JPS584916B2 - 試料中の尿酸を測定するための試験手段 - Google Patents

Description

【発明の詳細な説明】 本発明は一般に臨床試験の分野に関する。

さらに詳しくは、液体試料中の尿酸を測定するための単
一の試薬試験に関する。

噛乳動物の代射においては、摂取された核蛋白質がプリ
ンおよびピリミジンに内因的に一定に変化する。

このプリンは異化作用過程によりさらに脱アミノ化およ
び部分酸化されて尿酸になり、これは通常人体では尿中
に***される。

従って、ごく少量の濃度の尿酸が人間の血液および尿中
に常に存在する。

プリンを含有する食物を摂取しても、濃度が上昇するよ
うな腎臓の機能低下の場合を除いて、血清中の尿酸含有
量に影響を与えない。

プリンを含有する食物の摂取に関係しないある他の病的
状態、例えば***または痛風では、血清中の尿酸の量
の異常な増加が見られる。

また、血清中の尿酸は白血病および肺炎等の白血球核の
過剰な破壊に関係する状態で上昇する。

血清中の尿酸の試験は前述の状態を診断し、いくつかの
場合には、非常に関係の深い異常な状態、例えば肺炎と
関節炎を区別する助けとして役に立つと認識されている
。

肺炎は血清中の尿酸の異常な増加により特徴づけられる
が、関節炎はそのような増加を示さない。

それゆえ、血清中の尿酸濃度を正確に特定して測定する
簡単かつ経済的な試験を提供することが望まれる。

尿酸は正常時には、血清１００ｍｌ当り約０．７〜約６
．０〜（通常η％として報告されている）の量で血清中
に見られる。

上述した異常な状態では、血清中の尿酸含量は１０ｍｇ
％またはそれ以上の値にしばしば達する。

従来技術は血清中の尿酸を測定するための多くの方法を
開示している。

より広範に用いられている方法のなかには血液の枦液を
利用する発色法がある。

これらの方法のいくつかは血液の濾液からの尿酸の析出
（例えば銀塩として）およびリンタングステン酸塩また
はヒタングステン酸塩との反応による色原体付加物の生
成に依存する。

血液沢液を利用する他の方法は、尿酸濃度の定量的評価
のための従来の技術を用いて測定される色を生じさせる
ためにシアン化尿素溶液の存在下、沢液をタングステン
酸で直接処理することに依存する。

極く最近では、尿酸のアラントインと過酸化水素への触
媒酸化を包含する方法が提案されている。

この酸化は大気中の酸素の存在下で通常行なわれ、かつ
カウリーゼ活性を有する物質を利用する。

この反応はｐＨ９またはその付近で起こる。

このような方法では、尿酸がアラントインと過酸化水素
に転換する間に尿酸の特徴的スペクトルの消滅を測定す
るために、分光光度計を用いることができる。

もう１つの方法は尿酸のこのような分解時に生成した化
学量論量の過酸化水素を測定するために比色手段を利用
しており、例えばアルバウム（Ａｌｂａｕｍ ）特許番
号第３，３ ４ ９，０ ０ ６号およびワヒテル（Ｗ
ａ ｃｈ ｔ ｅｒ ）特許番号第３，３ ３ ５，０
６ ９号（いずれも本出願人に譲渡されている）に記
載されている。

酵素転換試験において、生成する過酸化水素が血清中に
存在する尿酸の量に比例する場合、過酸化水素は、過酸
化活性を有する物質の存在下で呈色する物質の酸化によ
り生じた色の変化によって測定される。

この反応は酸性ｐＨで起る。ナトリウムアジドまたはシ
アン化ナトリウム等のカタラーゼ防止剤は過酸化物のカ
タラーゼ分解を防止することを通常要求されている。

次いで得られた色を目で標準と比較するかまたは、電気
的に測定して試験する流体中に存在する尿酸の定量的評
価か得られる。

仏国特許７２７３１５５７号は基本的に異なる酵素触媒
反応を開示しており、そこではアルデヒドを含まないメ
タノールおよびカタラーゼをウリカーゼと共に試料（ｐ
Ｈ８に緩衝）に添加し、３−メチル−２−ベンゾチアゾ
リノンヒドラゾン（ ｐＨ３に緩衝）および塩酸に溶解
した塩化第二鉄を添加すると青色に呈色することが開示
されている。

加納特許番号第３，８ ６ ２，８ ８ ５号は、微生
物起源ウリカーゼおよびカタラーゼ防止剤（ｐＨ５．５
〜７．０に緩衝）により過酸化水素を発生させ、陰イオ
ン界面活性剤、色原体およびペルオキシダーゼ（ｐＨ４
．０〜７．０）の存在下発生した過酸化物を測定するこ
とによる尿酸の測定方法を開示している。

ゴツホマン（（３ｏ ｃｈｍａｎ ）とシュミット（
Ｓｃ ｈｍ−ｉｔｚ）は、「クリニカル・ケミストリー
Ｊ（ＣＰｉｎ．Ｃｈｅｍ ）第１７巻、１１５４ページ
（１９７１）において、３−メチル−２−ベンゾチアゾ
リノンヒドラゾン・塩酸塩をＮ，Ｎ−ジメチルアニリン
と共に用いてアゾ色素指示薬を形成させる尿酸の自動測
定法を報告している。

