DE2843539C3

DE2843539C3 - Testmittel zur Bestimmung einer oxydierenden Substanz

Info

Publication number: DE2843539C3
Application number: DE2843539A
Authority: DE
Inventors: Charles Tak Wai Elkhart Ind. Lam
Original assignee: Miles Laboratories Inc
Current assignee: Bayer Corp
Priority date: 1978-02-13
Filing date: 1978-10-05
Publication date: 1981-05-07
Also published as: DE2843539A1; AU4035678A; FR2421938A1; JPS54123096A; IT7851408A0; GB2014306A; DE2843539B2; IT1109214B; US4119405A; FR2421938B1; JPS5819989B2; JPS6054624B2; CA1100021A; GB2014306B; AU512401B2; JPS57168162A

Description

Die Erfindung betrifft ein Testmittel zur Bestimmung einer oxidierenden Substanz, z. B. zur qualitativen und quantitativen Bestimmung von biologischen Komponenten wie Glucose und Harnstoff, wobei solche Komponenten in den Tests in eine oxidierende Substanz, wie ein Peroxid, umgewandelt werden.

Glucoseoxydase wandelt Glucose enzymatisch in Gluconsäure und Wasserstoffperoxid um. Das so gebildete Wasserstoffperoxid kann zu H₂O mittels einer peroxidativ aktiven Substanz in Gegenwart eines Indikatorsystems reduziert werden, wobei das Indikatorsystem oxidiert wird und beispielsweise durch eine Farbänderung eine Wirkung anzeigt. Seit geraumer Zeit wird in Glucose-Testsystemen der chromogene Indikator ortho-Tolidin verwendet, aber man erhält Ergebnisse, bei denen durch störende Substanzen, wie Ascorbinsäure, der oxydierte Indikator reduziert wird. Außerdem wird die Sicherheit von ortho-Tolidin bezweifelt.

In gleicher Weise wird Harnsäure durch Uricase enzymatisch in Allantoin und Wasserstoffperoxyd umgewandelt. Das gebildete Wasserstoffperoxyd kann dann durch eine peroxydativ aktive Substanz in Gegenwart eines Indikatorsystems, und zwar gewöhnlich ortho-Dianisidin, zu H₂O reduziert werden.

Die Verwendung von 3-Methyl-2-benzothiazolinonhydrazonhydrochlorid mit N,N-Dimethylanilin zur Bildung eines Azofarbstoff-Indikators bei der Bestimmung von Harnsäure ist aus »Gin. Chem. 17:1154 (1971)« und Glucose »Clin. Chem. 18: 943 (1972)« bekannt. Obwohl behauptet wird, daß die Mischung mit N,N-Dimethylanilin 'beständiger ist als ortho-Tolidin, treten doch aufgrund der Anfälligkeit gegenüber Störung durch Ascorbinsäure erhebliche Fehler bei den berichteten Harnsäure- und Glucosekonzentrationen auf.

Aus der DE-OS 25 06 115 ist es bekannt daß man zu der vorerwähnten Mischung aus 3-Methyl-2-benzothiazolinonhydrazon mit einem aromatischen Amin, z. B. einem Naphthylamin-derivat noch einen Puffer aus einer im Verhältnis zum Amin mindestens äquimolaren Menge an Zitronensäure und/oder Maleinsäure zugeben kann.

Aus dem Stand der Technik ist, soweit die Verwendung von Hydrazonindikatoren zu Analyse von H₂O₂ gelehrt wird, bekannt, daß die Reaktion zwischen MBTH und dem aromatischen Amin beständig ist gegenüber der Einwirkung von reduzierenden Substanzen auf die Probe. Obwohl dies hinsichtlich der Indikatoren wie ortho-Tolidin stimmen kann, ergibt die Verwendung solcher Hydrazonindikatoren sehr schlechte Anzeigungen in Gegenwart von Ascorbat

Deshalb waren die früheren Arbeiten zur Entwicklung von Indikatorsystemen, die im wesentlichen frei von einer Anfälligkeit gegenüber der Einwirkung von störenden Substanzen sind oder hinsichtlich der Sicherheit der Indikatoren bisher ergebnislos.

Aufgabe der Erfindung ist es, ein Testmittel zur Bestimmung von oxydierenden Substanzen zur Verfügung zu stellen, das gegenüber der Störung durch reduzierende Substanzen beständig ist.

