DE2506115A1 - Reagenz fuer kolorimetrische bestimmungen - Google Patents

Reagenz fuer kolorimetrische bestimmungen

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DE2506115A1
DE2506115A1 DE19752506115 DE2506115A DE2506115A1 DE 2506115 A1 DE2506115 A1 DE 2506115A1 DE 19752506115 DE19752506115 DE 19752506115 DE 2506115 A DE2506115 A DE 2506115A DE 2506115 A1 DE2506115 A1 DE 2506115A1
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Paul Dr Hunziker
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F Hoffmann La Roche AG
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Description

F. Hoffmann-La Roche & Co. Aktiengesellschaft, Basel/Schweiz
Reagenz für kolorimetrisch^ Bestimmungen
Die vorliegende Erfindung betrifft ein Reagenz zur kolorimetrischen Bestimmung von Oxidationsmitteln, insbesondere von Wasserstoffperoxid.
Die Bestimmung von Wasserstoffperoxid ist besonders wichtig im Zusammenhang mit diagnostischen Verfahren zur qualitativen und quantitativen Messung des Gehaltes von Inhaltsstoffen, wie z.B. Glukose, Harnsäure oder Cholesterin, in biologischen Flüssigkeiten. Zur Bestimmung von Glukose hat sich eine Methode, worin die Glukose mittels Glukoseoxidase behandelt wird und u.a. Wasserstoffperoxid als Reaktionsprodukt entsteht in letzter Zeit durchgesetzt. Andererseits hat sich zur Bestimmung der Harnsäure eine enzymatisch^ Methode bewährt, wobei die Harnsäure mittels Uricase in Allantoin und Wasserstoffperoxid umgewandelt wird. Weiter ist auch die Bestimmung des Cholesterins - nach vorangegangener Spaltung der ChoIesterinester - unter Bildung von Wasserstoffperoxid mittels Cholesterinoxidase möglich.
Hen/3.12.1974 509834/0877
In den geschilderten Harnsäure- , Glukose- und Cholesterintests wird in einem zweiten Schritt das Wasserstoffperoxid mittels Peroxidase und einem farbstoffbildenden Mittel (hiernach als Chromogen bezeichnet) kolorimetrisch bestimmt.
Peroxidase H2°2 + ctiroinoSen ^" Farbstoff + H3O
Zu diesem Zweck wurde bisher hauptsächlich o-Dianisidin als Chromogen verwendet, jedoch mit dem Nachteil, dass der entsprechende Farbstoff eine geringe Empfindlichkeit und einen ungünstigen Absorptionsbereich (420-460 nm) aufweist.
Es wurde nun von W. Gochman und J.M. Schmitz in Clinical Chemistry, vol 17, No. 12, Seiten 1154-1159, 1971, als Chromogen eine Mischung von 3-Methyl-2-benzothiazolinonhydrazon-hydrochlorid und Ν,Ν-Dimethylsnilin vorgeschlagen, weMs elnai Farbstoff mit hoher Intensität und günstigem Absorptionsbereich (590-600 nm) ergibt. Diese Mischung besitzt jedoch eine Stabilität von höchstens einem Tag und kann dementsprechend nicht gebrauchsfertig den analytischen Labors zur Verfügung gestellt werden, was in der Anwendung einen vermehrten Aufwand und ein erhöhtes Fehlerrisiko bedeutet.
Erfindungsgemäss wurde nun ein Chromogen entwickelt, welohes die Vorteile grosser Empfindlichkeit, eines günstigen Absorptionsbereichs und grosser Stabilität kombiniert und sowohl manuell als automatisch eingesetzt werden kann.
Genauer gesagt, betrifft die vorliegende Erfindung ein Reagenz zur kolorimetrischen Bestimmung von Oxidationsmitteln enthaltend
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a) ein nicht gleichzeitig in ortho- und para- Stellung substituiertes aromatisches Amin und/oder ein Säureadditionssalz davon,
b) ein Hydrazon, welches zur oxidativen Kupplung mit diesem Amin unter Bildung eines Farbstoffes fähig ist, und/oder ein Säureadditionssalζ davon,
c) eine im Verhältnis zum Amin mindestens äqulmolare Menge an Zitronensäure und/oder Maleinsäure
Der Ausdruck "aromatisches Amin" umfasst sowohl kernunsübstituierte als kernsubstituierte aromatische Amine. Diese Amine können primär, sekundär oder tertiär, sein. Als aromatische Amine werden Anilinderivate, Naphthylamine oder Naphthylaminderivate bevorzugt. Ein besonders bevorzugtes kernunsubstituiertes aromatisches Amin ist N, N-Dimethylanilin.