この分野においてこれまでの研究者の貢献にもかかわら
ず、これらの方法は、液相で通常行なう一連の別々の操
作を要するという欠点を持っていた。

動物ウリカーゼおよびペルオキシダーゼを同時に用いる
組合せの反応は、尿酸と色原体が競合するため、すなわ
ち両者がペルオキシダーゼの存在下で過酸化水素により
酸化されるためと用いる２つの酵素の最適ｐＨが著るし
く異なるために不可能と考えられていた。

両反応を同じｐＨまたは非常に近いｐＨで行なう従来技
術のシステムでは最高の効率特性を示す動物起源ウリカ
ーゼ等の使用可能なある反応成分は、この反応に要求さ
れるｐＨ範囲内でペルオキシダーゼ生成系の成分として
機能したいためにここでは用いることができないという
欠点がある。

このように安定化された統一的な試薬試験において、尿
酸測定用手段を包含することは以前は不可能であった。

本発明の第１の目的は体液中の尿酸測定用組成物または
用具等の統一的な試験手段を提供することである。

本発明の第２の目的は、多数の試料を試験するために特
に有用な検出手段を用いた尿酸試験組成物および用具を
提供することである。

本発明の第３の目的は統一的な試験手段を用いることに
より長時間に亘って安定な単一作用尿酸試験用具を提供
することである。

本発明の第４の目的はｐＨ感受性の妨害物質を含有しな
い新規な精製された動物起源ウリカーゼ活性物質を包含
させることにより上述の利点が達成される尿酸測定のた
めの改良された試験手段を提供することである。

本発明の他の目的および充分な理解が以下の記載および
好ましい実施態様に向けられた特許請求の範囲を参照す
ることによって得られるであろう。

本発明に従えば、精製されたウリカーゼをその中に用い
た組成物または用具等の統一的な試験手段、試験用具の
製造方法およびそれを用いる尿酸の測定方法が提供され
る。

さらに詳しくは、ウリカーゼ活性物質、少なくとも１つ
の色原体およびペルオキシダーゼよりなる尿酸検出用試
験手段において、ウリカーゼ活性物質が、低金属結合定
数緩衝液に対して透析され、約６．８〜約７．５のｐＨ
を有し、前記ｐＨ領域において安定であり、そして、約
６０００未満の分子量のｐＨに対して感受性を有する妨
害物質を含有していない動物起源ウリカーゼであること
を特徴とする試験手段が提供される。

この試験手段は少なくとも１つのカップリング剤および
少なくとも１つの安定剤をさらに包含することができる
組成物の形を採ることができる。

この組成物を 剤またはマトリックス等の担体に任意に
包含して試験用具を得ることができる。

このウリカーゼ活性物質は標準的な動物ウリカーゼ製品
を分別して低分子量の妨害物質を除くことにより精製さ
れ、以前は達成されなかったｐＨ範囲に亘って安定であ
り、統一的な試験を可能にする。

上述の組成物の成分である精製された動物起源ウリカー
ゼ活性物質は、例えばインヂアナ４６５１４、エルクハ
ートのマイルス・ラボラトリーズ・インコーポレーテツ
ドのマイルス・リサーチ・プロダクツ（Ｍｉ ｌｅｓ
Ｒｅｓｅａｒｃｈ Ｐｒｏｄｕｃｔｓ，Ｍｉ ｌｅｓＬ
ａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ Ｉｎｃ．， Ｅｌｋｈａｒｔ
，Ｉｎｄｉａｎａ４６５１４）より商業的に入手可能な
動物ウリカーゼ製品を分別精製することにより調製され
る。

ｐＨの変化に感受性があり、約６０００未満の比較的低
分子量の妨害物質が除去される。

驚くべきことに、この一見簡単な精製方法によって生成
されたウリカーゼ活性物質は、約６，８〜約７．５のｐ
Ｈ範囲に亘って安定であり、かくして、単一の反応のパ
ラメーターの下で機能する多くの反応系を有する統一さ
れた酵素触媒尿酸試験組成物の調製を可能にする。

動物ウリカーゼは銅蛋白（複合金属蛋白）であり、Ｃｕ
２＋は酵素の触媒位置の一部であると信じられている。

活性位置の銅を含む部分の構造は以下に図式的に示され
ている。

すなわち、酵素の銅蛋白の性質は、Ｃｕ２＋イオンの瞬
間的な還元とＣｕ＋イオンの錯体形成を可能にする種種
の試薬によって酵素が急速であるが可逆的に抑制される
ようにする。

それゆえウリカーゼは低い金属結合定数を有する緩衝液
に対して透析することにより精製することが好ましい。

好ましい実施態様においては、トリス（ヒドロキシメチ
ル）一アミノメタン（ＴＲＩＳ）、ピペラジンーＮ，Ｎ
’−ビス（２−エタンスルホン酸）（ ＰＩＦＥＳ ）
、Ｎ−トリス−（ヒドロキシメチル）メチル−２−アミ
ノエタンスルホン酸（ＴＢＳ）およびリン酸塩緩衝液等
の低い金属結合定数を有する緩衝液を含んでいる溶液に
対して酵素を透析す？。

