DE2843539A1 - Testmittel, testgeraet und verfahren zum stoerungsfreien bestimmen von oxydierenden substanzen - Google Patents

Testmittel, testgeraet und verfahren zum stoerungsfreien bestimmen von oxydierenden substanzen

Info

Publication number
DE2843539A1
DE2843539A1 DE19782843539 DE2843539A DE2843539A1 DE 2843539 A1 DE2843539 A1 DE 2843539A1 DE 19782843539 DE19782843539 DE 19782843539 DE 2843539 A DE2843539 A DE 2843539A DE 2843539 A1 DE2843539 A1 DE 2843539A1
Authority
DE
Germany
Prior art keywords
test
hydrazone
acid
determination
test device
Prior art date
Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
Granted
Application number
DE19782843539
Other languages
English (en)
Other versions
DE2843539B2 (de
DE2843539C3 (de
Inventor
Charles Tak Wai Lam
Current Assignee (The listed assignees may be inaccurate. Google has not performed a legal analysis and makes no representation or warranty as to the accuracy of the list.)
Bayer Corp
Original Assignee
Miles Laboratories Inc
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by Miles Laboratories Inc filed Critical Miles Laboratories Inc
Publication of DE2843539A1 publication Critical patent/DE2843539A1/de
Publication of DE2843539B2 publication Critical patent/DE2843539B2/de
Application granted granted Critical
Publication of DE2843539C3 publication Critical patent/DE2843539C3/de
Expired legal-status Critical Current

Links

Classifications

    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
    • C12Q1/00—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions
    • C12Q1/62—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions involving uric acid
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
    • C12Q1/00—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions
    • C12Q1/26—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions involving oxidoreductase
    • C12Q1/28—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions involving oxidoreductase involving peroxidase
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
    • C12Q1/00—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions
    • C12Q1/54—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions involving glucose or galactose
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
    • C12Q2326/00—Chromogens for determinations of oxidoreductase enzymes
    • C12Q2326/32—3-Methyl-2-benzothiazolinone hydrazone hydrochloride hydrate, i.e. MBTH
    • Y—GENERAL TAGGING OF NEW TECHNOLOGICAL DEVELOPMENTS; GENERAL TAGGING OF CROSS-SECTIONAL TECHNOLOGIES SPANNING OVER SEVERAL SECTIONS OF THE IPC; TECHNICAL SUBJECTS COVERED BY FORMER USPC CROSS-REFERENCE ART COLLECTIONS [XRACs] AND DIGESTS
    • Y10—TECHNICAL SUBJECTS COVERED BY FORMER USPC
    • Y10S—TECHNICAL SUBJECTS COVERED BY FORMER USPC CROSS-REFERENCE ART COLLECTIONS [XRACs] AND DIGESTS
    • Y10S435/00—Chemistry: molecular biology and microbiology
    • Y10S435/805—Test papers
    • Y—GENERAL TAGGING OF NEW TECHNOLOGICAL DEVELOPMENTS; GENERAL TAGGING OF CROSS-SECTIONAL TECHNOLOGIES SPANNING OVER SEVERAL SECTIONS OF THE IPC; TECHNICAL SUBJECTS COVERED BY FORMER USPC CROSS-REFERENCE ART COLLECTIONS [XRACs] AND DIGESTS
    • Y10—TECHNICAL SUBJECTS COVERED BY FORMER USPC
    • Y10T—TECHNICAL SUBJECTS COVERED BY FORMER US CLASSIFICATION
    • Y10T436/00—Chemistry: analytical and immunological testing
    • Y10T436/14—Heterocyclic carbon compound [i.e., O, S, N, Se, Te, as only ring hetero atom]
    • Y10T436/142222—Hetero-O [e.g., ascorbic acid, etc.]
    • Y10T436/143333—Saccharide [e.g., DNA, etc.]
    • Y10T436/144444—Glucose

Landscapes

  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Wood Science & Technology (AREA)
  • Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
  • Zoology (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • Immunology (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • Microbiology (AREA)
  • Molecular Biology (AREA)
  • Analytical Chemistry (AREA)
  • Biotechnology (AREA)
  • Physics & Mathematics (AREA)
  • Biophysics (AREA)
  • Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
  • General Engineering & Computer Science (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Genetics & Genomics (AREA)
  • Emergency Medicine (AREA)
  • Measuring Or Testing Involving Enzymes Or Micro-Organisms (AREA)
  • Investigating Or Analysing Biological Materials (AREA)
  • Investigating Or Analyzing Non-Biological Materials By The Use Of Chemical Means (AREA)