Im Fall von kernsubstituierten aromatischen Aminen werden als Substituent, nieder Alkyl, nieder Alkoxy, Hydroxy, Halogen, Alkylthio, Mercapto, Amino und Mono- oder Di-nieder Alkylamino bevorzugt, wobei Amino besonders bevorzugt ist.
Die Bezeichnung "nieder Alkyl" allein oder in Kombination wie beispielsweise nieder Alkoxy oder nieder Alkylthio bezieht sich, auf geradkettige oder verzweigte Kohlenwasserstoffe, die bis zu 7 Kohlenstoffatome besitzen, wie beispielsweise Methyl, Aethyl, Propyl, Isopropyl, Butyl, tert.-Butyl, Pentyl usw. Der Ausdruck "Halogen" umfasst Fluor, Chlor, Brom und Iod.
Geeignete kernsubstituierte aromatische Amine sind m-Phenylendiamin, o-Chloranilin, Naphthyl-(l)amin, o-Toluidin, p-Aminophenol, Naphthyl-(2)amin.
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Es wird jedoch vorgezogen, Säureadditionssalze der erwähnten aromatischen Amine zu verwenden. Zu diesem Zweck eignen sich insbesondere anorganische Säureadditionssalze wie Halogenide, Sulfate usw., wobei Hydrochloride besonders bevorzugt sind. Ganz besonders bevorzugt sind m-Phenylendiammonium-di-ohlorid und N,N-Dimethylanilinhydrochlorid.
Als Hydrazone die zur oxidativen
Kupplung mit den erfindungsgemäss verwendeten Aminen unter Bildung eines Farbstoffes fähig sind, können N-Methyl-2-benzothiazolinon-hydrazon, N-Methyl-pyridon-4-hydrazon, N-Methyl-pyrldon-2-hydrazon, N-Methyl-chinolinon-2-hydrazon, N-Methyl-chinolinon-4-hydrazon, N-Methyl-2-benzothiazolinonhydrazon, N-Methyl-thiazolinon-2-hydrazon, N-Methyl-4-phenylthiazolinon-2-hydrazon, N-Methyl-oxazolinon-2-hydrazon, N-Methyl-benzoxazolinon-2-hydrazon !,^-dimethylbenzimidazolinon-2-hydrazon und/oder Säureadditionssalze davon genannt werden. Besonders bevorzugt ist N-Methyl-2-benzothiazolinon-hydrazonhydrochlorid.
In dem erfindungsgemässen Reagenz wird das Mengenverhältnis von Zitronensäure und/oder Maleinsäure zu den anderen Komponenten so gewählt, dass die Farbreaktion in einem pH-Bereich von 3,2 bis 4,7 (Harnsäure Bestimmung) oder 4,7 bis 5,5 (Glukose- oder Cholesterinbestimmung) erfolgt. Das Verhältnis des aromatischen Amins oder des Säureadditionssalzes davon zum Hydrazon kann in weiten Grenzen variiert werden. In dem Pail, wo Zitronensäure verwendet wird, liegen die Säure, das aromatische Amin und/oder das Säureadditionssalz davon und das reaktive Hydrazon und/oder das Säureadditionssalz davon vorzugsweise in dem erfindungsgemässen Reagenz in einem G-ewichtsverhältnis von 120/0,5-2/0,5-2, (Harnsäurebestimmung) oder 50/0,5-2/0,5-2 (alukose- oder Cholesterinbestimmung) vor. Ein Gewichtsverhältnis von 120/1/1
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(Harnsäurebestimmung) oder 50/1/1 (Glukose- oder Gholesterinbestimmung) ist besonders bevorzugt.