Diese Aufgabe wird bei Testmitteln gemäß dem Oberbegriff der Ansprüche 1 und 2 durch die im kennzeichnenden Teil der Ansprüche 1 und 2 genannten Merkmale gelöst Vorteilhafte Ausgestaltungen der erfiridungsgemäßen Testmittel sind in den Ansprüchen 3—6 beschrieben. Die Erfindung wird im Folgenden an Hand der Zeichnung näher erläutert.

F i g. 1 ist eine graphische Darstellung und gibt die Werte an, die man im Beispiel 2 gefunden hat bei einem Glucoseoxydase-Peroxydasereagenz-Test unter Verwendung von ortho-Tolidin als Indikator, wobei man die Kurve durch Auftragen des Absorptionskoeffizienten der Probe K im Verlauf der Zeit erhielt;
F i g. 2 ist eine graphische Darstellung der im Beispiel 2 bei einem Glucoseoxydase-Peroxydasereagenz-Test gemessenen Werte unter Verwendung von MBTH/ Diäthylanilin (DEA) als Indikator, wobei K gegen die Zeit aufgetragen wurde;

F i g. 3 ist eine graphische Darstellung der in Beispiel 2 berichteten Werte für einen Glucoseoxydase-Peroxydasereagenz-Test unter Verwendung von MBTH/Chromotropsäure (CTA) als erfindungsgemäßen Indikator, wobei man K gegenüber der Zeit aufgetragen hat;

F i g. 4 ist eine graphische Darstellung der im Beispiel

so 3 beschriebenen Werte für MBTH/CTA gemäß der Erfindung bei verschiedenen pH-Niveaus, wobei die Werte durch Auftragen der optischen Dichte (OD) gegenüber der Zeit gewonnen wurden, und

F i g. 5 ist eine graphische Darstellung der im Beispiel 3 für verschiedene MBTH-Kuppler berichteten Werte in Tris-Malonat-Puffer (pH 7) mit der Ausnahme, daß die Dimethylanilinkurve bei einem Zitronensäurepuffer (pH 5) beobachtet wurde.

In dem Testsystem können die Mittel, welche auf die Gegenwart eines Bestandteiles in der Probe unter Ausbildung wenigstens einer oxydierenden Substanz ansprechen, Glucoseoxydase für die Glucosebestimmung oder Uricase für die Harnsäurebestimmung und eine peroxydativ aktive Substanz einschließen. Typische peroxydative aktive Substanzen sind Peroxydase oder Hämoglobin, welche dann angewendet werden, wenn Wasserstoffperoxyd die oxydierende Substanz ist.
Die Kupplung verläuft wahrscheinlich mittels eines

Mechanismus, wie er für S-Methyl^-benzothiazoIinonhydrazon (MBTH) und 4,5-Dihydroxy-2,7-naphthalin-disulfonsäure (Chromotropsäure, CTA) im Diagramm A angegeben wird.

Diagramm A

HO OH

CTA

HO OH

Das erfindungsgemäße Testmittel ist hochempfindlich gegenüber niedrigen Niveaus von in Körperflüssigkeiten nachzuweisenden Bestandteilen, und auch hoch widerstandsfähig gegenüber den Einwirkungen von gleichzeitig reduzierenden Substanzen, insbesondere Ascorbinsäure in Urin. Da eine charakteristische Farbreaktion stattfindet in Abhängigkeit von der Konzentration der nachzuweisenden oxydierenden Substanz, ist eine quantitative Bestimmung für Bestandteile solcher Körperflüssigkeiten wie Glucose und Harnsäure möglich.

Mit den Testmitteln gemäß der Erfindung ist ein störungsfreier Nachweis von Glucose in Mengen von wenigstens 1,0 mg/dl möglich, und zwar auch in Gegenwart von geringen, aber nachweisbaren Mengen von Ascorbat und es ist auch möglich, die Anwesenheit von erheblich erhöhten Glucose-Niveaus zu bestimmen, und zwar von solchen über 500 mg/dl in Gegenwart von wenigstens 1000 mg/dl Ascorbinsäure.

Die bei den Testmitteln geeigneten Hydrazone sind Kondensationsprodukte eines Hydrazins mit einem Aldehyd oder Keton und enthalten die Gruppe >C=NNH2. Viele Hydrazone sind zu einer oxydativen Kupplung mit Hydroxynaphthalinsulfonaten unter Ausbildung einer gefärbten Einheit fähig. Dazu gehören u. a.

