DE2149675B2 - Verfahren zur quantitativen bestimmung von harnsaeure - Google Patents
Verfahren zur quantitativen bestimmung von harnsaeureInfo
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Description
OH
Die Erfindung betrifft ein Verfahren zur quantitativen Bestimmung von Harnsäure mittels Uricase.
Bekannte Verfahren zur quantitativen Bestimmung von Harnsäure können grob in zwei Kategorien
eingeordnet werden. Die zur ersten Kategorie gehörenden Verfahren nutzen die reduzierende Wirkung
der Harnsäure aus. Hierbei wird Phosphor-Wolframsäure einer Harnsäure enthaltenden Probe zugesetzt
und das bei der Reduktion der Phosphor-Wolframsäure mit Harnsäure entstandene Phosphor-Wolfram-Blau
kolorimetrisch gemessen. Dieses Verfahren ist jedoch nicht genügend genau, da andere in der Probe
enthaltene reduzierende Verbindungen den gemessenen Wert beeinflussen können. Ferner ist eine
vorhergehende Enteiweißung der Probe erforderlich, wodurch die Bestimmung kompliziert wird. Die zur
zweiten Kategorie gehörenden Verfahren werden mittels Uricase durchgeführt, wobei hauptsächlich
die Absorption im ultravioletten Bereich bestimmt wird. Hierbei wird die auf dem Abbau von Harzsäure
zu Allantoin unter der Einwirkung von Uricase beruhende Absorptionsabnahme der Harnsäure bestimmt.
Die Harnsäure hat ein Absorptionsmaximum bei 293 πΐμ. Obwohl dieses Verfahren spezifisch für
Harnsäure ist, ist seine Reproduzierbarkeit gering, und es können Verfälschungen auftreten, die auf der
Absorption von in der Probe enthaltenden Proteinen beruhen. Ein weiterer Nachteil dieses Verfahrens ist,
daß ein spezielles Spektrophotometer erforderlich ist, das eine Absorptionsmessung im ultravioletten Bereich
gestattet.
Es ist ferner bekannt, daß Harnsäure kolorimetrisch unter Verwendung von Phosphor-Wolframsäure aus
der Absorptionsdifferenz einer nicht behandelten Probe und einer zuvor mit Uricase behandelten Probe
bestimmt werden kann. Weiterhin ist es bekannt, daß Harnsäure durch kolorimetrische Bestimmung der
unter der Einwirkung von Uricase entstandenen Wasserstoffperoxidmenge bestimmt werden kann.
HO
+ 2H2O + O,
H2NCONH H O
Uricase
II. H2O2 + CH3OH
NH
+ CO2 + H2O-
Katalase
-> HCHO + 2H,C
III. HCHO + 2CH3COCH2COCH3 + NH3
O1
CH3CO
H1C
C-CH3
+ 3H,Ö
Die gemäß der Reaktion nach H a η ι ζ s c 1
(Hantzsch Pyridine Synthesis, Merck Index, 8. Auf lage, 1174) erfolgende Bildung von 3,5-Diacelyl-l,4-di
r,o hydrolulidin ist spezifisch auf die in der Probe ent
haltene Harnsäure, und die Harnsäuremenge kam durch kolorimetrische Messung der auf 3,5-Diacetyl
1,4-dihydrolutidin beruhenden Gelbfärbung be 410 ηΐμ exakt bestimmt werden.
Es wird angenommen, daß die Reaktion wie in vorstehenden Reaktionsscheina dargestellt abläuft
Eine stufenweise Zugabe der erforderlichen Reagen zien, d. h. Uricase, Katalase und das Hantzsch
Reagens, zu der Harnsäureprobe ist zur Durchführung des Uricase-Katalase-Verfahrens nicht erforderlich.
Die vorgenannten drei Reagenzien können in kombinierter Form als Testreagens verwendet
werden, und die enzymatischen Reaktionen und die Farbreaktion können gleichzeitig ablaufen.
Im allgemeinen liegt das pH-Optimum für Uricase bzw. Katalase bei etwa pH 8,5 bzw. 6,3. Andererseits
erreicht die Farbentwicklung bei der Reaktion eines Ammoniumsalzes, Acetylaceton und Formaldehyd
nach H a η t ζ s c h ihr Maximum im pH-Bereich von etwa 5,5 bis etwa 6,5 (vgl. Biochemical Journal,
Bd. 55 [1953], S. 416). Beruhend auf den vorgenannten Tatsachen wurde nun festgestellt, daß sich das Uricase-Katalase-Verfahren
vorzugsweise bei pH-Werten in der Nähe des Neutralpunktes durchführen läßt.