In dem Pail bei dem Maleinsäure verwendet wird, liegen die Säure, das aromatische Amin und/oder das Säureadditionssalz davon und das reaktive Hydrazon und/oder das Säureadditionssalz davon vorzugsweise in dem erfindungsgemässen Reagenz in einem G-ewichtsverhältnis von 120/0,5-6/0,5-6, vor. Bin G-ewichtsverhältnis von 6O/I/I ist besonders bevorzugt.
Das erfindungsgemässe Reagenz kann für diagnostische. Zwecke geeignete Zusätze, wie z.B. ein bakterizides Mittel wie Natriumazid oder Natrium-äthylmercurithiosalicylat (Thimerosal) enthalten.
Das Reagenz kann sowohl in flüssiger Form, wie z.B. in Form einer wässrigen Lösung, als in fester Form, wie z.B. als Pulver- oder Granulatgemisch, Tablette oder Lyophilisat vorliegen.
Weiter kann das Reagenz gelöst werden und durch Imprägnieren auf einen saugfähigen Träger wie Papier, Pappe, Textilgewebe, Holz, usw. aufgebracht werden.
Besonders bevorzugt ist das Reagenz pulverförmig.
Das Reagenz wipd vorzugsweise in einem Behälter einer Reagenzgarnitur, welche zusätzlich in einem weiteren Behälter die fUr die Bestimmung der Wasserstoffperoxid erforderliche Puffer-Peroxidase Mischung enthält, verpackt.
Diese Reagenzgarnitur kann zusätzlich die für eine enfcymatische Harnsäure-Bestimmung erforderliche Uricase und Puffer enthalten. In einer weiteren Ausfunrungsform kann die Reagenzgarnitur zusätzlich die für eine enzymatisehe Glukose-Bestiamung erforderliche Glukoseoxidase
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und Puffer enthalten. In einer weiteren Ausführungsform kann die Reagenzgarnitur zusätzlich die für eine enzymatisch^ Cholesterinbestimmung erforderliche Cholesterinesterase, Cholesterinoxidase und Puffer enthalten.
Die Erfindung wird anhand der nachstehenden Beispiele näher erläutert.
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Beispiel 1
Durch Vermischen der spezifischen Bestandteile können die folgenden Reagenzien hergestellt werden.
A] 30 mg 3-Methyl-2-benzothiazolinon-hydrazon-hydrochlorid und 30 mg m-Phenylendiammoniumdichlorid und 3*6 g Zitronensäure (Pulver)
B] 30 mg 3-Methyl-2-benzothiazolinon-hydrazon-hydrochlorid und ^O mg m-Phenylendiammoniumdichlorid und 1*55 ß Maleinsäure (Pulver)
C] 30 mg 3-Methyl-2-benzothiazolinon-hydrazon-hydrochlorid und 30 mg Ν,Ν-Dimethylanilin-hydroehlorid und 3*6 g Zitronensäure (Pulver).
Beispiel 2
Die durch Beispiel 1 veranschaulichte Mischung A wird in klinisch chemischen Analysenautomaten mit kontinuierlicher Strömung (Technicon^ Auto-Analyzer^ ), zur Harnsäure-Bestimmung eingesetzt. Hierbei werden die zu analysierenden Proben der Reihe nach aus getrennten Probebehältern vom Probenschlauch angesaugt (Durchfluss 0,42 cc/Min). Der Probeteller dreht mit einer konstanten Geschwindigkeit und liefert dem System 60 Proben pro Stunde mit einem Waschverhältnis von 5:1. Eine auf diese Weise angesaugte Probe wird in Strömung mit einer 1,3^-igen Kochsalzlösung (Durchfluss 1,50 cc/Min.) gemischt und durch eine übliche Mischspule mit 5 Windungen aus Glas geleitet. Nachdem die Mischung die Misohspule durchflossen hat, wird sie durch einen Dialysator (Dialysierweg 60 cm), welcher mit einer Cellophanmembrane oder dergleichen versehen ist, gepumpt, wobei die Harnsäure durch Dialyse in die in den unteren Teil des Dialysators zugeflihrte, (Dureh-