3-Methyl-2-benzothiazolinon-hydrazon,

1 -Methyl-2-chinolinon-hydrazon,

N-Methylpyridon-;2-hydrazon,

N-Methylpyridon-2-hydrazon,

N-Methyl-chinolinon-2-hydrazon,

1 -Methyl-chinolonon-4-hydrazon,

N-Methyl-2-benzothiazolinonhydrazon,

N-Methyl-thiazolinon-2-hydrazon,

N-Methyl-4-phenylthiazolinon-2-hydrazon,

N-Methyl-oxazolinon-2-hydrazon,

N-Methyl-benzooxazoünon-2-hydrazonund

l,3-Dimethyl-benz-imidazolinon-2-hydrazon.

Bevorzugt wird ein 3-(Ci-C4-Alkyl)-2-benzothiazolinon-hydrazon-chromogen, wie 3-Methyl-2-benzothiazolinon-hydrazon (MBTH) verwendet. Solche Hydrazone sind stark reduzierende Mittel.

Auch die Säureadditionssalze der Hydrazone können verwendet werden. Alle üblichen Säureadditionssalze, wie solche, die als Chlorwasserstoffsäure, Bromwasserstoffsäure, Schwefelsäure, Salpetersäure und dgL, gebildet wurden, sind geeignet Die Säureadditionssalze könren entweder alleine oder sie können in Kombination mit dem entsprechenden Hydrazon verwendet werden.
Die Molverhältnisse von Hydrazon/Kuppler liegen

ίο im Bereich von 17 :1 bis etwa 1:17, wobei ungefähr äquimolare Verhältnisse bevorzugt werden für eine optimale Kombination von Nachweisempfindlichkeit und Störungsbeständigkeit

Die Zusammensetzung kann weiterhin Stabilisierungsmittel enthalten, wobei Carboxymethylcellulose und Polyoxyäthylenäther von Fettalkoholen besonders bevorzugt werden.

Testmittel der Erfindung werden vorzugsweise in einem im allgemeinen neutralen oder schwach alkalisehen pH-Bereich verwendet obwohl sie auch noch in einem etwas niedrigeren pH-Bereich wirksam bleiben. Durch Aufrechterhaltung eines im allgemeinen neutralen oder alkalischen pH wird eine verbesserte Reaktivität hinsichtlich der Geschwindigkeit und der Beständigkeit gegenüber Störungen erzielt, ganz im Gegensatz zu der Lehre des Standes der Technik.

Bei der Anwendung der Testmittel in Lösung wird das Hydroxynaphthalinsulfonat vorzugsweise in Konzentrationen von etwa 10~⁵ Molar (M) bis etwa 10~³ Μ eingesetzt Das Hydrazon liegt vorzugsweise in Konzentrationen von etwa 10~⁵ M bis etwa 10~³ M vor. Sind ein oder mehrere Stabilisierungsmittel vorhanden, so werden sie vorzugsweise in einer Gesamtkonzentration von etwa 0,5 mg/dl bis etwa 5,0 mg/dl angewendet Falls Peroxydase wenigstens eines der auf die Bestandteile ansprechenden Mittel in dem Reagenz des Testsystems vorliegt, so liegt die Konzentration der Peroxydase vorzugsweise im Bereich von 10 μg (Mikrogramm)/1 bis etwa 200 μg/L Das zur Herstellung der Lösung verwendete Lösungsmittel kann Wasser sein, eine physiologische Lösung, ein organisches Lösungsmittel, wie Methanol, oder Mischungen davon.

Die Testmittel können auch eine Trägermatrix umfassen. Derartige Testmittel können durch Imprägnierung oder nach anderen geeigneten Verfahren hergestellt werden, wie durch Drucken oder Sprühen der Zusammensetzung auf die Matrix. Vorzugsweise wird das Testmittel durch mehrfaches Eintauchen hergestellt. Die Konzentrationen des verwendeten Reagenz in den Flüssigkeiten liegt im Bereich von etwa 10"³ M bis zu einer gesättigten Lösung. Im allgemeinen ist bei der Verwendung eines Hydrazons und eines Kupplers eine Konzentration von jeweils etwa 0,02 M geeignet. Die Peroxydase-Konzentration in der verwendeten Eintauchlösung liegt im Bereich von 0,015 mg/ml bis etwa 2 mg/ml.

