｏｎａｌ Ｕｎｉｏｎ ｏｆ Ｂｉｏｃｈｅ
ｍｉｓｔｒｙ ）は酵素活性の国際単位（１，Ｕ、）を
ｐｎおよび温度を制御した特定の条件下の毎分当りの利
用される１μｍｏｌの基質と定義した。

実施例に示された反射率（％Ｒ）と吸収種（尿酸）の濃
度との関係は、コルラミ、ジー・著「反射分光学」、ス
プリンゲルーフエアラーク・ニューヨーク・インコーホ
レーテッド発行（１９６９）（Ｋｏｒｔｕｍｉ Ｇ、
、Ｒｅｆｌｅｃｔａｎｃｅ ５ｐｅｃｔｒｏｓｃｏｐ
ｙ 。

Ｓｐｒｉｎｇｅｒ−ｙｅｒｌａｇ Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ
Ｉｎｃ 、、１９６９ ）で反射分光学の詳細な論議
と共に与えられているクベルカーモンクの式（Ｋｕｂｅ
ｌｋａ −Ｍｏｎｋｅｑｕａｔｉｏｎ ） によって
得られる。

クベルカーモンクの式によって定義された関係において
は％Ｒ値は検出された尿酸の濃度が増加すると減少し、
逆に減少すると増加する。

かくしてその式に従えば得られた表示は検出される尿酸
の濃度と反比例の関係にある。

すべての表示は他に指示がなげれば５３０ｎｍで得た。

反射率の表示はカリホルニア９２６３４、ヒュラートン
ベツクマン・インストルメンツ・インコーポｖ−７ツト
製ベックマンＤＫ−２スペクトロフオトメーター（Ｂｅ
ｃｋｍａｎ ＤＫ −２Ｓｐｅｃｔｒｏｐｈｏｔｏｍｅ
ｔｅｒ １Ｂｅｃｋｍａｎ Ｉｎｓｔｒｕｍｅｎｔｓ
。

Ｉｎｃ、、ＦｕｌｌｅｒｔｏｎｌＣａｌｉｆｏｒｎｉａ
９２６３４ ）またはイスラエル−エレクトロ−オプ
ティカル・インダストリー・リミテッド製スペクトロカ
ラリメーター５ＣＦ−１（米国においてプルマー、リサ
ーチ・コーポレーション、プレインウェル、ロングアイ
ランド、ニューヨーク１１８０３より市販） ＣＳｐｅ
ｃｔｒｏｃｏｌｏｒｉｍｅｔｅｒ ５ＣＦ−１、Ｉ ５
ｒａｅｌＥｌｅｃｔｒｏ−Ｏｐｔｉｃａｌ Ｉｎｄｕ
ｓｔｒｙ Ｌｔｄ。

（ｄｉｓｔｒｉｂｕｔｅｄ ｉｎ ｔｈｅ Ｕ、
Ｓ、 ｂｙ ＢｒｏｏｍｅｒＲｅｓｅａｃｈ Ｃｏｒ
ｐｏｒａｔｉｏｎ、 Ｐｌａｉｎｗｅｌｌ、ＬｏｎｇＩ
ｓｌａｎｄ、 Ｎ、Ｙ、 １１８０３ ） 〕等の商業
的に入手可能な分光光度計により得ることができる。

示された実施例は単に例示であり、本発明な限定するた
めに構成されるものではない。

当業者は、所望のように成分およびパラメータを変化さ
せ、置き換え、修正することができるであろう。

実施例 １ 本発明に係る精製された動物起源ウリカーゼ活性物質を
下記のように調製した。

活性度９ Ｉ、Ｕ、／−の５ｒＩＬｌのウリカーゼ〔ベ
ーリンゲル・マンハイム・ＧｍｂＨ，マンハイム、***
（Ｂｏｅｈｒｉｎｇｅｒ Ｍａｎｎｈｅｉｍ ＧｍｂＨ
，Ｍａｎｎｈｅｉｍ。

Ｆｅｄｅｒａｌ Ｒｅｐｕｂｌｉｃ ｏｆ Ｇｅｒｍ
ａｎｙ ） 〕を、分子量約６０００未満の分子を透過
可能なスペクトレイパー膜〔スペクトラム・メディカル
・インダストリーズ、ロサンジエルス、カリホルニア６
０９１６ （Ｓｐｅｃｔｒｕｍ Ｍｅｄｉｃａｌ Ｉｎ
ｄｕｓｔｒｉｅｓ、Ｌｏｓ Ａｎｇｅｌｅｓ 、 Ｃａ
１ｉｆｏｒｎｉａ ６０９１６ ） 〕で形成された透
析袋に入れた。