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fluss 1,50 cc/Min) gepufferte, Uricase-Lösung vom pH = 9,5, (Boratpuffer 5 mMol/l·) übergeht. Nach Durchgang des Dialysators wird das Reaktionsgemisch bei einer Temperatur von 37°C während 4 Minuten in einem Heizbad inkubiert,
wobei die Harnsäure quantitativ zu Allantoin und Wasserstoffperoxid umgesetzt wird. Dem erhaltenen Reaktionsgemisch wird dann in kontinuierlicher Weise eine wässrige Lösung des erwähnten Chromogens in 250 ml zugesetzt, (Durchfluss 0,250 cc/Min). Anschliessend wird diese Mischung durch eine Mischspule mit 20 Windungen aus Glas geleitet. Nach DurchfHessen dieser Mischspule wird eine gepufferte wässrige Peroxidase-LÖsung vom pH-Wert 7,5» (Zitratpuffer 10 mMol/l), zugesetzt (Durchfluss 0,250 cc/Min), wodurch die entstandene Mischung einen pH-Wert von zirka 4,0 aufweist. Diese Mischung wird dann durch eine zweite
Mischspule mit 20 Windungen geleitet. Bei Durchströmung dieser Mischspule reagiert das Wasserstoffperoxid unter katalytischem Einfluss der Peroxidase mit dem Chromogen unter Bildung einer roten Färbung. Anschliessend werden in einem Photometer in einer 15 mm Durchflussküvette bei 520 nm photometrische Messungen durchgeführt, d.h. die Extinktion der zu prüfenden Lösung wird bei 520 nm in einem Photometer mit einer Durchflussküvette gemessen. Die Ergebnisse der photometrischen Messung werden mit einem geeigneten Registriergerät festgehalten.
Das System mit kontinuierlicher Strömung saugt 60 Proben/Stunde an. Die Materialien, welche in das System einströmen, werden mittels einem geeigneten Pumporgan, welches eingestellt wurde um die gewünschte Strömungsgeschwindigkeit aufrecht zu erhalten, in dieses System gepumpt. Zur Vermeidung von Kontaminationseinflussen werden die Verdünnungslösung und die gepufferte Uricase-Lösung durch Luftblasen segmentiert (Durchfluss 0,23 cc/Min).
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Zur Erzielung eines regelmässigen Blasenmusters wird ; diesen beiden Lösungen, sowie der gepufferten Peroxidäse . Lösung Heptadecenylbenzimidazolsulfonsäure-Natriumsalz ..-(Ultravon) als Detergenz zugesetzt. Die Konzentration des zugeführten Detergenz beträgt für die Verdunnungslösung . 0,15 Prozent. ~
Die gemäes Beispiel 1 hergestellten Reagenzien B und G werden in ähnlicher Weise zur Harnsäure-Bestimmung verwendet., wobei bei dem Reagenz C die gebildete Färbung blau ist und die photometrische Messung bei 59O-6OOnm erfolgt.
Beispiel 3
Es wurde eine VerdUnnungsreihe wässriger Harnsäurestandards hergestellt mit den Konzentrationen 2 mg/lOO ml, 5 mg/lOO ml, 10 mg/lOO ml, 20 mg/lOO ml, 30 mg/lOO ml und 40 mg/100 ml. Diese Standards werden wie Proben eingesetzt und wie durch Beispiel 2 veranschaulicht unter Verwendung der Reagenzien A und B bestimmt.
5 Reagenz A Ergebnis in Skalenteilen Reagenz B Ergehnis in Skalenteilen
Harnsäurekonzentration 10 106
mg/ml 20 112 213 :
30 224 432
40 441 660
668 890
Harnsäurekonzentration
5
10
20
30
40
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Die vorstehenden Ergebnisse zeigen die mit dem erfindungsgemässen Chromogen erreichte Linearität
Beispiel 4
Es wurden respektive 5 mg/lOO ml Glutathion, 5 mg/ 100 ml Acetylsalicylsäure und 5 mg/lOO ml Ascorbinsäure zwei verschiedenen Kontrollseren mit einem (ursprünglichen) Harnsäure-Gehalt von je 5,32 mg/lOO ml (Serum l) und 9,44 mg/ 100 ml (Serum 2) zugegeben und danach der Harnsäuregehalt erneut, wie durch Beispiel 2 veranschaulicht, bestimmt.
Das Ergebnis wird in der nachstehenden Tabelle wiedergeben.