Der Ausdruck »Trägermatrix« bezieht sich auf feuchtigkeitsaufnehmende und nicht feuchtigkeitsaufnehmende Matrizes, die unlöslich sind, und ihre strukturelle Einheit beibehalten, wenn sie Wasser oder physiologischen Flüssigkeiten ausgesetzt werden. Geeignete feuchtigkeitsaufnehmende Substanzen sind z. B. Papier, Cellulose, Holz, synthetischer Harz, Vliese, Glasfasern, Gewebe und Vliese und dergl. Nicht feuchtigkeitsaufnehmende Matrizes &.ind organo-plastische Materialien wie Polypropylen und dergL Wird eine feuchtigkeitsaufnehmende Matrix verwendet, so wird die Matrix vorteilhaft durch geeignete Mittel, wie durch

einen zweiseitig klebenden Klebestreifen, an einem unlöslichen Trägerteil befestigt, wie ein organo-plastischer Streifen, z. B. Polystyrol, weil dies die Anwendung erleichtert

Alternativ können die Testmittel auch in Form einer verpreßten ooer verformten Tablette, welche die üblichen Trägermaterialien enthält, vorliegen.

Das Testmittel wird vorzugsweise angewendet, indem man es kurz in eine Testprobe eintaucht, oder indem man auf andere Weise eine Testprobe auf die Trägermatrix bringt, und dadurch wird eine nachweisbare Farbänderung erzeugt, falls oxydative Komponenten vorliegen. Das Testmittel kann in gleicher Weise angewendet werden bei Plasmaproben, Serumproben oder anderen zu prüfenden Körperflüssigkeiten.

Die Beziehung zwischen K (dem Absorptionskoeffizienten der Probe), die in einigen der folgenden Beispiele angegeben wird, und der Konzentration der absorbierten Spezies (wie Harnsäure oder Glucose) wird durch die Kubelka-Monk-Gleichung ausgedrückt, die mit einer ausführlichen Diskussion der Reflexionsspektrophotometrie in Kortümi, G., »Reflectance Spectroscopy«, Springer-Verlag Ine, New York, 1969, beschrieben wird. K ist dabei definiert als das Zweifache der Absorptions/Einheitsweglänge (2 AJb) bei Durchlässigkeitsmessungen. Es wird hierbei angenommen, daß K proportional der Konzentration der gebildeten gefärbten Indikatormoleküle ist Bei der durch die Kubelka-Monk-Gleichung definierten Beziehung nimmt der Prozentsatz der Reflexion (⁰ZoR) ab in dem Maße, wie die Konzentration der nachgewiesenen oxydativen Substanz ansteigt, und umgekehrt Die vorgenommenen Ablesungen stimmen daher im umgekehrten Maße gemäß der Gleichung mit der Konzentration der nachzuweisenden absorbierten Spezies überein. Die Ablesungen wurden bei den angegebenen Wellenlängen vorgenommen.

Beispiel 1

Ein Testmittel mit einer Zusammensetzung gemäß der Erfindung wurde hergestellt und hinsichtlich der Empfindlichkeit zum Nachweis von Glucose mit im Handel erhältlichen üblichen Mitteln, welche Indikatoren des Standes der Technik verwendeten, verglichen. Eine erste Imprägnierlösung wurde hergestellt in 42,5 Millilitern (ml) destilliertem H2O, zu dem die folgenden Substanzen unter Rühren gegeben wurden:

Zitronensäure Natnumcitrat Na₄ EDTA (Natriumsalz von Äthylendiamintetraessigsäure) Tabelle 1

714 Milligramm (mg) 3136 mg

2400 mg

Glucoseoxydase (5000 I. U. per ml) Peroxydase (100 I. U. per mg) Polyvinylpyrrolidon (PVP) Copolymer aus Methylvinyläther und Maleinsäureanhydrid

15 ml

324 mg

360 mg/3,6 ml H₂O

720 mg/14,4 ml

Eine internationale Einheit (I. U.) der Enzymaktivität ist wirksam, um die Umwandlung von 1 Mikromol

ι ο (μπιοί) des Substrats pro Min. unter bestimmten pH- und Temperaturbedingungen zu bewirken. Blätter von Whatman 3 MM-Filterpapier wurden bis zur Sättigung mit der vorerwähnten Lösung getränkt und bei 87° C getrocknet

is Eine zweite Irnprägnierlösung wurde hergestellt in 50 ml einer 4 :1-Methanol/^O-Lösung, zu der unter Rühren gegeben wurden:

MBTH	0,20 Gramm (g)
20 4,5-Dihydroxy-2,7-naphthalin-
disulfonsäure (Chromotropsäure)	0,05 g
Natriumlaurylsulfat	0,20 g

