DE2149675B2

DE2149675B2 - Verfahren zur quantitativen bestimmung von harnsaeure

Info

Publication number: DE2149675B2
Application number: DE19712149675
Authority: DE
Inventors: Toshio Tokio Kanzaki
Original assignee: Chugai Pharmaceutical Co Ltd
Current assignee: Chugai Pharmaceutical Co Ltd
Priority date: 1970-10-05
Filing date: 1971-10-05
Publication date: 1973-03-08
Also published as: DE2149675C3; DE2149675A1

Description

OH

Die Erfindung betrifft ein Verfahren zur quantitativen Bestimmung von Harnsäure mittels Uricase.

Bekannte Verfahren zur quantitativen Bestimmung von Harnsäure können grob in zwei Kategorien eingeordnet werden. Die zur ersten Kategorie gehörenden Verfahren nutzen die reduzierende Wirkung der Harnsäure aus. Hierbei wird Phosphor-Wolframsäure einer Harnsäure enthaltenden Probe zugesetzt und das bei der Reduktion der Phosphor-Wolframsäure mit Harnsäure entstandene Phosphor-Wolfram-Blau kolorimetrisch gemessen. Dieses Verfahren ist jedoch nicht genügend genau, da andere in der Probe enthaltene reduzierende Verbindungen den gemessenen Wert beeinflussen können. Ferner ist eine vorhergehende Enteiweißung der Probe erforderlich, wodurch die Bestimmung kompliziert wird. Die zur zweiten Kategorie gehörenden Verfahren werden mittels Uricase durchgeführt, wobei hauptsächlich die Absorption im ultravioletten Bereich bestimmt wird. Hierbei wird die auf dem Abbau von Harzsäure zu Allantoin unter der Einwirkung von Uricase beruhende Absorptionsabnahme der Harnsäure bestimmt. Die Harnsäure hat ein Absorptionsmaximum bei 293 πΐμ. Obwohl dieses Verfahren spezifisch für Harnsäure ist, ist seine Reproduzierbarkeit gering, und es können Verfälschungen auftreten, die auf der Absorption von in der Probe enthaltenden Proteinen beruhen. Ein weiterer Nachteil dieses Verfahrens ist, daß ein spezielles Spektrophotometer erforderlich ist, das eine Absorptionsmessung im ultravioletten Bereich gestattet.

Es ist ferner bekannt, daß Harnsäure kolorimetrisch unter Verwendung von Phosphor-Wolframsäure aus der Absorptionsdifferenz einer nicht behandelten Probe und einer zuvor mit Uricase behandelten Probe bestimmt werden kann. Weiterhin ist es bekannt, daß Harnsäure durch kolorimetrische Bestimmung der unter der Einwirkung von Uricase entstandenen Wasserstoffperoxidmenge bestimmt werden kann.

HO

+ 2H₂O + O,

H₂NCONH H O

Uricase

II. H₂O₂ + CH₃OH

NH

+ CO₂ + H₂O-

Katalase

-> HCHO + 2H,C

III. HCHO + 2CH₃COCH₂COCH₃ + NH₃

O¹

CH₃CO

H₁C

C-CH₃

+ 3H,Ö

Die gemäß der Reaktion nach H a η ι ζ s c 1 (Hantzsch Pyridine Synthesis, Merck Index, 8. Auf lage, 1174) erfolgende Bildung von 3,5-Diacelyl-l,4-di

r,o hydrolulidin ist spezifisch auf die in der Probe ent haltene Harnsäure, und die Harnsäuremenge kam durch kolorimetrische Messung der auf 3,5-Diacetyl 1,4-dihydrolutidin beruhenden Gelbfärbung be 410 ηΐμ exakt bestimmt werden.