尿酸をウリカーゼによって約ｐＨ７でアラントインと過
酸化水素に酵素的に酸化する。

緩衝液またはｐＨにかかわらず、本来の酵素反応の化学
量論は式〔Ｉ〕： ＣＮＯＨ ＋０十Ｈ２０ Ｓ ４ ３ ３ →Ｃ，Ｎ４０４Ｈ３−十Ｈ２０２ 〔Ｉ〕に
より与えられる。

すなわち尿酸塩のモノアニオンから酸素への電子対の伝
達により不安定な酸中間体（ｌ一カルボキシ−２，４，
６．８−テトラアザビシクロ（ ３．３．０ ，ｌ−オ
クター４−エンー３，４ｃ７−ジオン）および過酸化水
素が得られる。

この中間体生成物は尿酸より強い酸（より低いｐＫ）で
あり（尿酸塩のｐＫ＝５．７５に対して尿酸ｐＫ＝４．
５、尿酸塩のＰｋ２＝１０．３に対して尿酸ｐＫ２＝
１ １． ５ ）、銅（Ｃｕ”）およびコバルト（Ｃｏ
２＋）と金属キレートを形成させることにより安定化す
ることができる。

ｐ Ｈ ７． ０で極度に精製された酵素の存在下では
、アラントイン、過酸化水素および二酸化炭素の化学量
論量が生成される。

次いで過酸化水素がペルオキシダーゼの存在下で色原体
と反応して赤い錯体を与える。

この試験の全般的化学反応は以下のようである。

すなわち、 アウトライン＋ＣＯ ＋Ｈ Ｏ （ＩＩ）２
２ ２ ？２０＋３−アルキルー２−ベンゾチアゾリノンヒドラ
ゾン十カップリング試薬 この系では、尿酸および色原体との間の競合の難点およ
び酵素の最適ｐＨの極度の相異の難点が強い還元剤、ヒ
ドラゾンおよび非常に感受性があり、さらにウリカーゼ
の活性物質として働くカップリング剤を用いることによ
ってさらに克服される。

例えば３−メチル−２−ベンゾチアゾリノンヒドラゾン
（ＭＢＴＨ）およびプリマキンニリン酸塩（ＦＤＰ）を
用いる色原体反応が以下のように図式Ａに図式的に表わ
されている。

特定のことばが明確にするために以下の記載に用いられ
ているが、これらのことばは代表的な説明のために選ば
れた本発明の特別の実施態様のみを言及しようとするも
のであり、本発明の範囲を限定あるいは制限しようとす
るものではない。

市販のウリカーゼ製品は、好ましい実施態様において、
そのウリカーゼ製品を分別して約６０００未満の分子量
を有する分子を除くことを特徴とする透析方法によって
精製される。

ヒドラゾンはヒドラジンとアルデヒドまたはケトンとの
縮合生成物であり、Ｃ−ＮＮＨ３基を含有する。

多くのヒドラゾンはある芳香族アミンまたはヒドロキシ
ナフタレンスルホン酸塩と酸化的にカップリングして呈
色物質を形成する。

このヒドラゾンとしては、とりわけ，、３−メチル−２
−ペンゾチアゾリノンヒドラゾン、２−ヒドラジノベン
ゾチアゾール、Ｎ−メチル−ピリドン−４−ヒドラゾン
、Ｎ−メチル−ピリドン−２−ヒドラゾン、Ｎ−メチル
ーキノリノン−２−ヒドラゾン、メチルーキノリノン−
４−ヒドラゾン、Ｎ−メチル−２−ベンゾチアゾリノン
ヒドラゾン、Ｎ−メチルーチアゾリノン−２−ヒドラゾ
ン、Ｎ−メチル−４−フエニルチアゾリノン−２−ヒド
ラゾン、Ｎ−メチルーオキサゾリノン−２−ヒドラゾン
、Ｎ−メチルーベンズオキサゾリノン−２−ヒドラゾン
および１，３−ジメチルベンズイミダゾリノン−２−ヒ
ドラゾンが挙げられる。

組成物の好ましい実施態様では、３−メチル−２−ベン
ゾチアゾリノンヒドラゾン（ＭＢＴＨ）等の３−（Ｃ１
〜Ｃ４アルキル）−２−ペンゾチアゾリノンヒドラゾン
・色原体が色原体として用いられる。

このようなヒドラゾンは強い還元剤である。このヒドラ
ゾンは約０．０５〜％から約０．２■％の濃度でベンゼ
ン溶鉛中で用いられる。

色原体ヒドラゾンと組合わせて用いることができるカッ
プリング剤の代表例は下記の通りである。

（１） 一般式： （式中、Ｘは炭素原子、窒素原子またはイオウ原子を表
わし、Ｒ１は水素原子、水酸基、アミノ基、アルキレン
ジアミン基またはアミノアルカノール基を表わすかまた
はＲ２が水素原子の場合にＲ２と一緒になってＮＨＣＨ
２ＣＨＯＨＣＨ２となるものを表わし、Ｒ２およびＲ３
は同一または異なっていてもよく、水素原子または亜硫
酸基を表わし、Ｒ４は水素原子、水酸基、 ＮＨＣＨ（ＣＨ３）ＣＨ２ＣＨ２ＣＨ２ＮＨ２、または
亜硫酸基を表わし、Ｒ５は水素原子、亜硫酸基またはア
セトアミノ基を表わし、Ｒ６は水素原子またはメトキシ
基を表わし、Ｒ７は水素原子、水酸基またはアミン基を
表わす。