このウリカーゼを０．５ＭのＴＲｌ５ に対してｐＨ
７，０，４℃で１８時間攪拌下透析した。

この酵素を充分に透析するために要する緩衝液の最小容
量を測定するためにこの研究を始めた。

１１１Ｌｌのウリカーゼを２０ｍ１！、５０ｒｒＬＩ！
、１００ｍおよび１０００−の緩衝液に対して透析した
。

透析したウリカーゼをすべて測定したところ、種々の容
量の緩衝液で活性度の重大な相異は見られなかった。

結果を第１表に示す。※ かくして、実質的に完全に精
製したことにより、２０ｗＬｌ程度の緩衝液を用いてさ
え妨害物質を除去することができることが明らかである
。

実施例 ２ 第２表に示された種々の緩衝液に対して透析したウリカ
ーゼを用いて２段浸漬法で細片を調製した。

それぞれ示された緩衝液に対して透析した０、５ｒｕｌ
のウリカーゼ（３，０１，Ｕ、／ＷＬｌ ）、０．５ｍ
ｌ！の安定剤Ｃ１，５Ｉｎ９％のＣＭＣおよび脂肪族ア
ルコールのポリオキシエチレンエーテル０．８ ｍ９％
（ＢＲＩＪ３５）〕、００．０６ｍの西洋わさびペルオ
キシダーゼ、および０．１ｄ（３，７５ｒ１１９％）の
カップリング剤ＦＤＰをすべて蒸留水中で混合すること
によって第１の浸漬溶液を調製した。

５．０ｒ１１９の色原体ＭＢＴＨをベンゼン１０ＷＩＩ
！に溶解することにより第２の浸漬溶液を調製した。

２．５４ ＸＩ ０．１６ｃｍの寸法のワットマンＥＴ
３１Ｐ紙〔ワットマン・インコーホレーテッド、クリア
レン、ニューシャーシー０７０１４（Ｗｈａｔｍａｎ
Ｉｎｃ、 Ｃ１１ｆｔｏｎ、Ｎ、 Ｊ、０７０１４）
）を各第１の浸漬溶液で飽和含浸し、５０℃で３０分間
乾燥し、次いで第２の浸漬溶液で飽和含浸した後、再度
乾燥し、５．１ ＸＩ ０．２ｙｎｗに切断して本発明
に係る用具を作成した。

次いで、このように調製した用具を３つのグループに分
けた。

これらのグループの２つをそれぞれ６０℃で２４時間お
よび７２時間加温状態に置いた。

第３のグループは加温はせず、対照とした。次いで、こ
れらの用具を、第２表に示された量の尿酸を含む０．０
３ｗＬｌに分別した血清試料をその上に置き、生じた色
の変化を観察することにより試験した。

％Ｒの表示を新しく調製した細片で１２０秒毎に測定し
た。

第２表の結果は、尿酸の濃度が増加すると％Ｒが漸次減
少することを示し、この関係はクベルカーモンクの式に
よって定義されている。

これは、試験した名緩衝液が、精製されたウリカーゼ活
性物質を調製する際に有利に役立つことを示す。

実施例 ３ ※ ※ 透析する緩衝液のｐＨの変化に対する感受性を試験
した。

第３表に示された種々のｐＨレベルに調整されたリン酸
塩緩衝液に対して透析されたウリカー（ゼで実施例２の
ように用具を調製した。

％Ｒで示され、得られたデータを第３表に示す。

この結果は尿酸濃度の増加につれて漸次減少する傾向を
示す。

これは少なくとも約６．８〜少なくとも約７．５のｐＨ
を有する緩衝液に対して透析されたウリカーゼが尿酸の
検出において高い感受性を与えたことを示す。

ＴＲｌ５．ＰＩＰＥＳおよびＴＥＳ緩衝液に対して透析
されたウリカーゼを用いて得られた結果は、同じｐＨ範
囲に亘ってウリカーゼが安定であることを示す。

実施例 ４ 第４表に示されたカップリング剤をＦＤＰの代りに用い
た以下の方法に従って用具を調製した。

ＭＢＴＨｏ、２ｆを５０ｒＩＬｌのメタノールと１０ｒ
ＩＬｌのＨ２Ｏの混合液に溶解させた。

このＭＢＴＨ溶液６ＴＩＬｌに、０．０２ｆＩの選択さ
れたカップリング剤、０．５−の２００９％ペルオキシ
ダーゼおよび０．１Ｍの透析したウリカーゼ（６Ｉ 、
Ｕ、／ｒｒＬＩりを加えて本発明に係る組成物を含む溶
液を調製した。