Es wird angenommen, daß die Reaktion wie in vorstehenden Reaktionsscheina dargestellt abläuft Eine stufenweise Zugabe der erforderlichen Reagen zien, d. h. Uricase, Katalase und das Hantzsch

Reagens, zu der Harnsäureprobe ist zur Durchführung des Uricase-Katalase-Verfahrens nicht erforderlich. Die vorgenannten drei Reagenzien können in kombinierter Form als Testreagens verwendet werden, und die enzymatischen Reaktionen und die Farbreaktion können gleichzeitig ablaufen.

Im allgemeinen liegt das pH-Optimum für Uricase bzw. Katalase bei etwa pH 8,5 bzw. 6,3. Andererseits erreicht die Farbentwicklung bei der Reaktion eines Ammoniumsalzes, Acetylaceton und Formaldehyd nach H a η t ζ s c h ihr Maximum im pH-Bereich von etwa 5,5 bis etwa 6,5 (vgl. Biochemical Journal, Bd. 55 [1953], S. 416). Beruhend auf den vorgenannten Tatsachen wurde nun festgestellt, daß sich das Uricase-Katalase-Verfahren vorzugsweise bei pH-Werten in der Nähe des Neutralpunktes durchführen läßt.

Im erfindungsgemäßen Verfahren werden 0.2 ml einer Harnsäurelösung mit einer Konzentration von 20 mg/100 ml in 3,0 ml einer wäßrigen Lösung von Ammoniumphosphat und Phosphorsäure mit einem pH-Wert von 7, die 2 mg Uricase pro 100 ml enthält, innerhalb von 30 Minuten bei 37° C vollständig abgebaut. Vorzugsweise wird daher ein aus einer Probe und dem Testreagens bestehendes Gemisch mindestens 30 Minuten nach dem Vermischen bei einer Temperatur von etwa 37° C gehalten, um die im vorstehenden Reaktionsschema unter I. dargestellte Reaktion zu vervollständigen. Eine Katalase-Kon/entration von 10 mg/100 ml ist ausreichend; bei Verwendung höherer Katalase-Konzentrationen wurden keine Änderungen in der Farbentwicklung beobachtet. Vorzugsweise wird im Uricase-Katalase-Verfahren Methanol als Alkohol verwendet. Die bevorzugte Methanolkonzentration beträgt 8 bis 10 ml pro 100 ml. In F i g. 1 bzw. 2 sind die aus menschlichem Blutserum bzw. aus menschlichem Urin erhaltenen Harnsäurewerte nach dem Uricase-Katalase-Verfahren mit den durch Absorptionsmessung im ultravioletten Bereich nach Behandeln der Probe mit Uricase erhaltenen Werten verglichen.

In F i g. 3 ist die Beziehung zwischen der Harnsäurekonzentration und der Absorption dargestellt. Die zur Durchführung der Reaktion nach H a η t ζ s c h erforderlichen Reagenzien können gemäß der vorstehend zitierten Literaturstelle hergestellt werden.

Die Herstellung der für das Uricaie-Katalase-Verfahren benötigten Reagenzien ist nachfolgend aufgeluhrt.

1. Harnsäure-Standard-Stammlösung

100 mg reine Harnsäure und 80 mg Liihiumcarbonat werden in einen 100 ml fassenden MeßKolbcn gegeben und in 15 ml destilliertem Wasser unter nachfolgendem Erwärmen auf 60 C gelöst. Nach dem Abkühlen wird die Lösung mit destilliertem Wasser auf 100 ml aufgefüllt und nach Zugabe von einigen 1 ropfen Chloroform im Kühlschrank aufbewahrt.

2. Harnsäure-Slandaid-Lösung

10 ml der Hamsäurc-Standard-Stammlösung werden unmittelbar vor Gebrauch mit destilliertem Wasser auf ein Volumen von 100 ml verdünnt.

3. Farbreagens

10,0 g Diammoniumhydrogenphosphat. 0.3 ml Phosphorsäure, 10,0 ml Methanol. 0.2 ml Acetylaceton, 10 mg im Handel erhältliche Kalalasc und 2 mg ebenfalls im Handel erhältliche Uricase werden in destilliertem Wasser zu einem Volumen von 100,0 ml gelöst Die Lösung wird filtriert und vor dem Gebrauch im Kühlschrank aufbewahrt.