）を有する化合物およびそのリン酸塩等の酸付加塩 （２）一般式：Ｒ−ＣＨ２−Ｒ（式中、それぞれのＲは
ジメチルアニリン、ヒドロキシフエニル、ベンゾチアゾ
ールまたはベンゾフエノンを表わす。

）を有する化合物 （３）チアミンまたはその酸付加塩 （４）メチルフエニルプロパンジアミン （５）フエノチアジン 好ましいカップリング剤としては、プリマキンニリン酸
塩（ＦＤＰ）、クロモトロープ酸および４，４′−メチ
レンビス（ Ｎ ， Ｎ’−ジメチルアニリン）（ＭＢ
ＤＭＡ）が挙げられる。

カップリング剤は約１．０■％〜約５０ｍ９％の水溶液
で用いられる。

この組成物はさらに有利に選択された安定剤、カルボキ
シメチルセルロース（ＣＭＣ）おヨヒ脂肪族アルコール
のポリオキシエチレンエーテル（ＢＲＩＪ ：登録商標
、アイシーアイ・ユナイテッド・ステイツ・インコーポ
レーテツド、ウイルミングトン、デラウエアｌ ９８
９ ７ （ＩＣＩ Ｕｎｉ−ｔｅｄ Ｓｔａｔｅｓ Ｉ
ｎｃ・，Ｗｉｌｍｉｎｇｔｏｎ，Ｄｅｌａｗａ一ｒｅｌ
９８９７）社製〕を含むことができる。

これらは総濃度約０．５ｍｇ％〜約５．０ｍｇ％で水溶
液中に存在する。

本発明に従った組成物を含んでいる溶液は、尿等の体液
試料に添加することによって尿酸を検出するために用い
ることができる。

結果として色の変化を伴なう発色錯体が形成される。

しかしながら、この組成物は溶液としてよりもむしろ固
体製品の形で、また好ましくは使い易さと信頼性のため
に設計された用具でより有利に用いられる。

本発明の特徴として、不活性担体およびその不活性担体
に包含される上述の実施例で説明されるような本発明に
従った組成物よりなる用具が作成される。

この不活性担体は吸収性または非吸収性の担体マトリッ
クスの形を採ることができるかまたは 剤または他の通
常の形を採ることができる。

この担体マトリックスということばは生理的液体または
他の液体と接触される場合、不溶性であり、その構造全
体を維持する吸収性または非吸収性のマトリックスのこ
とをいう。

用いることができる好適な吸収性マトリックスとしては
、紙、セルロース、木、合成樹脂フリース、ガラス繊維
、不織布および織布等が挙げられる。

非吸収性マトリックスとしてはポリプロピレンのような
有機プラスチック材料が挙げられる。

使い易くするために、そのマトリックスをポリスチレン
製の支持部材のような非溶解性支持部材と組合わせるこ
とができる。

また、この不活性担体は崩壊剤、充填剤および潤滑剤の
ような通常の担体材料を含んでいる圧縮成形または形成
形した 剤の形にすることができる。

本発明の試験用具は実施例に示されているように高度な
安定性を示す。

この安定性は基質上にある組成物の成分を分離し、最終
製品を箔、乾燥剤を含んでいる容器等に装填することに
よりさらに改良することができる。

印刷、ｌまたはそれ以上の成分のカプセル包装、異なっ
た成分に対して別別のマトリックスまたは基質の使用、
基質の両側へ共存できない成分の配置などによって成分
を物理的に分離することができる。

さらに本発明の特徴として、不活性担体を本発明の組成
物で含浸、プリントまたは他の方法で接触することより
なる尿酸試験用具を調製する方法も提供される。

担体が液状の組成物で含浸される場合には、担体は次い
で乾燥工程を受ける。

さらに本発明は、液体試料中の尿酸測定用組成物または
試験用具を用いる方法を提供する。

組成物または用具と試料を接触させ、色のある変化を観
察することによってこの試料を試験する。

吸収性担体マトリックスを有する型の用具を用いる場合
には、この試料をマトリックスに入れてその上の色の変
化を観察する。

視覚による比較に加えて、生じたある色の変化を測定す
るために種々の器具を用いる方法により行なうことがで
き、このようにして人間の目による主観的な色の測定を
不要にすることにより試験の精度を向上させる。

酵素製品の活性は乾燥重量η当りの活性単位数によって
測定される。

国際生化学連合の酵素委員会（Ｔｈｅ Ｃｏｍｍｉｓｓ
ｉｏｎ ｏｎ Ｅｎｚｙｎｅｓ ｏｆ ｔｈｅＩｎｔｅ
ｒｎａｔｉｏｎａｌ Ｕｎｉｏｎ ｏｆ Ｂｉｏｃｈｍ
ｉｓｔｒｙ）は酵素活性の国際単位（Ｉ． Ｕ．）をｐ
Ｈおよび温度を制御した特定の条件下の毎分当りの利用
されるｌμｍｏｌの基質と定義した。