Im erfindungsgemäßen Verfahren werden 0.2 ml einer Harnsäurelösung mit einer Konzentration von
20 mg/100 ml in 3,0 ml einer wäßrigen Lösung von Ammoniumphosphat und Phosphorsäure mit einem
pH-Wert von 7, die 2 mg Uricase pro 100 ml enthält, innerhalb von 30 Minuten bei 37° C vollständig abgebaut.
Vorzugsweise wird daher ein aus einer Probe und dem Testreagens bestehendes Gemisch mindestens
30 Minuten nach dem Vermischen bei einer Temperatur von etwa 37° C gehalten, um die im vorstehenden
Reaktionsschema unter I. dargestellte Reaktion zu vervollständigen. Eine Katalase-Kon/entration
von 10 mg/100 ml ist ausreichend; bei Verwendung höherer Katalase-Konzentrationen wurden keine Änderungen
in der Farbentwicklung beobachtet. Vorzugsweise wird im Uricase-Katalase-Verfahren Methanol
als Alkohol verwendet. Die bevorzugte Methanolkonzentration beträgt 8 bis 10 ml pro 100 ml.
In F i g. 1 bzw. 2 sind die aus menschlichem Blutserum bzw. aus menschlichem Urin erhaltenen Harnsäurewerte
nach dem Uricase-Katalase-Verfahren mit den durch Absorptionsmessung im ultravioletten
Bereich nach Behandeln der Probe mit Uricase erhaltenen Werten verglichen.
In F i g. 3 ist die Beziehung zwischen der Harnsäurekonzentration
und der Absorption dargestellt. Die zur Durchführung der Reaktion nach H a η t ζ s c h erforderlichen Reagenzien können gemäß
der vorstehend zitierten Literaturstelle hergestellt werden.
Die Herstellung der für das Uricaie-Katalase-Verfahren
benötigten Reagenzien ist nachfolgend aufgeluhrt.
1. Harnsäure-Standard-Stammlösung
100 mg reine Harnsäure und 80 mg Liihiumcarbonat werden in einen 100 ml fassenden MeßKolbcn gegeben
und in 15 ml destilliertem Wasser unter nachfolgendem Erwärmen auf 60 C gelöst. Nach dem Abkühlen wird
die Lösung mit destilliertem Wasser auf 100 ml aufgefüllt und nach Zugabe von einigen 1 ropfen
Chloroform im Kühlschrank aufbewahrt.
2. Harnsäure-Slandaid-Lösung
10 ml der Hamsäurc-Standard-Stammlösung werden
unmittelbar vor Gebrauch mit destilliertem Wasser auf ein Volumen von 100 ml verdünnt.
3. Farbreagens
10,0 g Diammoniumhydrogenphosphat. 0.3 ml
Phosphorsäure, 10,0 ml Methanol. 0.2 ml Acetylaceton, 10 mg im Handel erhältliche Kalalasc und
2 mg ebenfalls im Handel erhältliche Uricase werden in destilliertem Wasser zu einem Volumen von 100,0 ml
gelöst Die Lösung wird filtriert und vor dem Gebrauch im Kühlschrank aufbewahrt.
4. Nullwenreagens
10,0 g Diammoniumhydrogenphosphat, 0,3 ml Phosphorsäure, 10.0 ml Methanol, 0,2 ml Acetylaceton
und 10 mg Katalase werden in destilliertem
ίο Wasser zu einem Volumen von 100 ml gelöst. Die
Lösung wird filtriert und vor dem Gebrauch im Kühlschrank aufbewahrt.
Die Beispiele erläutern die Erfindung. In den Beispielen werden die vorstehend hergestellten Reagenzien
verwendet.
Die Versuche werden in jeweils vier Teströhrchen
durchgeführt, die mit A, B, C und D bezeichnet sind. In die Röhrchen A und B werden jeweils 0,2 ml
menschliches Blutserum und in die Röhrchen C und D jeweils 0,2ml Harnsäure-Standard-I.ösung gegeben.
Anschließend werden in die Röhrchen A und C je
3,0 ml des Farbreagens und in die Röhrchen B und D je 3.0 ml des Nullwenreagens gegeben. Die Röhrcheninhallc
werden heftig gerührt und 70 Minuten bei 37 C in einem thermostatisierten Bad inkubiert.