Description

HOFFMANN · EITLI3 & PARTNER
PATENTANWÄLTE O r> / O C 0 Q DR. ING. E. HOFFMANN (1930-1976) · DIPL-ING. W.EITlE . DR. RER. NAT. K. HOFFMANN · Dl PL.-ING. W. LEH N
DIPL.-ING. K. FOCHSLE · DR. RER. NAT. B. HANSEN ARABELLASTRASSE 4 (STERNHAUS) · D-8000 MÖNCHEN 81 · TELEFON (089) 911087 · TELEX 05-29619 (PATH E)
31 249 o/fi
Miles Laboratories, Inc. Elkhart, Indiana / USA
Testmittel, Testgerät und Verfahren zum störungsfreien Bestimmen von oxydierenden Substanzen
Die Erfindung betrifft allgemein das Gebiet von Diagnosetests und insbesondere solche Tests, die zur qualitativen und quantitaven Bestimmung von biologischen Komponenten wie Glucose und Harnstoff geeignet sind, wobei solche Komponenten in den Tests in eine.. oxydierenden Substanz, wie ein Peroxyd, umgewandelt werden.
Glucoseoxydase wandelt Glucose enzymatisch in Gluconsäure und Wasserstoffperoxyd um. Das so gebildete Wasserstoffperoxyd kann zu H2O mittels einer peroxydativ aktiven Substanz
— 6 "~
909833/0630
in Gegenwart eines Indikatorsystems reduziert werden, wobei das Indikatorsystem oxydiert wird und beispielsweise durch eine Farbänderung eine Wirkung anzeigt. Seit geraumer Zeit wird in Glucose-Testsystemen der chromogene Indikator ortho-Tolidin verwendet, aber man erhält Ergebnisse, bei denen durch störenden Substanzen, wie Ascorbinsäure, der oxydierte Indikator reduziert wird. Außerdem wird die Sicherheit von ortho-Tolidin bezweifelt.
In gleicher Weise wird Harnsäure durch Uricase enzymatisch in Allantoin und Wasserstoffperoxyd umgewandelt. Das gebildete Wasserstoffperoxyd kann dann durch eine peroxydativ aktive Substanz in Gegenwart eines Indikatorsystems, und zwar gewöhnlich ortho-Dianisidin, zu H-O reduziert werden.
Kürzlich haben Gochman und Schmitz die Verwendung von 3-Methyl-2-benzothiazolinonhydrazon-hydrochlorid mit N,N-Dimethylanilin zur Bildung eines Azofarbstoff-Indikators bei der Bestimmung von Harnsäure ^Clin.Chem. 17: 1154 (1971]i/ und Glucose /Clin.Chem. 18: 943 (1972)J berichtet. Obwohl behauptet wird, daß die Mischung mit N,N-Dimethylanilin beständiger ist als ortho-Tolidin treten doch aufgrund der Anfälligkeit gegenüber Ascorbinsäure-Störung erhebliche Fehler bei den berichteten Harnsäure- und Glucosekonzentrationen auf..
Der Mechanismus der oxydativen Kupplung von heterocyclischen Hydrazonen mit Phenolen, aromatischen Aminen und anderen Verbindungen,der bei der klassischen Azokupplungsreaktion stattfinden kann, wird kurz von Zollinger in "Azo und Diazo Chemistry, Interscience, New York, Seiten 215-217, (1961)" berichtet. Eine Zusammenfassung der Originalarbeiten, die
909833/0530
darauf gerichtet waren, Azofarbstoffe durch oxydative Kupplung zu erhalten, von Hünig und Mitarbeitern in Deutschland (1957-1968) wird in Baer "Cationic Dyes for Synthetic Fibers, Venkataraman (ed.), The Chemistry of Synthetic Dyes, Band 4, Acedemic Press, N.Y., Seiten 188-193 (1971)" beschrieben.
In der US-PS 3 979 262 wird beschrieben, daß ein Puffer aus Zitronen-oder Maleinsäure zu der Mischung von Gochman gegeben wird,und dabei wird gezeigt, ztvsammen mit N,N-Dimethy!anilin andere aromatische Amine verwendet werden können, solange sie nicht sowohl in ortho- als auch in para-Stellung substituiert sind. Der Puffer ist auch kritisch und hält einen vorbestimmten pH-Bereich von 3,2 bis 4,7 bei der Harnsäurebestimmung und von 4,7 bis 5,5 bei der Glucose- und Cholesterinbestimmung aufrecht.
Aus dem Stand der Technik ist, soweit die Verwendung von Hydrazonindikatoren zu Analyse von H3O3 gelehrt wird, bekannt, daß die Reaktion zwischen MBTH und Dimethylanilin beständig ist gegenüber der Einwirkung von reduzierenden Substanzen auf die Probe. Obwohl dies hinsichtlich der Indikatoren wie ortho-Tolidin stimmen kann, ergibt die Verwendung solcher Hydrazonindikatoren sehr schlechte Anzeigungen in Gegenwart von Ascorbat.
Deshalb waren die früheren Arbeiten zur Entwicklung von Indikatorsystemen, die im wesentlichen frei von einer Anfälligkeit gegenüber der Einwirkung von störenden Substanzen sind oder hinsichtlich der Sicherheit der Indikatoren bisher ergebnislos.
909633/0530
Es ist ein Ziel der Erfindung, eine verbesserten Test zur Bestimmung von oxydierenden Substanzen in Körperflüssigkeiten zu zeigen.
Es ist ein weiteres Ziel der Erfindung, einen verbesserten Test für solche oxydierenden Substanzen zu zeigen, die enzymatisch aus anderen klinisch signifikanten Körperflüssigkeitskomponenten umgewandelt werden.
Ein weiteres Ziel der Erfindung ist es, einen verbesserten Test für solche Körperflüssigkeitskomponenten zu zeigen,, wobei man die Materialien verwendet, deren Sicherheit anerkannt ist.
Ein weiteres Ziel der Erfindung ist es, einen verbesserten Test zum Nachweis von oxydierenden Substanzen in Körperflüssigkeiten zu zeigen, der gegenüber der Störung durch reduzierende Substanzen beständig ist.
Noch ein weiteres Ziel der Erfindung ist es, einen verbesserten Test zum Nachweis von oxydierenden Substanzen zu zeigen, bei dem die vorher erwähnten Vorteile durch ein neues Indikatorsystem erzielt werden, das aus einem Hydrazon und einem Hydroxynaphthalinsulfonat, ausgewählt aus der Gruppe 4,5-Dihydroxy-2f7-naphthalin-disulfonsäure ( Chromotropsäure) und 1-Hydroxy-2-naphthalinsulfonsäure ausgewählt ist.
Andere Ziele und ein besseres Verständnis für die Erfindung gehen aus der nachfolgenden Beschreibung hervor.
Fig. 1 ist eine graphische Darstellung und gibt die Werte an, die man im Beispiel 2 gefunden hat bei einem Glucoseoxydase-Peroxydasereagenz-Test unter Verwendung von
909833/0530' ~9~
-S-
ortho-Tolidin als Indikator, wobei man die Kurve durch Auftragen des Absorptionskoeffizienten der Probe K im Verlauf der Zeit erhielt;
Fig. 2 ist eine graphische Darstellung der im Beispiel 2 bei einem Glucoseoxydase-Peroxydasereagenz-Test gemessenen Werte unter Verwendung von MBTH/Diäthylanilin (DEA) als Indikator, wobei K gegen die Zeit aufgetragen wurde;
Fig. 3 ist eine graphische Darstellung der in Beispiel 2 berichteten Werte für einen Glucoseoxydase-Peroxydasereagenz-Test unter Verwendung von MBTH/Chromotropsäure (CTA) als erfindungsgemäßen Indikator, wobei man K gegenüber der Zeit aufgetragen hat;
Fig. 4 ist eine graphische Darstellung der im Beispiel 3 beschriebenen Werte für MBTH/CTA gemäß der Erfindung bei verschiedenen pH Niveaus, wobei die Werte durch Auftragen der optischen Dichte (OD) gegenüber der Zeit gewonnen wurden, und
Fig. 5 ist eine graphische Darstellung der im Beispiel 3 für verschiedene MBTH-Kuppler berichteten Werte in Tris-Malonat-Puffer (pH 7) mit der Ausnahme, daß die Dimethylanilinkurve bei einem Zitronensäurepuffer (pH 5) beobachtet wurde.
- 10 -
909833/0530