このように調製された反応溶液を、その０．２ｒＩＬｌ
と尿酸０．０１ｒＩＬｌを混合することによって試験し
た。

５■％および１０ｒ／１９％の濃度の尿酸で試験する場
合、種々のカップリング剤と共に観察された反応を第４
表に示す。

このように第４表はクロモトロープ酸、 ＭＢＤＭＡおよびプリマキンニリン酸塩が、本発明に係
る組成物でカップリング剤として用いられる場合効果的
であり、ある他の化合物、すなわち、パラーｄ−メチル
アミノベンズアルデヒド、ビス（４−ヒドロキシフェニ
ル）メタンおよびイミノジベンジルは効果的でないこと
を示す。

効果的なカップリング剤である他の化合物としては、ナ
フチルエチレンジアミン、ナフチルアミノエタノール、
ヒドロキシテトラヒドロベンゾキノリン、フェノチアジ
ン、Ｈ−酸（８−アミノ−１−ナフトール−６−スルホ
ン酸）、■−ヒドロキシー２−ナフタレンスルホン酸、
■−ヒドロキシー３−ナフタレンスルホン酸、■−アミ
ノー２−ナフタレンスルホン酸および６−アセトアミノ
１−ヒドロキシナフタレンスルホン酸が挙げられる。

実施例 ５ 尿酸含有量未知の２０の清浄な血清試料を、下記のよう
に１段浸漬法で調製された用具を用いて分析した。

この結果を、キャロル、その他著、「臨床化学」第１７
巻、１５８ページ（１９７１）ＣＣａｒｒｏｌｌ ｅ
ｔ ａｌ 、、Ｃ１１ｎｉｃａｌ Ｃｈｅｍｉｓｔｒ
ｙ１７：１５８（１９７１）、ｌに従った標準のリンタ
ングステン酸塩法により行なわれた試験と比較した。

０．３■％の３−メチル−２−ペンゾチアゾリノンヒト
ラソン（ＭＢＴＨ）、０．１５■％のペルオキシダーゼ
、０．０７５１ｖ％のプリマキンニリン酸塩（ＦＤＰ
）および１．０■％のカルボキシメチルセルロースを含
む１０ｒＩＬ／！の蒸留水を、本発明の製造方法により
得た３、Ｏ１，Ｕ、／ｒＩＩＩ！の活性度を有する精製
した動物起源ウリカーゼ活性物質を包むｐＨ７の０．５
ＭのＴＲｌ８ １０ｍ１と混合した。

２．５４Ｘ１０．１６ｃＩＩｌの寸法のワットマンｐ紙
を各上記溶液１ｒｎ！！で含浸し、５０℃で３０分間乾
燥し、次いで５．１Ｘ１０．２ｍｍに切断して本発明に
係る用具を調製した。

この用具を、使い易くするために拡大したポリスチレン
支持部材に両面接着テープで固定した。

それぞれの用具の上にそれぞれ０．０５ｗＬｌの血清試
料を加え、１０秒後および５分後に再度呈色を観察する
ことによってこれらの用具を試験した。

すべての表示は、黄緑色のフィルター〔エドムンド・サ
イエンティフィック・カンパニー、バリングトン、ニュ
ーシャーシー０８００７ （Ｅｄｍｕｎｄ５ｃｉｅｎｔ
ｉｆｉｃ Ｃｏ 、、Ｂ ａｒｒ ｉｎｇｔｏｎ 、
Ｎｅｗ Ｊ ｅｒｓｅｙ０８００７）、ｌを用いたエ
ームス分光光度計（ＡＲＭ）［エームス・カンパニー、
ティビジョン・オブ・マイルス・ラボラトリーズ−イン
コーホレーテッド、エルクハート、インジアナ４６５１
４ （Ａｍｅｓ Ｃｏｍｐａｎｙ、 Ｄｉｖｉｓｉｏ
ｎ ｏｆＭｉｌｅｓ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ
Ｉｎｃ、、Ｅ １ｋｈａｒｔ １１ｎｄｉａｎａ４６
５１４ ） ）により得た。