Gefundener Wert Abweichung vom Reagenz A (mg/lOO ml) Sollwert %
Serum 1+5 mg/lOO ml Glutathion 5,28 -0,7
Serum 1+5 mg/100 ml Acetylsalicylsäure
Serum 1+5 mg/l00 ml Ascorbinsäure Serum 2+5 mg/100 ml Glutathion
Serum 2+5 mg/l00 ml Acetylsalicylsäure
Serum 2+5 mg/lOO ml Ascorbinsäure
Die vorstehenden Ergebnisse zeigen die geringe Störanfälligkeit des erfindungsgemässen Chromogens gegenüber in biologischen Flüssigkeiten vorhandenen reduzierenden Bestandteilen.
+0,4
5,25 -1,3
9,32^ -1,1
9,34 -1,1
9,27 -1,8
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Beispiel 5 .
Die nachstehende Tabelle veranschaulicht die Richtigkeit der Harnsäurebestimmung bei Verwendung der Reagenzien A bis C.
Kontrollserum Chromogen Sollwert Gefundener Wert Serum 1 Reagenz A 4,4 4,6 Serum 2 Reagenz A 8,7 8,8 Serum 3 Reagenz A 4,8 4,4 Serum 4 Reagenz A 10,4 10,5 Serum 5 Reagenz A 5,1 5,3 Serum 1 Reagenz C 4,4 4,4 Serum 2 Reagenz C 8,7 8,7 Serum 3 Reagenz C 4,8 4,3 Serum 4 Reagenz C 10,4 10,3 Serum 5 Reagenz B 5,1 5,3
Die Versuche wurden mit zwei Wochen alten Reagenzien-Lösungen durchgeführt, was auch zum Beweis der Stabilität dieser Reagenzien dient.
Beispiel 6
Eine Mischung von 30 mg ^-Methyl-^-benzothiazolinon-hydrazon-hydrochlorid und 30 mg n-Phenyldiammoniumchlorid und 1,44 g Zitronensäure (Pulver) wird in klinisch chemischen Analysenautomaten mit kontiuierlicher Strömung (Technicon Äuto-Analyser^), zur Glukose-Bestimmung eingesetzt. Hierbei werden die zu analysierenden Proben der Reihe nach aus getrennten Probebehältern vom Probenschlauch angesaugt (Durchfluss 0,10 cc/Min). Der Probeteller dreht mit einer konstanten Geschwindigkeit und liefert dem System 60 Proben pro Stunde mit einem Waschverhältnis von 5:1. Eine auf diese Weise ange-
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saugte Probe wird in Strömung mit einer 1,3^-igen Kochsalzlösung (Durchfluss 1,60 cc/Min*) gemischt und durch eine übliche Mischspule mit 5 Windungen aus Glas geleitet. Nachdem die Mischung die Mischspule durchflossen hat, wird sie durch einen Dialysator (Dialysierweg 7,5 cm), welcher mit einer Cellophanmembrane oder dergleichen versehen ist, gepumpt, wobei die Glukose durch Dialyse in die in den unteren Teil des Dialysators zugeführte, (Durchfluss, 1,60 cc/Min) gepufferte, Glukoseoxidase-Lösung vom pH = 7)5» (Zitratpuffer 1,7 g/l) übergeht. Nach Durchgang des Dialysators wird das Reaktionsgemisch bei Raumtemperatur während mindestens 2 Minuten inkubiert, wobei die Glukose quantitativ zu Gluconsäure und Wasserstoffperoxid umgesetzt wird. Dem erhaltenen Reaktionsgemisch wird dann in kontinuierlicher Weise eine wässrige Lösung des erwähnten Chromogens in 100 ml zugesetzt, (Durchfluss 0,160 cc/Min). Anschliessend wird diese Mischung durch eine Mischspule mit 20 Windungen aus Glas geleitet. Hach DurchfHessen dieser Mischspule wird eine gepufferte wässrige Peroxidase-Lösung vom pH-Wert 7,5, (Zitratpuffer 10 g/l), zugesetzt (Durchfluss 0,230 cc/Min), wodurch die entstandene Mischung einen pH-Wert von zirka 5,1 aufweist. Diese Mischung wird dann durch eine zweite Mischspule mit 20 Windungen geleitet. Bei Durchströmung dieser Mischspule reagiert das Wasserstoffperoxid unter katalytischem Einfluss der Peroxidase mit dem Chromogen unter Bildung einer roten Färbung. Anschliessend werden in einem Photometer in einer 15 mm Durchflussküvette bei 520 nm photometrische Messungen durchgeführt, d.h. die Extinktion der zu prüfenden Lösung wird bei 520 nm in einem Photometer mit einer Durchflussküvette gemessen. Die Ergebnisse der photometrischen Messung werden mit einem geeigneten Registriergerät festgehalten.