Die Erfindung betrifft Testmittel, wie eine Zusammensetzung und ein Gerät, ein Verfahren zur Herstellung eines solchen Testgerätes und ein Verfahren zur Bestimmung wenigstens einer oxydierenden Substanz, wie einem Peroxyd. Insbesondere betreffen die Testmittel ein Hydrazon und ein Hydroxynaphthalinsulfonat aus der Gruppe 4,5-Dihydroxy-2,7-naphthalin-disulfonsäure (Chromotropsäure) und 1-Hydroxy-2-naphthalinsulfonsäure. Weiterhin wird durch die Erfindung ein Testsystem gezeigt zur Bestimmung- eines Bestandteiles in einer Probe, wobei Mittel vorgesehen sind, die in Gegenwart des genannten Bestandteiles in der Probe ansprechen und wenigstens eine oxydierende Substanz bilden, und in dem Mittel auch eine Zusammensetzung zur Bestimmung wenigstens einer oxydierenden Substanz vorhanden ist, wobei die Verbesserung darin besteht, daß die Zusammensetzung aus einem Hydrazon und einer Hydroxynaphthalinsulfonsäure aus der Gruppe 4/5-Dihydroxy-2,7-naphthalin-disulfonsäure und 1-Hydroxy-2-naphthalinsulfonsäure besteht. Das Testsystem ist vorzugsweise von einer solchen Art, bei welcher Peroxyde durch enzymatische Umwandlung von in Körperflüssigkeiten vorhandenen Konstituenten bestimmt werden. Falls die Testmittel in Form einer Zusammensetzung vorliegen, so können sie gewünschtenfalls auf einen Träger aufgebracht werden, wie einer Tablette oder einer Matrix, um so ein Testmittel zu bilden. Das Indikatorsystem ist hochempfindlich gegenüber den nachzuweisenden Bestandteilen von Körperflüssigkeiten bei niedrigen Niveaus und auch sehr beständig gegenüber störenden reduzierenden Substanzen, wie Ascorbinsäure, die oftmals in Körperflüssigkeiten vorkommen.
- 11 -
909833/0530
In dem Testsystem können die Mittel, welche auf die Gegenwart eines Bestandteiles in der Probe ansprechen, unter Ausbildung wenigstens einer oxydierenden Substanz Glucoseoxydase für die Glucosebestimmung oder Uricase, für die Harnsäurebestimmung und eine peroxydativ aktive Substanz einschließen. Typische peroxydative aktive Substanzen sind Peroxydase oder Hämoglobin, welche dann angewendet werden, wenn Wasserstoffperoxyd die oxydierende Substanz ist.
Die Kupplung verläuft wahrscheinlich mittels eines Mechanisjnus, wie er für 3-Methyl-2-benzothiazolinonhydrazon (MBTH) und Chromotropsäure (CTA) im Diagramm A angegeben wird, wobei dies aber keine Theorie sein muß, auf welche die Erfindung aufbaut.
Diagramm A
N-NH,
MBTH
OH OH
CTA
Peroxidase H2°2
OH OH
909833/0630
- 12 -
Im Gegensatz zu den bekannten Zusammensetzungen ist die Zusammensetzung der vorliegenden Erfindung hochempfindlich gegenüber niedrigen Niveaus von Bestandteilen in Körperflüssigkeiten, die man nachweisen will, und auch hoch widerstandsfähig gegenüber den Einwirkungen von gleichzeitig reduzierenden Substanzen, insbesondere Ascorbinsäure in Urin. Da eine charakteristische Farbreaktion stattfindet in Abhängigkeit von der Konzentration der nachzuweisenden oxydierenden Substanz ist eine quantitative Bestimmung für Bestandteile solcher Körperflüssigkeiten wie Glucose und Harnsäure möglich.
Es ist jetzt auch möglich unter Anwendung der Testzusammensetzung des Testgerätes gemäß der Erfindung einen störungsfreien Nachweis von Glucose in Mengen von wenigstens 1,0 mmg (m)/Deziliter (dl) zu bringen, und zwar auch in Gegenwart von geringen, aber nachweisbaren Mengen von Ascorbat und es ist auch möglich, die Anwesenheit von erheblich erhöhten Glucose-Niveaus zu bestimmen, und zwar von solchen über 500 mg/dl in Gegenwart von wenigstens 1000 mg/dl Ascorbinsäure .
Obwohl bestimmte Ausdrücke in der nachfolgenden Beschreibung aus Gründen der Klarheit verwendet werden, sollen diese Ausdrücke nur auf die jeweilige Ausführungsform der Erfindung, wie sie zur beispielhaften Beschreibung angegeben wird, bezogen sein und in keiner Weise den Umfang der Erfindung beschränken.
Die Testmittel gemäß der Erfindung können in vielen pysikalischen Formen vorliegen und schließen viele spezifische Hydrazone ein für die Kupplung mit den vorgesehen Hydroxy-
- 13 -
909833/0530
naphthalinsulfonaten, unabhängig von der angenommenen Form. Wie beschrieben wird, können gewünschtenfalls weitere Reagenzien, wie Stabilisierungsmittel, zusätzlich verwendet werden. Die Testmittel können sowohl in flüssiger als auch in fester Form angewendet werden und dies gilt auch für das Testsystem, bei dem eine Zusammensetzung der Testmittel verwendet wird, wie sie in den Verfahren und in den Ausführung sformen nachfolgend beschrieben sind.
Das Hydroxynaphthalinsulfonat-Kupplungsmittel des Testmittels ist vorzugsweise Chromotropsäure. Ein anderes Hydroxynaphthalinsulfonat, das vorteilhaft angewendet wird, ist 1-Hydroxy-2-naphthalinsulfonsäure.
Die bei den Testmitteln geeigneten Hydrazone sind Kondensationsprodukte eines Hydrazins mit einem Aldehyd oder Keton und enthalten die Gruppe ~^~ C=NNH„. Viele Hydrazone sind zu einer oxydativen Kupplung mit Hydroxynaphthalinsulfonaten unter Ausbildung einer gefärbten Einheit fähig. Dazu gehören u.a. 3-Methyl-2-benzothiazolinon-hydrazon , 1-Methyl-2-chinolinon-hydrazon, N-Methylpyridon-2-hydrazon, N-Methylpyridon-2-hydrazon, N-Methyl-chinolinon-2-hydrazon, 1-Methyl-chinolinon-4-hydrazon, N-Methyl-2-benzothiazolinonhydrazon, N-Methyl-thiazolinon-2-hydrazon, N-Methyl-4-phenylthiazolinon-2-hydrazon, N-Methyl-oxazolinon-2-hydrazon, N-Methyl-benzooxazolinon-2-hydrazon und 1,3-Dimethyl-benzimidazolinon-2-hydrazon. Gemäß einer bevorzugten Ausführungsform der Zusammensetzung wird ein 3- (Cj-C^-Alkyl)-2-benzothiazolinon-hydrazon-chromogen, wie 3-Methyl-2-benzothiazolinon-hydrazon (MBTH) verwendet. Solche Hydrazone sind stark reduzierende Mittel.
- 14 -
909833/0530
Auch die Säureadditionssalze der Hydrazone können verwendet werden. Alle üblichen Säureadditionssalze, wie solche, die aus Chlorwasserstoffsäure, Bromwasserstoffsäure, Schwefelsäure, Salpetersäure und dgl., gebildet wurden, sind geeignet. Die Säureadditionssalze können entweder alleine oder sie können in Kombination mit dem entsprechenden Hydrazon verwendet werden.
Die Molverhältnisse von Hydrazon/Kuppler liegen im Bereich von 17:1 bis etwa 1 : 17, wobei ungefähr äquimolare Verhältnisse bevorzugt werden für eine optimale Kombination von Nachweisempfindlichkeit und Störungsbeständigkeit.
Die Zusammensetzung kann weiterhin Stabilisierungsmittel enthalten, wobei Carboxymethylcellulose und Polyoxyäthylenäther von Fettalkoholen besonders bevorzugt werden.
Testmittel gemäß der Erfindung und Testsysteme, welche Zusammensetzungen solcher Testmittel einschließen, werden vorzugsweise in einem im allgemeinen neutralen oder schwach alkalischen pH-Bereich verwendet, obwohl sie auch noch in einem etwas niedrigeren pH operativ bleiben. Durch Aufrechterhaltung eines im allgemeinen neutralen oder alkalischen pH wird eine verbesserte Reaktivität hinsichtlich der Geschwindigkeit und der Beständigkeit gegenüber Störungen erzielt, ganz im Gegensatz zu der Lehre des Standes der Technik.
Das Testsystem umfaßt zusammen mit der Zusammensetzung gemäß der Erfindung Mittel, die auf einen Bestandteil in der zu untersuchenden Probe ansprechen unter Ausbildung einer oxydierenden Substanz, die durch die Zusammensetzung
909833/0530