4. Nullwenreagens

10,0 g Diammoniumhydrogenphosphat, 0,3 ml Phosphorsäure, 10.0 ml Methanol, 0,2 ml Acetylaceton und 10 mg Katalase werden in destilliertem

ίο Wasser zu einem Volumen von 100 ml gelöst. Die Lösung wird filtriert und vor dem Gebrauch im Kühlschrank aufbewahrt.

Die Beispiele erläutern die Erfindung. In den Beispielen werden die vorstehend hergestellten Reagenzien verwendet.

Beispiel 1

Die Versuche werden in jeweils vier Teströhrchen

durchgeführt, die mit A, B, C und D bezeichnet sind. In die Röhrchen A und B werden jeweils 0,2 ml menschliches Blutserum und in die Röhrchen C und D jeweils 0,2ml Harnsäure-Standard-I.ösung gegeben. Anschließend werden in die Röhrchen A und C je

3,0 ml des Farbreagens und in die Röhrchen B und D je 3.0 ml des Nullwenreagens gegeben. Die Röhrcheninhallc werden heftig gerührt und 70 Minuten bei 37 C in einem thermostatisierten Bad inkubiert. Die Röhrchen werden dann unter fließendem Wasser

abgekühlt, und es wird die Absorption bei 410 ηΐμ von A und C unter Verwendung von B und D als Nullwert gemessen. Die Harnsäurekonzentration in der Probe wird mittels nachfolgender Gleichung berechnet, in der Ea die Absorption der Probe A und Ec

die Absorption der Probe C bedeutet.

mg Harnsäure/100 ml Blutserum = —— · 10 .

Das vorstehend beschriebene Verfahren wurde mit 118 menschlichen Blutseren durchgeführt. Die dabei erhaltenen Ergebnisse wurden mit den Ergebnissen verglichen, die bei der Absorptionsmessung im ultravioletten Bereich nach Behandlung der Probe mit

Uricase (J. Lab. din. Med. Bd. 54 [1959], S. 903) erhalten wurden. Diese Ergebnisse sind in F i g. 1 dargestellt. Aus F i g. 1 ist ersichtlich, daß die nach beiden Verfahren erhaltenen Werte auf einer Geraden mit einem Neigungswinkel von 45° liegen und mit-

so einander übereinstimmen.

Beispiel 2

Gemäß dem im Beispiel 1 beschriebenen Verfahren wird die Harnsäurekonzentration in 107 Proben von zehnfach verdünntem menschlichen Urin bestimmt. Die Ergebnisse sind in F i g. 2 dargestellt.

Beispiel 3

1 hireh Verdünnen der Harnsäure-Standard-Stammlösung mit destilliertem Wasser werden Proben mit Harnsäurekonzentrationen von 5, 10. 15 und 20 mg, 100 ml hergestellt. In vier Ί eströhrchen werden jeweils <>s 0,2 ml dieser Lösungen gegeben, und ein fünftes Tcströhrchen wird mit 0,2 ml destilliertem Wasser beschickt. Anschließend werden in jedes Röhrchen 3,0 ml Farbreagens gegeben. Die Röhrchcninhalte

werden heftig gerührt und 70 Minuten bei 37"C in einem thermostatisierlen Bad inkubiert. Die Röhrchen werden dann unter fließendem Wasser abgekühlt, und es wird die Absorption der Proben bei 410 ηΐμ gegen den nur destilliertes Wasser enthallenden Nullwert gemessen. Die Ergebnisse sind in F i g. 3 dargestellt. Aus F i g. 3 ist ersichtlich, daß die Beziehung der Harnsäurekonzentration und der Absorption einer Funktion genügt, die durch eine Ursprungsgerade darstellbar ist.

