DE2326756B2 - Verfahren zur quantitativen Bestimmung von Harnsäure - Google Patents
Verfahren zur quantitativen Bestimmung von HarnsäureInfo
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Description
Gegenstand der Patentanmeldung P 22 37 940.4 ist ein Verfahren zur quantitativen Bestimmung von
Harnsäure, in welchem man auf eine Harnsäure enthaltende Probe Uricase und Katalase in Gegenwart
von Äthanol unter Luftzutritt einwirken läßt, dadurch gekennzeichnet, daß man den entstandenen Acetaldehyd
unter Einwirkung von Alkoholdehydrogenase mit NADH 7U Äthanol rückreduziert und die Abnahme der
NADH-Konzentration durch spektrophotometrische
Bestimmung mißt, wobei das Verfahren bei einem pH von 6,8—7,1 durchgeführt wird und dem Reaktionsgemisch
so viel Äthanol zugegeben wird, daß dessen Konzentration die Grenzen von 03—0,7 Vol.-% nicht
überschreitet.
Es wurde nun gefunden, daß sich die volle enzymatische Harnsäure-Bestimmung auch dann quantitativ
und ohne Störung durch Fremdsubstanzen durchführen läßt, wenn man das obengenannte Verfahren
bei einem pH-Wert von 63—6,8 durchführt.
Die Durchführung der erfindungsgemäßen Verfahren erfolgt in analoger Weise wie in der Stammanmeldung
beschrieben.
Beispiel I
a. Reagentien und Reagenzlösungen
a. Reagentien und Reagenzlösungen
1. Phosphat-Puffer (pH 6,4)
6,647 g Kaliumdihydrogenphosphat und 2,538 g Dinatrium-hydrogenphosphat-dihydrat werden in
1000 ml bidestilliertem Wasser gelöst
2. NADH-Lösung
25 mg NADH werden in 10 ml einer einprozentigen
Natriumbicarbonatlösung gelöst Die Lösung ist ca. 10 Tage haltbar.
3. Äthanol (absolut)
4. Alkohol-Dehydrogenase (Boehringer Mannheim)
Kristpllsuspension in 3,2 M Ammoniumsulfatlösung, pH ca. 6. Sp. Aktivität 200 U/mg (25° C)
Kristpllsuspension in 3,2 M Ammoniumsulfatlösung, pH ca. 6. Sp. Aktivität 200 U/mg (25° C)
5. Katalase (Boehringer Mannheim)
Lösung in 30% Glycerin/10% Äthanol. Sp.
Aktivität 260 000 U/ml (25° C)
6. Uricase (Boeringer Mannheim)
Lösung in 50% Glycerin pH 10,2 50 mM Glycin;
ίο 0,13 N Natriumcarbonat Sp. Aktivität 4,5 U/mg (25°C)
7. Harnsäure-Standardlösung (12 mg/100 ml)
12 mg Harnsäure werden mit 0,1 n· Natronlauge gelöst und auf 100 ml aufgefüllt
b. Durchführung der Harnsäure-Bestimmung
In eine 1-cm-Küvette werden nacheinander 2,0 ml
Phosphatpuffer (1), 0,15 ml NADH-Lösung (2), 0,01 ml
Äthanol, 0,01 ml Alkohol-dehydrogenase, 0,005 ml Katalase und schließlich 0,1 ml der Probe pipettiert
Es wird nach jedem Pipettieren kurz gemischt und der erste Extinktionswert (E\) bei 366 μιη 10 Minuten nach
Zugabe der Probe abgelesen. Unmittelbar nach dem Ablesen von Ei werden 10 μΙ Uricase einpipettiert Nach
weiteren 10 Minuten wird der zweite Extinktionswert (E2) bei derselben Wellenlänge abgelesen. Der Leerwert
(L) wird gegen Wasser bestimmt.
„ (E,-E2)-L = AE
Der Faktor 131 wurde empirisch bestimmt.
Harnsäure-Bestimmung von S Proben
Harnsäure-Bestimmung von S Proben
)5 Es wurde uie Harnsäure-Standardlösung (vgl. auch
Beispiel la, Punkt 7) parallel nach dem erfindungsgemäßen
Verfahren und nach dem Verfahren von Praetorius bestimmt. Man erhält für das erfindungsgemäße
Verfahren die folgenden Werte (mg/100 ml):
j 12,2 12,2 12.2 11,6 lÜT]
Wie ersichtlich, wurden im Mittel 100% Harnsäure-Werte wiedergefunden.
Die in Beispiel I verwendeten Reagentien 1 —6 können vorteilhafterweise auch, entsprechend den im
Abschnitt b) genannten Volumenverhältnissen, für einen oder mehrere Tests gemischt werden.
Man kann das dem Gemisch entnommene Testvolumen dann in einem einzigen weiteren Pipettierungsschritt
mit der zu prüfenden Probe (Serum oder Urin, oder andere Hamsäiire-haltige Lösungen) versetzten,
so daß die aufwendigen Einzelpipettierungen entfallen.
Claims (1)
1. Verfahren zur quantitativen Bestimmung von Harnsäure, in welchem man auf eine Harnsäure
enthaltende Probe Uricase und Katalase in Gegenwart von Äthanol unter Luftzutritt einwirken läßt,
den entstandenen Acetaldehyd unter Einwirkung von Alkoholdehydrogenase mit NADH zu Äthanol
rückreduziert und die Abnahme der NADH-Konzentration durch spektrophotometrische Bestimmung
mißt, wobei dem Reaktionsgemisch so viel Äthanol zugegeben wird, daß dessen Konzentration
die Grenzen von 03—0,7 VoL-% nicht überschreitet,
gemäß Patentanmeldung P2237940.4. dadurch
gekennzeichnet, daß man das Verfahren bei einem pH-Wert von 6,3—6,8 durchführt
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