bestimmt wird. Solche Mittel sind vorzugsweise enzymatischer Natur. Soll beispielsweise Glucose bestimmt werden, so wird Glucoseoxydase und Peroxydase zur Bildung von H2O2 daraus verwendet. Wenn man Harnsäure bestimmen will, verwendet man Uricase und Peroxydase als auf den Bestandteil ansprechendes Mittel. Die Konzentration und die Art der auf den Bestandteil ansprechenden Mittel können solche, wie sie aus dem Stand der Technik bekannt sind, einschliessen.
Die Testmittel können als Lösung zur Bestimmung der oxydativen Substanz in einer Probe verwendet werden. Weiterhin kann das Testsystem zur Bestimmung von Bestandteilen, die in eine solche oxydative Substanz umgewandelt werden, und welches die. Testmittel in Form einer Zusammensetzung enthält, als Lösung verwendet werden. Das Testsystem wird vorzugsweise zum Nachweis von biologischen Bestandteilen wie in Körperflüssigkeiten verwendet, indem man es zu einer Probe, wie Urin, Serum, cerebrospinalen Flüssigkeiten, der überstehenden Flüssigkeit von Gewebekulturen und dgl. zugibt. Für Anordnungen, bei denen man das Testsystem in flüssiger Form verwendet, soll die Peroxydase von den anderen Reagenzien getrennt vorliegen, bis zur Anwendung. Der Nachweis erfolgt dann,indem man das getrennt vorliegende Reagenz, wie die Peroxydase, zugibt.
Bei der Anwendung in Lösung, unabhängig davon, ob das Testmittel selbst oder als Zusammensetzung davon in einem Testsystem vorliegt, wird das gemäß der Erfindung zu verwendende Hydroxynaphthalinsulfonat vorzugsweise in Konzentrationen
-5 -3
von etwa 10 Molar (M) bis etwa 10 M. angewendet. Das
909833/0530
Hydrazon wird vorzugsweise in Konzentration von etwa 10 M bis etwa 10 angewendet. Sind ein oder mehrere Stabilisierungsmittel vorhanden, so werden sie vorzugsweise in einer Gesamtkonzentration von etwa 0,5 mg/Deziliter (dl) bis etwa 5,0 mg/dl angewendet. Falls Peroxydase wenigstens eines der auf die Bestandteile ansprechenden Mittel in dem Reagenz des Testsystems vorliegt, so liegt die Konzentration der Peroxydase vorzugsweise im Bereich von 10,ug (Mikrogramm)/1 bis etwa 200,ug/l. Das zur Herstellung der Lösung verwendete Lösungsmittel kann Wasser sein, eine physiologische Lösung, ein organisches Lösungsmittel, wie Methanol, oder Mischungen davon.
Die Erfindung betrifft auch Testgeräte, welche die Testmittel oder das Testsystem gemäß der Erfindung enthalten und ein Verfahren zur Herstellung eines solchen Testgerätes, bei dem man einen Träger, wie eine Matrix oder eine Tablette, mit den Testmitteln, bzw. dem Testsystem zusammenbringt. Erfolgt dieses Zusammenbringen durch Imprägnieren mit einer Lösung der Zusammensetzung gemäß der Erfindung, einschließlich einem Testsystem, wird der so imprägnierte Träger anschließend getrocknet. Außer einer Imprägnierung kann das Testgerät gemäß der Erfindung auch nach anderen geeigneten Verfahren hergestellt werden, wie durch Drucken oder Sprühen der Zusammensetzung auf ein Substrat oder eine Matrix.
Vorzugsweise wird das Gerät durch mehrfaches Eintauchen hergestellt. Die Konzentrationen des verwendeten Reagenz in den Flüssigkeiten liegt im Bereich von etwa 1O~ M bis zu einer gesättigten Lösung. Im allgemeinen ist bei der Verwendung eines Hydrazone und eines Kupplers eine Konzentration von jeweils etwa 0,02 M geeignet. Die
- 17 -
909833/0530
Peroxydase-Konzentration in der verwendeten Eintauchlösung liegt im Bereich von O#O15 mg/ml bis etwa 2 mg/ml.
Feste Zubereitungen werden vorzugsweise mit einer als Träger dienenden Matrix in Streifenform hergestellt. Der Ausdruck "Trägermatrix11 bezieht sich auf feuchtigkeitsaufnehmende und nicht feuchtigkeitsaufnehmende Matrizes, die unlöslich sind und ihre strukturelle Einheit beibehalten, wenn sie Wasser oder physiologischen Flüssigkeiten ausgesetzt werden. Geeignete feuchtigkeitsaufnehmende Substanzen sind beispiel Papier, Cellulose, Holz, synthetischer Harz, Vliese, Glasfasern, Gewebe und Vliese und dergl. Nicht feuchtigkeitsaufnehmende Matrizes sind organo-plastische Materialien wie Polypropylen und dergl. Wird eine feuchtigskeitsaufnehmende Matrix verwendet, so wird die Matrix vorteilhaft durch geeignete Mittel, wie durch einen zweiseitig klebenden Klebestreifen, an einem unlöslichen Trägerteil befestigt , wie ein organo-plastischer Streifen,z.B. Polystyrol, weil dies die Anwendung erleichtert.
Alternativ kann die erfindungsgemäße Zusammensetzung in einem Träger verwendet werden in Form einer verpreßten oder verformten Tablette, welche die üblichen Trägermaterialien enthält.
Das Testgerät wird vorzugsweise angewendet, indem man es kurz in eine Testprobe eintaucht, oder indem man auf andere Weise eine Testprobe auf die Trägermatrix bringt, und dadurch wird eine nachweisbare Farbänderung erzeugt, falls oxydative Komponenten vorliegen. Das Testgerät kann in gleicher Weise angewendet werden bei Plasmaproben, Serumproben oder anderen zu prüfenden Körperflüssigkeiten.
- 18 -
9 09833/053 0
Die Beziehung zwischen K (dem Absorptionskoeffizienten der Probe), die in einigen Beispielen angegeben wird, und der Konzentration der absorbierten Spezies (wie Harnsäure oder Glucose) wird durch die Kubelka-Monk-Gleichung ausgedrückt, die mit einer ausführlichen Diskussion der Reflexionsspektrophotometrie in Kortümi, G., "Reflectance Spectroscopy", Springer-Verlag Inc., New York, 1969, beschrieben wird. K ist dabei definiert als das Zweifache der Absorptions/Einheitsweglänge (2A/b) bei Durchlassigkeitsmessungen. Es wird hierbei angenommen, daß K proportional der Konzentration der gebildeten gefärbten Indikatormoleküle ist. Bei der durch die Kubelka-Monk-Gleichung definierten Beziehung nimmt der Prozentsatz der Reflexion (%R) ab in dem Maße, wie die Konzentration der nachgewiesenen oxydativen Substanz ansteigt, und umgekehrt. Die vorgenommenen Ablesungen stimmen daher im umgekehrten Maße gemäß der Gleichung mit der Konzentration der nachzuweisenden absorbierten Spezies überein. Die Ablesungen wurden bei den angegebenen Wellenlängen vorgenommen.
Die Ablesungen der Reflexion kann man mit handelsüblichen Spektrophotometern messen, wie einem Beckman DK-2-Spektrophotometer, Beckman Instruments, Inc., Fullerton, California 92634, oder Spektrocolorimeter SCF-1, Isreal Electro-Optical Industry Ltd.
Meerettich-Peroxydase und Glucoseoxydase wurden erhalten von Miles Research Products, Miles Laboratories, Elkhart, Indiana 46515. Ein Copolymer aus Methylvinylather und Maleinsäureanhydrid (Gantrez AN-139) und Polyvinylpyrrolidin (PVP) wurden von GAF Corp., Chemical Products, New York, N.Y. 10010, erhalten. Das 3-Methyl-2-benzothiazolinonhydrazon-hydrochlorid-monohydrat (MBTH), andere Hydrazone, Chromotropsäure, 4,5-Dihydroxy-2,7-naphthalin-disulfonsäuredinatriumsalz-dihydrat, 1-Hydroxy-2-naphthalinsulfonsäure, 1-Hydroxy-3-naphthalin-sulfonsäure, 1-Hydroxy-5-naphthalinsulfonsäure, 3-Dimethylaminobenzolsäure und Violettsäure
909833/059 0
- 19 -
2843b39
(!-Naphthol-3,6-disulfonsäure) wurden von der Aldrich Chemical Co., Inc., Milwaukee, Wisconsin 53233, erhalten. Es wurden Lösungsmittel und Reagenzien mit Standardreagenzreinheit verwendet.