Das System mit kontinuierlicher Strömung saugt 60 Proben/Stunde an. Die Materialien, welche in das System einströmen, werden mittels einem geeigneten Pumporgan, welches eingestellt wurde um die gewünschte Strömungsgeschwindigkeit aufrecht zu er-
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- 13 - :
halten, in dieses System gepumpt. Zur Vermeidung von Kontaminationseinflüssen werden die Verdünnungslösung und die gepufferte Glucoseoxidase-Lösung durch Luftblasen segmentiert (Durchfluss 0,230 cc/Min). Zur Erzielung eines regelmassigen Blasenmusters wird diesen beiden Lösungen, sowie der gepufferten Peroxidase lösung Polyoxyäthylensorbitanmonolaurylat (Tween 20) als Detergenz zugesetzt. Die Konzentration, des zugeführten Detergenz beträgt für die Verdünnungslösung 0,10 Prozent und für die Enzymlösungen 1,5 Prozent.
Beispiel 7 '.'.'■
20μΐ Probe und 5 ml einer gepufferten (Phosphatpuffer · 10 mMol/l; pH-Wert 7,1) wässerigen Suspension von Cholesterinesterase (0,2 Einheiten/ml) werden gemischt und bei 37° inkubiert (Leerwertansatz). Davon werden 2,5 ml abpipettiert, mit 20μ1 einer gepufferten (Phosphatpuffer 10 mMol/l; pH-Wert 7*1) wässerigen Suspension von Cholesterinoxidase (3 Einheiten/ml) versetzt und bei 37° stehen gelassen (Probenansatz).,
Nach 15 Minuten werden Proben- und Leerwertansatz mit 100μ1 einer wässerigen Lösung enthaltend 30μg 3-Methyl-2-benzothiazolinon-hydrazon-hydrochlorid, 30μg m-Phenylendiammoniumchlorid und 1,44 mg Zitronensäure und danach mit 500μ1 einer gepufferten (Phosphatpuffer 60 mMol/l, pH-Wert 7,1) wässerigen Peroxidaselösung versetzt. Nach 10 Minuten wird die Extinktion der Probe gegen den Leerwert bei 5ΟΌ-55Ο nm gemessen. Die Berechnung der Oholesterinkonzentration erfolgt über einem mltgeführten Standard.
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Claims (5)

  1. - 34 -
    Patentansprüche
    1J Reagenz zur kolor!metrischen Bestimmung von Oxidationsmitteln enthaltend
    a) ein nicht gleichzeitig in ortho- und para-Stellung substituiertes aromatisches Amin und/oder ein Säureadditionssalz davon,
    b) ein Hydrazon, welches zur oxidativen Kupplung mit diesem Amin unter Bildung eines Farbstoffes fähig ist und/oder ein Säureadditionssalz davon,
    c) eine im Verhältnis zum Amin mindestens äquimolare Menge an Zitronensäure und/oder Maleinsäure.
  2. 2. Reagenz nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, dass das Hydrazon N-Methyl-2-benzothiazolinon-hydrazon-hydroohlorid ist.
  3. 3. Reagenz nach Anspruch 1 oder 2, dadurch gekennzeichnet, dass das aromatische Amin ein kernsubstituiertes Anilin-derivat oder ein Naphthylamin-derivat ist.
  4. 4. Reagenz nach einem der Ansprüche 1 bis 3* dadurch gekennzeichnet, dass das aromatische Amin mit nieder Alkyl, nieder Alkoxy, Hydroxy, Halogen, Nieder-alkylthio oder Mercapto kernsubstituiert ist.
  5. 5. Reagenz nach einem der Ansprüche 1 bis 4, dadurch gekennzeichnet, dass das aromatische Amin m-Phenylendiamin ist,
    6. Reagenz nach einem der Ansprüche 1 bis 2, dadurch gekennzeichnet, dass das aromatische Amin ein kernunsubstitaiertes Anilinderivat ist.