Beispiel 4

Es wird die Harnsäuremenge in einem Serum gemäß dem im Beispiel 1 beschriebenen Verfahren bestimmt. Anschließend wird dieses Serum mit verschiedenen bekannten Harnsäuremengen versetzt und die im Serum enthaltene gesamte Harnsäuremenge entsprechend dem im Beispiel 1 beschriebenen Verfahren bestimmt. Die Ergebnisse dieses Versuchs sind in der ίο Tabelle zusammengestellt.

Harnsäurekonzenlration	Zu HX) ml Blutserum	Theoretische Harnsäure	Gemessene Harnsäure	(%)
im Blutserum	zugesetzte Hainsäuremenge	konzentration	konzentration	100,0
(mg/100 ml)	(mg)	(mg/100 ml)	(mg/100 ml)	100,0
3,4	2,0	5,4	5,4	100,0
3_;4	4.0	7,4	7,4	100,0
3,4	6,0	9,4	9,4	99,0
6,0	2,0	8,0	8,0	101,7
6,0	4,0	10,0	9,9	100,0
6,0	6,0	12,0	12,2	100,8
8,2	2,0	10,2	10,2	100,7
8,2	4,0	12,2	12,3	Durchschnitt
8,2	6,0	14,2	14,3	100.2

Hierzu 1 Blatt Zeichnungen

Claims

Patentansprüche:

1. Verfahren zur quantitativen Bestimmung von Harnsäure mittels Uricase, dadurch gekennzeichnet, daß man auf eine Harnsäure enthaltende Probe Uricase und Katalase in Gegenwart von Methanol einwirken läßt, den entstandenen Formaldehyd mit Acetylaceton und Ammoniak zu S.S-Diacetyl-l^dihydrolutidin umsetzt und die Gelbfärbung spektrophotometrisch mißt.

2. Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß man das Verfahren bei pH-Werten in der Nähe des Neutralpunktes durchfuhrt.

J. Verfahren nach Anspruch 1 und 2, dadurch gekennzeichnet, daß man das Verfahren mindestens 30 Minuten bei 37° C durchführt.

4. Verfahren nach Anspruch 1 bis 3, dadurch gekennzeichnet, daß man das Verfahren mit 8 bis 10 ml Methanol pro 100 ml Farbreagens durchführt.

5. Verfahren nach Anspruch 1 bis 4, dadurch gekennzeichnet, daß man die Gelbfärbung bei 410 πΐμ mißt.

Diese Bestimmung wird mit Peroxidase und o-Di anisidin durchgeführt. Obwohl diese Verfahren der Vorteil haben, daß die Messung im sichtbaren Be reich durchgeführt werden kann, ist deren Durch führung kompliziert, da sie eine Enteiweißung ah verfahrenswesentlichen Schritt enthalten.

Aufgabe der Erfindung war es daher, ein einfaches genaues und reproduzierbares Verfahren zur quantitativen Bestimmung von Harnsäure zur Verfügung zu stellen, das die Nachteile der bekannten Verfahrer nicht aufweist und insbesondere ohne vorhergehend« Enteiweißung der Probe durchgeführt werden kann Diese Aufgabe wird durch die Erfindung gelöst.

Gegenstand der Erfindung ist somit ein Verfahrer zur quantitativen Bestimmung von Harnsäure mittel; Uricase, das dadurch gekennzeichnet ist, daß man au eine Harnsäure enthaltende Probe Uricase und Kata läse in Gegenwart von Methanol einwirken läßt den entstandenen Formaldehyd mit Acetylacetor und Ammoniak zu 3,5-Diacetyl-l,4-dihydrolutidir umsetzt und die Gelbfärbung spektrophotometriscr mißt.

Der Reaktionsablauf des erfindungsgemäßen Verfahrens, das nachstehend als »Uricase-Katalyse-Verfahren« bezeichnet wird, ist im nachstehenden Reaktionsschema dargestellt.