Die Beispiele sollen die Erfindung nur beschreiben und keineswegs beschränken. Für den Fachmann ist es ersichtlich, daß er Änderungen vornehmen kann.
Beispiel
Ein Testgerät, welches die Zusammensetzung gemäß der Erfindung erhielt, wurde hergestellt und hinsichtlich der Empfindlichkeit zum Nachweis von Glucose mit im Handel erhältlichen üblichen Geräten, welche Indikatoren des Standes der Technik verwendeten, verglichen. Eine erste Imprägnierlösung wurde hergestellt in 42,5 Millilitern (ml) destilliertem H~O, zu dem die folgenden Substanzen unter Rühren gegeben wurden:
Zitronensäure 714 Milligramm (mg)
Natriumeitrat 3136 mg
Na4 EDTA 2400 mg
(Natriumsalz von
Äthylendiamintetraessigsäure)
Glucoseoxydase 15 ml
(5000 I.U. per ml)
Peroxydase 324 mg
(100 I.ü. per mg)
Polyvinylpyrrolidin 360 mg/3,6 ml H0O (PVP) *
Gantrez An-139 720 mg/1 4,4 ml
-20 -
909833/0530
Eine internationale Einheit (I.U.) der Enzymalctivität ist wirksam, um die Umwandlung von 1 Mikromol £ümöl) : r des Substrats pro Min. unter bestimmten pH- und Tempera— turbedingungen zu bewirken. Blätter von Whatman 3MM-Pilter-· papier (Whatman, Inc., Clifton, N.J. 07014) wurden bis zur Sättigung mit der vorerwähnten Lösung: getränkt und bei 87°C getrocknet. - : ; "- -
Eine zweite Imprägnierlösurig wurde hergestellt in 50 mleiner 4:1 Methanol/H20 -Lösung, zu der unter-Rühren : gegeben wurden:
MBTH 0,20 Gramm (g)
Chromotropsäure 0,05 g
Natriumlaurylsulfat 0,20 g
Das so behandelte Papier,'welches den getrockneten Rück-- : stand der ersten Imprägnierlösung enthielt, wurde dann bis zur Sättigung mit der zweiten Imprägnierlösung imprägniert und bei 600C getrocknet. Das so zubereitete Papier wurde in 2,5 mm χ 2,5 mm Stücke geschnitten und bildete so ein Gerät gemäß der Erfindung, das in diesem Beispiel als MBTH/CTA bezeichent wird. Das Gerät wurde dann auf ein zweiseitig mit Klebstoff beaufschlagtes Klebeband gegeben und so an einen organo-plastischen Träger geheftet.
Die erfindungsgemäß hergestellten Geräte wurden mit CLINISTIX-Reagenzstreifen (ortho-Tolidin), DIASTIX-Reagenzsteifen (Kaliumiodid) und S-GLUKOTEST (ortho-Tolidin) verglichen. CLINISTIX und DIASTIX sind eingetragenen Handelsnamen der Arnes Company, Division of Miles Laboratories. S-GLUKOTEST ist von Biodynamics/BMC, Indianapolis, Indiana, erhältlich. Alle Geräte wurden geprüft, indem man sie kurz
909833/053
in Urinlösungen einer bekannten Glucosekonzentration eintauchte. Es wurde jeweils die Farbentwicklung festgestellt, um zu unterscheiden zwischen 0, 1, 2, 5, 10, 20, 30, 50 und 100 Milligramm/Deziliter (mg/dl). Die Angabe "0" zeigt an, daß kein erkennbarer Nachweis erfolgte, während "50" anzeigt, daß ein Nachweis bei wenigstens 50 mg/dl in der Probe möglich war. Zwischenzahlen geben relative, sichtbar unterschiedliche Farbintensitäten, die beobachtet wurden,an. Die Ergebnisse werden in Tabelle 1 gezeigt.
TABELLE 1
Glucose
(mg/%)		 CLINISTIX® DIASTIX® S-GLUKOTEST® MBTH/CTA
0 0 0 0 0
1 0 0 0 5
2 0 0 0 10
5 0 0 0 20
10 0 0 0 30
20 0 0 0 38
30 0 1 0 42
50 5 8 8 50
100 10 10 10 50
909833/063 0'
Diese Ergebnisse zeigen, daß ein Gerät, das mit der Testzusammensetzung gemäß der Erfindung versehen wurde, empfindlich ist gegenüber Glucosemengen, die erheblich niedriger sind als solche, wie sie mit den Nachweisgeräten des Standes der Technik erkennbar waren.
Beispiel 2
Bei den in diesem Beispiel beschriebenen Versuchen wurde die relative Beständigkeit gegen Ascorbat von verschiedenen MBTH-Kuppler-Systemen miteinander und gegenüber o-Tolidin verglichen.
Zunächst wurde eine Imprägnierlösung hergestellt, die folgende Bestandteile enthielt:
Destilliertes Wasser 40 ml
Äthanol 4O ml
Gantrez AN 139
5 % Gewicht/Volumen
(w/v) in destilliertem Wasser 52 ml
Trismalonat-Puffer
Z2,8 m Tris (hy.droxymethyl)aminomethan;
1,4 m Malonsäure,
1,4 m Natriummalonat/ 32 ml
Polyvinylpyrolidon
10 % w/v in destilliertem Wasser 28 ml
200 mg Peroxydase in
4,3 ml Glucoseoxydase
(10OO v/ml) +19,3 ml
destilliertes Wasser
Blätter aus Eaton-Dikeman 204-Filterpapier (E & D) wurden bis zur Sättigung mit der vorher zubereiteten Lösung imprägniert und dann bei 3O0C getrocknet.
903833/0630
Ein erster„Teil ^dieser getrockneten Papiere wurde mit 0,02.lM,orrtBolidin iii'GHCi3: gesättigt und dann bei 50°C . ■-:■-.-■: getrocknet!Jwabei man das o-Tolidin enthaltende Testger-, rät erhielt*;Der"restliche bzw. der zweite Teil des vorher zubereiteten"getrockneten Papiers wurde dann bis zur Sättigung mit einer Lösung aus 50 ml Methanol, worin 234 mg MBTH-Hydrochlorid-monohydrat gelöst waren, imprägniert ..und bei 6O0C .getrocknet.
Bei ei.n;er „dritteri. Imprägnierung„ wurden, die rPapiere aus . dem zweiten Teil jeweils imprägniert bis zur Sättigung. r mit den angegebenen Lösungen eines der folgenden potentiellen Kuppler:,,... ....
Chromotropsäure 400 mg in 40 ml Methanol
+ 10 ml Wasser
Violettsäure' " 350 mg in 40 ml Methanol
--.-:.-- '■:-.:- + 10 ml Wasser
Dimethylaminobenzoe-
säure 165 mg in 50 ml Methanol
Diäthylanilin. -. 186 mg in 50 ml Methanol
Die so imprägnierten Papiere wurden dann bei 6O0C getrocknet und bildeten das Testgerät.
Diese Geräte wurden mit 100.mg/dl Urin-Glucoselösungen, welche entweder 0 oder 50 mg/dl Ascorbät enthielten, ge-^ prüft und alle Farbänderungen wurden mit Hilfe eines aufzeichnenden Reflexionsspektrophotometer abgelesen. Die Reflexionswerte bei den spezifischen Wellenlängen wurden nach der zuvor erwähnten Kubelka-Monk-Gleichung umgerechnet und die äquivalenten Absorptionswerte (K) wurden als Funktion gegen die Zeit aufgetragen.
- 24 -
90983 3/0 530
Bei der Bewertung der relativen Ascorbatbeständigkeit
wurden die Daten für die ersten 30 Sekunden verwendet,
weil während dieses Zeitraumes ein im allgemeinen lineares Ansprechen von K mit der Zeit erfolgte. Dies wird graphisch durch die Kurvenwerte der Probe in den Figuren 1 bis 3 gezeigt. Ein Verhältnis der Neigungen wurde angewendet, wobei die Neigung von K gegenüber der Zeit für die Daten in Gegenwart von 50 mg/dl Ascorbat aufgenommen wurden, geteilt wurden durch die Neigung von K gegenüber der Zeit für die Daten, die in Abwesenheit von Ascorbat aufgenommen wurden. Ein Wert von 1 bedeutet, daß keine Störung durch Ascorbat vorliegt. Ein Wert von 0 würde bedeuten, daß eine vollständige Störung durch Ascorbat vorliegt. Die Ergebnisse werden in Tabelle 2 gezeigt:
TABELLE 2
Relative Beeinflussung durch Ascorbat
Indikator Λ beobachtet
(nM)		 Neigung bei 50 mg/dl
Ascorbat
o-Tolidin
MBTH-Chromotrop-
säure (CTA)
MBTH-Violettsäure
MBTH-Dimethyl-
aminobenzolsäure
MBTH-Diäthyl-
anilin (DEA)		 620
560
540
600
600		 Neigung bei 0 Ascorbat
0,005
0,42
0,08
0,08
0,07
- 25 -
909833/0530'
Die bei den verschiedenen Zeiten gefundenen Ergebnisse und deren jeweiligen K-Werte werden in Fig. 1 für ortho-Tolidin gezeigt, in Fig. 2 für MBTH/DEA und in Fig. 3 für MBTH/CTA, wobei die einzelnen Testgeräte- oder vorrichtungen jeweils gemäß der Erfindung hergestellt wurden.