標準のリンタングステン酸法によって各試料を試験した
結果と比較する際に、手製の用具の応答変化を最小にす
るために、５分と１０秒の表示の間のＡＲＭ単位の差（
Ａ）を用いた。

各試料の結果を第５表に示す。

ＡＲＭ単位の表示は存在する尿酸の濃度■％と直線関係
で変化する。

得られた結果は、記載された試験が文献の分析法に関係
し、尿酸レベルの相異に非常に感受性があることを示し
た。

この感受性は尿酸濃度がわずかに変化した試料間で表示
が明確に増加することにより明らかである。

実施例 ６ 以下のように２段浸漬法の種々の組成に従って、尿酸試
験用具を調製した。

透析した０、 ５ ｗＬｌのウリカーゼ活性物質（１，
３１、Ｕ、／ｄ）、０．１１ｍ（７）ＦＤＰ （３，
７５１１１５７％ ） 、Ｊ：り得られた水溶液、Ｑ、
Ｑ６ｍのペルオキシダーゼ（１，５１ｎ９％）および０
．５ｍ１（１−５ＦＱ％のＣＭＣと０．８Ｗ１９％のＢ
ＲＩＪ）を混合して第１の浸漬溶液を調製した。

ワラ１１フＰ紙を上記第１の浸漬溶液で飽和食潰し、６
０℃で１０分間乾燥した。

この１紙を０．０５７Ｑ％のＭＢＴＨを含む１０ｒｒＬ
ｌノヘンゼン溶液で飽和含浸し、６０℃でＩＯ分間乾燥
した後５、Ｉ Ｘ １０．２ｍｍに切断して本発明に係
る用具を作成した。

この用具に２．４．６．８．１０９％の濃度の尿酸を含
む試料０．０３ｒＩＬｌを加え、１２０秒後の反射率を
観察することによりこの用具を試験した。

３９，３．３４．７．２９．４．２６．９および２５．
８％Ｒの表示を得た。

これらの表示が以前述べたクベルカーモンクの式により
定義された逆の関係であり、尿酸の濃度変化に対して良
好な感受性を示すことを確認する。

ＦＤＰ３．７５ｍ９％に代えて、■、０．２−１よび５
．０■％の濃度のＰＤＰ を用いた以外は上述の方法に
従って用具を調製した。

このように調製された用具を上記のように試験した。

１２０秒毎に観察した％Ｒの表示より、この用具に用い
たカップリング剤ＰＤＰの濃度が相異する結果として観
察した感受性の重大な変化はなかった。

同様に１．５１１Ｉ９％の安定剤ＣＭＣを０．５および
２．４■％の濃度とした以外は上述のように用具を調製
した。

このように調製した用具を上述のように試験し、高度な
感受性を有する尿酸を検出するために観察した。

０．０５１ｖ％の色原体ＭＢＴＨに代えて０．ｏｌ、０
．１０および０．２０１１１９％の濃度とした以外は上
述のように用具を作成した。

このように作成した用具を上述のように試験したところ
尿酸濃度に対して顕著な感受性を同様に示した。

１．５■％のペルオキシダーゼの濃度を０．５．１．０
．５，０および２０■％とした以外は上述のように用具
を作成した。

この用具を上述のように試験したところ１．５■％の濃
度のペルオキシダーゼを有する用具と同じ感受性で尿酸
濃度を識別した。

Ｌ３１．Ｕ、／ｗＬｌの活性度を有するウリカーゼ活性
物質に代えて０．８および１．８１．Ｕ、／ｒＩＬｌの
ものを用いた以外は上記のように用具を作成した。

この用具を試験したところ、種々の活性度のペルオキシ
ダーゼを用いた結果として、尿酸検出の感受性に重大な
変化は認められなかった。

本発明はある程度特定して記載されたが、この記載は実
施例によってのみなされたものであり、本発明の精神お
よび範囲から逸脱することなく多くの変化がなされるこ
とは理解されよう。

Claims (1)

1. 【特許請求の範囲】 １ 約６０００未満の分子量を有する成分を分別によっ
   て動物起源ウリカーゼから除去することを特徴とする試
   料中の尿酸測定に用いる約６０００未満の分子量を有す
   るｐＨ感受性の妨害物質を含まない精製された動物起源
   ウリカーゼ活性物質の製造方法。 ２ 前記分別操作が透析により達成される特許請求の範
   囲第１項記載の製造方法。 ３ 前記透析操作が低金属結合定数を有する緩衝液に対
   して行なわれる特許請求の範囲第２項記載の製造方法。