Die Röhrchen werden dann unter fließendem Wasser
abgekühlt, und es wird die Absorption bei 410 ηΐμ
von A und C unter Verwendung von B und D als Nullwert gemessen. Die Harnsäurekonzentration in
der Probe wird mittels nachfolgender Gleichung berechnet, in der Ea die Absorption der Probe A und Ec
die Absorption der Probe C bedeutet.
mg Harnsäure/100 ml Blutserum = —— · 10 .
Das vorstehend beschriebene Verfahren wurde mit 118 menschlichen Blutseren durchgeführt. Die dabei
erhaltenen Ergebnisse wurden mit den Ergebnissen verglichen, die bei der Absorptionsmessung im ultravioletten
Bereich nach Behandlung der Probe mit
Uricase (J. Lab. din. Med. Bd. 54 [1959], S. 903)
erhalten wurden. Diese Ergebnisse sind in F i g. 1 dargestellt. Aus F i g. 1 ist ersichtlich, daß die nach
beiden Verfahren erhaltenen Werte auf einer Geraden mit einem Neigungswinkel von 45° liegen und mit-
so einander übereinstimmen.
Gemäß dem im Beispiel 1 beschriebenen Verfahren wird die Harnsäurekonzentration in 107 Proben von
zehnfach verdünntem menschlichen Urin bestimmt. Die Ergebnisse sind in F i g. 2 dargestellt.
1 hireh Verdünnen der Harnsäure-Standard-Stammlösung
mit destilliertem Wasser werden Proben mit Harnsäurekonzentrationen von 5, 10. 15 und 20 mg,
100 ml hergestellt. In vier Ί eströhrchen werden jeweils
<>s 0,2 ml dieser Lösungen gegeben, und ein fünftes Tcströhrchen
wird mit 0,2 ml destilliertem Wasser beschickt. Anschließend werden in jedes Röhrchen
3,0 ml Farbreagens gegeben. Die Röhrchcninhalte
werden heftig gerührt und 70 Minuten bei 37"C in einem thermostatisierlen Bad inkubiert. Die Röhrchen
werden dann unter fließendem Wasser abgekühlt, und es wird die Absorption der Proben bei 410 ηΐμ
gegen den nur destilliertes Wasser enthallenden Nullwert
gemessen. Die Ergebnisse sind in F i g. 3 dargestellt. Aus F i g. 3 ist ersichtlich, daß die Beziehung
der Harnsäurekonzentration und der Absorption einer Funktion genügt, die durch eine Ursprungsgerade
darstellbar ist.
Es wird die Harnsäuremenge in einem Serum gemäß dem im Beispiel 1 beschriebenen Verfahren bestimmt.
Anschließend wird dieses Serum mit verschiedenen bekannten Harnsäuremengen versetzt und die im
Serum enthaltene gesamte Harnsäuremenge entsprechend dem im Beispiel 1 beschriebenen Verfahren
bestimmt. Die Ergebnisse dieses Versuchs sind in der ίο Tabelle zusammengestellt.
Harnsäurekonzenlration | Zu HX) ml Blutserum | Theoretische Harnsäure | Gemessene Harnsäure | (%) |
im Blutserum | zugesetzte Hainsäuremenge | konzentration | konzentration | 100,0 |
(mg/100 ml) | (mg) | (mg/100 ml) | (mg/100 ml) | 100,0 |
3,4 | 2,0 | 5,4 | 5,4 | 100,0 |
3;4 | 4.0 | 7,4 | 7,4 | 100,0 |
3,4 | 6,0 | 9,4 | 9,4 | 99,0 |
6,0 | 2,0 | 8,0 | 8,0 | 101,7 |
6,0 | 4,0 | 10,0 | 9,9 | 100,0 |
6,0 | 6,0 | 12,0 | 12,2 | 100,8 |
8,2 | 2,0 | 10,2 | 10,2 | 100,7 |
8,2 | 4,0 | 12,2 | 12,3 | Durchschnitt |
8,2 | 6,0 | 14,2 | 14,3 | 100.2 |
Hierzu 1 Blatt Zeichnungen
Claims (5)
1. Verfahren zur quantitativen Bestimmung von Harnsäure mittels Uricase, dadurch gekennzeichnet,
daß man auf eine Harnsäure enthaltende Probe Uricase und Katalase in Gegenwart von Methanol einwirken läßt, den
entstandenen Formaldehyd mit Acetylaceton und Ammoniak zu S.S-Diacetyl-l^dihydrolutidin umsetzt
und die Gelbfärbung spektrophotometrisch mißt.
2. Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß man das Verfahren bei pH-Werten
in der Nähe des Neutralpunktes durchfuhrt.
J. Verfahren nach Anspruch 1 und 2, dadurch gekennzeichnet, daß man das Verfahren mindestens
30 Minuten bei 37° C durchführt.
4. Verfahren nach Anspruch 1 bis 3, dadurch gekennzeichnet, daß man das Verfahren mit 8 bis
10 ml Methanol pro 100 ml Farbreagens durchführt.
5. Verfahren nach Anspruch 1 bis 4, dadurch gekennzeichnet, daß man die Gelbfärbung bei
410 πΐμ mißt.
Diese Bestimmung wird mit Peroxidase und o-Di
anisidin durchgeführt. Obwohl diese Verfahren der Vorteil haben, daß die Messung im sichtbaren Be
reich durchgeführt werden kann, ist deren Durch führung kompliziert, da sie eine Enteiweißung ah
verfahrenswesentlichen Schritt enthalten.
Aufgabe der Erfindung war es daher, ein einfaches genaues und reproduzierbares Verfahren zur quantitativen
Bestimmung von Harnsäure zur Verfügung zu stellen, das die Nachteile der bekannten Verfahrer
nicht aufweist und insbesondere ohne vorhergehend« Enteiweißung der Probe durchgeführt werden kann
Diese Aufgabe wird durch die Erfindung gelöst.
Gegenstand der Erfindung ist somit ein Verfahrer zur quantitativen Bestimmung von Harnsäure mittel;
Uricase, das dadurch gekennzeichnet ist, daß man au eine Harnsäure enthaltende Probe Uricase und Kata
läse in Gegenwart von Methanol einwirken läßt den entstandenen Formaldehyd mit Acetylacetor
und Ammoniak zu 3,5-Diacetyl-l,4-dihydrolutidir umsetzt und die Gelbfärbung spektrophotometriscr
mißt.
Der Reaktionsablauf des erfindungsgemäßen Verfahrens, das nachstehend als »Uricase-Katalyse-Verfahren«
bezeichnet wird, ist im nachstehenden Reaktionsschema dargestellt.
Applications Claiming Priority (1)
Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
---|---|---|---|
JP8664970 | 1970-10-05 |
Publications (3)
Publication Number | Publication Date |
---|---|
DE2149675A1 DE2149675A1 (de) | 1972-04-06 |
DE2149675B2 true DE2149675B2 (de) | 1973-03-08 |
DE2149675C3 DE2149675C3 (de) | 1973-11-29 |
Family
ID=13892866
Family Applications (1)
Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
---|---|---|---|
DE19712149675 Expired DE2149675C3 (de) | 1970-10-05 | 1971-10-05 | Verfahren zur quantitativen Be Stimmung von Harnsaure |
Country Status (1)
Country | Link |
---|---|
DE (1) | DE2149675C3 (de) |
Cited By (2)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
DE2855433A1 (de) * | 1978-02-13 | 1979-08-16 | Miles Lab | Testmittel und anzeiger zum nachweis von harnsaeure |
CN110411969B (zh) * | 2019-08-02 | 2021-10-01 | 淮阴师范学院 | 紫外分光光度法测定禽类粪便中尿酸含量的方法 |
-
1971
- 1971-10-05 DE DE19712149675 patent/DE2149675C3/de not_active Expired
Cited By (2)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
DE2855433A1 (de) * | 1978-02-13 | 1979-08-16 | Miles Lab | Testmittel und anzeiger zum nachweis von harnsaeure |
CN110411969B (zh) * | 2019-08-02 | 2021-10-01 | 淮阴师范学院 | 紫外分光光度法测定禽类粪便中尿酸含量的方法 |
Also Published As
Publication number | Publication date |
---|---|
DE2149675C3 (de) | 1973-11-29 |
DE2149675A1 (de) | 1972-04-06 |
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Legal Events
Date | Code | Title | Description |
---|---|---|---|
C3 | Grant after two publication steps (3rd publication) | ||
E77 | Valid patent as to the heymanns-index 1977 | ||
8339 | Ceased/non-payment of the annual fee |