実施例に示された反射率（％Ｒ）と吸収種（尿酸）の濃
度との関係は、コルツミ、ジー、著「反射分光学」、ス
プリンゲルーフエアラーク・ニューヨーク・インコーポ
レーテツド発行（１９６９）（Ｋｏｒｔｕｍｉ Ｇ．，
Ｒｅｆｌｅｃｔａｎｃｅ Ｓｐｅｃｔｒｏｓｃ −ｏ
ｐｙ Ｓｐｒｉｎｇｅｒ−Ｖｅｒｌａｇ Ｎｅｗ Ｙｏ
ｒｋ Ｉｎｃ．，１９６９）で反射分光学の詳細な論議
と共に与えられているクベルカーモンクの式（Ｋｕ ｂ
ｅ ｌ ｋａ −Ｍｏｎｋ ｅｑｕａｔｉｏｎ）によっ
て得られる０クベルカーモンクの式によって定義された
関係においては％Ｒ値は検出された尿酸の濃度が増加す
ると減少し、逆に減少すると増加する。

かくしてその式に従えば得られた表示は検出される尿酸
の濃度と反比例の関係にある。

すべての表示は他に指示がなければ５３０ｎｍで得た。

反射率の表示はカリホルニア９ ２ ６ ３ ４、ヒュ
ラートンベツクマン・インストルメンツ・インコーポレ
ーテツド製ベツクマンＤＫ−２スペクトロフォトメータ
ー（Ｂｅｃｋｍａｎ ＤＫ＝２８ｐｅｃｔｒｏｐ−ｈｏ
ｔｏｍｅｔｅｒ， Ｂｅｃｋｍａｎ Ｉｎｓｌｒｕｍｅ
ｎｔｓ， Ｉ−ｎｃ．， Ｆｕｌｌｅｒｔｏｎ Ｃａｌ
ｉｆｏｒｎｉａ ９２６３４ ）またはイスラエル・エ
レクトローオプテイカル・インダストリー・リミテッド
製スペクトロカラリメーターＳＣＦ−１（米国において
ブルマー・リサーチ・コーポレーション、フレインウエ
ル，ロングアイランド，ニューヨーク１１８０３より市
灰（Ｓｐｅｃｔｒｏｃｏｌｏｒｉｍｅｔｅｒ ＳＣＦ−
１ ， Ｉｓｒａ−ｅｌ Ｅｌｅｃｔｒｏ−Ｏｐｔｉｃ
ａｌ Ｉｎｄｕｓｔｒｙ Ｌｔｄ．（ｄｉｓｔｒｉｂｕ
ｔｅｄ ｉｎ ｔｈｅ Ｕ．Ｓ．ｂｙ Ｂｒｏｏｍｅｒ
Ｒｅｓｅａｒｃｈ Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ， Ｐｌａ
ｉｎｗｅｌ ｌ， Ｌ−ｏｎｇ Ｉｓｌａｎｄ， Ｎ．
Ｙ．１ １ ８ ０ ３ ） ）等の商業的に入手可
能な分光光度計により得ることができる。

示された実施例は単に例示であり、本発明を限定として
構成されるものではない。

当業者は、所望のように成分およびパラメータを変化さ
せ、置き換え、修正することができるであろう。

実施例 １ 本発明に係る精製された動物起源ウリカーゼ活性物質を
下記のように調製した。

活性度９ Ｉ． Ｕ． ７ｍｌの５ｍｌのウリカーゼ（
ベーリンゲル・マンハイム・ＧｍｈＨ１マンハイム、西
独（Ｂｏｅｈｒ ｉｎｇｅｒ Ｍａｎｎｈｅｉｍ Ｇｍ
ｂＨ， ＦｅｄｅａｌＲｅｐｕｂｌ ｉｃ ｏｆ Ｇｅ
ｒｍａｎｙ） ）を、分子量約６０００未満の分子を透
過可能なスペクトレイパー膜〔スペクトラム・メディカ
ル・インダストリーズ、ロサンジエルス、カリホルニア
６０９１６（ＳｐｅｃｔｒｕｍＭｅｄｉｃａｌ Ｉｎｄ
ｕｓｔｒｉｅｓ， ＬｏｓＡｎｇｅｌｅｓ， Ｃａｌｉ
ｆｏｒｎｉａ６ ０ ９ １ ６ ） ］で形成された
透析袋に入れた。

このウリカーゼを０．５ＭのＴＲＩＳに対してｐ Ｈ
７． ０、４℃で１８時間攪拌下透析した。

この酵素を充分に透析するために要する緩衝液の最小容
量を測定するためにこの研究を始めた。

１ ｍｌのウリカーゼを２ ０ｍｌ， ５ ０ｍｌ，
１ ０ ０ｍｌおよび１０００ｍｌの緩衝液に対し
て透析した。

透析したウリカーゼをすべて測定したところ、種々の容
量の緩衝液で活性度の重大な相異は見られなかった。

結果を第１表に示す。かくして、実質的に完全に精製し
たことにより、２０ｍｌ程度の緩衝液を用いてさえ妨害
物質を除去することができることが明らかである。

実施例 ２ 第２表に示された種々の緩衝液に対して透析したウリカ
ーゼを用いて２段浸漬法で細片を調製した。

それぞれ示された緩衝液に対して透析した０．５ｍｌの
ウリカーゼ（ ３． ０ Ｉ． Ｕ． ／ｍｌ ）、０
． ５ ｍｌの安定剤（ １． ５■％のＣＭＣおよび
脂肪族アルコールのポリオキシエチレンエーテル０．８
ｍｇ％（ ＢＲＩＪ３５）〕、０．０６ｍｌの西洋わさ
びペルオキシダーゼ、および０．１ｍｌ（ ３．７ ５
ｍｇ％）のカップリング剤ＰＤＰをすべて蒸留水中で混
合することによつて第１の浸漬溶液を調製した。