Das so behandelte Papier, welches den getrockneten

Rückstand der ersten Imprägnierlösung enthielt wurde dann bis zur Sättigung mit der zweiten Imprägnierlösung imprägniert und bei 6O⁰C getrocknet Das so zubereitete Papier wurde in 2,5 mm χ 2,5 mm Stücke geschnitten und bildete so ein Gerät gemäß der Erfindung, das in diesem Beispiel als MBTH/CTA bezeichnet wird. Das Gerät wurde dann auf ein zweiseitig mit Klebstoff beaufschlagtes Klebeband gegeben und so an einen organo-plastischen Träger geheftet

Die erfindungsgemäß hergestellten Geräte wurden mit CLISTINIX-Reagenzstreifen (ortho-Tolidin), DIA-STIX-Reagenzstreifen (Kaliumiodid) und S-GLUKO-TEST (ortho-Tolidin) verglichen. CLISTINIX und DIASTIX sind von der Ames Company, Division of Miles Laboratories und S-GLUKOTEST ist von Biodynamics/BMC, Indianapolis, Indiana, erhältlich. Alle Geräte wurden geprüft, indem man sie kurz in Urinlösungen einer bekannten Glucosekonzentration eintauchte. Es wurde jeweils die Farbentwicklung festgestellt um zu unterscheiden zwischen 0,1, 2,5,10, 20, 30, 50 und 100 Milligramm/Deziliter (mg/dl). Die Angabe »0« zeigt an, daß kein erkennbarer Nachweis erfolgte, während »50« anzeigt, daß ein Nachweis bei wenigstens 50 mg/dl in der Probe möglich war.

Zwischenzahlen geben relative, sichtbar unterschiedliche Farbintensitäten, die beobachtet wurden, an. Die Ergebnisse werden in Tabelle 1 gezeigt

Glucose (mg/%) CLINISTlX⁸

DIASTIX®

S-GLUKOTEST^e MBTH/CTA

0 1 2 5

10 20 30 50 100

0
0
0
0
0
0
0
5
10

0	0	0
0	0	5
0	0	10
0	0	20
0	0	30
0	0	38
1	0	42
8	8	50
10	10	50

Diese Ergebnisse zeigen, daß das Testmitte! gemäß der Erfindung empfindlich ist gegenüber Glucosemengen, die erheblich niedriger sind als solche, wie sie mit den Nachweisgeräten des Standes der Technik erkennbar waren.

Beispiel 2

Bei den in diesem Beispiel beschriebenen Versuchen wurde die relative Beständigkeit gegen Ascorbat von verschiedenen MBTH-Kuppler-Systemen miteinander und gegenüber o-Tolidin verglichen.

Zunächst wurde eine Imprägnierlösung hergestellt, die folgende Bestandteile enthielt:

Destilliertes Wasser 40 ml

Äthanol 40 ml

Copolymer aus M ethylvinylather

und Maleinsäureanhydrid

5% Gewicht/Volumen

(w/v) in destilliertem Wasser 52 ml

Trismalonat-Puffer

[2,8 m Tris (hydroxymethyl)aminomethan; 1,4 m Malonsäure,

1,4 m Natriummalonat] 32 ml

Polyvinylpyrolidon

10% w/v in destilliertem Wasser 28 ml

200 mg Peroxydase in 4,3 ml Glucoseoxydase (1000 v/ml) + 19,3 ml destilliertes Wasser

Blätter aus Eaton-Dikeman 2004-Filterpapier (E & D) wurden bis zur Sättigung mit der vorher zubereiteten Lösung imprägniert und dann bei 30⁰C getrocknet.

Ein erster Teil dieser getrockneten Papiere wurde mit 0,02 M o-Tolidin in CHCl₃ gesättigt und dann bei 50⁰C getrocknet, wobei man das o-Tolidin enthaltende Testgerät erhielt. Der restliche bzw. der zweite Teil des vorher zubereiteten getrockneten Papiers wurde dann bis zur Sättigung mit einer Lösung aus 50 ml Methanol, worin 234 mg MBTH-Hydrochlorid-monohydrat gelöst waren, imprägniert und bei 60⁰C getrocknet.