Diese deutlichen Werte zeigen, daß MBTH/Chromotropsäure eine Ascorbatbeständigkeit haben, die wesentlich größer ist als bei ortho-Tolidin und tatsächlich bemerkenswert (6mal) Ascorbat-beständiger ist als frühere Formulierungen, die sich auf MBTH/Diäthylanilin aufbauten.
Beispiel 3
Es wurden Lösungen aus den nachfolgend angegebenen Zusammensetzungen gemäß vorliegender Erfindung hergestellt und mit solchen des Standes der Technik verglichen, um die Einwirkung von Veränderungen des pH-Wertes und durch Puffer mit und ohne Ascorbat au vergleichen.
Es wurde eine erste Testlösung bei einem pH von 5,0 in 0,311 M Citratpuffer hergestellt. Eine weitere Testlösung wurde bei pH 7,0 eingestellt mit 0,093 M Tris/Tris(hydroxymethyl)aminomethan/, kombiniert mit 0,093 M Malonat. In jedem Puffersystem wurden Testlösungen zubereitet mit Konzentrationen von 100/UM MBTH, 100,uM Kuppler, 333,uM H3O3 und 56,8,uM (1 mg/dl) Ascorbinsäure.
Diese Lösungen wurden in 3 ml Standardgläsern oder in Quarzküvetten bewertet. In allen Fällen ließ man die Reaktion ablaufen, indem man Peroxydase bis zu einer Konzentration
90983 3/053 Ö'
von 125 Nanograiffitt (ng /nil} einspritzte. Die Veränderungen in der optischen Dichte (AöO) wurden mittels eines üblichen Aufzeichnungs-Absorptionsspectrophotometers aufgezeichnet, wobei man die Ergebnisse, die in den Tabellen 3 und 4 gezeigt werden,erhielt.
TABELLE
Tris-Malonat-Puffer (pH 7}
MBTH-Kuppler Wellenlänge Verhältnis der Reaktion
(AOD/Min.)
Chromotrop-
säure
Ν,Ν-Dimethyl-
anilin
1-Hydroxy-2-
naphthalin-
sulfonsäure
1-Hydroxy-3-
naphthalin-
sulfonsäure
1-Hydroxy-5-
naphthalin-
sulfonsäure		 572 nm
495 nm
490 nm
495 nm		 kein Ascorbat Ascorbat
0,600 0,223
keine Reaktion keine Reaktion
0,373 0,159
0,545 0,0977
0,493 0,0815
- 27 -
90983 3/053 0'
TABELLE
Zitronensäure-Puffer (pH 5)
MBTH-Kuppler Wellenlänge Verhältnis der Reaktion
(AOD/Min.)		 Ascorbin
572 nra kein Ascorbin 0,0065
Chromotrop-
säure		 570 nm 0,162 0,0000
N,N-Dimethyl-
anilin		 495 nm 0,189 O,OO37
1-Hydroxy-2-
naphthalin-
sulfonsäure		 49O nm 0,0891 0,0000
1-Hydroxy-
3-naphthalin-
-sulfansäure		 495 nm 0,0992 0,0OO
1-Hydroxy-5-
naphthalin-
sulfonsäure		 0,0822
Die bei dem Tris-Malonat-Puffersystem bei pH 7 für die jeweils angegebenen erfindungsgemäßen Kuppler beobachteten Ergebnisse waren gegenüber denen mit Dimethylanilin erheblich überlegen. Sie waren reaktiver sowohl in Gegenwart als auch in Abwesenheit von Ascorbat. Die Aktivität bei etwa pH 7,0, ausgedrückt als Farbentwicklung (AOD) pro Minute war etwa 3- bis 4mal so groß wie bei Zitronensäure bei pH 5,0 ohne Ascorbat und eine noch größere Differenz sieht man mit Ascorbat. Die zu unterschiedlichen Zeiten erzielten Ergebnisse und die jeweiligen Absorptionswerte (optische Dichte) werden graphisch in Fig. 4 für das MBTH/ Chromotropsäuresystem in Tris-Malonat (pH 7) und für das Zitronensäure (pH 5) -System gezeigt. Ein Vergleich der
309833/0530
mit den verschiedenen Kupplern erzielten Ergebnisse wird graphisch in Fig. 5 gezeigt für das Tris-Malonat-System (pH 7), mit einer bemerkenswerten Ausnahme. Weil der Kuppler des Standes der Technik, Dimethylanilin, bei diesen Parametern nicht reagiert, wurde dessen Kurve von den mit Zitronensäure (pH 5) gemessenen Daten entnommen.
Im Gegensatz zu den bekannten Kupplersystemen sind die erfindungsgemäßen optimal wirksam in einem bevorzugten physiologischen pH-Bereich, was insbesondere bei Enzymbewertungen bedeutsam ist.
Beispiel 4
Testgeräte, die in der nachfolgend beschriebenen Weise hergestellt worden sind und Zusammensetzungen gemäß der Erfindung enthielten, wurden bei diesem Beispiel Zeiten erhöhter Temperatur ausgesetzt, um deren Stabilität zu prüfen.
Ein Puffer wurde zur Verwendung in der ersten Imprägnierlösung hergestellt durch Zugabe von 19,8 g Zitronensäure, 87,2 g Natriumeitrat, 66,8 g Äthylendiamin-tetraessigsäure zu 935 ml H2O, wobei man rührte.
Vier aliquote Mengen der ersten Imprägnierlösung wurden dann hergestellt, indem man jeweils 50 ml des zuvor hergestellten Puffers, 13 ml eines Copolymer aus 10 % Methylvinylather mit Maleinsäureanhydrid, 10 ml 5 i-iges Polyvinylpyrrolidon (PVP) und 0,15 g Peroxydase kombinierte und dann jeweils Glucoseoxydase und Wasser, wie in Tabelle 5 gezeigt wird, zugab.
- 29 -
909*33/0530
TABELLE
Formulierung Glucoseoxydase H2O
1 5 ml 35 ml
2 10 ml 30 ml
3 20 ml 20 ml
4 40 ml 0 ml
4 Blätter von E & D-Papier wurden bis zur Sättigung imprägniert und zwar jeweils mit einer der vorerwähnten Formulierungen und dann bei 90°C getrocknet.
Es wurde eine zweite Imprägnierlösung hergestellt, indem man 0,32 g Chromotropsäure, 0,8 g Natriumlaurylsulfat und 2,4 g MBTH in einem Lösungsmittel aus 160 ml Methanol und 40 ml H3O löste. Die so zubereiteten Blätter wurden dann bis zur Sättigung mit dieser zweiten Lösung imprägniert, bei 50°C getrocknet und auf eine Größe von 2,5 mm χ 2,5 mm geschnitten, wodurch man die Geräte gemäß der vorliegenden Erfindung erhielt. Die so hergestellten Geräte wurden durch ein zweiseitig klebendes Klebeband an organoplastische Unterlagen befestigt, um sie besser handhaben zu können.
Die Hälfte dieser Geräte wurde einer trockenen Wärme von 60 C während 3 Tagen in einen üblichen Laboratoriumsofen ausgesetzt, während die andere Hälfte bei Raumtemperatur (RT) zur Kontrolle aufbewahrt wurde. Die Geräte, und zwar sowohl die der Wärme ausgesetzten als auch die für die Kontrolle wurden dann geprüft, indem man sie kurz in Urinproben eintauchte, welche die Tabelle 6 angegebenen
- 30 -
909833/0530
Konzentrationen an Glucose enthielten. Die erzielten Ergebnisse wurden aufgezeichnet durch einen Vergleich der beobachteten Farben bei den Kontrollgeräten und den der Wärme ausgesetzten Geräten. Farbabschnitte mit steigender Intensität zeigen die unterschiedlichen Glucose-Konzentrationen an und diesen wurde willkürlich die Zahlenwerten (0 bis 70) zugeordnet in der folgenden Weise:
mg % 0 SO 100 250 500 1000 2000 >2000
Werte 0 10 20 30 40 50 60 70
Die Ergebnisse für die der Wärme ausgesetzten Geräte wurden mit denen der Kontrollprobe verglichen.
TABELLE
Formulierung Nr. 1 RT 60°C RT 60°C RT i 60°C L RT ! 60°C
Glucose 0 0 0 0 0 0 0 0
Mg% Wert 10 8 25 20 35 32 45 42
0= 0 20 18 45 42 48 45 55 55
50= 10 30 28 55 52 60 58 60 60
100= 20 40 37 60 58 65 62 70 70
250= 30 50 45 65 62 70 70 >70 >70
500= 40 60 55 70 70 70 70 >70
1000= 50
2000= 60
Beim Vergleich der wärmeausgesetzten Streifen zeigt es sich, daß die Formulierung 4 am wenigsten beeinflußt worden war. Selbst bei der Formulierung 1, die am meisten durch
909833/0530
- 31 -
Wärme beeinflußt, worden war, liegt kein wesentlicher Unterschied in der Intensität der gebildeten Farbe bei dem der Wärme ausgesetzten und dem nicht der Wärme ausgesetzten Gerät vor. Das heißt, daß man bei keiner dieser Formulierungen einen echten Verlust der Empfindlichkeit feststellen konnte.
Die Erfindung wurde hier im einzelnen erläutert aber es ist für den Fachmann ersichtlich, daß hier nur eine beispielhafte Erläuterung gegeben werden konnte, so daß man zahlreiche Änderungen im einzelnen vornehmen kann, ohne vom Umfang der Erfindung abzuweichen.
9098 3 3/0 530
Leerseite