５，０■の色原体ＭＢＴＨをベンゼン１０ｍｌに溶解す
ることにより第２の浸漬溶液を調製した。

２．５ ４× １ ０．１ ６ｃｍの寸法のワットマン
ＥＴ３１ｐ紙〔ワットマン・インコーポレーテツド，ク
リフトン，ニュージャージー０ ７ ０ １ ４ （Ｗ
ｈａｔｍ−ａｎ Ｉｎｃ． Ｃｌｉｆｔｏｎ， Ｎ．Ｊ
．０ ７０ １ ４ ）を各第１の浸漬溶液で飽和含浸
し、５０℃で３０分間乾燥し、次いで第２の浸漬溶液で
飽和含浸した後、再度乾燥し、５．Ｉ × １ ０．２
ｍｍに切断して本発明の用具を作成した。

次いで、このように調製した用具を３つのグループに分
けた。

これらのグループの２つをそれぞれ６０゜Ｃで２４時問
および７２時間加温状態に置いた。

第３のグループは加温せず、対照とした。次いで、これ
らの用具を、第２表に示された量の尿酸を含む０．０３
ｍｌに分別した血清試料をその上に置き、生じた色の変
化を観察することにより試験した。

％Ｒの表示を新しく調製した細片で１２０秒毎に測定し
た。

第２表の結果は、尿酸の濃度が増加すると％Ｒが漸次減
少することを示し、この関係はクベルカーモンクの式に
よって定義されている。

これは、試験した各緩衝液が、精製されたウリカーゼ活
性物質を調製する際に有利に役立つことを示す。

実施例 ３ 透析する緩衝液のｐＨの変化に対する感受性を試験した
。

第３表に示された種々のｐＨレベルに調製されたリン酸
塩緩衝液に対して透析されたウリカーゼで実施例２のよ
うに用具を調製した。

％Ｒで示され、得られたデータを第３表に示す。

この結果は尿酸濃度の増加につれて漸次減少する傾向を
示す。

これは少なくとも約６，８〜少なくとも約７．５のｐＨ
を有する緩衝液に透析されたウリカーゼが尿酸の検出に
おいて高い感受性を与えたことを示す。

ＴＲＩＳ ，ＰＩＰＥＳおよびＴＢＳ緩衝液に対して透
析されたウリカーゼを用いて得られた結果は、同じｐＨ
範囲に亘ってウリカーゼが安定であることを示す。

実施例 ４ 第４表に示されたカップリング剤をＦＤＰの代りに用い
た以下の方法に従って用具を調製した。

ＭＢＴＨ０．２ｇを５０ｍｌのメタノールと１０ｍｌの
Ｈ２０の混合液に溶解させた。

このＭＢＴＨ溶液６ｍｌに、０．０２ｇの選択されたカ
ップリング剤、０． ５ｍｌの２００■％ベルオキシダ
ーゼおよび０．１ｍｌの透析したウリカーゼ（ ６ Ｉ
．Ｕ／ｍｌ）を加えて本発明の組成物を含む溶液を含む
溶液を調製した。

このように調製された反応溶液を、その０．２ｍｌと尿
酸０．０１ｍｌを混合することによって試験した。

５ｍｇ％および１０■％の濃度の尿酸で試験する場合、
種々のカップリング剤と共に観察された反応を第４表に
示す。

このように第４表はクロモトロープ酸、ＭＢＤＭＡおよ
びプリマキンニリン酸−が、本発明に係る組成物でカッ
プリング剤として用いられる場合効果的であり、ある他
の化合物、すなわち、パラーｄ−メチルアミノベンズア
ルデヒド、ビス（４−ヒドロキシフエニル）メタンおよ
びイミノジベンジルは効果的でないことを示す。

効果的なカップリング剤である他の化合物としては、ナ
フチルエチレンジアミン、ナフチルアミンエタノール、
ヒドロキシテトラヒドロベンゾキノリン、フエノチアジ
ン、Ｈ一酸（８−アミノ−■−ナフトール−６−スルホ
ン酸）、■−ヒドロキシー２−ナフタレンスルホン酸、
■−ヒドロキシ−３−ナフタレンスルホン酸、■−アミ
ノー２−ナフタレンスルホン酸および６−アセトアミノ
ーｌ−ヒドロキシナフタレンスルホン酸が挙げられる。