Bei einer dritten Imprägnierung wurden die Papiere aus dem zweiten Teil jeweils imprägniert bis zur Sättigung mit den angegebenen Lösungen eines der folgenden potentiellen Kuppler:

Chromotropsäure
Violettsäure

Dimethylaminobenzoe-

säure

Diäthylanilin

400 mg in 40 ml Methanol
+ 10 ml Wasser
350 mg in 40 ml Methanol
+ 10 ml Wasser

165 mg in 50 ml Methanol
186 mg in 50 ml Methanol

Die so imprägnierten Papiere wurden dann bei 60⁰C

ι ^r> getrocknet und bildeten das Testmittel.

Diese Testmittel wurden mit 100 mg/dl Urin-Glucoselösungen, welche entweder 0 oder 50 mg/dl Ascorbat enthielten, geprüft und alle Farbänderungen wurden mit Hilfe eines aufzeichnenden Reflexionsspektrophotome-

JD ters abgelesen. Die Reflexionswerte bei den spezifischen Wellenlängen wurden nach der zuvor erwähnten Kubelka-Monk-Gleichung umgerechnet und die äquivalenten Absorptionswerte (K) wurden als Funktion gegen die Zeit aufgetragen.

Bei der Bewertung der relativen Ascorbatbeständigkeit wurden die Daten für die ersten 30 Sekunden verwendet, weil während dieses Zeitraumes ein im allgemeinen lineares Ansprechen von K mit der Zeit erfolgte. Dies wird graphisch durch die Kurvenwerte

so der Probe in den Figuren 1 bis 3 gezeigt. Ein Verhältnis der Neigungen wurde angewendet, wobei die Neigung von K gegenüber der Zeit für die Daten, die in Gegenwart von 50 mg/dl Ascorbat aufgenommen wurden, geteilt wurden durch die Neigung von K gegenüber der Zeit für die Daten, die in Abwesenheit von Ascorbat aufgenommen wurden. Ein Wert von 1 bedeutet, daß keine Störung durch Ascorbat vorliegt. Ein Wert von 0 würde bedeuten, daß eine vollständige Störung durch Ascorbat vorliegt. Die Ergebnisse werden in Tabelle 2 gezeigt:

Tabelle 2

Relative Beeinflussung durch Ascorbat

Indikator	λ beobachtet	Neigung bei 50 mg/dl
	(nM)	Ascorbat
		Neigung bei 0 Ascorbat
o-Tolidin	620	0,005
MBTH-Chromotropsäure (CTA)	560	0.42
MBTH-Violettsäure	540	0,08
MBTH-Dimethylaminobenzolsäure	600	0,08
MBTH-Diäthylanilin (DEA)	600	0,07

Die bei den verschiedenen Zeiten gefundenen Ergebnisse und deren jeweiligen K-Werte werden in Fig. 1 für ortho-Tolidin gezeigt, in Fig.2 für MBTH/DEA und in F i g. 3 für MBTH/CTA.

Diese deutlichen Werte zeigen, daß MBTH/Chromotropsäure eine Ascorbatbeständigkeit hat, die wesentlich größer ist als bei ortho-Tolidin und tatsächlich bemerkenswert (6 mal) Ascorbat-beständiger ist als frühere Formulierungen, die sich auf MBTH/Diäthylanilin aufbauten.

Beispiel 3

Es wurden Lösungen aus den nachfolgend angegebenen Zusammensetzungen hergestellt und miteinander verglichen, um die Einwirkung von Veränderungen des pH-Wertes und durch Puffer mit und ohne Ascorbat zu vergleichen.

Es wurde eine erste Testlösung bei einem pH von 5,0 in 0311M Citratpuffer hergestellt Eine weitere Testlösung wurde bei pH 7,0 eingestellt mit 0,093 M

ίο

Tris[Tris(hydroxyrnethyl)arninornethan], kombiniert mit 0,093 M Malonat. In jedem Puffersystem wurden Testlösungen zubereitet mit Konzentrationen von ΙΟΟμΜ MBTH, 100 μΜ Kuppler, 333 μΜ H₂O₂ und 56,8 μΜ(1 mg/dl) Ascorbinsäure.

Diese Lösungen wurden in 3 ml Standardgläsern oder in Quarzküvetten bewertet. In allen Fällen ließ man die

Tabelle 3
Tris-Malonat-Puffer (pH 7)

Reaktion ablaufen, indem man Peroxydase bis zu einer Konzentration von 125 Nanogramm (ng/ml) einspritzte. Die Veränderungen in der optischen Dichte (ΔΟΌ) wurden mittels eines üblichen Aufzeichnungs-Absorptionsspectrophotometers aufgezeichnet, wobei man die Ergebnisse, die in den Tabellen 3 und 4 gezeigt werden, erhielt.