Claims (24)

HOFFMANN · U.TUi & ΡΛι PAT E N TAN WALT E DR. ING. E. HOFFMANN (1930-197ί) . DIPL.-I NG. W.EITLE · DR. RER. NAT. K. HOFFMANN · DIPL.-ING. W. LEHN DIPL.-ING. K. FoCHSLE · DR. RER. NAT. B. HANSEN ARABELLASTRASSE 4 (STERN HAUS) · D-8000 MD N CH EN 81 ■ TELEFON (089) 911087 ■ TELEX 05-29619 (PATHE) 2843b39 31 249 o/fi Miles Laboratories, Inc. Elkhart, Indiana / USA Testmittel, Testgerät und Verfahren zum störungsfreien Bestimmen von oxydierenden Substanzen Patentansprüche
1.j Testmittel zur Bestimmung einer oxydierenden Substanz,
adurch gekennzeichnet, daß es aus einem Hydrazon und einem Hydroxynaphthalinsulfonat aus der-Gruppe 4,5-Dihydroxy-2,7-naphthalin-disulfonsäure und/ oder 1-Hydroxy-2-naphthalin-sulfonsäure besteht.
2. Testmittel gemäß Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet , daß das Hydroxynaphthalinsulfonat 4,5-Dihydroxy-2,7-naphthalin-disulfonsäure ist.
3. Testmittel gemäß Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet , daß das Hydrazon 3-Methyl-2-benzothiazolinonhydrazon ist.
909 83 3/05 30 ' - 2 -
4. Testmittel gemäß Anspruch 2, dadurch gekennzeichnet , daß das Hydrazon 3-Methyl-2-benzothiazolinonhydrazon ist.
5. Testgerät zur Bestimmung einer oxydierenden Substanz, dadurch gekennzeichnet, daß es auf einer Trägermatrix das Testmittel gemäß Anspruch 1 enthält.
6. Testgerät zur Bestimmung einer oxydierenden Substanz, dadurch gekennzeichnet, daß es auf einer Trägermatrix das Testmittel gemäß Anspruch 4 enthält.
7. Testgerät gemäß Anspruch 5, dadurch g e kennzeichnet , daß die Trägermatrix feuchtigkeitsauf nehmend ist.
8. Testgerät zur Bestimmung einer oxydierenden Substanz, dadurch gekennzeichnet, daß das Testmittel gemäß Anspruch 1 in einer Tablette enthalten ist.
9. Verfahren zur Zubereitung eines Gerätes zur Bestimmung einer oxydierenden Substanz, dadurch gekennzeichnet, daß man eine Trägermatrix mit dem Testmittel gemäß Anspruch 1 kombiniert.
10. Verfahren gemäß Anspruch 9, dadurch gekennzeichnet , daß man die Kombination durchführt, indem man eine Lösung des Testmittels einimprägniert und anschließend trocknet.
11. Verfahren zur Bestimmung einer oxydierenden Substanz in einer flüssigen Probe, dadurch gekenn zeichnet , daß man die flüssige Probe mit dem Testmittel gemäß Anspruch 1 in Berührung bringt und die sich ergebende Farbe beobachtet.
909833/0530'
■ - J -
12. Verfahren zur Bestimmung einer oxydierenden Substanz in einer flüssigen Probe, dadurch gekennzeichnet, daß man die Probe mit dem Testgerät gemäß Anspruch 5 in Berührung bringt und die sich bildende Farbe beobachtet.
13. Testsystem zur Bestimmung eines Bestandteiles in einer- Probe mit einem Mittel, welches auf den Bestandteil in der Probe unter Ausbildung wenigstens einer oxydierenden Substanz anspricht, wobei das System eine Zusammensetzung enthält zur Bestimmung wenigstens einer oxydierenden Substanz, dadurch gekennzeichnet, daß die Zusammensetzung aus einem Hydrazon und einem Hydroxynaphthalinsulfonat aus der Gruppe 4,5-Dihydroxy-2,7-naphthalin-disulfonsäure und/oder 1-Hydroxy-2-naphthalin-sulfonsäure besteht.
14. .Testsystem gemäß Anspruch 13, dadurch gekennzeichnet , daß das Hydroxynaphthalinsulfonat 4,5-Dihydroxy-2,7-naphthalin-disulf onsäure ist.
15. Testsystem gemäß Anspruch 13, dadurch g e kennz eichnet, daß das Hydrazon 3-Methyl-2-benzothiazolinon-hydrazon ist.
16. Testsystem gemäß Anspruch 14, dadurch gekennzeichnet , daß das Hydrazon 3-Methyl—2— benzothiazolinon-hydrazon ist.
17. Testgerät, dadurch gekennzeichn e t , daß es aus einer Trägermatrix, auf welcher das Testsystem gemäß Anspruch 13 aufgebracht ist, besteht.
909833/0530
18. Testgerät, dadurch gekennzeichnet, daß es auf einer Trägermatrix das Trägersystem gemäß Anspruch 16 aufgetragen enthält.
19. Gerät gemäß Anspruch 17, dadurch gekennzeichnet , daß die Trägermatrix feuchtigkeitsaufnehmend ist.
20. Testgerät, dadurch gekennzeichnet, daß es aus einer Tablette besteht, auf welcher das Testsystem gemäß Anspruch 13 aufgebracht ist.
21. Verfahren zur Herstellung eines Testgerätes, dadurch gekennzeichnet, daß man eine Trägermatrix mit dem Testsystem gemäß Anspruch 13 ausrüstet.
22. Verfahren gemäß Anspruch 21, dadurch gekennzeichnet , daß das Ausrüsten durchgeführt wird durch Imprägnieren einer Lösung des Testsystems und anschließendem Trocknen.
23. Verfahren zur Bestimmung eines Bestandteiles in einer Flüssigprobe, dadurch gekennzeichnet, daß man die Probe mit dem Testsystem gemäß Anspruch 13 in Berührung bringt und die sich ergebende Farbänderung beobachtet.
24. Verfahren zur Bestimmung eines Bestandteiles in einer Flüssigprobe, dadurch gekennzeichnet, daß man die Probe mit dem Testgerät gemäß Anspruch 17 in Berührung bringt und die sich ergebende Farbe beobachtet .
909833/0530
DE2843539A 1978-02-13 1978-10-05 Testmittel zur Bestimmung einer oxydierenden Substanz Expired DE2843539C3 (de)