実施例 ５ 尿酸含有量未知の２０の清浄な血清試料を、下記のよう
に１段浸漬法で調製された用具を用いて分析した。

この結果を、キャロル、その他著、〔臨床化学」第１７
巻、１５８ページ（１９７１ ）（Ｃａｒｒｏｌｌ ｅ
ｔ ａｊＪ．， Ｃｌ ｉｎ ｉｃａ ｌ Ｃｈｅｍｉ
ｓ ｔｒｙ １７ ：１５８（１９７１））に従った
標準のリンタングステン酸塩法により行なわれた試験と
比較した。

０．３ｍｇ％の３−メチル−２−ベンゾチアゾリノンヒ
ドラゾン（ＭＢＴＨ）、０．１５■％のペルオキシダー
ゼ、０．０７５■％のプリマキンニリン酸塩（ＦＤＰ）
および１．０〜％のカルボキシメチルセルロースを含む
ｌｏｍｌの蒸留水を、本発明に係る３． ０ Ｉ． Ｕ
． ／ｍｌの活性度を有する精製した動物起源ウ１ノカ
ーゼ活性物質を含むｐＨ７の０． ５ ＭのＴＲＩＳｌ
Ｏｍｌと混合した。

２．５ ４× ｌ ０．１ ６ｃｍの寸法のワットマン
濾紙を各上記溶液１ ｍｌで含浸し、５０℃で３０分間
乾燥し、次いで５．Ｉ × Ｉ ０．２ｍｍに切断して
本発明に係る用具を調製した。

この用具を、使い易くするために拡大したポリスチレン
支持部材に両面接着テープで固定した。

それぞれの用具の上にそれぞれ０． ０ ５ｍｌの血清
試料を加え、１０秒後および５分後に再度呈色を観察す
ることによってこれらの用具を試験した。

すべての表示は、黄緑色のフィルター〔エドムンド・サ
イエンティフィック・カンパニー，バリングトン，ニュ
ージャージー０ ８ ０ ０ ７ （ＥｄｍｕｎｄＳｃ
ｉｅｎｔｉｆ ｉｃ Ｃｏ．， Ｂａｒｒｉｎｇｔｏｎ
， Ｎｅｗ Ｊｅ−ｒｓｅｙ０８００７））を用いたエ
ームス分光光度計（ＡＲＭ）（エームス・カンパニー，
テイヒション・オブ・マイルス・ラボラトリーズ・イン
コーポレーテツド，エルクハート，インジアナ４ ６
５ １ ５ （Ａｍｅｓ Ｃｏｍｐａｎｙ ＋Ｄｉｖｉ
ｓｉｏｎ ｏｆ Ｍｉ ｌｅｓＬａｂｏｒａｔｏｒｉｅ
ｓ Ｉｎｃ，Ｅｌｋｈａｒｔ， Ｉｎｄｉａｎａ４６５
１４））により得た。

標準のリンタングステン酸法によって各試料を試験した
結果と比較する際に、手製の用具の応答変化を最小にす
るために、５分とｌ０秒の表示の間のＡＲＭ単位の差（
Δ）を用いた。

各試料の結果を第５表に示す。

ＡＲＭ単位の表示は存在する尿酸の濃度ｍ９％と直線関
係で変化する。

得られた結果は、記載された試験が文献の分析法に関係
し、尿酸レベルの相異に非常に感受性があることを示し
た。

この感受性は尿酸濃度がわずかに変化した試料間で表示
が明確に増加することにより明らかである。

実施例 ６ 以下のように２段浸漬法の種々の組成に従って、尿酸試
験用具を調製した。

透析した０．５ｍｌのウリカーゼ活性物質（１．３Ｉ．
Ｕ／ｍｌ）、０． １ ｍｌのＦＤＰ （ ３．７ ５
７Ｖ％）より得られた水溶液、０．０６ｍｌのベルオキ
シダーゼ０．５■％）および０． ５ ｍｌ． （ １
． ５ １Ｑ％のＣＭＣと０． ８ ■％のＢＲＩＪ
）を混合して第１の浸漬溶液を調製した。

ワットマン濾紙を上記第１の浸漬溶液で飽和含浸し、６
０℃でｌＯ分間乾燥した。

この濾紙を０．０５■％のＭＢＴＨを含むｌ０ｍｌのベ
ンゼン溶液で飽和含浸し、６０℃で１０分間乾燥した後
５． ｌ × １ ０．２ｍｍに切断して本発明に係る
用具を作成した。