MBTH-Kuppler

Wellenlänge Verhältnis der Reaktion (Δ OD/Min.)
kein Ascorbat Ascorbat

Chromotropsäure	572 nm	0,600	0,223	0,159	Reaktion	Ascorbin
N,N-Dimethylanilin	-	keine Reaktion keine	0,0977		0,0065
l-Hydroxy-2-naphthalinsulfonsäure	495 nm	0,373	0,0815		0,0000
l-Hydroxy-3-naphthalinsulfonsäure	490 nm	0,545			0,0037
l-Hydroxy-5-naphthalinsulfonsäure	495 nm	0,493			0,0000
Tabelle 4					0,000
Zitronensäure-Puffer (pH 5)			Verhältnis der Reaktion
MBTH-Kuppler		Wellenlänge	(A OD/Min.)
			kein Ascorbin
			0,162
Chromotropsäure		572 nm	0,189
N,N-Dimethylanilin		570 nm	0,0891
l-Hydroxy-2-naphthalinsulfonsäure		495 nm	0,0992
l-Hydroxy-3-naphthalinsulfonsäure		490 nm	0,0822
l-Hydroxy-5-naphthalinsulfonsäure		495 nm

Die bei dem Tris-Malonat-Puffersystem bei pH 7 für die jeweils angegebenen erfindungsgemäßen Kuppler beobachteten Ergebnisse waren gegenüber denen mit Dimethylanilin erheblich überlegen. Sie waren reaktiver sowohl in Gegenwart als auch in Abwesenheit von Ascorbat. Die Aktivität bei etwa pH 7,0, ausgedrückt als Farbentwicklung (4OD) pro Minute war etwa 3- bis 4mal so groß wie bei Zitronensäure bei pH 5,0 ohne Ascorbat und eine noch größere Differenz sieht man mit Ascorbat Die zu unterschiedlichen Zeiten erzielten Ergebnisse und die jeweiligen Absorptionswerte (optische Dichte) werden graphisch in Fig.4 für das MBTH/Chromotropsäuresystem in Tris-Malonat (pH 7) und für das Zitronensäure (pH 5)-System gezeigt. Ein Vergleich der mit den verschiedenen Kupplern erzielten Ergebnisse wird graphisch in Fig.5 gezeigt für das Tris-Malonat-System (pH 7), mit einer bemerkenswerten Ausnahme. Weil Dimethylanilin bei diesen Parametern nicht reagiert, wurde dessen Kurve von den mit Zitronensäure (pH 5) gemessenen Daten entnommen.

Die Vergleichsversuche zeigen, daß die erfindungsgemäßen Kupplersysteme optimal wirksam sind in einem bevorzugten physiologischen pH-Bereich, was insbesondere bei Enzymbewertungen bedeutsam ist

Beispiel 4

Testmittel, die in der nachfolgend beschriebenen Weise hergestellt worden sind und Zusammensetzun-

gen gemäß der Erfindung enthielten, wurden bei diesem Beispiel Zeiten erhöhter Temperatur ausgesetzt, um deren Stabilität zu prüfen.

Ein Puffer wurde zur Verwendung in der ersten Imprägnierlösung hergestellt durch Zugabe von 19,8 g Zitronensäure, 87,2 g Natriumcitrat, 66,8 g Äthylendiamin-tetraessigsäure zu 935 ml H₂O, wobei man rührte.

Vier aliquote Mengen der ersten Imprägnierlösung wurden dann hergestellt, indem man jeweils 50 ml des zuvor hergestellten Puffers, 13 ml eines Copolymer aus 10% Methylvinyläther mit Maleinsäureanhydrid, 10 ml 5%iges Polyvinylpyrrolidon (PVP) und 0,15 g Peroxydase kombinierte und dann jeweils Glucoseoxydase und Wasser, wie in Tabelle 5 gezeigt wird, zugab.

Tabelle 5

Formulierung

Glucoseoxydase

H₂O

2 3 4

5ml	35 ml
10ml	30 ml
20 ml	20ml
40 ml	0ml

4 Blätter von E & D-Papier wurden bis zur Sättigung imprägniert und zwar jeweils mit einer der vorerwähnten Formulierungen und dann bei 90° C getrocknet

Es wurde eine zweite Imprägnierlösung hergestellt, indem man 0,32 g Chromotropsäure, 0,8 g Natriumlaurylsulfat und 2,4 g MBTH in einem Lösungsmittel aus 160 ml Methanol und 40 ml H2O löste. Die so zubereiteten Blätter wurden dann bis zur Sättigung mit dieser zweiten Lösung imprägniert, bei 50° C getrocknet und auf eine Größe von 2,5 mm χ 2,5 mm geschnitten. Die so hergestellten Testmittel wurden durch ein zweiseitig klebendes Klebeband an organoplastische Unterlagen befestigt, um sie besser handhaben zu können.