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    .250811 S
    7. Reagenz nach Anspruch 6, dadurch gekennzeichnet, dass das aromatische Amin Ν,Ν-Dimethy1anilin ist.
    8. Reagenz nach einem der Ansprüche 1 bis 7» dadurch gekennzeichnet, dass es ein Säureadditionssalz des aromatischen Amins enthält. -
    9· Reagenz nach Anspruch 8, dadurch gekennzeichnet, dass das Säureadditionssalζ ein Hydrochlorid ist.
    10. Reagenz nach Anspruch 9» dadurch gekennzeichnet,.
    en . ■ " dass das Säureadditionssalz m-PhenyVdiammonium-diChlorid ist.
    11. Reagenz nach Anspruch 9, dadurch gekennzeichnet,
    dass das Säureadditionssalz Ν,Ν-Dimethylanilin-hydrochlorid ist.
    12. Reagenz nach einem der Ansprüche 1 bis 11, dadurch gekennzeichnet, dass es als Säure ausschliesslich Zitronen- ' säure enthält.
    . Reagenz nach einem der Ansprüche 1 bis 11, dadurch gekennzeichnet, dass es als Säure ausschliesslich Maleinsäure enthält.
    14. Reagenz nach Anspruch 12, dadurch gekennzeichnet, dass die Zitronensäure, das aromatische Amin und/oder das Säureadditionssalz davon und das Hydrazon und/oder das Säureadditionssalz davon in einem Gewichtsverhältnis von 120/0,5-2/0,5-2 respektive vorliegen.
    15. Reagenz nach Anspruch 14, dadurch gekennzeichnet, dass das Gewichtsverhältnis I20/1/1 beträgt.
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    16. Reagenz nach Anspruch 12, dadurch gekennzeichnet, dass die Zitronensäure, das aromatische Amin und/oder das-Säureadditionssalz davon und das Hydrazon und/oder das Säureadditionssalz davon in einem Gewichtsverhältnis von 50/0,5-2/0,5-2 respektive vorliegen.
    17· Reagenz nach Anspruch 14, dadurch gekennzeichnet, dass das G-ewichtsverhältnis 50/1/1 beträgt.
    18. Reagenz nach einem der Ansprüche 1 bis 17* in Form einer wässrigen Lösung.
    19. Reagenz nach einem der Ansprüche 1 bis 17 in Form eines Pulvers.
    20. Reagenz nach einem der Ansprüche 1 bis 17 in Form eines Granulats.
    21. Reagenz nach einem der Ansprüche 1 bis 17 in Form einer Tablette.
    22* Reagenz nach einem der Ansprüche 1 bis 17 in Form eines Lyophilisats.
    23. Reagenz nach einem der Ansprüche 1 bis 22, dadurch gekennzeichnet, dass es zusätzlich ein bakterizides Mittel enthält.
    24. Verfahren zur Herstellung eines Reagenz gemäss einem der Ansprüche 1 bis 23, dadurch gekennzeichnet, dass man die verschiedenen Bestandteile auf übliche Weise vermischt.
    25■ Verwendung eines Reagenz gemäss einem der Ansprüche 1 bis 24 und Peroxidase zur Bestimmung von Wasserstoffperoxid.
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    26-, Verwendung gemäss Anspruch 25 in Zusammenhang mit einer Harnsäurebestimmung.
    27 . Verwendung gemäss Anspruch 25 in Zusammenhang mit einer Glukosebestimmung.
    28. Verwendung gemäss Anspruch. 27 im Zusammenhang mit einer Cholesterinbestimmung.
    29;. Verfahren zur Bestimmung von Wasserstoffperoxid, dadurch gekennzeichnet, dass man ein Reagenz gemäss einem der Ansprüche 1 bis 23 und Peroxidase verwendet.
    30· Verfahren nach Anspruch 29 in Zusammenhang mit einer Harnsäurebestimmung.
    31· Verfahren nach Anspruch 29 in Zusammenhang mit einer Glukosebestimmung.
    32. Verfahren nach Anspruch 29 im Zusammenhang mit einer Cholesterinbestimmung.
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