この用具に２，４，６，８，１０■％の濃度の尿酸を含
む試料０．０３ｍｌを加え、１２０秒後の反射率を観察
することによりこの用具を試験した。

３９．３ ， ３４．７ ， ２９．４ ， ２６．９
および２５８％Ｒの表示を得た。

これらの表示が以前述べたクベルカーモンクの式により
定義された逆の関係であり、尿酸の濃度変化に対して良
好な感受性を示すことを確認する。

ＰＤＰ３．７５■％に代えて、１．０ ， ２．０およ
び５０〜％の濃度のＦＤＰを用いた以外は上述の方法に
従って用具を調製した。

このように調製された用具を上記のように試験した。

１２０秒毎に観察した％Ｒの表示より、この用具に用い
たカップリング剤ＦＤＰの濃度が相異する結果として観
察した感受性の重大な変化はなかった。

同様に１．５■％の安定剤ＣＭＣを０．５および２．４
〜％の濃度とした以外は上述のように用具を調製した。

このように調製した用具を上述のように試験し、高度な
感受性を有する尿酸を検出するために観察した。

０．０５ｍｇ％の色原体ＭＢＴＨに代えて０．０１，０
．１０および０．２０ｍｇ％の濃度とした以外は上述の
ように用具を作成した。

このように作成した用具を上述のように試験したところ
尿酸濃度に対して顕著な感受性を同様に示した。

１．５■％ペルオキシダーゼの濃度を０．５ ， １．
０，５．０および２０ｍｇ％とした以外は上述のように
用具を作成した。

この用具を上述のように試験したところ１．５ｍｇ％の
濃度のペルオキシダーゼを有する用具と同じ感受性で尿
酸濃度を識別した。

１，３Ｉ．ＴＪ．／ｍｌの活性度を有するウリカーゼ活
性物質に代えて０．８および１．８■．Ｕ．／ｍｌのも
のを用いた以外は上記のように用具を作成した。

この用具を試験したところ、種々の活性度のペルオキシ
ダーゼを用いた結果として、尿酸検出の感受性に重大な
変化は認められなかった。

本発明はある程度特定して記載されたが、この記載は実
施例によってのみなされたものであり、本発明の精神お
よび範囲から逸脱することなく多くの変化がなされるこ
とは理解されよう。

Claims (1)

1. 【特許請求の範囲】 １ ウリカーゼ活性物質、少なくとも１つの色原体およ
   びベルオキシダーゼよりなる尿酸検出用試験手段におい
   て、ウリカーゼ活性物質が、低金属結合定数の緩衝液に
   対して透析され、約６．８〜約７．５のｐＨを有し、前
   記ｐＨ領域において安定であり、そして、約６０００未
   満の分子量の、ｐＨに対して感受性を有する妨害物質を
   含有していない動物起源ウリカーゼであることを特徴と
   する試験手段。 ２ 色原体がヒドラゾンである特許請求の範囲第１項記
   載の試験手段。 ３ ヒドラゾンが、３−メチル−２−ベンゾチアゾリノ
   ンヒドラゾン、３−エチル−２−ベンゾチアゾリノンヒ
   ドラゾン、３−プロピル−２−ベンゾチアゾリノンヒド
   ラゾンまたは３−ブチルー２一ベンゾチアゾリノンヒド
   ラゾンである特許請求の範囲第２項記載の試験手段。 ４ ヒドラゾンが３−メチル−２−ベンゾチアゾリノン
   ヒドラゾンである特許請求の範囲第３項記載の試験手段
   。 ５ 低金属結合定数の緩衝液に対して透析され、約６．
   ８〜約７．５のｐＨを有し、前記ｐＨ領域において安定
   であり、そして、約６０００未満の分子量の、ｐＨに対
   して感受性を有する妨害物質を含有していない動物起源
   ウリカーゼから成るウリカーゼ活性物質、少なくとも１
   つの色原体、ベルオキシダーゼおよび少なくとも１つの
   カップリング試薬よりなることを特徴とする尿酸検出用
   試験手段。 ６ 前記カップリング試薬が、一般式： （式中、Ｘは、炭素原子、窒素原子またはイオウ原子を
   表わし、Ｒ１は、水素原子、水酸基、アミノ基、アルキ
   レンジアミン基またはアミノアルカノール基を表わすか
   、もしくはＲ２が水素原子のときＲ２と一緒になってＮ
   ＨＣＨ２ＣＨ（ＯＨ）ＣＨ２となるものを表わし、Ｒ２
   およびＲ３は、同一または異なっていて良く、水素原子
   または亜硫酸基を表リし、Ｒ４は、水素原子、水酸基、 ＮＨＣＨ（ＣＨ３）ＣＨ２ＣＨ２ＣＨ２Ｎ｝｛２または
   亜硫酸基を表わし、Ｒ５は、水素原子、亜硫酸基または
   アセトアミノ基を表わし、Ｒ６は水素原子またはメトキ
   シ挙を表わし、Ｒ７は水素原子、水酸基またはアミン基
   を表わす。 ）を有する化合物およびリン酸塩等のその酸付加塩、一
   般式： Ｒ−ＣＨ２−Ｒ （式中、それぞれのＲは、ジメチルアニリン、ヒドロキ
   シフエニル、ベンゾチアゾールまたはベンゾフエノンを
   表わす。 ）を有する化合物、チアミンまたはその酸付加塩、メチ
   ルフエニルプロパンジアミンおよびフエノチアジンから
   なる群より選ばれたものである特許請求の範囲第５項記
   載の試験手段。 Ｔ 低金属結合定数の緩衝液に対して透析され、約６．
   ８〜約７．５のｐＨを有し、前記ｐＨ領域において安定
   であり、そして、約６０００未満の分子量の、ｐＨに対
   して感受性を有する妨害物質を含有していない動物起源
   ウリカーゼから成るウリカーゼ活性物質少なくとも１つ
   の色原体、ベルオキシダーゼおよび少なくとも１つの安
   定剤よりなることを特徴とする尿酸検出用試験手段。 ８ 前記安定剤が、カルボキシメチルセルロースおよび
   脂肪族アルコールのポリオキシエチレンエーテルからな
   る群より選ばれたものである特許請求の範囲第７項記載
   の試験手段。