Die Hälfte dieser Testmittel wurde einer trockenen Wärme von 6O⁰C während 3 Tagen in einen üblichen Laboratoriumsofen ausgesetzt, während die andere

Hälfte bei Raumtemperatur (RT) zur Kontrolle aufbewahrt wurde. Die Testmittel, und zwar sowohl die der Wärme ausgesetzten als auch die für die Kontrolle wurden dann geprüft, indem man sie kurz in Urinproben eintauchte, welche die in Tabelle 6 angegebenen Konzentrationen an Glucose enthielten. Die erzielten Ergebnisse wurden aufgezeichnet durch einen Vergleich der beobachteten Farben bei den Kontrolltestmitteln und den der Wärme ausgesetzten Testmitteln. Farbabschnitte mit steigender Intensität zeigen die unterschiedlichen Glucose-Konzentrationen an und diesen wurden willkürlich die Zahlenwerte (0 bis 70) zugeordnet in der folgenden Weise:

mg%	0	50	100	250	500	1000	2000	>2000
Werte	0	10	20	30	40	50	60	70

Die Ergebnisse für die der Wärme ausgesetzten Testmittel wurden mit denen der Kontrollprobe verglichen. Tabelle 6

Glucose	Formulierung Nr.	60 C	2	60 "C	3	60 C	4	60C
	1	0	RT	0	RT	0	RT	0
Mg% Wert	RT	δ	0	20	0	32	0	42
0= 0	0	18	25	42	35	45	45	55
50=10	10	28	45	52	48	58	55	60
100 = 20	20	37	55	58	60	62	60	70
250 = 30	30	45	60	62	65	70	70	>70
500 = 40	40	55	65	70	70	70	>70	>70
1000 = 50	50		70		70		>70
2000 = 60	60

Beim Vergleich der wärmeausgesetzten Streifen zeigt ten Farbe bei dem der Wärme ausgesetzten und nicht

es sich, daß die Formulierung 4 am wenigsten beeinflußt 40 der Wärme ausgesetzten Testmittel vor. Das heißt, daß

worden war. Selbst bei der Formulierung 1, die am man bei keiner dieser Formulierungen einen echten

meisten durch Wärme beeinflußt worden war, Hegt kein Verlust der Empfindlichkeit feststellen konnte, wesentlicher Unterschied in der Intensität der gebilde-

Hierzu 5 Blatt Zeichnungen

Claims

Patentansprüche:

1. Testmittel zur Bestimmung einer oxidierenden Substanz, enthaltend ein Hydrazon und ein Naphthalin, dadurch gekennzeichnet, daß das Naphthalin ein Hydroxynaphthalinsulfonat aus der Gruppe 4,5-Dihydroxy-2,7-naphthalin-disulfonsäure und/oder l-Hydroxy-2-naphthalin-sulfonsäure ist

2. Testmittel zur Bestimmung eines Bestandteiles in einer Probe, enthaltend ein Reagenzsystem, welches auf den Bestandteil in der Probe unter Ausbildung einer oxidierenden Substanz anspricht, und ein Reagenzsystem aus einem Hydrazon und einem Naphthalin zur Bestimmung der oxidierenden Substanz, dadurch gekennzeichnet, daß das Naphthalin ein Hydroxynaphthaünsulfonat aus der Gruppe 4,5-Dihydroxy-2₎7-naphthalin-disuIfonsäure und/ oder l-Hydroxy-2-naphthalinsulfonsäure ist

3. Testmittel gemäß Anspruch 1 oder 2, dadurch gekennzeichnet, daß das Hydrazon 3-MethyI-2-benzothiazolinhydrazon ist

4. Testmittel gemäß Anspruch 1 bis 3, dadurch gekennzeichnet, daß es eine Trägermatrix umfaßt.

5. Testmittel gemäß Anspruch 4, dadurch gekennzeichnet, daß die Trägermatrix feuchtigkeitsaufnehmend ist

6. Testmittel gemäß Anspruch 1 bis 3, dadurch gekennzeichnet daß es in Form einer Tablette vorliegt