Applications Claiming Priority (1)

Application Number Priority Date Filing Date Title
US05/877,499 US4119405A (en) 1978-02-13 1978-02-13 Test means and method for interference resistant determination of oxidizing substances

Publications (3)

Publication Number Publication Date
DE2843539A1 true DE2843539A1 (de) 1979-08-16
DE2843539B2 DE2843539B2 (de) 1980-09-18
DE2843539C3 DE2843539C3 (de) 1981-05-07

Family

ID=25370105

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
DE2843539A Expired DE2843539C3 (de) 1978-02-13 1978-10-05 Testmittel zur Bestimmung einer oxydierenden Substanz

Country Status (8)

Country Link
US (1) US4119405A (de)
JP (2) JPS5819989B2 (de)
AU (1) AU512401B2 (de)
CA (1) CA1100021A (de)
DE (1) DE2843539C3 (de)
FR (1) FR2421938A1 (de)
GB (1) GB2014306B (de)
IT (1) IT1109214B (de)

Cited By (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
EP0071730A1 (de) * 1981-06-23 1983-02-16 Roche Diagnostics GmbH Stabilisiertes Reagenz zum Nachweis von Wasserstoffperoxid

Families Citing this family (22)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
DE2856487A1 (de) * 1977-12-29 1979-07-12 Wako Pure Chem Ind Ltd Verfahren zur bestimmung von peroxidischen substanzen und hierfuer brauchbare verbindungen
US4230798A (en) * 1978-02-13 1980-10-28 Miles Laboratories, Inc. Unitized uric acid test composition and device
JPS5520471A (en) * 1978-08-01 1980-02-13 Kyowa Hakko Kogyo Co Ltd Hydrogen peroxide quantifying method
US4247297A (en) * 1979-02-23 1981-01-27 Miles Laboratories, Inc. Test means and method for interference resistant determination of oxidizing substances
US4307188A (en) * 1979-09-06 1981-12-22 Miles Laboratories, Inc. Precursor indicator compositions
CA1141637A (en) * 1979-10-10 1983-02-22 Erma C. Cameron Cofactor indicator compositions
US4273556A (en) * 1979-12-19 1981-06-16 Sherwood Medical Industries Inc. Determination of urea
JPS57174099A (en) * 1981-04-17 1982-10-26 Fuji Photo Film Co Ltd Color indicator composition for detecting hydrogen peroxide and quantitative analytical film having reagent layer containing the same
US4394444A (en) * 1982-06-21 1983-07-19 Miles Laboratories, Inc. Cofactor indicator compositions
US4460684A (en) * 1982-08-02 1984-07-17 Miles Laboratories, Inc. Ascorbate-resistant broad range glucose test composition, test device and method
US4615972A (en) * 1983-11-04 1986-10-07 Immuno Concepts, Inc. Stabilization of indicators for detecting enzyme activity
US4737457A (en) * 1986-02-26 1988-04-12 Eastman Kodak Company Analytical composition, element and method for the determination of hydrogen peroxide
DE3618752A1 (de) * 1986-06-04 1987-12-10 Bayer Ag 4,6-dinitrobenzthiazolonhydrazone(2)
US4885240A (en) * 1986-09-04 1989-12-05 Eastman Kodak Company Use of organic buffers to reduce dehydroascorbic acid interference in analytical methods
DK0555045T3 (da) * 1992-02-03 1998-03-16 Lifescan Inc Forbedret oxidativt koblingsfarvestof til spektrofotometrisk kvantitativ analyse af analytter
US5518891A (en) * 1993-03-25 1996-05-21 Actimed Laboratories, Inc. Dye forming composition and detection of hydrogen peroxide therewith
US5563031A (en) * 1994-09-08 1996-10-08 Lifescan, Inc. Highly stable oxidative coupling dye for spectrophotometric determination of analytes
AU2003235973A1 (en) * 2002-06-07 2003-12-22 Arkray, Inc. Method of assay by oxidation-reduction reaction with formazan
WO2003107011A1 (ja) * 2002-06-14 2003-12-24 アークレイ株式会社 スルホン酸化合物およびニトロ化合物を用いた測定方法
JP3973160B2 (ja) * 2002-07-17 2007-09-12 アークレイ株式会社 スルホン酸化合物を用いたタンパク質の分解方法
JP5778701B2 (ja) * 2010-03-01 2015-09-16 システム バイオロジー アーゲー エクオールの検出のための試験細片
AR099935A1 (es) * 2014-04-15 2016-08-31 Dow Global Technologies Llc Reactivo de prueba estabilizado

Citations (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
DE2506115A1 (de) * 1974-02-15 1975-08-21 Hoffmann La Roche Reagenz fuer kolorimetrische bestimmungen

Family Cites Families (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
NL137003C (de) * 1967-10-14
US3784358A (en) * 1971-09-24 1974-01-08 Cities Service Oil Co Support for chromogenic glycol test reagent

Patent Citations (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
DE2506115A1 (de) * 1974-02-15 1975-08-21 Hoffmann La Roche Reagenz fuer kolorimetrische bestimmungen

Cited By (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
EP0071730A1 (de) * 1981-06-23 1983-02-16 Roche Diagnostics GmbH Stabilisiertes Reagenz zum Nachweis von Wasserstoffperoxid

Also Published As

Publication number Publication date
AU4035678A (en) 1980-04-17
FR2421938B1 (de) 1983-02-25
JPS5819989B2 (ja) 1983-04-21
JPS54123096A (en) 1979-09-25
CA1100021A (en) 1981-04-28
US4119405A (en) 1978-10-10
DE2843539B2 (de) 1980-09-18
IT1109214B (it) 1985-12-16
DE2843539C3 (de) 1981-05-07
IT7851408A0 (it) 1978-10-06
JPS57168162A (en) 1982-10-16
JPS6054624B2 (ja) 1985-11-30
GB2014306B (en) 1982-09-08
GB2014306A (en) 1979-08-22
FR2421938A1 (fr) 1979-11-02
AU512401B2 (en) 1980-10-09

Similar Documents

Publication Publication Date Title
DE3000380C2 (de) Testmittel und Testvorrichtung für den Nachweis einer oxidierenden Substanz
DE2843539A1 (de) Testmittel, testgeraet und verfahren zum stoerungsfreien bestimmen von oxydierenden substanzen
DE3012368C2 (de) Verfahren und diagnostische Mittel zum Nachweis von Redox-Reaktionen
DE2833612C3 (de) Mittel und Verfahren zur Bestimmung von Wasserstoffperoxyd
DE60210904T2 (de) Nitrit-stabilisierte Zusammensetzungen von Tetrazolium-Reagenz und Methoden derer Nutzung
DE2940165C2 (de) Glucoseindikator und Testvorrichtung mit dem Glucoseindikator
DE2951221A1 (de) Testmittel zur bestimmung von glucose in einer koerperfluessigkeit, verfahren zu dessen herstellung und dessen verwendung bei der bestimmung von glucose
DE2925524A1 (de) Einrichtung zum nachweis von bilirubin, verfahren zu deren herstellung und deren verwendung zum nachweisen von bilirubin
DE1598133C3 (de)
CH640638A5 (de) Teststreifen zur glukosebestimmung.
EP0068356B1 (de) Mittel und Verfahren zum Nachweis von Wasserstoffperoxid oder Peroxidasen
DE3872998T2 (de) Test auf okkultes blut im stuhl.
DE3586336T2 (de) Triarylmethan-leukofarbstoffe enthaltende zusammensetzungen und elemente und verfahren zur verwendung derselben.
DE3408062A1 (de) Verfahren zur bestimmung von ss-hydroxibuttersaeure und eine zusammensetzung zur bestimmung von ss-hydroxibuttersaeure
EP0103823B1 (de) Reagenz und Verfahren zur Bestimmung von gamma-Glutamyltransferase
DE3785380T2 (de) Analytische Zusammensetzung, Element und Verfahren zur Bestimmung von Wasserstoffperoxid.
DE3443415C2 (de)
DE2500689C2 (de)
DE2857298C2 (de) Mittel zur Bestimmung von peroxidativ wirksamen Substanzen
CH646792A5 (de) Testvorrichtung fuer die bestimmung von harnsaeure.
DE3510992A1 (de) Analysengeraet mit einer eine oxidase enthaltenden reagenzschicht
DE2922748C2 (de) Testmittel zur Bestimmung des Harnstoffgehaltes in Flüssigkeiten
DE3783285T2 (de) Indikatorzusammensetzung und verfahren zu ihrer herstellung.
DE2433426A1 (de) Teststreifen zum nachweis von verbindungen in koerperfluessigkeiten, sekreten oder exkreten
EP0160847A1 (de) Analystisches Element zur Bestimmung von Glucose, glucosehaltigen Oligosacchariden und Harnsäure

Legal Events

Date Code Title Description
OAP Request for examination filed
OD Request for examination
C3 Grant after two publication steps (3rd publication)
8380 Miscellaneous part iii

Free format text: DER VERTRETER LAUTET RICHTIG: PETERS, G., RECHTSANW., 5090 LEVERKUSEN

8339 Ceased/non-payment of the annual fee